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Verfahren zur Herstellung von Abbauprodukten des Vitamin B12-Faktors
III Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Abbauprodukten
des Vitamin-Bl2-Faktors III durch hydrolytische Prozesse, wobei neue, bisher noch
nicht beschriebene chemische Produkte erhalten werden, die niedermolekular sind
und im ultravioletten Spektralbereich stark absorbieren.
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Unter den verschiedenen natürlichen Vitaminen der Bl2-Gruppe besitzen
nur das Vitamin B12 selbst und der von der Anmelderin aufgefundene Vitamin-Bl2-Faktor
III antiperniciöse Wirksamkeit. Außerdem konnte die Anmelderin auf biosynthetischem
Weg zu neuen Vitamin-Bl2-Arten gelangen, die antiperniciös wirksam sind und in der
Natur noch nicht aufgefunden wurden. Die Herstellung neuer biosynthetischer Cobalamine
ist insofern bedeutungsvoll, als solche Produkte eventuell zusätzliche besonders
wertyolle therapeutische Eigenschaften besitze-l können.
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Die Biosynthese von Cobalaminen besteht darin, daß unter der Einwirkung
von Fermenten, die z. B. in E. coli vorhanden sind, an Ätiocobalamin ein Nucleotid
angelagert- wird. Die Synthese des betreffenden Nucleotids wird von E. coli bewerkstelligt,
wenn man ihm die entsprechende Base anbietet. Auf diese Weise gelangte die Anmelderin
zu verschiedenen Benzimidazol-cobalaminen, wodurch manche Benzimidazole als »precursors«
von besonderer Bedeutung für die Herstellung. neuer Cobalamine wurden.
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Diese Ausführungen machen es verständlich, daß der Herstellung von
Abbauprodukten des Vitamin-Bl2-Faktors III, die die betreffende Base enthalten,
die
Base selbst vorstellen oder Abbauprodukte der Base sind, eine beträchtliche Bedeutung
beizumessen ist. Die Kenntnis und Gewinnung solcher Abbauprodukte, für die ein starkes
Absorptionsvermögen im ultravioletten Bereich charakteristisch ist, bietet die Möglichkeit
zur Biosynthese nicht nur des Vitamin-Bl2-Faktors III, sondern eventuell noch anderer
neuartiger und wertvoller Cobalamine.
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Es-wurde nun die überraschende Beobachtung gemacht, daß aus dem Vitamin-B12-Faktor
III durch Einwirkung konzentrierter Salzsäure bzw. konzentrierter wäßfiger Lösungen
von Perchlorsäure (z. B.
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70%iger) im Temperaturbereich von o bis 37° im Laufe von einigen Stunden
in praktisch quantitativer Ausbeute Ätiocobalamin gebildet wird unter gleichzeitiger
Freisetzung eines Nucleotids, das nachfolgend als »Nucleotid des Vitamin-Bl2-Faktors
III« bezeichnet wird. Bei längerer Einwirkung der genannten Agenzien auf den Vitariin-B12-Faktor
III bleibt die Ausbeute an Nucleotid des Vitamin-Bl2-Faktors III praktisch konstant;
die Ausbeute an Ätiocobalamin sinkt jedoch unter gleichzeitiger Bildung eines neuen
kobalthaltigen Abbauproduktes, das die Anmelderin »Faktor 1 a« nennt. Der Faktor
1 a läßt sich durch sein Absorptionsspektrum sowie durch sein elektrophoretisches
Verhalten vom Ätiocobalamin nicht unterscheiden, wohl aber sind die R-Werte und
die Coli-Aktivität der beiden Faktoren verschieden (vgl.
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Tabelle I).
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Zur Gewinnung dieser beiden Produkte aus dem Vitamin-B12-Faktor III
wird das in der oben erwähnten Weise hergestellte Hydrolysat-nach Entfernen der
Salzsäure im Vakuum bzw. nach Abneutralisieren mit Kalilauge in Form eines Trockenpräparates
(z. B. nach dem Aufnehmen in Kieselgur und Trocknen im Vakuum) auf die Zellulosepulversäule
gebracht; anschließend wird mit cyanidhaltigem wassergesättigtem n-Butanol entwickelt.
Wie die Tabelle 1 zeigt, führt die Salzsäurehydrolyse unter anderem zur Bildung
geringer Mengen an Ätiocobalamincarbonsäuren, die beim Perchlorsäureabbau nicht
entstehen.
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Die Unterschiede in den R-Werten der in der Tabelle I angeführten
Cobalamine sind der bremsenden Wirkung des Kaliumperchlorates zuzuschreiben.
