DE1180893B

DE1180893B - Herstellung und Gewinnung des neuen Antibioticums íÀ11072 R. P.íÂ

Info

Publication number: DE1180893B
Application number: DER32864A
Authority: DE
Inventors: Denise Mancy; Leon Ninet; Jean Preud-Homme
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1961-06-08
Filing date: 1962-06-05
Publication date: 1964-11-05

Description

Herstellung und Gewinnung des neuen Antibioticums »11 072 R. P.« Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung eines neuen Antibioticums, das im folgenden mit der Nr. 11072 R. P. bezeichnet wird. Das neue Antibioticum ist besonders bei Mycobakterien und anderen grampositiven Keimen wirksam. Dieses Antibioticum ist ganz besonders wertvoll, da es die gleiche Wirksamkeit auf gegen andere Antibiotica, wie beispielsweise Streptomycin, Neomycin, Kanamycin, resistente Mycobakterien, wie auf gegen diese Antibiotica sensible Mycobakterien besitzt. Das neue Antibioticum wird durch Züchtung von im nachfolgenden vollständigen identifizierten Mikroorganismen, die dem Genus Streptomyces angehören, unter künstlichen Bedingungen erzeugt.
Das kristallisierte Antibioticum 11072 R.'P. ist in Methanol, Äthanol, Aceton, Chloroform, Methylenchlorid, Essigsäureäthylester, Dioxan, Pyridin, Dimethylformamid und Äther löslich, in Wasser und Isopropyläther schwach löslich und in Petroläther unlöslich. Das Antibioticum 11072 R. P. zeichnet sich somit durch eine starke Löslichkeit in vielen organischen Lösungsmitteln aus. Insbesondere liegt der Verteilungskoeffizient von 11072 R. P. zwischen den folgenden mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln: Butanol, Essigsäureäthylester und Dichloräthan und dem Kulturfiltrat (wäßrige Phase) stets über 20.
Das Antibioticum 11072 R. P. ergibt in den folgenden Reaktionen negative Teste: Biuret-Reaktion, Reaktion nach S a k a g u c h i , Ninhydrin-Reaktion, Reaktion nach Molisch, Reaktion nach Tollens, Reaktion nach E h r 1 i c h , 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Reaktion. In folgenden Reaktionen ergibt es positive Teste: Ninhydrin-Reaktion nach saurer Hydrolyse, Reaktion mit Kaliumpermanganat, Reaktion mit Fehlingscher Lösung, Reaktion nach S e 1 i v a n o f f und Reaktion nach D i s c h e. Diese Teste zeigen, daß das Antibioticum 11072 R. P. Aminosäuren und Osidgruppen, jedoch keinen aromatischen Ring enthält. Die in dem Molekül von 11072 R. P. vorhandenen Aminosäuren wurden nach 24stündiger Hydrolyse in 6n-Salzsäure durch Chromatographie bestimmt: Hierbei wurden insbesondere Glycocoll, Prolin, Leucin und Isoleucin identifiziert.
Das Antibioticum 11072 R. P. enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff. Seine Elementarzusammensetzung ist die folgende: C = 61.85 bis 61,90%, H = 8,9 bis 8,95 %, 0 = 16,7 bis 17,0%, N = 12,25 bis 12,35 0/0. Das Antibioticum besitzt die folgenden physikalischen Eigenschaften: Aussehen ....... weißes mikrokristallines Pulver Schmelzpunkt ... 222 bis 223° C

Drehvermögen ... [cal ö0 = -100 ± 5°

(c = 1% in Methanol)

Analyse funktioneller Gruppen - O - CHs ***1''**** 1,25% - CO - CH3 . . . . . . . . 5,10% -C-CH 3 . . . . . . . . . . 24,451V0 - N - CH3 . . . . . . . . . . 13,30% Ultraviolettspektrum (die Messung wurde mit 10 wg%cm3 und 100 [.g/cm3 enthaltenden Lösungen in-Methanol durchgeführt) schwache Absorption bei niedrigen Wellenlängen kein Absorptionsmaximum zwischen 200 und 400 m[ Infrarotspektrum (die Messung wurde an mit Kaliumbromid verpreßten Produkten vorgenommen) Dieses Spektrum ist in der Figur wiedergegeben, in der als Abszisse einerseits die Wellenlängen in Mikron (unterer Maßstab) und andererseits die Wel- Ienzahlen in cm-' (oberer Maßstab) und als Ordinaten die Transmissionen in ,1/o aufgetragen sind.

In der nachfolgenden Tabelle I sind die Hauptbanden der Infrarotabsorption für dieses Produkt wiedergegeben.

Tabelle I

3330 st 1414 m 1141 m 843 m

2975 st 1388 m 1126 m 828 m

2905 sch 1371 m 1102 m 782 sch

1782 st 1350 m 1079 st 760 sch

1666 sst 1302 st l051 sch 724 sch

1640 sst l283 m 1022 m 711 m

l620 sst 1270 m 926 m 663 m

1535 st 1238 sch 891 ssch

l472 m 1197 876 ssch

1449 st 1178 st 862 sch

sst = sehr stark

st = stark

m = mittel

sch = schwach

ssch = sehr schwach

Das Antibioticum 11072 R. P. kann durch Papierchromatographie identifiziert werden. Das Antibioticum wurde auf Papier Arches Nr. 302 chromatographiert, wobei absteigend mit verschiedenen Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen entwickelt wurde.

Die Auswertung der Chromatogramme erfolgte durch Biautographie auf Nähragarplatten, die mit Mycobakterium 607 oder Sarcina lutea beimpft waren. Die erhaltenen Rf-Werte sind in der nachfolgenden Tabelle II angegeben.

