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Verfahren zur Reinigung von Heparin nach der Chromatographischen Methode
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Reinigen von rohen Heparinprodukten und
zum weiteren Reinigen von reinen Heparinprodukten.
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Die reinen Heparinprodukte, die üblicherweise auf dem Markt erhältlich
sind, haben einen Titer von 100 bis 120 U/mg, selten erreichen sie einen Titer von
130 bis 135 U/mg. Daneben enthalten einige dieser Produkte Spuren von Nucleinsäuren
(mehr oder weniger verändert durch Reinigungs- und Entfärbungsprozesse), die auch
für die Viskosität veranrtwortlich sind, die die konzentrierten Heparinlösungen
oft zeigen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren besteht aus einer chromatographischen
Behandlung von Heparin mit einem anionischen Harz des Cellulosetyps der allgemeinen
Formel
in der Cellulose für den Celluloseträgerstoff steht, R,, AZ und R3 H oder Alkylreste
mit 1 bis 4 C-Atomen und R4 -CH, oder -CH, bedeuten und X OH oder
einen Säurerest (-Cl, -Br oder SO"H) darstellt.
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Das vorliegende Verfahren führt zu Produkten mit einem Titer, der
höher ist als der, wie er bei den üblicherweise gereinigten Produkten gefunden wurde,
und diese Produkte sind frei von Verunreinigungen, wie Nucleinsäuren und restlichen
färbenden Substanzen, die nicht leicht durch andere Methoden abzutrennen sind.
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Vorversuche sind in dieser Richtung gemacht worden, wenn auch unter
verschiedenen Bedingungen und unter Verwendung verschiedener Techniken und Materialien,
jedoch haben sie alle zu unbefriedigenden Ergebnissen geführt.
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Für diesen Zweck sind verschiedene Harze brauchbar; tatsächlich adsorbiert
jedes anionische Harz Heparin leicht. Jedoch ist die Adsorptionsfähigkeit mit anionischen
Harzen des Cellulosetyps höher (Triäthylaminoäthylcellulose oder Diäthylaminoäthylcellutose).
Insbesondere wurde Diäthylaminoäthylcellulose wegen ihrer vergleichsweise hohen
Beständigkeit und ihres hohen Adsorptionsvermögens gewählt, tatsächlich können 10
g Diäthylaminoäthylcellulose, die eine Austauschkapazität von 0,70 bis 0,95 meq/g
besitzen, 1,5 bis 2,5 g Heparin adsorbieren. Die leichte Erhältlichkeit dieses Harzes
auf dem Markt war ein weiterer Grund für seine Auswahl. Geht man von reinem Heparin
aus (110 bis 120 U/ mg), so erhält man Fraktionen mit 160 bis 180 U/mg und solche
mit 25 bis 50 U/mg. Die Gesamtausbeute der antikoagulierenden Aktivität wurde mit
75 bis 100 °/o gefunden, die Ausbeute an aktiverer Fraktion erreichte Werte von
65 bis 85 °/o der Gesamtaktivität des Ausgangsmaterials.
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Aus Roh-Heparin 20 bis 65 U/mg wurden Fraktionen mit 110 bis 130 U/mg
und Fraktionen mit 8 bis 15 U/mg erhalten. Die Gesamtausbeute der antikoagulierenden
Aktivität wurde mit 80 bis 950/,
gefunden, die Ausbeute an aktiverer Fraktion
erreichte Werte von 70 bis 800/, der Gesamtaktivität des Ausgangsmaterials.
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Zwei verschiedene Techniken wurden angewendet: 1. Kolonnen- oder Säulenadsorption
und Eluierung, 2. Adsorption unter Rühren und Eluierung (Batchprozeß).
