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Verfahren zur Gewinnung von novobiocin-aktiven Verbindungen
Die Erfindung bezieht sich allgemein auf Verfahren zur Gewinnung von Antibiotika aus Rohlösungen.
Im besonderen betrifft sie ein neues verbessertes Verfahren zur Gewinnung und Konzentrierung von Novobiocin und seinen Analogen aus Fermentationsbrühen, welche gebildetes Novobiocin oder dessen Analoge, Myzel von Mikroorganismen und geeignete Nährmedien enthalten. In einer ihrer speziellen Ausführungformen betrifft die Erfindung die Isolierung von Novobiocin, Dihydronovobiocin und andern NovobiocinAnalogen.
Novobiocin, für das die folgende Strukturformel vorgeschlagen wurde,
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Fermentationsbrühen, rohen Konzentraten, verdünnten Lösungen, Extrakten u. dgl. durch Behandlung mit einem Anionen-Austauschharz und anschliessende Elution der daran adsorbierten novobiocin-aktiven Ver- bindungen gewonnen werden können.
Das erfindungsgemässe Verfahren besitzt gegenüber den bekannten Methoden zur Gewinnung von Novobiocin-Aktivität durch Lösungsmittelextraktion oder Lösungsmittel-Trennverfahren den Vorteil, dass die
Volumina der in dem Verfahren verwendeten Lösungen vergleichsweise klein und daher Apparatur- und
Laboratoriumsbedarf auf ein Minimum reduziert sind.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens liegt darin, dass durch die Verwendung von
Anionenaustauschharzen unter optimalen Bedingungen eine praktisch vollständige Gewinnung der novo- biocin-aktiven Verbindungen erreicht werden kann, im Gegensatz zu der bloss teilweisen, durch andere Methoden wie Lösungsmittelextraktion erzielbaren.
Insbesondere besteht das erfindungsgemässe Verfahren zur Gewinnung von novobiocin-aktiven Verbindungen aus ihren Lösungen in der Behandlung dieser Lösungen mit einem stark basischen, polymeren, organischen, stickstoffhältigen Anionenaustauschharz, dessen Austauschfähigkeit im wesentlichen auf der
Anwesenheit von quaternären Ammonium- oder Amingruppen beruht, wobei die Novobiocin-Aktivität an dieses Harz adsorbiert und anschliessend durch Abtrennen des Harzes aus der Lösung und Eluieren der novobiocin-aktiven Verbindungen gewonnen wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann unter Verwendung einer geeigneten Kolonne durchgeführt werden oder es können Ansätze des novobiocin-aktiven Materials in Tanks verarbeitet werden. Nach der ersteren Methode wird das Harz in eine senkrechte Kolonne gepackt und die die Novobiocin-Aktivität enthaltende Lösung wird durch das Harzbett geleitet. Der Auslauf der Kolonne wird fortlaufend untersucht, um die Zufuhr zur Kolonne zu beenden, sobald der Auslauf mehr als einen willkürlich festgesetzten, praktisch annehmbaren Minimalgehalt an Novobiocin-Aktivität aufweist. Bei Erreichen dieses Wertes wird die weitere Zufuhr unterbrochen und die adsorbierte novobiocin-aktive Verbindung aus der Austauschharzkolonne durch Durchschicken einer geeigneten Elutionslösung eluiert.
Das ausgewaschene Harz kann dann regeneriert und wieder für den Adsorptionsprozess verwendet werden oder es kann auch frisches Harz dem regenerierten Harz hinzugefügt werden.
Bei ansatzweisem Betrieb wird das gewählte Anionenaustauschharz in einem geeigneten Gefäss mit der die novobiocin-aktive Verbindung enthaltenden Lösung verrührt, wobei die Mengenverhältnisse von Harz und Lösung empirisch auf Grund früherer Versuche festgestellt werden ; sobald die Novobiocin-Aktivität der Lösung auf den gewünschten Wert herabgesetzt ist, wird die Lösung abdekantiert oder in anderer Weise von dem Harz getrennt. Hierauf wird die novobiocin-aktive Substanz aus dem Harz eluiert, was, wenn gewünscht, in einer Kolonne geschehen kann.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Adsorption der novobiocin-aktiven Verbindungen aus diese enthaltenden Rohbrühen. Diese Rohbrühen enthalten zusätzlich noch Mycel von Mikroorganismen sowie geeignete Nährstoffe und verschiedene Fermentations-Nebenprodukte.
Die Adsorption aus der Rohbrühe wird so durchgeführt, dass man das lonenaustauschharz nach der Ernte zusetzt, das Harz die novobiocin-aktive Substanz aus der Brühe adsorbieren lässt und dann abtrennt, z. B. durch Filtrieren, Abseihen oder andere Verfahren wie Verwendung von Flüssigkeitszyklonen, Rillenherden, Klassifizierern u. dgl. Die Verwendung eines Siebes mit einer solchen Maschenweite, dass das Harz zurückgehalten und das Mycel durchgelassen wird (normalerweise etwa 10 - 200 Maschen), erwies sich für diesen Zweck als besonders vorteilhaft, da keine Verstopfung der Siebe durch Mycel oder erschöpfte Brühe zu beobachten war. Zur weiteren Erleichterung dieses Trennvorganges kann ein Vibrationssieb benutzt werden.
Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens eignen sich zerkleinerte Harze aus der Klasse der stark basischen, polymeren, stickstoffhältigen Anionenaustauscher. Dies sind üblicherweise Harze mit an eine Styrol-Divinylbenzolgrundmasse angelagerten quaternären Ammoniumgruppen. Beispiele
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(DowChemicalund"Duolite A-102". Ausser diesen beispielsweise angeführten Harzen können auch noch andere Ionenaustauschharze von stark basischem Typ für die Adsorption von Novobiocin verwendet werden.