Tabelle II

Entwicklungslösungsmittel Erhaltener

R,-Wert

Obere Phase des Gemisches

Benzol + n-Butanol + Wasser

(75: 25: 25 Volumina) ....... 1,0

Obere Phase des Gemisches

Benzol + n-Butanol + Wasser

(25: 75: 25 Volumina) ....... 1,0

Obere Phase des Gemisches Benzol

-!- Essigsäureäthylester + Wasser

(95. 5 : 25 Volumina) ....... 0,20

(87. 13: 25 Volumina) ....... 0,45

(85: 15: 25 Volumina) ....... 0,60

Obere Phase des Gemisches

Benzol + Chloroform + Wasser

(80: 20: 25 Volumina) ....... 0,20

(75: 25: 25 Volumina) ....... 0,30

(65: 25: 25 Volumina) ....... 0,40

(25: 75: 25 Volumina) ....... 1,0

Destilliertes Wasser 0,60

n-Propanol + Wasser

(5: 95 Volumina) . . . . . .. . . . . 0,70

(15: 85 Volumina) . . . . . . . . . . . 0,80

(25: 75 Volumina) . . . . . . . . . . . 0,90

(75: 25 Volumina) . . . . . . . . . . . 1,0

Diese Chromatographien zeigen, daß das Antibioticum 11072 R. P. nur eine einzige Wirksubstanz enthält.

Die bakteriostatische Wirkung von _ 11072 R.T. gegenüber einer gewissen Zahl von Keimen wurde durch eine der üblicherweise zu- diesem- Zweck angewendeten Verdünnungsmethoden bestimmt. Für jeden Keim wurde die kleinste Konzentration an Substanz, die jegliche sichtbare Entwicklung in einer geeignetem Nährbouillon verhindert, bestimmt. Die Ergebnisse der verschiedenen Bestimmungen sind in der nachfolgenden Tabelle III zusammengestellt, in der die minimalen bakteriostatischen Konzentrationen in Mikrogramm Substanz je Kubikzentimeter Versuchsmedium ausgedrückt sind.

Tabelle IIl

Antibiotisches Spektrum

Bakteriostatische

Geprüfte Bakterienstämme Konzentrationen

,ug/cma

Mycobacterium tuberculosis, var.

hominis, Stamm H 37 Rv ....... 1 bis 5

Mycobacterium tuberculosis,

Stamm Vy (Rinderstamm) ...... 0,5 bis 1

Mycobacterium

species - ATCC 607 . . . . . . . . . 0,25 bis 0,50

Corynebacterium

pseudodiphtericum

(Faculte de Pharmacie, Paris) ... 0,02

Neisseria catarrhalis

(Faculte de Pharmacie, Paris)... 0,26

Sarcina lutea - ATCC 9341 ..... 0,36

Micrococcus citreus-ATCC 8411 6,9

Micrococcus

lysodeikticus - ATCC 4698. . . 0,46

Staphylococcus aureus,

Stamm 209 P - ATCC 6538 P > 250

Streptococcus

faecalis - ATCC 9790 . . . . . . . . > 250

Streptococcus viridans

(Institut Pasteur, Paris) . . . . . . . . > 250

Streptococcus pyogenes

haemolyticus (Stamm Dig 7,

Institut Pasteur, Paris) . . . ...... > 250

Diplococcus pneumoniae

(StammTil,InstitutPasteur,Paris) > 250

Bacillus subtilis - ATCC 6633 ... > 250

Bacillus

megatherium - NRRL-B-938 . . > 250

Bacillus cereus - ATCC 6630 ... > 250

Bacillus brevis - ATCC 8185 ... > 250

Escherichia coli - ATCC 9637. . > 250

Aerobacter

aerogenes - ATCC 8308 ..... > 250

Alcaligenes faecalis - ATCC 8749 > 250

Proteus vulgaris

(Faculte de Pharmacie, Paris) . . > 250

Klebsiella

pneumoniae - ATCC 10 031. . > 250

Pseudomonas aeruginosa (Stamm

Bass, Institut Pasteur, Paris) ... > 250

Diese verschiedenen Bestimmungen zeigen; daß das Antibioticum 11072 R. P. seine Wirkung insbesondere auf die Mycobakterien einschließlich virulenter Stämme ausübt. Außerdem wirkt es ebensogut auf die gegen andere Antibiotica resistenten Stämme wie auf nicht resistente Stämme, wie die nachfolgende Tabelle IV zeigt.

Tabelle IV

Wirkung auf gegen andere Antibiotica resistente

Mycobakterien

Bakteriostatische

Bakterienstämme Konzentrationen

yg/Cm3

Mycobacterium tuberculosis,

Stamm Vy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 bis 1

Mycobacterium tuberculosis,

Stamm Vy . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 bis 5

(resistent gegen Streptomycin)

Mycobacterium tuberculosis,

Stamm Vy . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 bis 5

(resistent gegen Neomycin)

Mycobacterium tuberculosis,

Stamm Vy . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 bis 5

(resistent gegen Viomycin)

Mycobacterium tuberculosis,

Stamm Vy . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 bis 5

(resistent gegen Kanamycin)

Schließlich ist das Antibioticum 11072 R. P. auch bei zahlreichen aus pathologischen Produkten bei Kranken isolierten Stämme, wie die nachfolgende Tabelle V zeigt, wirksam.

Tabelle V

Wirkung auf aus pathologischen Produkten isolierte

Stämme von Mycobacterium tuberculosis

Bakterienstämme (gegebenenfalls mit Bakteriostatische

dem Kennzeichen des Kranken, bei Konzentrationen

dem sie isoliert wurden, bezeichnet) yg/cm3

H 37 Rv . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,8 bis 1

Arl. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 bis 2

Ve. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,8 bis 1

Pa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,8 bis 1

Bat. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,4 bis 0,6

Bar. (gegen Isoniazid resistenter

Stamm) . .. .... .. . . . . . . . . . . . . . . 1 bis 2

Er. (gegen Isoniazid resistenter

Stamm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 bis 2

B V (polyresistenter Stamm) ..... 1 bis 2

Sav. (polyresistenter Stamm) ..... 2 bis 4

Bid. (Rinderstamm) . . . . . . . . . . . . . 2 bis 4

Die antibiotische Wirksamkeit in vitro des Antibioticums 11072 R. P. auf Mycobakterien wurde in vivo im Laboratorium bei Tieren bestätigt, die experimentell mit Mikroorganismen, wie beispielsweise Tuberkelbazillen (virulente Stämme Vy und Br) infiziert waren. Das Antibiotikum erweist sich insbesondere bei der Maus bei Verabreichung auf subkutanem und oralem Weg als sehr wirksam; außerdem erweist es sich auch bei der Tuberkulose beim Meerschweinchen bei oraler Verabreichung als wirksam.