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Beide Techniken können sowohl für die weitere Reinigung der reinen
Produkte, die üblicherweise therapeutisch verwendet werden (110 bis 120 U/mg), wie
auch für die Reinigung von Rohprodukten (20 bis 65 U/mg) angewendet werden; für
letzteren Zweck ist jedoch die zweite Art der Techniken (Batchprozeß) ratsamer,
weil im allgemeinen die Mengen an zu reinigenden Rohprodukten beträchtlich sind
und dabei die erste Technik (Kolonnenadsorption) verschiedene Schwierigkeiten bereiten
würde. Bei Verwendung der zweiten Art der Techniken können große Mengen an Rohprodukten
aufbereitet werden und man erhält dabei ein reines Heparin vom Titer 110 bis 130
U/mg. Dieses Produkt kann dann mit Hilfe der Kolonnenadsorption bis zu einem Titer
von 160 bis 180 U/mg gereinigt werden.
Wie zuvor dargelegt,
wird aus den Rohprodukten eine Fraktion mit niedriger antikoagulierender Aktivität
(8 bis 15 U/mg) erhalten. Diese Fraktion behält oftmals eine bemerkenswerte »Clearing«-Aktivität.
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Es folgt nun eine kurze Beschreibung der chromatographischen Vorgänge:
Rohes oder reines Heparin wird in einer Pufferlösung beim pH 5,5 bis 8,5 in Mengen
von 10 bis 20 mg/ccm gelöst. Das puffernde Salz ist in der Pufferlösung mit einer
Konzentration von nicht höher als 0,2n enthalten.
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Heparin wird von einem anionischen Celluloseharz, vorzugsweise Diäthylaminoäthylcellulose,
adsorbiert, welche vorher beim selben pH wie die Ausgangsmenge gepuffert wurde.
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Die Gewichtsmenge an zu verwendendem Harz beträgt fünf- bis zwölfmal
soviel wie das zu adsorbierende Produkt. Nach Beendigung der Adsorption wird das
Harz, welches jetzt die gesamte Antikoagulanzaktivität des Ausgangsmaterials enthält,
mit etwas Adsorptionspufferlösung gewaschen. Dann folgt die erste Eluierung mit
einer Salzlösung geeigneter Konzentration.
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In der Regel hat - falls das Salz einer starken Säure verwendet wird
(z. B. Chlorid, Bromid, Sulfat, Nitrat u. dgl.) - die Konzentration der Eluierlösung
für diese erste Eluierung 0,4 bis 0,5n und gegebenenfalls darüber, aber weniger
als 0,8n zu sein; wird jedoch ein Salz einer schwachen Säure (Acetat, Formiat, Borat,
Sulfit od. dgl.) verwendet, so muß die Konzentration der Eluierlösung 0,5 bis 0,7n
und gegebenenfalls darüber, aber weniger als 0,9n betragen. Das Eluat enthält eine
Heparinfraktion mit geringer antikoagulierender Aktivität (25 bis 50 U/mg).
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Für die zweite Eluierung können Salze von starken Säuren einer Konzentration
von nicht über 1,3n, vorzugsweise 1,0 bis 1,2n, verwendet werden. Statt dessen können
auch Salzlösungen von schwachen Säuren einer Konzentration von nicht über 1,8n,
vorzugsweise von 1,5 bis 1,7n*), verwendet werden. Das Eluat enthält eine Heparinfraktion
mit einer hohen antikoagulierenden Aktivität (160 bis 180 U/mg).
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Wenn die Kolonnenadsorption und Eluierung angewendet wird, wird das
Harz zuerst beim pH 5,5 bis 8,5 mit einer Pufferlösung gepuffert, die eine Salzkonzentration
von nicht über 0,2n enthält. Das Harz wird dann so in die Kolonne gefüllt, daß seine
Schichtdicke nicht unter 7 cm beträgt.
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Das Ausgangsprodukt wird in derselben Pufferlösung gelöst, die zum
Puffern des Harzes dient, dann läßt man die Lösung durch die Harzsäule rieseln,
die anschließend mit weiterer Adsorptionspufferlösung gewaschen wird. Auf diese
Weise wird die gesamte antikoagulierende Aktivität des Ausgangsproduktes durch das
Harz zurückgehalten.
