DE1217549B - Herstellung des neuen Antibiotikums Bleomycin - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

C12d

Deutsche KL: 30 h-6

Nummer: 1 217 549

Aktenzeichen: Z10690IV a/30 h

Anmeldetag: 5. März 1964

Auslegetag:' 26. Mai 1966

Die Erfindung betrifft die Herstellung und Isolierung eines neuen Antibiotikums, Bleomycin, und seiner Salze im reinen und rohen Zustand.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Bleomycin besteht im wesentlichen darin, daß ein Streptomyces-verticillus-Stamm in einem Medium gezüchtet wird, bis sich eine ausreichende Menge Bleomycin angesammelt hat.

Das erfindungsgemäß hergestellte Bleomycin liegt als Base oder saures Salz entweder in gereinigtem oder rohem Zustand und entweder in Lösung oder in fester Form vor. Bleomycin hemmt das Wachstum gramnegativer und -positiver Bakterien einschließlich säurebeständiger Bakterien. Es übt eine therapeutische Wirkung gegen die experimentelle Infektion von Mäusen mit pathogenen Bakterien und gegen Tumore bei Versuchstieren aus. Gründliche Untersuchungen sprechen viel dafür, daß das Bleomycin für die Therapie gegen bakterielle Infektion und insbesondere gegen Krebs beim Menschen und Tier verwendbar ist. Außerdem wirkt es wachstumshemmend auf Organismen, die Krankheiten bei Pflanzen hervorrufen, und es wird erwartet, daß es für die Verhütung oder Unterdrückung von Krankheiten beim Reis, bei Hülsenfrüchten, beim Weizen und bei anderen Pflanzen nutzbar ist.

Die neue antibiotische Substanz besteht aus Bleomycin A, Bleomycin B oder deren sauren Additionssalzen. Jedes Bleomycin ist eine Substanz, die in Wasser und Methanol löslich, in Äthanol, Butanol, Aceton, Äthylacetat, Äther, Chloroform und Benzol jedoch im wesentlichen unlöslich ist, mit Säuren Salze bildet, im ultravioletten Absorptionsspektrum ihre Maximalwerte bei 244 und 295 πιμ erreicht, eine positive Pauly-, Ehrlich- und Dragendorf-Reaktion und eine negative Fehling-, Tollens-, Anthron- und Ferrichloridreaktion ergibt, wobei Bleomycin Al, A2, A3, Bl, B 2, B 3, B 4 und B 5 eine negative Ninhydrinreaktion und Bleomycin A4, A5 und A6 eine positive Ninhydrinreaktion ergeben und jedes Bleomycin A, d.h. Bleomycin Al, A2, A3, A4, A5 und A6, eine negative Sakaguchi-Reaktion und jedes Bleomycin B, d. h. Bleomycin Bl, B 2, B 3, B.4 und B 5, eine positive Sakaguchi-Reaktion ergibt, und Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Kupfer oder kein Kupfer enthält.

In den Zeichnungen zeigt

F i g. 1 die ultravioletten Absorptionsspektren des Bleomycins A und B,

F i g. 2 die infraroten Absorptionsspektren des Bleomycins A und B,

F i g. 3 die ultravioletten Absorptionsspektren des Bleomycins Cu-At 2, Cu-At 5 und Cu-Bt2 und

Herstellung des neuen Antibiotikums· Bleomycin

Anmelder:

Fa. Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai, (Microbial Chemistry Research Foundation),

Tokio

Vertreter:

H. Haalck, Rechtsanwalt,

Hamburg 20, Goernestr. 12

Als Erfinder benannt:

Hamao Umezawa,

Kenji Maeda,

Yoshiro Okami Tomio Takeuchi, Tokio

Beanspruchte Priorität:

Japan vom 5. März 1963 (10 177)

F i g. 4 die infraroten Absorptionsspektren des Bleomycins Cu-At2, Cu-At5 und Cu-Bt2.