Das Antibioticum 11072 R. P. kann durch aerobe Züchtung.gewisserStreptnmyces, insbesondere »S. caelicus« (hinterlegt im Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illionis, USA., unter der Nr. NRRL 2957) und »S. griseus 20129« (hinterlegt im Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, USA., unter der Nr. NRRL 2986), erhalten werden.
S. caelicus wurde aus einer in der Nähe von Madras in Indien entnommenen Erdprobe isoliert. Die Isolierungsmethode ist die folgende: Die entnommene Erdprobe wird in destilliertem sterilem Wasser suspendiert und die Suspension dann auf versohiedene Konzentrationen verdünnt. Ein kleines Volumen jeder Verdünnung wird auf die Oberfläche von Petrischalen aufgebracht, die ein Nährmedium nach E m e r s o n oder irgendein anderes geeignetes Medium enthalten. Nach Inkubation von einigen Tagen bei 26°C werden die Kolonien der Mikroorganismen, die man isolieren will, auf Schrägagar versetzt, um reichlichere Kulturen zu erhalten.
In der Klassifizierung von »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Auflage (1957), für den Genus Streptomyces findet man keine Beschreibung einer Species, deren Züchtungscharakteristiken und biochemischen Eigenschaften mit denjenigen dieses Streptomyces übereinstimmen. Dieser Organismus kann daher als eine neue Species betrachtet werden, die den Namen »Streptomyces caelicus« auf Grund der Farbe ihres luftausgesetzten Teils und ihrer Fähigkeit, ein blaues Pigment auf gewissen Züchtungsmedien zu bilden, erhalten hat.
Im nachstehenden sind die Eigenschaften dieser neuen Species definiert: Streptomyces caelicus bildet Sporen mit ovaler bis zylindrischer Form mit stark abgerundeten Enden; die Abmessungen der Sporen betragen 0,6 bis 0,8 bis 0,9 .bis 1,2 g,; sie befinden sich auf langen Sporenfäden, die sich in engen Spiralen mit länglicher Form einrollen, die leicht bis zu zehn bis fünfzehn Windungen aufweisen. Die so zusammengesezteh Sporo-. phore sind auf luftausgesetzten Hyphen von 0,3 bis 0,5 #t Durchmesser befestigt, wobei ihre Befestigung einstielig ist. Diese Art der Sporulation bringt S. caelicus in die »Spira«-Gruppe der Klassifikation der Streptomyces von P r i d h g m (Applied Microbiology, 1958, Bd. 6, S. 52 bis 79); sie, wurde auf den folgenden von P r i d h a m zu diesem Zweck empfohlenen Kulturmedien beobachtet und identisch befunden: synthetischer Agar nach Czapek, Agar nach H i c k e y und T r e s n e r, Agar mit Tomatenextrakt und Hafermehl, Agar mit Stärke und Mineralsalzen, Agar nach Bennett.
Streptomyces. caelicus besitzt die besonderen Merkmale, einerseits einen sporulierten luftausgesetzten Teil von blauer Farbe aufzuweisen und andererseits auf gewissen Züchtungsmedien in reichlichem Maße ein blaues Pigment gleichbleibender Intensität, insbesondere auf gewissen synthetischen Medien, zu bilden, wo es besonders in Erscheinung treten kann. Meistens beginnt dieses Pigment von den ersten Tagen der Züchtung ab gebildet zu werden, wobei es diesen Medien eine lebhaft blaue Farbe verleiht, Dann ist seine Produktion so reichlich, daß seine Anhäufung sehr rasch zu einer außerordentlich dunklen blauschwarzen. Färbung des. -Aggrs führt. Auf gewissen organischen Medien,ist dieses blaue Pigment durch ein unabhängig davon gebildetes schwarzes Pigment mehr oder weniger dunkler gemacht.
Man kann den Streptomyces caelicus von allen bisher beschriebenen Streptomycesspecics, die ein blaues Pigment erzeugen, aus folgenden Gründen unterscheiden: A. S. caelicus erzeugt ein Pigment, dessen Färbung sich je nach dem Aziditäts- oder Alkalinitätsgrad des Mediums zu ändern vermag und in saurem Medium nach Rot umschlägt, wie es das vom Streptomyces coelicolor erzeugte Pigment tut. Wenn man die in der Klassifikation von Bergey (7. Auflage) beschriebenen Species betrachtet, so ist die Species S. coelicolor (S. violaceoruber von W ak sm an und C u rt i s), die auf Grund dieser Pigmentbildung am nächsten kommende. S. caelicus unterscheidet sich jedoch wesentlich von dieser Species, und zwar durch die folgenden Punkte: a) Die Färbung des sporulierten der luftausgesetzten Teils von S. caelicus ist schwach grünlichhellblau, während diejenige von S. coelicolor (S. violaceoruber) grau ist; ein Vergleich von gleichzeitig durchgeführten Züchtungen dieser beiden Species läßt keinen Zweifel über den Unterschied der Färbung des der luftausgesetzten Teils.
b) S. caelicus bildet sehr lange Sporenfäden, die sich zu engen länglichen, Spiralen einrollen, die leicht bis zu zehn bis fünfzehn Windungen bilden. Das Aussehen der Sporenfäden unterscheidet sich vom Aussehen derjenigen von S. coelicolor (S. violaceoruber), die nur wenig enge Spiralen mit einer viel geringeren Anzahl von Windungen bilden.
c) S. caelicus ist im Gegensatz zu S. coelicolor (S. violaceoruber) ein chromogener Stamm, der insbesondere auf Maltose-Trypton-Agar nach W i 11 i a m s und M c C o y ein schwärzliches Pigment erzeugt.
B. Von Kutzner und Waksman (I. of Bact., 1959, Bd. 78, S. 528 bis 538) wurde eine Tabelle der Species von Streptomyces, die ein blaues Pigment erzeugen, aufgestellt. Unter diesen finden sich nur zwei Species mit blauem luftausgesetztem Mycel: S. caeruleus von B a l d a c c i und S. cyaneus von K r a s s i 1 n i -k o v. S. caeruleus, der keine Sporenfäden in Form von Spiralen hat, gehört nicht zu der gleichen Klassifikationsgruppe wie S. caelicus. Beim S. cyaneus ist die Art seines Pigments, dessen Farbe gegen Änderungen des pH-Werts des Mediums unempfindlich ist, von derjenigen des Pigments von S. caelicus verschieden.

