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Fermentative Herstellung von Citronensäure Die fermentative Herstellung
von Citronensäure durch Züchten von Sporen von Aspergillus niger auf an Stärke reichen
Medien ist bekannt. Insbesondere ist es auch, z. B. aus der USA.-Patentschrift 2
492 667, bekannt, daß diese Fermentation von der Entwicklung eines eigenen Zellenstoffwechsels
der Gärerreger und dieser Stoffwechsel in hohem Grade von dem Medium abhängig ist,
auf dem die Sporen gezüchtet wurden. Das Problem des Einsatzes von Aspergillus-niger-Sporen,
welche die richtige Art und den richtigen Grad physiologischer Aktivität aufweisen,
wurde bis heute nicht in befriedigender Weise gelöst.
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Es ist zwar bekannt, daß auf synthetischen Nährmedien gezüchtete Sporen
von Aspergillus niger eine gute physiologische Aktivität in bezug auf die Erzeugung
von Citronensäure aufweisen, jedoch fallen die Sporen auf solchen Nährmedien nur
in einer ungenügenden Menge an. Bei der bekannten Verwendung von auf nichtsynthetischen
Medien, wie Weizenkleie, Puffreis, poliertem Reis und Rübenpulpe, gezüchteten Sporen
von Aspergillus niger ergibt sich eine wenig wirksame Bildung von Citronensäure.
Einige weitere nichtsynthetische Nährstoffe weisen Schwierigkeiten wegen der Verunreinigungen
auf, die die aseptische Sporenfortpflanzung stark behindern.
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Es ist weiterhin bekannt, Sporen gewisser Pilze, unter anderem auch
von Aspergillusarten, auf Kleie von Weizen, Roggen, Gerste, Hafer oder Mais unter
Zusatz gewisser Salze zu züchten. Hierbei wird jedoch Weizenkleie als das günstigste
Nährmedium bezeichnet, und als Verwendung für die so gezüchteten Sporen wird nur
die alkoholische Gärung angegeben.
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Die Erfindung besteht in der Verwendung von auf Maiskleie gezüchtetem
Impfgut von Aspergillus niger zur fermentativen Herstellung von Citronensäure und
beruht auf der Feststellung, daß von allen bekannten nichtsynthetischen Nährmedien
gerade Maiskleie als Nährmedium für die Züchtung von Aspergillus-niger-Sporen überraschende
technische Vorteile bietet, wenn diese Sporen als Impfgut zur fermentativen Herstellung
von Citronensäure verwendet werden, während z. B. die zur Züchtung von Sporen für
die alkoholische Gärung besonders empfohlene Weizenkleie für den vorliegenden Zweck
nahezu wertlos ist.
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Es wurde nämlich gefunden, daß Maiskleie, die mit destilliertem Wasser
getränkt, sterilisiert, mit einer Suspension von z. B. auf Schrägagar gezüchteten
Sporen von Aspergillus niger beimpft und beispielsweise 7 bis 14 Tage belüftet wird,
eine sehr gute Ausbeute an Sporen liefert, die alle erwünschten Eigenschaften für
die Citronensäuregärung aufweisen. Diese Sporen ergeben, wenn sie zur Herstellung
von Citronensäure, beispielsweise nach der USA.-Patentschrift 2 492 667, verwendet
wurden, eine wesentlich höhere Produktionsgeschwindigkeit und Ausbeute als Sporen,
die auf anderen Medien gezüchtet sind.
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Das auf Maiskleie gezüchtete Impfgut für die fermentative Herstellung
von Citronensäure kann z. B. folgendermaßen erhalten werden: 1200 g Maiskleie werden
in einem Glaskolben mit 11 destilliertem Wasser gründlich gemischt. Das Gemisch
wird 1,5 bis 2 Stunden im Autoklav unter einem Druck von 1,4 kg/cm2 gehalten, nach
Druckentspannung auf etwas unter 50° C gekühlt und unter sterilen Bedingungen mit
einer Sporensuspension versetzt, die aus ein bis zwei Schrägagar-Kulturen von Aspergillus
niger nach der USA.-Patentschrift 2492667
durch Suspendieren in 200 ml sterilem,
destilliertem Wasser unter Zusatz eines Netzmittels hergestellt ist. Das Gemisch
wird 7 bis 14 Tage bei einer Luftzufuhr von 31/min belüftet.