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Die Eluierung wird dann mit einer für die erste Eluierung verwendeten
Pufferlösung ausgeführt und das Eluat mit folgendem versetzt: 1,0 bis 1,5 Volumteilen
Aceton, 1,2 bis 1,7 Volumteile 95o/oiger Äthyl-') Salze mit einwertigem Anion
werden im allgemeinen verwendet (z. B. NaCI, CH,COONa u. dgl.), der Ausdruck »Molarkonzentrationw
ist dem Ausdruck »Normalkonzentratione äquivalent und wird oftmals an dessen Stelle
gebraucht. In dem Falle, wenn Salze mit mehrwertigem Anion verwendet werden (z.
B. NaaHP04, KH.P04, NaHS04 u. dgl.), wird die Konzentration auf »Normale-Basis ausgedrückt,
die Wertigkeit des Anions ist bei der Kalkulation in Betracht zu ziehen. alkohol
oder 2 bis 3 Volumteile Methylalkohol. Die erste Heparinfraktion mit niederem Titer
ist auf diese Weise ausgefällt.
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Eine andere Eluierung wird anschließend mit der Pufferlösung für die
zweite Eluierung ausgeführt, und das Eluat wird mit folgendem versetzt: 0,7 bis
1.0 Volumteile Aceton, 1,0 bis 1,2 Volumteile 95o/oiger Äthylalkohol oder 2 bis
3 Volumteile Methylalkohol. Auf diese Weise wird eine Heparinfraktion mit höherem
Titer (160 bis 180 U/mg) gefällt.
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Bei Gebrauch der Adsorption unter Rühren (Batch-Adsorption) ist es
ratsam, zwei Adsorptionen vorzunehmen, indem man für jede der beiden die Hälfte
der insgesamt zu verwendenden Harzmengen verwendet (nämlich auf 1 g Ausgangsmaterial
für die erste Adsorption 3 bis 5 g Harz und für die zweite Adsorption ebensoviel).
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Jede Adsorption dauert 30 Minuten, und daran schließt sich eine Filtrierung
durch einen Büchnertrichter an.
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Üblicherweise wird das Harz zweimal mit der Adsorptionspufferlösung
gewaschen, um so die inaktive Mutterlauge zu entfernen.
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Die erste Eluierung wird ausgeführt und dann zweimal mit dem gewählten
Eluiermittel wiederholt, 30 Minuten gerührt und jeweils über den Büchnertrichter
filtriert.
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Der wenig aktive Heparinteil ist auf diese Weise aus dem Harz entfernt
und kann durch die oben beschriebene Ausfällung erhalten werden (Titer: 6 bis 15
U/mg).
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Die zweite Eluierung wird ebenso ausgeführt und zweimal mit dem gewählten
Eluiermittel wiederholt, 30 Minuten gerührt und jeweils durch den Büchnertrichter
filtriert. Die drei Elüate werden vereinigt und in der oben beschriebenen Weise
zwecks Ausfällung behandelt. Auf diese Weise wird der aktivere Teil, der im Ausgangsmaterial
enthalten ist, ausgefällt, die Niederschläge werden durch Filtrieren oder Zentrifugieren
gesammelt, mit wasserfreiem Methanol, Äthanol oder Äthyläther gewaschen und zum
Schluß im Vakuum getrocknet (Titer: 110 bis 130 U/mg).
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Die soeben beschriebene Technik zieht man zur Reinigung von Rohprodukten
vor. In dem Falle sind die aktiven Eluate oftmals dunkelbraun, und das Endprodukt
zeigt einen dunklen Farbton. Um einen wesentlichen Teil der gefärbten Substanz zu
eliminieren, kann der Niederschlag in Wasser oder lo/oiger NaCI-Lösung gelöst, der
pH-Wert - falls erforderlich - auf 7,0 bis 9,5 eingestellt und die anfallende Lösung
mit Aktivkohle und einem Filterhilfsmittel behandelt werden. Der Aktivitätsverlust
während des ersten Bleichprozesses ist - falls er innerhalb der genannten pH-Werte
ausgeführt wird - nicht hoch.