Die Züchtungseigenschaften und die biochemischen Eigenschaften des Streptomyces caelicus wur= den auf Agar-Nährmedien und in Nährbouillons untersucht, wie sie üblicherweise zur Prüfung des Aussehens von Streptomycesstämmen verwendet werden. Die gemachten Beobachtungen sind in nachfolgender Tabelle angegeben. Sie beziehen sich, falls es nicht anders angegeben ist auf Kulturen, die 2 bis 3 Wochen bei 26° C inkubiert wurden und einen guten Entwicklungsgrad erreicht hatten. Der größte Teil der verwendeten Züchtungsmedien wurde nach den in »The Actinomycetes«, S. A. W a k s m a n , S. 193 bis 197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., USA, 1950, beschriebenen Formulierungen hergestellt. In diesem Falle sind sie durch den Buchstaben W und anschließend die in »The Actinomycetes« gegebenen Zahlen bezeichnet. Die anderen Medien sind durch Anmerkungen am Ende der Tabelle bezeichnet.

Entwick- Vegetatives Mycel Luftausgesetzter Teil Beobachtungen

Kulturmedium oder (umfest die Gesamtheit Lösliches Pigrnent und

lungsgrad von luftausgesetztem Mycel

Unterseite der Kultur und Sporulation) biochemische Produkte

Agar nach B e n n e t t gut Unterseite schwarz gut entwickelt; weißgräulich schwarz

Anmerkung (A) bis blaugrünhellgräulich;

Exsudation von einigen leb-

haft blau gefärbten Tröpf-

chen, die den luftausgesetz-

ten Teil der Stelle, an der

sie auftreten, färben

Maltose-Trypton- sehr gut Unterseite schwarz sehr gut entwickelt; blaugrün- schwarz der Stamm ist chromo-

Agar hellgräulich;Exsudationvon gen; man sieht ein

(Anmerkung B) einigen lebhaft blau gefärb- reichlich auftretendes

ten Tröpfchen, die den ruft- lösliches schwarzes Pig-

ausgesetzten Teil der Stelle, ment von den ersten

an der sie auftreten, färben Tagen der Züchtung ab

auftreten

Agar nach Einer- ziemlich Unterseite schwarz sehr mäßig entwickelt; weiß- schwarz

s o n (W-23) gut lich bis lebhaft blau

AgarmitHefeextrakt sehr gut Unterseite schwarz sehr gut entwickelt; blaugrün- schwarz

nach P r i d h a m hellgräulich

(Anmerkung C)

Glucose-Pepton- gut Unterseite gut entwickelt; blaugrünhell- dunkel-

Agar (W 7) bläulichschwarz gräulich blauschwarz

Nähragar (W 5) mittel gut entwickelt; keines blauschwarz;

blauschwarz schwach grün-

lich

Glucose-Asparagin- ziemlich Unterseite sehr mäßig entwickelt; rosa dunkelviolett

Agar (W 2) gut dunkelviolett bis blaugrünhellgräulich

Glycerin-Asparagin- mittel Entwicklung mittel; keines dunkelviolett

Agar (W 3) sehr dunkelviolett

Anmerkung A: K. L. J o n es, Journal of Bacteriology, 1949, Bd. 57, S. 142.

Anmerkung B: A. M. W i 11 i a m s und E. M c C o y, Applied bTicrobiology, 1953, Bd. 1, S. 307.

Anmerkung C: T. G. P r 1 d h a m und Mitarbeiter, Aatibiotica Annual, 1956-57, S. 947.

(Fortsetzung)

Entwick- 1 Vegetatives Mycel Luftausgesetzter Teil Beobachtungen

(umfaßt die Gesamtheit Kulturmedium lungsgrad oder von luftausgesetztem Mycel Lösliches Pigment und

Unterseite der Kultur und Sporulation) biochemische Produkte

Agar mit Calcium- gut Unterseite gut entwickelt; blaugrünhell- blau Löslichmachung von

malat dunkelblau gräulich Calciummaiat

nach Krainsky

(Anmerkung E)

Agar mit Tyrosin mittel sehr dunkelblau- Spuren; graublau bis burgun- dunkel- Keine sichtbare Löslich-

schwarz derblau blauschwarz machung von Tyrosin

Kultur auf Kartof- ziemlich sehr vermindert; begrenzt an braunschwarz braun schwärzlichesvege-

feln (W 27) gut der Spitze des Kartoffel- mit und ohne tativesMycelundbraun-

stücks zusätzlich blau- schwarzes lösliches Pig-

schwarz ment vom Beginn der

Züchtung ab; dann mehr

oder weniger regelmäßi-

ges und mehr oder we-

niger zögerndes Auf-

treten von blauschwar-

zem Pigment, das das

vegetative Mycel färbt

und in die Kartoffel

diffundiert

Agar mit Stärke ziemlich Unterseite blau mäßige Entwicklung; gräu- lebhaft blau von Hydrolyse von Stärke ist

(W 10) gut lich bis burgunderblau gleichbleiben- schwach und langsam

der Intensität

Synthetischer Agar gut Unterseite gut entwickelt; blaugrau bis blauschwarz

nach Czapekmit bläulichschwarz burgunderblau; Exudation

Saccharose (W 1) von einigen lebhaft blau

gefärbten Tröpfchen, die

den luftausgesetzten Teil

der Stelle, an der sie auf-

treten, färben

Reine Gelatine 12 % ziemlich Kultur mäßige Entwicklung; blau- blauschwarz bis ziemlich rasche vollstän-

(Anmerkung D) gut an der Oberfläche hellgräulich dunkelbraun- dige Verflüssigung

mit blauschwarzer veilchenfarbig,

Unterseite entwickelt sich

von der Ober-

fläche aus

Synthetische Bouil- ziemlich Schleier mit gelb- weißlich bis hellblau veilchenfarbig Bildung von Nitriten aus

Nitraten: schwach posi-

lonnachCzapek gut licherUnterseite

mit Saccharose tiv ganz zu Beginn der

(W 18) Züchtung, wird ziem-

lich rasch negativ

Anmerkung E: G r u n d y und Mitarbeiter, Antibiotics and Chemotherapy, 1952, Bd. 2, S. 401.

Anmerkung D: »Plain gelatinK, hergestellt nach den Angaben des »Manual of Methods for Pure Clrlture Study of Bacteriac der Society of

American Bacteriologists (IIsa-18).