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Die Spaltung des Vitamin-Bl2-Faktors III unter den oben angeführten
Bedingungen geht z. B. bei 23° sehr rasch vor sich und ist bereits nach 2 Stunden
völlig beendet. Die Ausbeute an Ätiocobalamin erreicht bereits nach 1112 Stunden
das Maximum, um dann allmählich abzusinken. Die Ausbeute an Faktor Ia ist in den
ersten 2 Stunden gering, steigt aber im Laufe von einigen Stunden beträchtlich an.
Der Faktor 1 a entsteht offenbar aus dem Ätiocobalamin, wie der ganze Reaktionsverlauf
zeigt.
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Die Trennung des Nucleotids des Vitamin-Bl2-Faktors III von den farbigen
Komponenten der Hydrolysate gelingt erfindungsgemäß durch die neuartige und sehr
wichtige Beobachtung, daß gewisse stark basische Anionenaustauscher, wie z. B. Dowex-I,
Dowex-2 ud Amberlite JRA-400 (alle drei sind Polystyrolharze, enthalten quaternäre
Ammoniumgruppen) in der Chlorid- bzw. Formiatform das Nucleotid des Vitamin-Bl2-Faktors
III aus neutralen bzw. schwach alkalischen wäßrigen Lösungen gut adsorbieren, wobei
gleichzeitig die kobalthaltigen Anteile sich leicht mit Wasser auswaschen lassen.
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Nach Waschen der Säule mit Wasser, wobei außer den Cobalaminen auch
Salze-entfernt werden, läßt sich das Nucleotid des Vitamin-Bl2-Faktors III bereits
mit 0,002 n-HCl leicht eluieren. Es ist jedoch zweckmäßiger, etwas stärkere, z.
B. 0, OI n-Salzsäure zu verwenden, um das Volumen des Eluates klein zu halten. Die
hierbei erhältliche Elutionskurve ist symmetrisch, woraus zu entnehmen ist, daß
das Nucleotid des Vitamin-Bl2-Faktors III einheitlich ist.
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Es wurde weiterhin gefunden, daß gewisse carboxylhaltige Kationenaustauscher,
wie z. B. Amberlite JRG-5o-H+ (carboxylhaltiges Acrylsäureharz) das Nucleotid des
Vitamin-Bl2-Faktors III nicht adsorbieren, sehr stark aber die Cobalamine. Durch
aufeinanderfolgende Chromatographie des Nucleotids des Faktors III, z. B. an Dowex-2-HCl,
Amberlite JRC-50-H+ und wieder Dowex-2-HCl läßt sich das Nucleotid in sehr reiner
Form darstellen. Die Elution kann mittels eines Spektrophotometers -verfolgt werden,
da das Nucleotid des Faktors III im UV-Bereich stark absorbiert. Nach Einengen der
Eluate zur Trockne, Aufnehmen des Rückstandes in sehr wenig Wasser und Zusatz von
Aceton fällt das Nucleotid des Yitanim-B12-Faktors III gummiartig aus und wird nach
Entfernen der Lösungsmittel und Trocknen im Vakuum bald fest. Es besitzt im UV charakteristische
Absorptionsmaxima, und zwar in 0, OI n-HCl und 289,5 mµ e1 cm1% 139,5, bei PH etwa
8,2 in Wasser und 291,5 mµ E1 cm 1% 107,2 bei 248,5 m,z E 11,9, 166,2.
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Es enthält Phosphat und gibt eine stark positive Reaktion auf Zucker.
Aus dem prozentuellen Phosphatgehalt des Nucleotids läßt sich ein Molekulargewicht
von etwa I490 für den Vitamin-Bl2-Faktor III berechnen.
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Der Abbau des Nucleotids des Vitamin-Bl2-Faktors III mit 6 n-HCl
bei 100° geht sehr langsam vor sich, und es werden in 24 Stunden erst etwa 65 01o
der Phosphorsäure freigesetzt. Es entsteht dabei ein basisches Produkt, das folgende
Absorptionsmerkmale besitzt: in 0, OI n-HCl Maxima bei 289 und 252 mµ, Minima bei
268 und 238 my, bei PE 8,2 in Wasser Maxima bei 29I und 249 my, Minima bei 270 und
233 ms.
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Diese basische Substanz, die vorläufig als »Abbauprodukt II« bezeichnet
wird, wird in folgender Weise in reinem Zustand erhalten: Einengen des Hydrolysats
im Vakuum, Entfernen der HC1 über Ätznatron, Aufnehmen des Rückstandes in Wasser,
Alkalisieren auf PH 7,5 bis 8,2, Durchlassen dieser Lösung durch eine Säule aus
Dowex-2-HCl und Eluieren mit Wasser, wobei das Produkt im Eluat erscheint.