Wie später beschrieben werden wird, kann durch weitere Reinigung Bleomycin A in Bleomycin Al, A2, A3, A4, A5 und A6 getrennt werden, unter denen gewöhnlich Bleomycin A 2 und A 5 die Hauptkomponenten darstellen, und Bleomycin B in Bleomycin Bl, B 2, B 3, B 4 und B 5 getrennt werden, unter denen Bleomycin B 2 und B 4 die Hauptkomponenten sind.

Bleomycin wurde nach systematischer Forschungsarbeit unter den Antibiotika entdeckt, und der es erzeugende Organismus wurde von den Entdeckern aus einer bei der Kohlengrube in Kaho-Gun, Bezirk Fukuoka, gesammelten Bodenprobe isoliert. Der isolierte, Bleomycin erzeugende Organismus erhielt von seinen Entdeckern die Nummer B80-Z2 und wurde im Nationalen Gesundheitsinstitut von Japan, Abteilung für Antibiotika, Unterabteilung Mykologie, unter der Stammnummer NIHJ 424 hinterlegt. Dieser Stamm wurde in der American-Type-Culture-Collection unter der laufenden Nummer ATCC15003 hinterlegt.

Dieser Stamm (B80-Z2) wies folgende Merkmale auf:

1. Mikroskopische Merkmale:

Luftmycelium entwickelt sich aus feinem verzweigtem vegetativem Mycelium. Luftmycelium

609 570/502

bildet Windungen. Im allgemeinen ist das Photographieren von Sporen an den Windungen mittels eines Elektronenmikroskops schwierig. Bei diesem Stamm jedoch wurde angenommen, daß die Sporenoberfläche glatt war.

2. Züchtungsmerkmale auf verschiedenen Medien:

1. Auf Czapek-Dox-Agarplatte, inkubiert bei 27° C:

Blaßgelblichbraunes Wachstum mit guter Bildung von weißem Luftmycelium. Wenig .bräunlichgelber löslicher Farbstoff.

2. Auf Krainskys Glucose-Asparagin-Agarplatte, inkübiert bei 27° C:

Wachstum ist blaßbräunlich mit gelblichem Farbton. Gute Bildung von Luftmycelium von blasser matter grünlichgrauer Farbe. Kein löslicher Farbstoff.

3. Auf Stärke-Agarplatte, inkubiert bei 27° C:
Wachstum ist gelblich. Luftmycelium ist weiß bis grünlichweiß. Geringer bräunlicher löslicher Farbstoff. Keine oder schwache Stärkehydrolyse um das Wachstum herum.

4. Auf Calciummalat-Agarplatte, inkubiert bei 27⁰C:

Farbloses Wachstum mit wenig weißem Luftmycelium. Kein löslicher Farbstoff.

5. In Peptonlösung mit 0,2% NaNO₃-Gehalt, inkubiert bei 37° C:

Blaßbräunlichgelbes Wachstum bildet sich auf der Flüssigkeitsoberfläche als Ring entlang der Wandung des Reagenzglases. Auch wird eine geringe Menge Myceliummasse am Boden festgestellt. Weißes bis blaßbräunlich- oder -gelblichgraues Luftmycelium auf dem Oberflächenwachstum. Kein löslicher Farbstoff. Nitrit von Nitrat wird durch die Stärke-Jod-Reaktion nachgewiesen.

6. Auf Bouillon-Agarschräge, inkubiert bei 37°C: Farbloses bis cremefarbenes Wachstum mit gelegentlicher Bildung von weißem Luftmycelium. Kein löslicher Farbstoff.

7. Auf Loefflers koagulierter Serumschräge, inkubiert bei 37° C:

Farbloses bis cremefarbenes Wachstum mit wenig weißem Luftmycelium. Kein löslicher Farbstoff und keine Verflüssigung des koagulierten Serums.

8. Auf Blut-Agarplatte, inkubiert bei 37⁰C:
Rötlichbraunes Wachstum mit weißem Luftmycelium. Kein löslicher Farbstoff und keine Hämolyse.