Nach der Methode von Pri@dham und Gottlieb (J. of Bact., 1948, Bd. 56, S. 107 bis 114) wurde festgestellt, daß Streptomyces caelicus als Kohlenstoffquelle die folgenden Substanzen gut auswertet: Xylose, Arabinose, Rhamnose, Lävulose, Glucose, Galactose, Mannose, Lactose, Maltose, Saccharose, Trehalose, Cellobiose, Raffinose, Dextrin, Stärke, Glycerin, Adonit, Mannit, Inosit. Dagegen gedeiht er nicht mit Sorbose, Erythrit, Dulcit und Sorbit.

Als Stickstoffquelle verwertet Streptomyces caelicus die folgenden Substanzen gut: Ammoniumsulfat, Adenosin, Harnstoff, Asparagin, Glycocoll, Alanin, Valin, Glutaminsäure, Arginin, Lysin, Threonin, Phenylalanin, Tyrosin, Prolin, Histidin, Natriumnitrat, Natriumnitrit, Sarcosin und Hydroxyprolin. Mittelmäßig werden Adenin, Uracil und Acetamid ausgewertet. Nicht verwendbar sind Methionin, Creatin, Creatinin und Taurin.
»Streptomyces griseus 20129« wurde aus einer in Brasilien entnommenen Erdprobe isoliert. Die Isolierungsmethode ist die gleiche wie die für S. caelicus angegebene.
Die Untersuchung dieses neuen Stamms hat gezeigt, daß er morphologische Charakteristiken besitzt, die der Species Streptomyces griseus von W a k s m a n und H e n r i c i ähnlich sind, wie sie in »Bergey's Manual of Deterniinativ Bacteriology«, 7. Auflage, 1957, angegeben ist; Streptomyces gris.eus 20129 unterscheidet sich von letzterem nur durch einige Punkte, die allein ermöglichen, ihn als eine besondere Varietas zu unterscheiden. Streptomyces griseus 20129 bildet auf allen seinen Züchtungsmedien ein graugelbliches vegetatives Mycel, das sich oft graugrünlich oder selbst braungraugrünlich, insbesondere auf organischen Medien, färbt. Sein luftausgesetzter Teil, der reichlich ist und pulvriges Aussehen besitzt, ist sehr hellgelbgrau, wobei es häufig nach Grünlich umschlägt. Streptomyces griseus 20129 bildet kugelige bis ovale Sporen mit Abmessungen von 0,7 bis 1,0 g zu 0,8 bis 1,3 #t; diese Sporen befinden sich auf geraden oder schwach gebogenen Fäden, die sich niemals zu Spiralen einrollen.
Die Punkte, die ihn von der in Bergey's Manual beschriebenen Streptomyces-griseus-Speeies unterscheiden, sind die folgenden: Erzeugung von graugrünlichem bis braungrünlichem Pigment, das mehr oder weniger die Gesamtheit oder nur gewisse Teile des vegetativen Mycels der Kulturen auf Glucose-Agar und Magermilch färbt. Die Züchtung auf Kartoffeln führt zur Bildung einer braungräulichen oder selbst braunschwärzlichen bis braunolivfarbigen Färbung, die die Kartoffeln färbt.
Schließlich reduziert Streptomyces griseus 20l.29 Nitrate nicht zu Nitriten, im Gegensatz zu dem von Waksman und Henrici beschriebenen Stamm.
Nach der Methode von P r i d h a m und Gottlieb (J. of Bact., 1948, Bd. 56, S. 107 bis 114) wurde festgestellt, daß Streptomyces griseus 20 129 als Kohlenstoffquelle die folgenden Substanzen gut auswertet: Xylose, Arabinose, Glucose, Galactose, Lävulose, Mannose, Maltose, Trehalose, Cellobiose, Dextrin, Stärke, Glycogen, Glycerin, Adonit und Manr@it. Nicht verwendbar sind: Rhamnose, Fucose, Sorbose, Saccharose, Raffinose, Inulin, Erythrit, Dulcit, Sorbit, Inosit.
Die Lactose wird mittelmäßig ausgewertet und führt nur zu einem langsamen und unvollständigen Wachstum des Streptomyces.
Als Stickstoffquelle wertet Streptomyces griseus 20129 die folgenden Substanzen aus: Ammoniumsulfat, Adenin, Adenosin, Harnstoff, Asparagin, Glycocoll, Alanin, Valin, Glutaminsäure, Arginin, Lysin, Threonin, Methionin, Phenylalanin, Tyrosin, Prolin, Histidin. Nicht verwendbar sind: Natriumnitrat, Natriumnitrit, Uracil, Acetamid, Creatin, Creatinin, Taurin, Sarcosin, Hydroxyprolin.
Das Herstellungsverfahren des Antibioticums 11072 R. P. besteht im wesentlichen darin, Streptomyces caelicus oder S. griseus 20129 auf einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und anschließend das im Verlaufe der Züchtung gebildete Antibioticum abzutrennen.
Die Züchtung kann nach jeder aeroben Oberflächenzüchtung oder Immersionszüchtung erfolgen, doch ist letztere aus Gründen der Bequemlichkeit zu bevorzugen. Man verwendet zu diesem Zweck die verschiedenen Apparaturtypen, die jetzt üblicherweise in der Technik der Fermentationen verwendet werden.
Insbesondere kann man den folgenden Weg für die Durchführung der Arbeitsgänge einschlagen:

