DE1695364C

DE1695364C - Verfahren zur Herstellung von 2 Nitroimidazolen

Info

Publication number: DE1695364C
Authority: DE
Inventors: Giancarlo Pavia Sensi Piero Mailand Lancini, (Italien)
Original assignee: Gruppo Lepetit SpA, Mailand (Italien)
Publication date: 1972-09-14

Description

NH,

in der R und η die vorstehende Bedeutung haben, 12 bis 120 Stunden bei 25 bis 30° C mit einer Fermentationslösung behandelt, die durch die Fermentierung von Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans ATCC 19 551 erhalten worden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das 2-Aminoimidazol dem Fermentationsmedium von Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans ATCC 19 551 nach 48 Stunden zusetzt und die Fermentierung 12 bis 72 Stunden bei 25 bis 30⁰C fortsetzt.

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von 2-Nitroimidazolen der allgemeinen Formel I

NO,

in der R und π die vorstehende Bedeutung haben, 12 bis 120 Stunden bei 25 bis 3O⁰C mit einer Fermentationslösung behandelt, die durch die Fermentierung von Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans ATCC 19 551 erhalten worden ist Azomycin und seine Homologen haben protozoenfeindliche Eigenschaften.

Wie aus Journal of the American Chemical Society Bd. 87 (1965), S. 389 bis 390, bekannt ist, wurden bereits mehrere chemische vollsynthetische Verfahren zur Herstellung von 2-Nitroimidazol entwickelt Es konnte jedoch das 2-Nitroimidazol bestenfalls in 40%iger Rohausbeute erhalten werden, wenn man 2-Aminoimidazol mit Natriumnitrit in Gegenwart von Kupfer(II)-sulfat umsetzte, wobei das Reaktions-

produkt 16 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt wurde. Demgegenüber werden nach dem beanspruchten Verfahren erheblich bessere Ausbeuten erzielt.

Es ist bekannt, daß Azomycin durch einen Mikroorganismus gebildet wird, der der Gattung Nocardia angehört, und daß viele seiner Eigenschaften denen von Nocardia mesenterica ähneln, obwohl die Identität der zwei Mikroorganismen nicht bewiesen werden konnte. Die physiologischen und kulturellen Eigenschaften des azomycinbildenden Stammes sind im Journal of Antibiotics, 7 A (1954), S. 53, angegeben. Später wurde ein anderer azomycinbildender Mikroorganismus gefunden, der Streptomyces eurocidius benannt wurde (Journal of Antibiotics, 8A (1955), S. 105.

Aus einer nahe Ivrea (Italien) gewonnenen Bodenprobe wurde nun ein Streptomyces isoliert, der bei der American Type Culture Collection eingereicht wurde und die Nummer 19 551 erhalten hat. Die nachstehend beschriebenen Eigenschaften dieses Stammes sind denen von Streptomyces eurocidicus ziemlich ähnlich. Darüber hinaus wurde aber die überraschende Tatsache gefunden, daß die enzymatische Aktivität des neuen Stammes, der als Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans ATCC 19 551 bezeichnet wurde, die Aminogruppe einiger heterocyclischer Aminoverbindungen zu einer Nitrogruppe oxydieren kann. Dieser Effekt gestaltet die Herstellung von Azomycin in hohen Ausbeuten, indem man Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans ATCC 19 551 in einem geeigneten K ulturmedium kultiviert und in das Medium dann 2-Aminoimidazol als Ausgangsverbindung einführt, das nach bekannten Verfahren leicht hergestellt werden kann.
Weilerhin wurde gefunden, daß man nach diesem Verfahren nicht nur 2-Nitroimidazol selbst herstellen kann, da bei Zugabe eines substituierten 2-Aminoimidazols der allgemeinen Formel

in der R eine niedere Alkylgruppe bedeutet und η eine ganze Zahl von 0 bis 2 einschließlich bedeutet, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein 2-Aminoimidazol der allgemeinen Formel

in der R und η die oben angegebene Bedeutung haben, zu dem Medium, in dem Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans ATCC 19 551 die Oxydation von 2-Aminoimidazol zu 2-Nitroimidazol bewirkt, auch die entsprechenden substituierten 2-Nitroimidazole in hoher Ausbeute erzeugt werden. Dies ist ein sehr wertvoller Fortschritt, da 2-Nitroimidazoe und seine sub-