9. Auf Gelatinmedium, inkubiert bei 18 bis 20°C:

Farbloses bis blaßbräunliches Wachstum. Weißes Luftmycelium. Kein löslicher Farbstoff und keine Verflüssigung der Gelatine.

10. Auf Eimediumschräge, inkubiert bei 37°C:
ίο Cremefarbenes Wachstum mit reichlichem

schneeigem weißem Luftmycelium. Kein löslicher Farbstoff.

11. Auf entrahmter Milch, inkubiert bei 37⁰C:
Cremefarbenes Wachstum mit weißem Luftmycelium auf der Flüssigkeitsoberfläche an der Wandung des Reagenzglases. Kein löslicher Farbstoff. Schwache Koagulierung und kein oder schwacher Stärkeabbau.

12. Auf Kartoffelboden, inkubiert bei 27°C:

Gelblichbraunes Wachstum mit pulverförmigem weißem bis grauem Luftmycelium mit bräunlichem Farbton. Kein löslicher Farbstoff.

13. Auf Mohrrübenboden, inkubiert bei 27⁰C:
Cremefarbenes Wachstum mit bräunlichem Farbton. Weißes schneeiges Luftmycelium.

Kein löslicher Farbstoff.

14. Verwendung von Kohlenhydraten für das Wachstum auf Czapeks Grundagarmedium.
Dextrin, Glycerin, Stärke, Glucose und MaI-tose werden für gutes Wachstum verwendet.

Fructose, Inositol und Mannose ergeben unterschiedliche Resultate. Kein oder spärliches Wachstum wurde mit Arabinose, Galactose, Inulin, Lactose, Mannitol, Raffinose, Rhamnose, Salicin, Sorbitol, Sorbose, Saccharose, Xylose, Natriumacetat, Natriumeitrat und Natriumsuccinat erzielt.
Zusammenfassend wird festgestellt, daß der Stamm B80-Z2 zu der Gattung Streptomyces gehört. Er ist gekennzeichnet durch die Bildung von Windungen, blaßbräunlichgelbes Wachstum, weißes bis gräuliches Luftmycelium, keine Farbenerzeugung und keine oder schwache Stärkehydrolyse und proteolytische Aktivität. Unter den bekannten Streptomyces-Arten sind Streptomyces verticillus, S. cinnamoneus und S. flavopersicus als Windungen bildend und nicht farbenerzeugend bekannt. In der folgenden Tabelle werden der Stamm B 80-Z2 und die bekannten Arten miteinander verglichen.

	Windungen	B80-Z2	Stämme	Streptomyces	S. cinnamoneus	S. flavopersicus
Eigenschaften	Spiralen	+	verticillus	+	H-
	Farbenerzeugungsfähigkeit	—	+	—	—
Stärkehydrolyse	—	—	—	—
Nitratreduktion	±	—	+ +	7
Proteolyse	+	±	—	+
Farbe des Luftmyceliums auf syn	±	—	++	++
thetischem Medium	.gräulich mit	+	zimtfarben	blaßgelblich
	olivfarbenem	gräulicholiv-		mit blaßrosa
	Ton	farben mit		Farbton
Farbe des Wachstums		blaßrosa
	farblos, gelb	Farbton	cremefarben	gelblich
Hergestelltes Antibiotikum	lich bis braun	cremefarben
	Bleomycin		Cinnamycin Duramycin Heptaene	Actinospectacin
		Phleomycin