Streptomyees-Stammansatz

Kultur auf Agar

Kultur im Kolben unter Bewegung

Impfkultur im Fermentationsgefäß

Produktionskultur im Fermentationsgefäß

Das Fermentationsmedium soll eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralsalze und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese Elemente in Form von gut definierten Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können.
Als assimilierbare Kohlenstoffquelle kann man Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Lactose, Dextrine, Stärke oder andere Kohlenstoffe, Wasserstoff und Sauerstoff enthaltende Substanzen, wie beispielsweise Zuckeralkohole, wie Glycerin, Mannit od. dgl., oder gewisse organische Säuren, wie Milchsäure, Citronensäure, Weinsäure u. dgl., verwenden. Gewisse tierische oder pflanzliche Öle, wie beispielsweise Schmalzöl oder Sojaöl, können diese verschiedenen Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff enthaltenden Quellen mit Vorteil ersetzen oder ihnen beigefügt werden.
Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind außerordentlich verschiedenartig. Sie können sehr einfache chemische Substanzen sein, wie beispielsweise Nitrate, anorganische und organische Ammoniumsalze, Harnstoff und Aminosäuren. Sie können auch in Form von komplexen Substanzen, die den Stickstoff hauptsächlich in proteidischer Form enthalten, zugeführt werden, wie beispielsweise in Form von Casein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysaten, Sojamehlen, Arachismehlen, Fischmehlen, Fleischextrakten, Hefeextrakten, Distillers' Solubles und Maisquellwasser.
Unter den zugesetzten mineralischen Elementen können gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder Calcium- oder Magnesiumcarbonat.
Andere bewirken das zur Entwicklung des Streptomyces und zur Erzeugung des Antibioticums erforderliche Ionengleichgewicht, wie beispielsweise die Alkali- und Erdalkalichloride und -sulfate. Schließlich wirken gewisse in spezieller Weise als Aktivatoren der Stoffwechselreaktionen des Streptomyces. Zu diesen gehören die Zink-, Cobalt-, Eisen-, Kupfer-und Mangansalze.
Zu Beginn der Züchtung soll der pH-Wert des Fermentationsmediums zwischen 6,0 und 7,8, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7, liegen. Die zur Fermentation optimale Temperatur beträgt 25 bis 27° C, doch wird auch bei Temperaturen zwischen 23 und 35°C eine zufriedenstellende Produktion erzielt. Die Belüftung der Züchtung kann zwischen ziemlich weiten Grenzwerten schwanken. Es wurde jedoch gefunden, daß Belüftungen von 0,3 bis 21 Luft je Liter Kulturflüssigkeit und Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute an Antibioticum wird nach 2- bis 5tägiger Züchtung erhalten, wobei die Zeitspanne hauptsächlich von dem verwendeten Medium abhängt.
Aus den vorstehenden Ausführungen ist ersichtlich, daß die zur Produktion des Antibioticums 11072 R. P. angewendeten allgemeinen Bedingungen der Züchtung der Streptomyces in ziemlich weitem Maße variieren und jedem besonderen Erfordernis angepaßt werden können.
Das Antibioticum 11072 R. P. kann aus den Fermentationsmaischen nach folgenden Methoden isoliert werden: Die Fermentationsmaische wird zunächst bei einem pH-Wert zwischen 2 und 9 in Gegenwart einer Filterhilfe filtriert, wobei die in dem Filtrat befindliche Menge an Aktivität dann praktisch vom pH-Wert unabhängig ist; um die anschließenden Behandlungen zu erleichtern, wird das Züchtungsmedium jedoch im allgemeinen vorzugsweise in einem pH-Bereich zwischen 4 und 6 filtriert.
Das Antibioticum kann anschließend aus dem Filtrat mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel aus der Gruppe der aliphatischen Alkohole mit 4 bis 5 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise n-Butylalkohol oder Amylalkoholgemische, der aromatischen Alkohole, wie beispielsweise Benzylalkohol, der Ketone, wie beispielsweise Methylisobutylketon, der Ester, wie beispielsweise Essigsäureäthyl-oder -amylester, der chlorhaltigen Lösungsmittel, wie beispielsweise Chloroform oder Dichloräthan, extrahiert werden. Diese Extraktion kann auch bei einem pH-Wert zwischen 2 und 9 durchgeführt werden, doch wird im allgemeinen vorzugsweise bei einem pH-Wert zwischen 2 und 6 gearbeitet, um Bedingungen zu erzielen, die sich am besten für die technische Durchführung eignen. Die das Antibioticum 11072 R. P. enthaltende organische Lösung wird anschließend auf ein kleines Volumen eingeengt. Durch Zugabe eines Lösungsmittels, das das Antibioticum 11072 R. P. schlecht löst, wie beispielsweise Hexan oder Isopropyläther, wird das rohe Antibioticum dann teilweise oder vollständig je nach der vorgenommenen Einengung und den verwendeten Lösungsmitteln ausgefällt.
In den Fällen, in denen die Ausfällung des rohen Antibioticums nicht vollständig ist, werden die Mutterlaugen dieser Fällung behandelt, indem sie durch eine Aluminiumoxydsäule geleitet werden, die so beschaffen ist, daß etwa 1 kg Aluminiumoxyd je Liter Lösung vorliegt, wobei dieses Verhältnis zwar bevorzugt, jedoch nicht unbedingt erforderlich ist. Nach Waschen der Säule mit einem Lösungsmittel, das das Antibioticum schlecht löst, wie beispielsweise Hexan oder Isopropyläther, wird das an der Säule fixiert gebliebene Antibioticum mit einem der im vorstehenden erwähnten Lösungsmittel, die es gut lösen, wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Chloroform und Essigsäureäthylester, eluiert. Die das Antibioticum enthaltende organische Lösung wird dann auf ein geringes Volumen eingeengt, was gegebenenfalls nach Zugabe eines das Antibioticum schlecht lösenden Lösungsmitels, wie beispielsweise Isopropyläther, die Ausfällung des Restes des rohen Antibioticums bewirkt.