stituierten Derivate bekanntlich durch chemische Verfahren nicht leicht hergestellt werden können. Das Verfahren besteht in der Hauptsache darin, daß man die Ausgangsverbindung dem Kulturmedium nach etwa 48 Stunden zusetzt, wenn die Fermentation einen- geeigneten Grad erreicht hat, und die Fermentierung bei einer Temperatur von 25 bis 3O⁰C für die Dauer von 12 bis 72 Stunden fortsetzt Eine leichte Abwandlung dieser Methode kann vorgenommen werden, indem man das Mycel in einer geeigneten Stufe ι ο seines Wachstums isoliert und wäscht und es in einem frischen Medium suspendiert, dem dann die Ausgangsverbindung zugesetzt wird. Dieses Verfahren wird vorzugsweise angewendet, wenn ulkylsubstituierte Imidazole hergestellt werden sollen, da es die Verringerung der gleichzeitigen Bildung von Azomycin gestattet und die endgültige Reinigung erleichtert.

Die Produkte werden dann nach üblichen Verfahren gewonnen; die Trennung und Reinigung erfolgt entweder chromatographisch oder vorteilhafter durch fraktionierte Kristallisation.

Die nach dem vorliegenden Verfahren hergestellten alkylierten 2-Nitroimidazole besitzen bekanntlich wie 2-Nitroimidazol selbst (Azomycin) eine hohe Wirksamkeit gegen Trichomonas vaginalis. Sie sind beispielsweise in 11 Farmaco, Ed. Sei., 21 (1966), S. 278, beschrieben, wo auch von Derivaten berichtet wird, bei denen Alkylgruppen aus dem Stickstoffatom substituiert sind, das ein Wasserstcffatom trägt. Es liegt auf der Hand, daß die nach vorliegendem Verfahren hergestellten 2-Nitroimidazole auch als Zwischenprodukte für die Herstellung der N-alkylierten 2-Nitroimidazole nach üblichen Verfahren nützlich sein können.

Streptomyces euroeidicus var. nitroxydans ATCC 19 551 wird nachstehend beschrieben.

Allgemeine Eigenschaften von Streptomyces

euroeidicus var. nitroxydans ATCC 19 551

bei mikroskopischer Untersuchung

Substralniycel fein, üppig verzweigt, gewöhnlich mit einem Durchmesser von 0,8 bis 1,0 μ Luftmycel gewöhnlich auf den Standardmedien gut entwickelt, anfänglich weiß, dann hellgrau. Sporophoren lang und wellig; keine Bildung von Spiralen.

In Tabelle I sind die Kultureigenschaften von Streptomyces euroeidicus var. nitroxydans ATCC 19 551 angegeben. Die verwendeten Kulturmedien wurden nach Waksman (S.A. Waksman, The Actinomycetes, Bd. 2, 1961, The Williams and Wilkins Co.), hergestellt. Die Ergebnisse der Kohlenstoffverwertungstests (P r i d h a m und Gottlieb,]. Bacteriol., Bd.56 [1948], S. 107 bis 114), sind in Tabelle II angegeben, und in Tabelle III sind schließlich die Ergebnisse einiger physiologischer Tests aufgeführt.

Tabelle I
Kultureigenschaften von Streptomyces euroeidius var. nitroxydans ATCC 19551