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Der Abbau des Nucleotides des Vitamin-Bl2-Faktprs III mit 6 n-HCl
bei 150° geht rasch vor sich, wobei die Phosphorsäure in etwa 3 Stunden quantitativ
freigesetzt wird. Es entsteht dabei ein basisches Produkt, das folgende Merkmale
besitzt: Schmelzpunkt 2I9 bis 2200 (unter Zersetzen, Koffer-Mikroskop); Summenformel
C7H6N2O; Absorptionsdeaten: in 0, OI NHC1 Maximum bei 286 my, Minimum bei 260 mµ,
bie PH etwa 82, in Wsser Msxima bei 286
und 246 mµ, Minima bei 263
und 232 mµ, i 0,1 n-KOH Maximum bei 306mµ, Minimum bei 27I mµ Die Base gibt mit
Millons Phenol-Reagens einen roten Niederschlag und entfärbt in wäßriger Lösung
sofort Permanganat unter praktisch völliger Zerstörung des chromophoren Systems
(Verschwinden der charakteristischen Absorption im UV). -Diese Substanz ist mit
dem Abbauprodukt II nicht identisch. Sie wird vorläufig »Abbauprodukt III« genannt.
Wohl aber ist sie identisch mit der »Komponente avr, die man durch direkten Abbau
des Vitamin-B12-Faltors III erhalten kann, wie weiter unten beschrieben wird.. Die
Reinigung des Abbauproduktes III erfolgt in der gleichen Weise wie die des Abbauproduktes
II.
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Die Gewinnung des Nucleosids des Faktors III gelang überraschenderweise
unter der katalytischen Wirkung von Salzen seltener Erden. Diese Methode wurde bereits
zur Abspaltung esterartig gebundener Phosphorsäure aus gewissen Naturprodukten verwendet;
es war aber keinesfalls vorauszusehen, daß sie im vorliegenden Fall zum Ziel führen
würde. Sie wurde bisher auch noch nicht in der Vitamin-Bl2-Forschung benutzt. Es
wurde gefunden, daß in verdünnten, z. B. 2 Io-6-molaren Lösungen des Nucleotids
des Faktors III bei Verwendung eines 5- bis 20fachen Überschusses an Salzen der
seltenen Erden, wie z. B. an Ce(NO3)3 6H2O bei PH 7,6 bis 9 und Temperaturen von
über 200 unter rascher Abspaltung von Phosphorsäure das Nucleosid des Faktors III
entsteht.
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Zur präparativen Gewinnung dieses Nucleosids wird nach beendeter
Reaktion (nach völliger Abspaltung des Phosphats) die trübe (Cer-hydroxyd enthaltende)
Lösung klar zentrifugiert, durch eine Säule aus z. B. Dowex-2-HCl langsam durchgelassen.
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Dabei wird das Nucleosid festgehalten und dann mit Wasser eluiert.
Nach wiederholter Chromatographie erhält man das Nucleosid in reiner Form. Das Absorptionsspektrum
des Nucleosids gleicht dem des Nucleotids.
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Bei der Hydrolyse des Vitamin-Bl2-Faktors III mit 6 n-HC.l bei 150°
währen 20 Stunden erhält man zwei im UV-Bereich absorbierende Abbauprodkte, Die
Trennung und Reinigung dieser Abbauprodukte wurde erfindungsgemäß durch die wichtige
Beobachtung ermöglicht, daß nach dem Einengen der Hydrolysate im Vakuum und Trocknen
des Rückstandes, z. B. über Ätznatron und Calziumchlorid, bei der anschließenden
Extraktion mit Wasser oder verdünnter Salzsäure fast sämtliche Farbstoffe zurückbleiben
und nur die im UV absorbierenden Abbauprodukte des Vitamin-Bl2-Faktors III in Lösung
gehen. Die so gewonnenen, leicht rotbraungefärbten Extrakte werden im Vakuum auf
ein kleines Volumen eingeengt, mit etwas Kieselgur vermengt und getrocknet. Durch
systematische Versuche wurde gefunden, daß dadurch Chromatographie dieser so gewonnenen
Trockenpräparate an einer Säule aus Zellulosepulver unter Verwendung von Aceton
+ Wasser bzw. Aceton + verdünnte Salzsäure als Entwickler zwei im UV absorbierende
Komponenten erhältlich sind. Es ist notwendig, zunächst mit fast reinem Aceton zu
entwickeln und die Menge an Wasser bzw. verdünnter Salzsäure allmählich zu steigern.