Wenngleich die Teilchengrösse des Harzes nicht kritisch ist, erwiesen sich Teilchengrössen von ungefähr 10 bis 200 Maschen, vorzugsweise von 35 bis 100 Maschen für die Adsorption als besonders geeignet.
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Zur Elution der Novobiocin-Aktivität aus dem Ionenaustauschharz wird eine wässerige, einen Elektrolyten enthaltende Lösung vorzugsweise in einem organischen Lösungsmittel für das Antibiotikum, verwendet. Wässerige saure Lösungen mit einem Gehalt an einem organischen Lösungsmittel für die novobiocin-aktive Substanz erwiesen sich für diesen Zweck als geeignet, wie beispielsweise wässerige Lösungen von Salzsäure oder Essigsäure im Gemisch mit einem geeigneten, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wie einem Alkohol oder Keton.
Die Konzentration der sauren Verbindung in der Elutionslösung beträgt vorzugsweise ungefähr 1 - 10 Gew. Vol.-%. Die organische Phase kann durch ungefähr 70 bis 980/0 an organischem Lösungsmittel neben ungefähr 30 -'2fl/o Wasser gebildet werden.
Die Elution kann kolonnen-oder ansatzweise durchgeführt werden, wobei kolonnenweises Arbeiten bevorzugt wird, weil kleinere Volumina benötigt werden und weil bei Verwendung einer Kolonne leichter periodisch Analysen des Eluats vorgenommen werden können und dasselbe in Fraktionen aufgeteilt werden kann.
Das Eluat kann weiteren Reinigungsoperationen, wie der Chromatographie, unterworfen werden, beispielsweise durch Durchleiten durch eine Aluminiumoxydkolonne, die mit verdünnter Schwefelsäure und Wasser gewaschen worden war, und Behandeln des gereinigten und entfärben Eluats mit einer sauren Lösung, z. B. einer Methanol-Essigsäurelösung, um die Novobiocinsäure auszukristallisieren. Die erhaltenen Kristalle können filtriert, mit einem Waschmittel wie z. B. Wasser-Methanol, gewaschen, wieder filtriert und getrocknet werden. Wenn gewünscht, können aus dieser Novobiocinsäure mittels geeigneter Neutralisationsverfahren verschiedene Novobiocinsalze hergestellt werden. Novobiocin-Analoge, wie Dihydronovobiocin enthaltende Eluate können in gleicher Weise behandelt werden, um die NovobiocinAnalogen aus dem Eluat zu isolieren.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird nachstehend an Hand von Beispielen näher erläutert, die jedoch den Umfang der Erfindung nicht einschränken sollen.
Beispiel l : 251 einer filtrierten, durch Züchtung eines Novobiocin erzeugenden Stammes von Streptomyces sphaeroides in einem geeigneten Nährmedium erhaltenen Fermentationsbrühe, die ungefähr 7 200 000 Einheiten an Novobiocin-Aktivität enthalten, werden durch eine, 500 cm "Amberlite IRA- 411"-Harz enthaltende Kolonne geschickt. Das Harz wird nach seinem Chloridzyklus verwendet. Die Kontaktzeit zwischen Lösung und Harz in der Kolonne beträgt ungefähr 10 min. Der Auslauf zeigt keine messbare Novobiocin-Aktivität. Nach dem Kontakt mit der Lösung wird das Harz zur Entfernung der Verunreinigungen mit 95'igem Methanol gewaschen.
Dann wird das Novobiocin von dem Harz unter Verwendung einer 160/0 konzentrierte Salzsäure und 85% Methanol enhaltenden Lösung eluiert. In dem Eluat finden sich 4500000 Einheiten an Novobiocin-Aktivität. Das Eluat hat ein Gesamtvolumen von weniger
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als 3 l und enthält ungefähr 82% der gesamten, in der ursprünglichen Lösung vorhandenen NovobiocinAktivität.
Beispiel 3 : Zwei 30 cm3 -Anteile von "Dowex 1-X2"-Harz (50 - 100 Maschen, Chloridzyklus) werden zu 300 cm3 unfiltrierter Novobiocin-Fermentationsbrühe mit einer Aktivität von 510000 E zugesetzt. Jeder Harzanteil wird nach 10 min Kontaktzeit aus der erschöpften Brühe mit Hilfe eines 70 Maschen-Siebes abgesiebt und kolonnenweise mit einer 16% konzentrierte Salzsäure und 84% Methanol ent- haltenden Lösung eluiert. Im Eluat findet sich eine Aktivität von 202000 E.
Beispiel 4 : Man löst'5 g Natrium-dihydronovobiocin in 500 cms Wasser, setzt 50 cm3 "Dowex 1-X2"-Harz (Chlorid-Zyklus) zu und lässt 3 h lang stehen. Das Harz wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Dann wird ein aliquoter Anteil von 17 cm3 des Harzes kolonnenweise mit einer 16 cm kon-
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der Beschickung vorhandenen Dihydronovobiocins.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung von novobiocin-aktiven Verbindungen aus diese enthaltenden Mischungen, dadurch gekennzeichnet, dass die novobiocin-aktive Verbindung an ein zerkleinertes, stark basisches lonenaustauschharz vom quaternären Ammonium- oder Amino-Typ adsorbiert und die adsorbierte Verbindung von dem Harz eluiert wird.