Medien	Vegetatives Mycel	Luftmycel	Lösliches Pigment
Hafermehlagar	mäßiges Wachstum, glatte	mäßige Entwicklung und	abwesend
	Oberfläche, Hyalin	Sporenbildung, wattige
		Oberfläche, weiß
Bennets Agar	mäßiges Wachstum, glatte	mäßige Entwicklung, schlechte	Hellbraun
	Oberfläche, hellbraun	Sporenbildung, wattige
		Oberfläche, aschgrau bis grau
Czapeck-Dox-Agar	kein Wachstum
Kartoffelagar	mäßiges Wachstum, glatte	mäßige Entwicklung und	abwesend
	Oberfläche, Hyalin	Sporenbildung, wattige
		Oberfläche, weiß
Kartoffelpfropfen	gutes Wachstum, faltig, Hyalin	Spuren von grauweißem Luft	Braun
		mycel , keine Sporen
Glukoseasparagin	mäßiges Wachstum, glatte	gute Entwicklung und Sporen
	Oberfläche, Hyalin	bildung, wattige Oberfläche weiß
Glycerinasparagin	mäßiges Wachstum, glatte	mäßige Entwicklung und	Blaßgelb bL·
	Oberfläche, gelblich	Sporenbildung, wattige	bernstein
		Oberfläche, weiß	farben
Nähragar	mäßiges Wachstum, glatte	abwesend	Braun
	Oberfläche, braun bis rot
	braun mit violettem Ton
Stärkeagar	schlechtes Wachstum, glatte	abwesend	abwesend
	Oberfläche, Hyalin
Ca-Majat	kein Wachstum
Tyrosinagar	schlechtes Wachstum, glatte	abwesend	bernsteinfarben
	Oberfläche, Hyalin
Eialbumin	schlechtes Wachstum, glatte	mäßige Entwicklung und	abwesend
	Oberfläche, Hyalin	Sporenbildung, wattige
		Oberfläche, weiß
Zelluloseagar	kein Wachstum

Tabelle II

Verwertung von Kohlenstoffverbindungen durch den Stamm Streptomyces eurocidicus

var. nitroxydans ATCC 19 551

Kohlenstoffquellen Arabinose	.. ±
Xylose	.. ±
Glukose. .
Galactose
Fructose
Mannose	_
Rhamnose
Lactose
Maltose
Sucrose
Raffinose
Glycerin
Sorbit
Mannit
Dulcit
Inosit
Dextrin	.
Inulin
Stärke
Ribose
Sorbose

+ + + gutes Wachstum; + + mäßiges Wachstum; ± spärliches Wachstum; — kein Wachstum.

Tabelle III

Physiologische Eigenschaften des Stammes Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans

ATCC 19 551

	Ergebnis
Stärke	hydrolysiert langsame und teilweise Hydrolyse nicht reduziert positiv keine Veränderungen
Gelatine . .
Nitrate
Melanin
Lackmusttiilch

wird 2-Aminoimidazol in einer Menge von 100 y/ccm des Kulturmediums zugegeben. Die Fermeniierung wird 72 Stunden unter den gleichen Bedingungen durchgeführt; dann hört sie auf. Die Brühe wird mit n-NaOH-Lösung leicht alkalisch gestellt (pH = 8) und auf einem geeigneten Filter filtriert. Das Mycel wird wiederholt mit Wasser (pH-Wert 8) gewaschen, welches dem Filtrat zugesetzt wird, das mit 10%iger wäßriger Salzsäure angesäuert wird. Die erhaltene

Lösung wird dreimal mit dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert, und die erhaltene Lösung wird im Vakuum konzentriert, bis ein Produkt auskristallisiert. Dieses ist 2-Nitroimidazol, das durch Umkristallisieren gereinigt werden kann. Der Schmelzpunkt ist 283°C.

Bei Zugabe von 100 y/ccm 2-Aminoimidazol wird eine Menge 2-Nitroimidazol gewonnen, die einer Konzentration von 170 γ/ccm in der schließlich erhaltenen Fermentationsbrühe entspricht. Eine Kontrollkultur, der kein 2-Aminoimidazol zugesetzt wurde, ergab eine Konzentration von 68 y/ccm Azomycin, so daß die Ausbeute 74% beträgt.

Beispiel 2
Herstellung von 4(5)-Methyl-2-nitroimidazol

Zu 100 ecm eines Kulturmediums, das auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt und geimpft worden ist, wird nach 48stündigem Fermentieren bei 30⁰C 4(5)-Methyl-2-aminoimidazol in einer Menge zugesetzt, die 100 y/ccm entspricht. Nach 120 Stunden werden 118 y/ccm Nitroimidazole, d. h. sowohl 2-Nitroimidazol als auch 4(5)-Methyl-2-nitroimidazol, aus der Brühe mit Äthylacetat extrahiert und mittels fraktionierter Kristallisation getrennt.

Es wird eine Menge erhalten, die 55 y/ccm 4(5)-Methyl-2-nitroimidazol und 64 y/ccm 2-Nitroimidazol entspricht. Der Schmelzpunkt von 4(5)-Methyl-2-nitroimidazol ist 206⁰C.