Wie aus der obigen Tabelle hervorgeht, sind sich die miteinander verglichenen Stämme bis auf kleinere Unterschiede sehr ähnlich. Der Stamm B80-Z2 ähnelt am meisten dem S. verticillus, während S. cinnamoneus zimtfarbenes Luftmycelium, eine starke Stärkehydrolyse und eine starke proteolytische Wirkung aufweist, was der Stamm B80-Z2 nicht hat. S. flavopersicus bildet blaßgelbliches Luftmycelium auf dem synthetischen Agar und zeigte eine bedeutende proteolytische Aktivität in der entrahmten Milch und dem Gelatinemedium, wodurch sich dieser bekannte Stamm von dem Stamm B80-Z2 unterscheidet. Ferner wächst der Stamm B80-Z2 sehr gut in einem Medium, das aus Stärke als Kohlenstoffquelle und Sojabohnenmehl als Stickstoff quelle besteht, und die Stärkehydrolyse und Proteolyse lassen sich in Abhängigkeit von den Züchtungsbedingungen verändern. Daher werden die Unterschiede zwischen dem Stamm B 80-Z2 und S. verticillus bezüglich der Stärkehydrolyse und der proteolytischen Aktivität nicht als wesentlich angesehen. S. verticillus bildet gewöhnlich blaßrosagraues Luftmycelium, gelegentlich aber olivgraues Luftmycelium, das dem Luftmycelium des Stammes B80-Z2 sehr ähnlich ist. In anderen Punkten, z. B. bei der Nitratreduktion, bestehen gewisse Unterschiede zwischen ihnen, jedoch stimmen die meisten ihrer Eigenschaften miteinander überein, und es wird für richtig gehalten, daß der Stamm B80-Z2 zum S. verticillus gehört.

Wenn S. verticillus unter geeigneten Bedingungen gezüchtet wird, erhält man Bleomycin. Mycelia oder Sporen eines Bleomycin erzeugenden Organismus werden in ein geeignetes Medium eingeimpft und unter anroben Bedingungen vergärt, um ein Bleomycin enthaltendes Züchtungsprodukt herzustellen. Die Bleomycinherstellung kann durch 'Züchtung auf einem festen Medium erfolgen; es ist jedoch empfehlenswert, die Züchtung zur Produktion im großen Maßstab in einem flüssigen Medium durchzuführen. Die Inkubationstemperatur ist ausreichend hoch, wenn ein Bleomycin erzeugender Stamm dabei wachsen kann. Vorzugsweise wird jedoch die Gärung bei 25 bis 35° C, insbesondere bei 27 bis 32⁰C, durchgeführt. Das Medium zur Herstellung des Bleomycins besteht aus Stickstoffquellen, Kohlenstoffquellen, anorganischen Salzen mit oder ohne anregende Faktoren für die Produktion usw. Als Kohlenstoffquelle lassen sich Kohlenhydrate, Fette oder Öle verwenden. Beispielsweise werden Stärke, Glucose, Glycerin, Maltose, Dextrin und Saccharose entweder in gereinigtem oder rohem Zustand verwendet. Als Stickstoffquelle gelangen Sojabohnenmehl, Fleischextrakt, destillationslösliches Erdnußmehl, Pepton, Fischmehl, Hefeextrakt, eine Flüssigkeit, in der Getreidekörner gequollen sind, Nitrat, Ammoniumsalze, Harnstoff usw. zur Anwendung. Gegebenenfalls werden anorganische Salze, wie z. B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Calciumkarbonat, Phosphate usw., zugesetzt. Wenn erforderlich, werden zu dem Medium Salze von Schwermetallen, wie z. B. Kupfer, Mangan, Eisen, Zink usw., zugegeben. Sämtliche Stoffe, deren Verwendung zur Züchtung von Actinomycin bekannt ist und die im kanadischen Patent 513 324, in den britischen Patenten 730 341 und 736 325 und den USA.-Patenten 2 691618, 2 658 018, 2 653 899, 2 586 762, 2 516 080, 2 483 892, 2 609 329 und 2 709 672 angegeben sind, sind für die Herstellung des Bleomycins nutzbar. Um das Schäumen während der Gärung zu vermeiden, wird irgendein bekanntes Antischaummittel, wie z. B. Paraffin, Fett, Sojabohnenöl oder Silikonharz, verwendet. Alle anderen bekannten Verfahren zur Gärung von Penicillin und Streptomycin oder zur Herstellung anderer Antibiotika lassen sich zur Herstellung des Bleomycins durch Gärung verwenden.