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Die endgültige Entfärbung muß jedoch durch eine der üblichen Oxydationsmethoden
(mit H,02, KMn04, NaC10 u. dgl.) vervollständigt werden; diese Entfärbung gehört
jedoch nicht zum Gegenstand der Erfindung. Beispiel 1 1 g Heparin (Titer: 110 U/mg)
wird in 100 ccm einer O,lmolaren Acetatlösung, die dieselbe Menge NaCI-Lösung enthält,
beim pH 6,2 gelöst. Dann füllt man eine Säule (Durchmesser: 24 mm) mit 7 g Diäthylaminoäthylcellulose
(Austauschkapazität: 0,95 meq/g), die beim pH 6;2 mit derselben Pufferlösung angepuffert
ist, wie sie zum Lösen des Heparins
verwendet wurde. Die so entstandene
Harzschicht ist 8,5 cm dick. Durch sie läßt man die Heparinlösung hindurchperkolieren
und schließt zwei Waschungen mit je 50 ccm Pufferlösung an. Die erste Eluierung
wird mit 0,5molarer NaCl-Lösung ausgeführt, um so die weniger aktiven Fraktionen
und die Spuren von Nucleinsäuren zu entfernen; danach folgt eine zweite Eluierung
mit 1,2molarer NaCl-Lösung. Man erhält insgesamt 180 ccm Eluat und fällt durch Zusatz
von 1,2 Volumteilen 95°/oigem Äthanol. Nach dem Stehen über Nacht bei Zimmertemperatur
sammelt man den Niederschlag durch Zentrifugieren, wäscht zweimal mit einerkleinenMengeMethanolundtrocknetimVakuum:
Man erhält 560 mg Heparin mit einem Titer von 165 U/mg, die Rückgewinnung der Aktivität
beträgt 85 °/a. Die weniger aktive Fraktion hat einen Titer von 35 U/mg. Beispiel
2 20g Rohheparin (Titer: 60U/mg) werden in 1000 ccm einer O,lmolaren Acetatpufferlösung,
die dieselbe molare Menge an NaCl enthält, beim pH 6,0 gelöst. Diäthylaminoäthylcellulose
wird in zwei getrennten Mengen zu je 60 g beim pH 6,0 mit derselben Pufferlösung,
die zum Lösen des Heparins diente, gepuffert. Die erste Adsorption wird mit der
einen Hälfte des gepufferten Harzes ausgeführt: - Nach 30 Minuten langem Rühren
bei Zimmertemperatur wird das Harz auf dem Büchnertrichter abgetrennt. Man unterwirft
das Filtrat einer zweiten Adsorption mit dem zweiten Teil des gepufferten Harzes
und rührt wiederum 30 Minuten bei Zimmertemperatur. Anschließend filtriert man,
vereinigt die beiden Harze, wäscht zweimal mit je 1200 ccm Pufferlösung und filtriert
über einen Büchnertrichter.
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Das Harz, das jetzt die gesamte antikoagulierende Aktivität des Ausgangsmaterials
enthält, wird dreimal mit 1200 ccm einer 0,5molaren NaCl-Lösung eluiert, jeweils
30 Minuten gerührt und filtriert. Die drei Eluate werden mit 1,5 Volumteilen Aceton
versetzt, den entstandenen Niederschlag läßt man einige Stunden stehen, sammelt
ihn durch Zentrifugieren, wäscht mit Methanol und trocknet im Vakuum. Das erhaltene
Produkt besitzt eine sehr geringe antikoagulierende Aktivität (9 U/mg) und eine
beträchtliche »Clearing«-Aktivität.
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Dann wird das Harz dreimal mit 1200 ccm 1,2molarer NaCI-Lösung eluiert,
30 Minuten gerührt und jeweils filtriert. Die vereinigten Eluate fällt man durch
Zusatz von 1 Volumteil Aceton, läßt den entstandenen Niederschlag über Nacht stehen,
zentrifugiert, wäscht mit Methanol und trocknet im Vakuum. Das anfallende Produkt
ist dunkel gefärbt. Man löst es daher in 300 ccm destilliertem Wasser und bringt
die Lösung durch Zusatz von 0,1 n-N&OH-Lösung auf ein pH von 7,8. Dann fügt
man 20 g ,Aktivkohle und 50 g eines Filterhilfsmittels (Hylfo-Supercel) zu und filtriert
mehrmals. Man erhält eine leicht gelbbraungefärbte Lösung. Durch Zusatz von NaCl
bringt man dessen Konzentration auf 10/, und fällt anschließend mit 1,2 Volumteilen
Äthanol.