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Die Entwicklung der Sporen beginnt nach etwa 24 bis 30 Stunden. Während
der ersten 4 oder 5 Tage wird durch das sich in der Kleie entwickelnde Mycel
viel
Wärme erzeugt. Die Wärmeentwicklung läßt mit zunehmender SporenAldung nach. Eine
genügende Sporenbildung kann sich in 7 Tagen entwickeln; es empfiehlt sich jedoch
zur Erzielung einer optimalen Sporenausbeute, das Bebrüten um weitere 7 Tage zu
verlängern. Während -dieser Zeit wird die Temperatur vorzugsweise auf etwa 28 bis
30° C gehalten. Dann werden 121 steriles, destilliertes Wasser zugesetzt, die etwas
Netzmittel enthalten, der Kolben wird geschüttelt und das Impfgut in das Fermentationsgefäß
übergeführt.
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Die überraschend guten Eigenschaften der so gezüchteten Sporen für
die Herstellung von Citronensäure wurden an Hand von Vergleichsversuchen mit auf
anderen Medien gezüchteten Sporen aufgezeigt. In diesen Vergleichsversuchen wurde
die Gärung nach dem in der USA. Patentschrift 2 476158 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die als geeignetes Kontrollmittel - verwendete Zellmorphologie wurde durch makro-
und mikroskopische Untersuchungen ermittelt und die Citronensäure als Monohydrat
durch Titrieren mit 0,1 n-Natronlauge bestimmt.
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Als Impfstoffe dienten bei diesen Vergleichsversuchen Sporensuspensionen
vonAspergillus niger, welche auf Maiskleie, Weizenkleie, Roggenkörnern, Sabaurouds
Schrägagar, poliertem Reis, Rübenpulpe und den als Frühstücksnahrung am Prioritätstage
unter den Markenrämen »Puffed Wheat«- »Kix« und »Cheerios« erhältlichen Getreideerzeugnissen
angesetzt worden waren. Die Sporen wurden mittels Sieben auf einer -Schüttelvorrichtung-
von den Sporulationsmedien getrennt, mit Ausnahme der auf Maiskleie und Wei@ehkleie
gezüchteten Sporen, die nicht von der Kleie getrennt, sondern als Sporen-Kleie-Suspensionen
verwendet wurden. Die verwendete Sporenmenge wurde auf einen Normwert basiert, welcher
durch Abwaschen der Sporen von zwei Agarkulturen und Verdünnung der Suspension auf
100 ml hergestellt wurde. 5 ml dieser Suspension wurden als Normimpfgut für 4000
ml Medium verwendet. Mit Ausnahme der auf Mais- und Weizenkleie gezüchteten Sporen
wurden die Sporensuspensionen auf die gleiche Dichte wie das Normimpfgut gebracht.
Maiskleie und Sporen sowie Weizenkleie und Sporen wurden in Suspensionen übergeführt,
welche je 50 mg Feststoffe je Milliliter enthielten. Man näherte sich der Norm bei
Verwendung von 1,5 ml der Sporen-Kleie-Suspension je 4000 ml Medium.
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Die nachfolgende Tabelle I zeigt vergleichsweise die Wirksamkeit einer
Anzahl von Substraten in Bezug auf die Größe der Sporenernte, Leichtigkeit der Sterilisation
der Sporenernte; Kosten und Marktlage des Substrats und physiologische Aktivität
(bezüglich der Herstellung von Zitronensäure).