Das nach den vorstehenden Arbeitsweisen erhaltene rohe Antibioticum ist nicht immer direkt kristallisierbar. Es ist oft vorteilhaft, es zuvor einer Reinigung zu unterwerfen, die unter gewissen Bedingungen direkt zu dem reinen kristallisierten Antibioticum führen kann. Die Reinigung kann nach an sich üblichen Methoden, und insbesondere durch Chromatographie an gewisse Adsorptionsmittel oder Gegenstromverteilung, durchgeführt werden. Es ist besonders vorteilhaft, eine Chromatographie an Aluminiumoxyd in Chloroform durchzuführen. Das gereinigte Antibioticum kann durch Auflösen in einem Lösungsmittel, vorzugsweise in Chloroform, unter schwachem Erwärmen und anschließendes Abkühlen zur Bewirkung der Kristallisation oder auch durch Auflösen in einer großen Menge eines das Antibioticum schlecht lösenden Lösungsmittels, vorzugsweise Isopropyläther, und langsame Kristallisation bei Zimmertemperatur kristallisiert oder umkristallisiert werden. Selbstverständlich können die oben angegebenen verschiedenen Methoden in verschiedener Reihenfolge nacheinander angewendet oder mehrere Male wiederholt werden, je nach den Herstellungserfordernissen, um das Antibioticum 11072 R. P. in einer für die vorgesehenen Anwendunszwecke geeigneten Form zu erhalten.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. Im folgenden wird die Aktivität stets durch eine Diffusionsmethode mit Mycobacterium sp. ATCC 607 als empfindlichem Keim und bezogen auf eine Probe des reinen und kristallisierten Produkts als Eichmaß bestimmt. Diese Aktivität ist daher in Mikrogramm (#tg) kristallisiertes Produkt je Milligramm für feste Produkte und in Mikrogramm kristallisiertes Produkt je Kubikzentimeter für Lösungen ausgedrückt: Beispiel 1.
In ein 170-1-Fermentationsgefäß bringt man folgende Bestandteile ein: Maisquellwasser (50 % Trockenextrakt) ....... . . . . . . . . . . . . . 2,400 kg Saccharose ................... 3,600 kg Caleiumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . 0,900 kg Ammoniumsulfat . . . . . . . . . . . . . 0,240 kg Wasser q. s.................... 1001 Dieses Züchtungsmedium hat einen pH-Wert von etwa 6. Man sterilisiert durch 40minutiges Durchleiten von Dampf bei 122°C. Nach Sterilisieren und Abkühlen auf 27°C beträgt das Endvolumen der Bouillon 1201 und der pH-Wert 6,85. Das Medium wird dann mit 200 cm3 einer gerührten bzw. geschüttelten Erlenmeyer-Kultur des Stamms Streptomyces caelicus beimpft.
Die Kultur im Fermentationsgefäß wird mit 5 m3 steriler Luft je Stunde belüftet und mit einer Turbine mit 350 UpM in Bewegung gehalten. Die Temperatur wird bei 26 bis 27° C gehalten. Der pH-Wert des Mediums bleibt während der gesamten Züchtung praktisch auf seinem Ausgangswert. Die Entwicklung des Pilzes beginnt etwa nach 20 Stunden. Sie ist etwa 48 Stunden nach der Beimpfung zur Beimpfung der Produktionskultur geeignet.
Die Produktionskultur wird in einem 800-1-Fermentationsgefäß durchgeführt, das mit folgenden Substanzen beschickt ist: Sojamehl .. ..................... 16 kg Distillers' SQlubles . . . . . . . . . . . . . . . 2 kg Maisstärke . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 kg Sojaöl .......................... 6 kg Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 kg Wasser d. s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3501 Der pH-Wert des so erhaltenen Mediums wird mit 400 cm3 konzentrierter Natronlauge auf 7,6 eingestellt. Das Medium wird durch 40minutiges Durchleiten von Dampf bei 122° C sterilisiert. Nach der Sterilisation kühlt man auf 26 bis 27°C ab. Das Volumen der Bouillon beträgt 4001 und der pH-Wert etwa 6,5. Das Medium wird dann mit 401 der obigen Kultur aus dem 170-1-Fermamentationsgefäß beimpft. Das Medium wird mit einer Turbine mit 205 UpM in Bewegung gehalten, mit 15 ms steriler Luft je Stunde belüftet und bei 26 bis 27°C gehalten.
Der pH-Wert fällt langsam innerhalb von 24 Stunden von 6,5 auf 5,95 ab und steigt dann wieder, um nach 90stündiger Züchtung 8,35 zu erreichen. Die Produktion des Antibioticums beginnt etwa in der 40. Stunde. Die Fermentation wird nach 90 Stunden abgebrochen. Die dann in dem Medium vorhandene Antibioticummenge beträgt 410 #tg/cms.
Beispiel 2 Man bringt in ein mit einer Vorrichtung zum Bewegen ausgestattetes Gefäß 170 1 der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Fermentationsmaische (Gehalt 410 ug.%cm3) ein. Die Maische wird 1 Stunde in Bewegung gehalten, wobei der pH-Wert mit 5 n-Salzsäure auf 5 eingestellt wird und anschließend 10 kg Filterhilfe zugegeben werden. Das Gemisch wird auf einer Filterpresse filtriert, und der Kuchen wird mit 701 Wasser gewaschen. Das 2051 ausmachende Filtrat wird mit 5 n-Salzsäure auf pH 3 eingestellt und nacheinander mit 60 und dann 401 Essigsäureäthylester extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt und unter vermindertem Druck bis auf 11 eingeengt. Das Konzentrat wird mit 101 Hexan versetzt, und der so erhaltene Niederschlag wird abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 86 g Rohprodukt mit einer Aktivität von 488 wg/mg.
Man leitet die obigen Mutterlaugen durch eine Aluminiumoxydsäule, die dann mit Hexan gewaschen wird. Das an der Säule fixierte Produkt wird anschließend mit Methanol eluiert. Die erhaltene methanolische Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man eine zweite Fraktion Rohprodukt von .9 g mit einer Aktivität von 415 tig7mg erhält.
Beispiel 3 50 g des gemäß Beispiel 2 isolierten Rohprodukts (488 lig/mg) werden in 500 cm-3 Chloroform gelöst. Die erhaltene Lösung wird filtriert und dann in eine Säule, die 1 kg Aluminiumoxyd enthält, geleitet. Man eluiert anschließend das Antibioticum mit 2,51 Chloroform, wobei die Verunreinigungen an dem Aluminiumoxyd fixiert bleiben. Die so erhaltene Chloroformlösung wird im Vakuum zum Trocknen eingeengt. Man erhält so 29,5 g gereinigtes Produkt mit einer Aktivität von 781 [g/mg.