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Es werden erhalten 7,9 g Heparin vom Titer 125 U/mg, dessen antikosgulierende
Aktivität bei etwa 80 °/o liegt.
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Beispiel 3 1,4 g Heparin (Titer: 108 U/mg) werden in 100 ccm 0,05molarer
Phosphatlösung, die 0,1 Mol CH3COONa enthält und ein pH von 7,0 zeigt, gelöst. Dann
füllt man eine Säule (Durchmesser: 30 mm) mit 13 g Diäthylaminoäthylcellulose (Austauschkapazität:
0,80 meq/g), die beim pH 7,0 mit der zuvor genannten Pufferlösung, die zum Lösen
des Heparins diente, gepuffert worden ist. Die Dicke der Harzschicht in der Säule
beträgt 10 cm. Durch sie läßt man die Heparinlösung langsam hindurchsickern und
wäscht zweimal mit je 80 ccm der obengenannten Pufferlösung. Die erste Eluierung
nimmt man mit 0,7molarer Natriumacetatlösung vor und fällt aus dem Eluat durch Zusatz
von 1,2 Volumteilen 95°/oigem Äthanol einen Niederschlag. Nach dem Trocknen zeigt
diese Fraktion einen Titer von 30 U/mg. Die zweite Eluierung wird mit einer 1,7molaren
Natriumacetatlösung durchgeführt. Dann versetzt man das Eluat mit 1 Volumteil 95°/oigem
Äthanol, zentrifugiert, wäscht mit Äthanol und Äthyläther und trocknet im Vakuum.
Man erhält 680 mg Heparin mit einem Titer von 172 U/mg, dessen antikoagulierende
Aktivität 77,3 % beträgt. Beispiel 4 15g rohes Heparin (Titer: 48 U/mg) werden
in 600 ccm 0,1 Mol Acetatpufferlösung pH 6, die 0,1 Mol NaCI enthält, gelöst. Es
werden 90 g TEAE-Cellulose vorbereitet, die bei pH 6 mit dem gleichen Puffer, der
bei der Heparinlösung verwendet wird, behandelt werden.
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Zunächst wird eine Adsorption mit der Hälfte der Harzmenge unter 30
Minuten Rührung und bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach der Filtrierung auf dem
Büchertrichter wird die Lösung einer zweiten -Adsorption mit der anderen Hälfte
des gepufferten Harzes unterworfen, wobei 30 Minuten gerührt und bei Raumtemperatur
gearbeitet wird. Nach der Filtrierung wird das Harz mit der ersten Hälfte zusammengemischt
und zweimal mit dem Adsorptionspuffer (jedesmal 900 ccm) gewaschen. Nach der Filtrierung
auf dem Büchnertrichter wird das Harz, das noch die gleiche antikoagulierende Aktivität
des Ausgangsproduktes aufweist, die dreimal mit 900 ccm einer 0,5molaren KCl-Lösung
eluiert, wobei 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und jedesmal abgefiltert wird.
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Die drei Eluate werden vereinigt und mit 3 Volumen Methanol behandelt.
Der Niederschlag wird nach einigen Stunden Stehen zentrifugiert, mit Methanol gewaschen
und in der Trockne eingeengt. Das Produkt hat eine sehr niedrige (6 U/mg) antikoagluierende
Wirkung.
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Das Harz wird noch dreimal mit 900 ccm einer KCl-Lösung 1,1 Mol unter30
MinutenRührungeluiert und jedesmal abgefiltert. Die vereinigten Eluate werden mit
3 Volumen Methanol gefällt. Der Niederschlag wird nach einer Nacht Stehen zentrifugiert,
mit Alkohol gewaschen und in der Trocknung eingeengt. Der Titer ist 125 U/mg.
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Die Ausbeute ist 4,6 g gereingtes Heparin. Die Rückgewinnung der Aktivität
beträgt etwa 800/,.