| Tabelle I |
| Allgemeine Betrachtungen der Sporulationssubstrate |
| Sporulationssubstrat Sporenernte Sterilisation Kosten und Marktlage
Physiologische |
| Aktivität |
| Sabauroud-Agar ... mittel vollständig hohe Kosten, erhältlich
sehr gut |
| Roggenkörner ..... sehr gut langwierig geringe Kosten,
leicht erhältlich sehr gut |
| und schwierig |
| Rübenpulpe ....... gut vollständig geringe Kosten, erhältlich
sehr schlecht |
| Reis .............. gut vollständig geringe Kosten,
erhältlich schlecht |
| Kix . . . ........... gut vollständig hohe Kosten, erhältlich
sehr schlecht |
| Cheenos .......... gut vollständig hohe Kosten, erhältlich
sehr schlecht |
| Puffweizen ........ gut vollständig hohe Kosten, erhältlich
unsicher |
| Weizenkleie ....... ausgezeichnet vollständig geringe
Kosten, leicht erhältlich unsicher |
| Maiskleie ......... ausgezeichnet vollständig geringe
Kosten, leicht erhältlich sehr gut |
Bezüglich Tabelle I kann hervorgehoben werden, daß Sabauroud-Agar für Laboratoriumsversuche,
wo quantitative Wiederholbarkeit der Resultate wichtig ist, ein gutes Substrat darstellt,
seine Verwendung für die Herstellung in technischem Maßstab im Hinblick auf den
hohen Preis von Agar und die für die Gewinnung der Sporen erforderliche Zeit und
Einrichtungen kaum tragbar erscheint.
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Roggenkörner sind billig, leicht erhältlich und ergeben ausgezeichnete
Sporenbildung. Die Gewinnung der Sporen ist jedoch etwas schwierig, da diese vor
der Herstellung einer Suspension zur Impfung von den Roggenkörnern getrennt werden
müssen. Ein weiterer Nachteil dieses Substrats liegt darin, daß die Dauer und die
Temperatur, welche für die Sterilisation benötigt werden, die Körner auch verkohlen
läßt, was eine unwirtschaftliche Sporenbildung zur Folge hat. Rübenpulpe, Reis,
Kix, Cheerios, Puffweizen und Weizenkleie erfüllen ebenfalls nicht die praktischen
Anforderungen an ein wirtschaftlich befriedigendes Substrat wegen hoher Kosten und
bzw. oder unsicherer oder schlechter physiologischer Aktivität.
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Maiskleie erfüllte dagegen alle Anforderungen durch ertragreiche Ernten
von Sporen, welche sich zu einem stark Säure produzierenden Mycel entwickelten.
Maiskleie ist billig, leicht erhältlich, kann rasch und vollständig sterilisiert
werden, und die Sporen müssen nachher nicht von der Kleie getrennt werden, bevor
sie als Impfgut für eine Gärung verwendet werden.
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Zur Ermittlung der Citronensäure produzierenden Aktivität des Mycels,
welches aus den Sporen der verschiedenen in Tabelle 1 aufgeführten Substrate gewonnen
wurde, verwendete man diese Sporen als Impfgut für Gärmedien, deren Kohlenhydratgehalt
sich
aus Maiszuckerraffinade, Rohrzucker, High-test-Melasse zusammensetzte. Unter High-test-Melasse
soll hier Rohrzuckersaft verstanden werden, der aus etwa 78% Gesamtzucker besteht,
von dem 250/0 auf Rohrzucker und 53 % auf Invertzucker entfallen, und wegen der
Zollbestimmungen nicht weniger als 6'% feste Nichtzuckerstoffe enthält. Raffinierte
Zucker wurden wegen ihres geringen Gehaltes an unerwünschten Spurenelementen verwendet.
Die Bedingungen bei diesen Versuchen waren derart, daß Sporen, welche sich in diesen
Gärmitteln nicht zu guten säurebildenden Pilzen entwickelten, dies auch in weniger
reinen Zuckerlösungen nicht tun würden.
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Die nachfolgende Tabelle II zeigt die Citronensäureproduktion, welche
durch Impfung von raffinierten Zuckern mit Sporenkulturen, welche auf verschiedenen
Sporulationsmedien gezüchtet worden waren, und nachfolgender Gärung erzielt wurde.