25 g dieses Produkts werden in 1,251 Isopropyläther bei Zimmertemperatur gelöst, und die erhaltene Lösung wird 15 Minuten mit 5 g Adsorptionskohle in Bewegung gehalten. Man filtriert und läßt 3 Tage bei Zimmertemperatur kristallisieren. Nach Absaugen, Waschen und Trocknen erhält man 15,8 g reines Produkt mit einer Aktivität von 1000 [tg/mg. Beispiel 4 In ein mit einer Vorrichtung zum Bewegen ausgestattetes Gefäß bringt man 10001 Fermentationsmaische ein, die durch mehrere Arbeitsgänge nach der im Beispiel l beschriebenen Methode erhalten wurden. Die Aktivität der Maische beträgt 390 #tg/cms und der pH-Wert 7,8. Diese Maische wird mit Salzsäure auf pH 5 eingestellt und 30 Minuten mit 45 g Filterhilfe in Bewegung gehalten. Das Gemisch wird dann auf einer Filterpresse filtriert und der Filterkuchen mit 2001 Wasser gewaschen. Das 10401 ausmachende Filtrat wird mit 4001 Dichloräthan nach Einstellung des pH-Wertes mit Salzsäure auf 3 extrahiert. Der Extrakt wird anschließend unter vermindertem Druck auf 21 eingeengt. Das Konzentrat wird dann mit 81 Isopropyläther versetzt, und der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 154 g Rohprodukt mit einer Aktivität von 456 #Lg/mg.
Man leitet die Mutterlauge der Ausfällung durch eine Säule, die 8 kg Aluminiumoxyd enthält. Die Säule wird mit 41 Hexan gewaschen, und das an der Säule fixierte Produkt wird mit 301 Chloroform eluiert. Die so erhaltene Chloroformlösung wird unter vermindertem Druck auf 500 cms eingeengt. Das Konzentrat wird auf -f-5° C abgekühlt, was den Beginn der Kristallisation bewirkt. Man setzt dann 500 cm3 Isopropyläther zur Vervollkommnung der Kristallisation zu. Die erhaltenen Kristalle werden abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 192 g gereinigtes Produkt mit einer Aktivität von 960 [,g/mg. Nach Umkristallisation aus Isopropyläther in der am Ende des Beispiels 3 beschriebenen Weise erhält man 168 g reines Produkt mit einer Aktivität von 1000 #(g/mg.
Beispiel s 100 g des gemäß Beispiel 4 erhaltenen Rohprodukts mit einer Aktivität von 456 wg/mg werden in 11 Chloroform gelöst. Die Lösung wird in eine Säule, die 1 kg Aluminiumoxyd enthält, geleitet. Man eluiert anschließend das Antibioticum mit 21 Chloroform. Die erhaltene Chloroformlösung wird unter vermindertem Druck bis zur Kristallisation eingeengt. Die Kristalle werden dann abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 62 g reines Produkt mit einer Aktivität von 1000 gg/mg.
Beispiel 6 In ein 170-1-Fermentationsgefäß bringt man folgende Bestandteile ein: Pepton ....................... 1,200 kg Fleischextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . 0,600 kg Glucosehydrat ................ 1,200 kg Wasser q. s.................... 1001 Der pH-Wert des so erhaltenen Mediums wird mit 110 eins konzentrierter Natronlauge auf 6,95 eingestellt. Man sterilisiert das Medium durch 40minutiges Durchleiten von Dampf bei 122° C. Nach Abkühlen auf 26 bis 27° C beträgt das Endvolumen der Bouillon 1201 und der pH-Wert 6,60. Das Medium wird dann mit 200 cm3 einer gerührten bzw. geschüttelten Erlenmeyer-Kultur des Stamms Streptomyces griseus 20129 beimpft. Die Kultur im Fermentationsgefäß wird mit 5 ms steriler Luft je Stunde belüftet und mit einer Turbine mit 250 UpM in Bewegung gehalten. Die Temperatur wird auf 26° C eingestellt.
Der pH-Wert des Mediums bleibt während der ersten 16 Stunden zwischen 6,40 und 6,60 und steigt dann, um nach 24stündiger Züchtung 7,50 zu erreichen. Die Entwicklung des Pilzes beginnt etwa in der 20. Stunde. Sie ist 27 Stunden nach der Beimpfung zur Beimpfung der Produktionskultur geeignet.
Die Produktionskultur wird in einem 800-1-Fermentationsgefäß durchgeführt, das mit folgenden Substanzen beschickt ist: Sojamehl ....................... 16 kg Distillers' Solubles . . . . . . . . . . . . . . . 4 kg Stärke .......................... 6 kg Sojaöl .......................... 6 kg Caleiumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . 4 kg Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 kg Cobaltchlorid - 6 HQO . . . . . . . . . . . . 8 g Wasser q. s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3701 Der pH-Wert des so erhaltenen Mediums beträgt 6,45. Das Medium wird durch 40minutiges Durchleiten von Dampf bei 122° C sterilisiert. Nach Abkühlen auf 26 bis 27° C beträgt das Volumen der Brühe 4001 und der pH-Wert 6,55. Das Medium wird dann mit 40 1 der obigen Kultur aus dem 170-1-Fermentationsgefäß beimpft. Das Medium wird mit einer Turbine mit 220 UpM/Minute gerührt, mit 15 m3 steriler Luft je Stunde belüftet und bei 26 bis 27° C gehalten.
Der pH-Wert steigt in aufeinanderfolgenden Stufen bis auf 8,55 mit einer ersten Stufe bei 7 von 6 bis 30 Stunden, einer zweiten Stufe bei 7,30 von 43 bis 67 Stunden und einem anschließenden regelmäßigen Anstieg bis. auf 8,40 von 78 bis 115 Stunden; schließlich erreicht der pH-Wert bei 139 Stunden den Wert 8,55, man bricht dann die Fermentation ab. Die Produktion des Antibioticums beginnt etwa in der 67. Stunde und erreicht ihr Maximum bei 90 Stunden. Die in dem Medium vorhandene Antibioticummenge beträgt dann 26 wg/cm3.
3801 der, wie oben beschrieben, erhaltenen Fermentationsbrühe werden dann, wie im Beispiel 2 beschrieben, behandelt. Man erhält so 6,8 g Rohprodukt.
4,8 g dieses Rohprodukts werden in Chloroform gelöst und durch Chromatographie an Aluminiumoxyd, wie im Beispiel 3 beschrieben, gereinigt. Man erhält 4 g gereinigtes Produkt, das nach Kristallisation aus Isopropyläther, wie es im Beispiel 3 beschrieben ist, 3 g reines kristallisiertes Antibioticum 11072 R. P. mit einer Aktivität von 1000 gg/mg liefert.

Claims

Patentanspruch: Verwendung von Streptomyces caelicus NRRL 2957 oder Streptomyces griseus NRRL 2986 zur Herstellung des Antibioticums »11072 R. P.cc auf üblichem biologischem Wege unter aeroben Bedingungen, Gewinnung des Antibioticums aus der Kultur und gegebenenfalls dessen Beindarstellung.