Die angewendeten Versuchsverfahren sind, sofern nicht besonders angegeben, wie folgt:

1. Schüttelzüchtung

100 ecm des Mediums wurden in einen Sakaguchi-Kolben mit einem Volumen von 500 ecm eingebracht und 20 Minuten lang bei 120°C sterilisiert. In das sterilisierte Medium wurden Mycelia, Sporen oder eine Mischung aus Mycelia und Sporen des Bleomycin erzeugenden Stammes eingeimpft und bei 27 bis 29⁰C auf einer Schüttelmaschine mit 120 Hüben pro Minute mit einer Amplitude von 8 cm gezüchtet. 1 ml der nach dem zweiten Tag entstandenen Brühe wurde in 100 ecm des Mediums in einem Kolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ecm eingeimpft und gezüchtet.

2. Tankzüchtung

a) Züchtung in einem Gärbebehälter

In einen Gärbebehälter aus rostfreiem Stahl und mit einem Fassungsvermögen von 301 wurden 101 des Mediums eingebracht, die 30 Minuten lang bei 120° C sterilisiert wurden. Die Gärung erfolgte unter Zuführung von 101 Luft pro Minuten und unter Verrühren mit einer Geschwindigkeit von 500 U/min. Die Temperatur wurde auf 27 bis 29 ⁰C gehalten, und als Antischaummittel wurde Sojabohnenöl oder Silikonharz verwendet.

b) Züchtung in einem Tank aus rostfreiem Stahl und mit einem Fassungsvermögen von 4001 In den Tank wurden 1801 des Mediums eingebracht, die 30 Minuten lang bei 120⁰C sterilisiert wurden. Die Luftzufuhr betrug 2001 pro Minute, und das Verrühren erfolgte bei 200 U/min. Die Temperatur wurde auf 27 bis 29⁰C gehalten. Als Antischaummittel wurde Sojabohnenöl oder Silikonharz verwendet.

3. Bleomycinprobe

Als Probeorganismus wurde Mycobacterium phlei NIHJ verwendet. Die Probe wu^de unter Anwendung des Zylinderplattenverfahrens durchgeführt. Mycobacterium phlei wurde 1 Woche lang bei 27 bis 29⁰C in Glycerinbouillon unter Schütteln gezüchtet. Das Medium für das Zylinderplattenverfahren bestand aus 1,0% Glycerin, 1,0% Fleischextrakt, 1,0% Pepton, 0,2% NaCl und 2,0 % Agar. Zu 1000 ml des Mediums wurden 5 ml grüne l,5°/_oige Malachitlösung zugegeben. Der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt. Nach 20minutiger Sterilisierung bei 12O⁰C wurden zu 95 ecm dieses Mediums 5 ecm M. phlei-Züchtung als Keimschicht zugesetzt. Die weiteren Arbeitsgänge waren die gleichen wie bei dem Zylinderplattenprobeverfahren für Penicillin. Eine Menge Bleomycin, die durch das Ionenaustauschharzverf ahren mit anschließender Sephadex-Chromato-

graphie aus dem Züchtigungsfiltrat extrahiert wurde, wurde als Bezugssubstanz bezeichnet. Die Aktivität wurde durch das Gewicht der Bezugssubstanz ausgedrückt.

Der Bleomycin erzeugende Stamm wurde von den Erfindern zunächst in dem folgenden Medium unter Schütteln gezüchtet. Das Medium bestand aus 1,0% Glucose, 1,0% Stärke, 0,75% Fleischextrakt, 0,75% Pepton und 0,3% Natriumchlorid. Der anfängliche

pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt. Nach 4tägigei Züchtung betrug der pH-Wert der Brühe 7,3. Diese Brühe zeigte beim Zylinderplattenverfahren einen Hemmungsbereich von 30 mm.

Die Bleomycinerzeugung durch die Schüttelzüchtung in einem aus verschiedenen Arten von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen bestehenden Medium wurde untersucht. Die Ergebnisse der Bleomycinerzeugung und der pH-Wert der gezüchteten Brühe sind in den ίο folgenden Tabellen angegeben.