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Beim Entwickeln mit z. B. Aceton + 5 01o 0,1 n-HCl läßt sich die
schnellere Komponente (von der Anmelderin als » Komponente a« bezeichnet) eluieren.
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Sie ist nach ihrem Absorptionsspektrum und ihrem papierchromatographischen
Verhalten identisch mit dem Abbauprodukt III. Bei weiterer Steigerung des Wassergehaltes
läßt sich z. B. mit Aceton + 15 0Io 0,1 n-HCl das langsamer wandernde Abbauprodukt
(von der Anmelderin »Komponente b« genannt) in reiner Form gewinnen. Die Komponente
b konnte nach mehrmaliger Chromatographie, Einengen und Zusatz von Aceton in kristallisierter
Form erhalten werden. Ihr Absorptionsspektrum besitzt folgende Merkmale: in 0, OI
n-HCl Maxima bei 290 und 255 mµ, Minima be 270 und 248 mµ; bie PH 8,2 in Wasser
Maxima bei 298 und 252 mµ, Minima bei 273 und 244mM-Beispiel I 1,5 mg des Vitamin-Bl2-Faktors
III werden mit 0,1 ccm 70%iger Perchlorsäure versetzt und I2 Stunden bei 23° stehengelassen.
Anschließend wird das Hydrolysat mit etwas Wasser verdünnt, mit 1 Tropfen IO °/Oiger
Blausäure versetzt und mit 0,5 n-K O H bis zum Farbumschlag in Violett titriert
(Verbrauch'etwa 2,4ccm 0,5 n-KOH). Das auf pH 6 bis 7 abneutralisierte Hydrolysat
wird im Vakuum auf 0,1 bis 0,5 ccm eingeengt, in etwas Kieselgur aufgenommen, im
Vakuum getrocknet und auf einer Zellulosesäule chromatorgrphiert. Säulendruchmesser
1,15 cm, Höhe 10 cm. Entwickler; CN-haltiges wassergesättigtes n-Butanol. Während
der Entwicklung des Chrotnatogramms werden an der Säule sehr bald zwei violette
Zonen sichtbar, von denen die untere (vom R-Wert 0,4) das Ätiocobalamin, die obere
(vom R-Wert 0,2) der Faktor 1a ist. Nach dem Eluieren, Extrahieren mit Wasser und
Entfernen des Butanols werden die beiden Faktoren in reiner Form erhalten.
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Beispiel 2 70 mg Vitamin-Bl2-Faktor III werden in 5 ccm 70%iger Perchlorsäure
gelöst und 2 Stunden lang bei 23° stehengelassen. Dann wird das Hydrolysat mit etwas
Wasser verdünnt, mit einigen Tropfen Io°/Oiger Blausäure versetzt und mit 2 n-KOH
bis zum Farbumschlag in Violett titriert (Verbrauch etwa 30 ccm).
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Nach dem Stehenlassen im Kühlraum über Nacht wird das auskristallisierte
Kaliumperchlorat abgetrennt, das Filtrat auf etwa p g eingestellt und durch eine
Säule aus Dowex-2-HCl (Durchmesser 1,15 cm, Höhe 25 cm) durchgelassen, wobei die
gefärbten Abbauprodukte des Vitamin-Bl2-Faktors III die Säule passieren, während
das Nucleotid des Vitamin-Bl2-Faktors III in der Säule festgehalten wird. Nach dem
Waschen der Säule mit Wasser wird das Nucleotid mit 0, OI n-HCl eluiert, das Eluat
im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, d Rückstand in 20 ccm Wasser aufgenommen, auf
pfl etwa 8 eingestellt, die rosagefärbet Lösung durch eine Säule aus amberlite JRC-50-H+
(Durchmesser 1,15cm, Höhe 40 cm)
langsam durchgelassen und die Säule
anschließend mit Wasser nachgewaschen, wobei die Farbstoffe an der Säule festgehalten
werden, während das Nucleotid des Vitamin-B12-Faktors III in Form einer farblosen
Lösung im Durchlauf erscheint. Nach dem Einengen der bei 290 mµ absorbierenden Fraktionen
im Vakuum auf etwa 10 ccm und anschließender Chromatographie an einer Säule (Durchmesser
0,6 cm, Höhe 7 cm) aus Dowex-2-HCl, Einengen der Eluate bis zur Trockne, Aufnehmen
des Rückstandes in I bis 2 Tropfen Wasser und Zusatz von etwas Aceton fällt das
Nucleotid in gurnmiartiger Form aus. Nach Abtrennen der Lösungsmittel erstarrt das
Nucleotid und läßt sich zu einem Pulver zerreiben.