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Tabelle II Bewertung von Aspergillus-niger-Sporen-Impfgut, welches
auf verschiedenen Sporulationsmedien gezüchtet wurde, auf Grund der Citronensäureproduktion
| Sporulationsmedium 1 Gärmedium Total Säure |
| 1 g/41 |
| Sabauroud-Agar Maiszucker 359 |
| Roggenkorn .... Maiszucker 420 |
| Rohrzucker 399 |
| Maiskleie ...... Maiszucker 554 |
| Rohrzucker 343 |
| Rübenpulpe .... High-test-Melasse 0 |
| Reis ........... Maiszucker 195 |
| Kix ............ Maiszucker 134 |
| Cheerios ....... Maiszucker 0 |
| Puffweizen ..:.. Maiszucker 0 |
| Rohrzucker 0 |
| Weizenkleie .... High-test-Melasse 0 |
Von den neun oben angeführten Sporulationsmedien ergaben nur Sabauroud-Agar, Roggenkorn
und Maiskleie Sporen, welche sich in den verwendeten Substraten zu typischen Mycelen
mit dem für die Säureherstellung geeigneten Zellenstoffwechsel entwickelten.
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Reis und Kix ergaben Sporen, deren Pilze Citronensäure in Mengen erzeugten,
welche weit unter denjenigen von Sabauroud-Agar lagen.
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Rübenpulpe, Weizenkleie sowie Cheerios und Puffweizen ergaben Sporen,
aus denen sich Pilze entwickelten, deren Stoffwechsel ungeeignet war.
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Zur weiteren Bewertung von aus Maiskleie gezüchteten Sporen wurde
ein Vergleich mit auf Sabauroud-Agar und Roggenkorn gezüchteten Sporen bezüglich
deren Eigenschaften zur Erzeugung von Citronensäure aus drei verschiedenen Substraten
angestellt: 1. Entkationisierter Maiszucker Nr. 70; 2. Entkationisierte High-test-Melasse;
3. Rohrzuckerraffinade. Die Citronensäureausbeuten von den verschiedenen Substraten
unter Verwendung von auf den drei obengenannten Sporulationsmedien gezüchteten Sporen
sind in der nachfolgenden Tabelle III aufgeführt.
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Tabelle III Vergleich von auf Sabauroud-Agar, Roggenkorn und Maiskleie
gewonnenen Sporen auf Grund der Citronensäureproduktion aus Maiszucker Nr. 70, High-test-Melasse
und Rohrzuckersubstrat
| Umwandlung von |
| Impfgut Gärsubstrat Kohlenhydrat in |
| Citronensäure ) |
| (0/0) |
| Sporen aus Sa- |
| bauroud-Agar entkationisierter |
| Maiszucker 72,2(2) |
| entkationisierte |
| High-test-Melasse 67,4(3) |
| Rohrzucker- |
| raffinade 71,4(4) |
| Sporen aus |
| Reiskörnern . . entkationisierter |
| Maiszucker 78,3(2) |
| entkationisierte |
| High-test Melasse 69,2(2) |
| Rohrzucker- |
| raffmade 66,1 (2) 75,2 (1) |
| Sporen aus |
| Maiskleie .... entkationisierter |
| Maiszucker 86,3(2) |
| entkationisierte |
| High-test-Melasse 81,0(4) |
| Rohrzucker- |
| Raffinade 71,7 (1) 70,1(2) |
| *) Mittlere Werte. Die Zahlen in Klammern geben die das |
| Mittel bildende Anzahl Gärprozesse. |
Die überlegenheit des Impfgutes, welches aus auf Maiskleie gezüchteten Sporen zubereitet
wurde, gegenüber dem, welches aus auf Roggenkorn oder Sabauroud-Agar gezüchteten
Sporen zubereitet wurde, zeigt sich bei einem Vergleich der Säureausbeute aus den
drei verschiedenen Substraten.
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Es wurde ferner festgestellt, daß die Fermentation mit Maiskleiesporen
einen höheren anfänglichen Zuckergehalt zuließ, da die Säurebildung schneller erfolgte,
wodurch bei der gleichen Fermentation mehr Zucker vergoren werden konnte als bei
der Fermentation mit Roggenkornsporen mit geringerem anfänglichem Zuckergehalt.
Ferner wurde festgestellt, daß der Wirkungsgrad der Citronensäurebildung bei der
Fermentation unter Verwendung von entkationisiertem hochgrädigem Zuckersirup bei
Anwendung von auf Maiskleie gezogenen Sporen wesentlich verbessert wird. Da ferner
die Sporen nicht von der Kleie getrennt zu werden brauchen, gestattet das beschriebene
Verfahren, die gesamte Sporenentwicklung und die Impfung unter streng aseptischen
Bedingungen durchzuführen.