Beispiel 3
Herstellung von 4(5)-Methyl-2-nitroimidazol

Ein Standgefäß, das 40 1 Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung

4°

45 Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1
Herstellung von 2-Nitroimidazol

Ein Volumen von 100 ecm Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung

Sojabohnenmehl 20 g

Kaseinhydrolysat 2 g

Natriumchlorid 5 g

Natriumnitrat 5 g

Maltose 50 g

H₂O 1000 ecm

(durch Erhitzung bei 120°C für die Dauer von

20 Minuten sterilisiert; pH-Wert nach der Sterilisation 6,5)

wird mit 5 Volumprozent der Gärungsbrühe geimpft, die getrennt durch Kultivieren der Sporen von Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans ATCC 19 551 in einem geeigneten Kulturmedium hergestellt worden ist. Das Gefäß wird bei 28° C auf einer Schüttelvorrichtung (200 U/Minute) erhitzt, und nach 48 Stunden

6o

MgSO₄ ..
NH₄NO₃.
KH₂PO₄ .
Na₂HPO₄
CaCO₃.

2H₂O

0,5 g

10 g
0,624 g
0.376 g

10g

Glukose 90 g

CuSO₄-5H₂O.
FeSO₄-7H₂O .
ZnSO₄-7H₂O.
MnSO₄-4H-.O
CoCl₂-OH₂O .
(NH₄J₆Mo₇O₂₄

0,0033 g
0,01 g
0.05 g
0,004 g
0,002 g
0,001 g

4H₂O

Dest. H₂O 1000 ecm

(sterilisiert durch 15 Minuten dauernde Erhitzung bei 120⁰C; pH-Wert nach der Sterilisation 6,2)

enthält, wird mit 5 Volumprozent Impfbrühe geimpft. Das Medium wird bei 25° C gehalten und mechanisch mit 500 U/Minute gerührt. Es wird belüftet, indem man sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,5 1 pro Liter Medium und pro Minute einbläst. Nach einer Fermentation von 48 Stunden wird das Mycel nitriert, mit einer Pufferlösung von Phosphaten gewaschen und in 401 der gleichen Lösung suspendiert.

Es wird auf einen pH-Wert von 6,5 gepuffert. Dann werden 6,7 g 4(5)-Methyl-2-aminoimidazol zugesetzt, und die Fermentierung wird dann unter den gleichen Bedingungen wie zuvor durchgeführt. Nach 12 Stunden wird die Brühe mit Äthylacetat extrahiert, und die Abtrennung der Produkte erfolgt durch Chromatographie auf einer Kolonne aus Silikagel und unter Verwendung einer 1: !-Mischung von Diäthyläther und Petroläther als Entwicklungslösungsmittel. Es werden 4,5 g 4(5)-Methyl-2-nitroimidazol (=52% Ausbeute) erhalten; Schmelzpunkt 206⁰C.

Beispiel 4

Herstellung von 4,5-Dimethyl-2-nitroimidazol

Diese Verbindung wird im wesentlichen nach dem vorstehend im Beispiel 2 für die Herstellung von 4(5)-Methyl-2-nitroimidazol beschriebenen Verfahren unter Verwendung von 4,5-Dimethyl-2-aminoimidazol als Ausgangsverbindung hergestellt. Der Schmelzpunkt ist 217°C. Ausbeute = 45%.

Beispiele 5 bis 7

Nach dem gleichen, in den vorstehenden Beispieler beschriebenen Verfahren werden auch die folgender substituierten 5-Nitroimidazole hergestellt:

5. 4(5)-Äthyl-2-nitroimidazol, Schmelzpunkt 152 bis 154⁰C; Ausbeute = 64%,

6. 4(5)-Propyl-2-nitroimidazol, Schmelzpunkt 140_y 141°C; Ausbeute = 39%,

7. 4(5) - Isopropyl - 2 - nitroimidazol. Schmelzpunk 138/139°C; Ausbeute = 38%.

209638/2

Claims

Patentansprüche: ·

1. Verfahren zur Herstellung von 2-Nitroimidazolen der allgemeinen Formel

NO,

in der R eine niedere Alkylgruppe bedeutet und η eine ganze Zahl von O bis 2 einschließlich bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man ein 2-Aminoimidazol der allgemeinen Formel