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Beispiel 3 10 ccm eines 0,25 n-Ammoniumchlorid-ammoiak-Puffers vom
PH 8,6, enthaltend etwa 2 # 01-6 Mol Nucleotid des Vitamin-B12-Faktors III und 4
# 10-5Mol Ce(NO3)5. #6 H,O werden bei 50° 100 Minuten lang geschüttelt. Sodann wird
die trübe Flüssigkeit zentrifugiert, das klare Zentrifugat - durch eine Säule aus
Dowex-2-HCl (Durchmesser 0,6 cm, Höhe 7 cm) durchgelassen, wobei das entstandene
Nucleosid an der Säule adsorbiert bleibt. Es wird dann mit Wasser entwickelt, wobei
sich das Nucleosid in den bei 290 m, absorbierenden Fraktionen befindet.
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Beispiel 4 1 me ges Nucleotids des Vitamin-B12-Faktors III wird in
6 ccm 6 n-HCl gelöst und im zugeschmolzenen Glasrohr 3 Stunden auf I50° erhitzt.
Das Hydrolysat wird im Vakuum über Calciumchlorid und Ätznatron getrocknet, der
Rückstand in 2 ccm Wasser aufgenommen, auf pur etwa 8 gebracht und durch eine Säule
aus Dowex-2-HCl (Durchmesser 0,6 cm, Höhe 7 cm) durchlaufen gelassen, wonach die
Säule mit Wasser gewaschen wird. Die bei 286mµ absorbierenden Fraktionen enthalten
das basische Abbauprodukt des Nucleotids- (» Abbauprodukt III «, «"Komponente a
»).
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Beispiel 5 1 mg des Nucleotids des Vitariin-B12-Faktors III wird
in I ccm 6 n-H C1 gelöst und im zugeschmolzenen Glasrohr 30 Stunden auf 1000 erhitzt.
Die Weiterverarbeitung des Hydrolysates erfolgt, wie im Beispiel 4 beschrieben.
Die bei 290 mµ absorbierenden Fraktionen enthalten das basische Abbauprodukt des
Nucleotids (»Abbauprodukt II«).
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Beispiel 6 6o mg Vitamin-B12-Faktor III werden in 5 ccm 6 n-HCl 20
Stunden lang auf 150° erhitzt. Das Hydrolysat wird im Vakuum über Calciumchlorid
und Ätznatron zur Trockne gebracht, der Rückstand mit 5 ccm 0,1 n-HCl verrührt,
durch eine kleine Glassinternutsche G3 filtriert, das Filtrat im Vakuum auf 0,2
bis 0,5 ccm eingeengt, mit etwas Kieselgur vermengt und im Vakuum getrocknet. Das
trockene Kieselgurpräparat wird auf eine Zellulosepulversäule (Durchmesser 1,15
cm, Höhe 20 cm) gebracht. Man entwickelt mit Aceton, das steigende Mengen an 0,1
n-HCl enthält. Mit Aceton + 5 % 0,1 n-HCl wird aus der Säule die basische Komponente
a (identisch mit dem Abbauprodukt III) eluiert, die weitere Entwicklung mit Aceton
+ I5°/o 0,1 n-HCl erigt die saure Komponente b. -Tabelle I Cobalamine aus Vitamin-B12-Fakor
III und Vitamin B12, gewonnen durch Abbau mit konzentrierter Salzsäure bzw. 70%iger
Perchlorsäure bei 230. Perchlorsäurehydrolysate samt den Salzen (Kaliumperchorat)
chromatographiert.
| R-Wert a. d. Zellulosesäule Farbe a. d. Stabilität Elektro- |
| Cobalamin Salzsäure- Perchlor- Coiiaktivität chromato- des
phoreitsches |
| Hydroyse Hydroyse Säure (b) Verhalten |
| Ätiocobalamin-carbon- |
| säure x ................. . 0,01 - inaktiv Violett sehr gering |
| Ätiocobalamin-carbon- |
| säure y ................... 0,04 - inaktiv Violett sehr gering |
| Vitamin-B15-Faktor III 0,1 0,05 aktiv Rot sehr stabil |
| Faktor Ia ............ .0,3 0,2 sehr gering Blauviolett stabiler
als wie Faktor I |
| Ätiocobalamin Faktor I |
| (Faktor I) ................ 0,5. 0,4 aktiv (c) Vilett sehr
gering (c) |
(a) Aktivität gegenüber der E. coli-Mutante 313-3.
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(b) Bei PH 4,5 bis 5 und Zimmertemperatur.
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(c) Ebenso wie das native Produkt aus Faulschlamm.