1. Prüfung der Kohlenstoffquellen; Grundmedium bestand aus 0,75 °	Kohlenstoffquellen	pH	2	mcg/ml	pH	/0 Fleischextrakt, <	ige	pH	3,75% Pepton, 0,3% NaCl.	mcg/ml	pH	5	mcg/ml
Medium Nr.		7,8	0,25	6,2	Ti 3	7,4	4	0,36	7,8	0,38
	1% Glucose				mcg/ml
T-I	1% Stärke	7,0	0,29	6,8	0,37	7,4	0,38	7,6	0,37
2	2% Glucose	5,4	0,07	5,4		7,0	0,36	7,6	0,47
3	2% Stärke	8,2	0,27	8,0	0,34	8,6	0,32	8,8	0,11
4	2% Lactose	8,0	0,32	8,2	0,10	8,2	0,17	8,2	0,14
5	2% Saccharose	8,2	0,26	6,6	0,25	4,8	0,37	5,0	0,37
6	2% Maltose	5,8	0,05	6,6	0,17	7,2	0,44	7,6	0,38
7	2% Dextrin	6,8	0	6,4	0,10	6,2	0,07	6,4	0,18
8	2% Glycerin		0,35
	0

2. Prüfung der Stickstoffquellen

Grundmedium bestand aus 1 % Glucose, 1 % Stärke und 0,3 % NaCl. •In dem Medium Nr. 7 waren 2,0% Stärke enthalten.

Medium Nr.	Stickstoffquellen und Salze	pH	2 mcg/ml	pH	3 mcg/ml	T pH	age 4 mcg/ml	pH	5 mcg/ml	pH	6 mcg/ml
■ {	0,75% Fleischextrakt 0,75% Pepton	} 6,4	0,27	7,0	1,23	7,2	1,41	7,4	0,59	8,0	0,24
■1	1,5% Sojabohnenmehl 0,1% K2HPO4 0,05% MgSO4	6,4	0	6,4	0,06	6,6	0,41	7,0	1,40	7,8	0,90
3 .	1 % Sojabohnenmehl 0,1% K2PHO4 0,05% MgSO4 0,5% Getreidekörnerquell- fiüssigkeit	. 6,8	0,03	7,2	0,06	7,0	0,38	7,4	0,45	8,6	0,29
«1	0,74% Fleischextrakt 0,75% Pepton 0,3% Hefe	7,2	0,25	7,6	1,35	7,6	1,00	8,2	0,43	8,2	0,39
5 {	2% Getreidekörnerquell- fiüssigkeit	1 6,8	0	6,8	0,06	6,8	0,22	6,8	0,06	7,2	0,06
6 {	1,5% Sojabohnenmehl 0,3% Hefe	1 6,6	0	6,6	0,13	6,4	0,31	7,2	1,19	8,2	0,20
71	0,75% Fleischextrakt . 0,75% Pepton	J 7,0	0,09	6,6	0,79	7,2	1,17	7,4	1,47	8,0	1,44

Diese Ergebnisse sind Ergebnisse von Prüfungsbeispielen. Stärke, Dextrin, Glucose, Lactose und Maltose sind Beispiele für Kohlenstoffquellen, die für die Erzeugung von Bleomycin geeignet sind. Sojabohnenmehl, Fleischextrakt, Pepton und Hefe sind Beispiele für StickstoffqueUen, die für die Erzeugung des Bleomycins nutzbar sind.

Ein aus 2,5% Stärke, 0,5% Glucose, 3,5% Sojabohnenmehl, 0,1% K₂HPO₄, 0,05% Zinksulfat und 0,01% CuSO₄-H₂O bestehendes Medium (pH7;0) ist ein Beispiel für ein für die Bleomycinherstellung geeignetes Medium.

Ein Stamm, der durch die Einkolonieauswahl aus der ursprünglichen Züchtung des Stammes Nr. B 80-Z2

9 ίο

ausgewählt worden war, wurde in dem oben ange- ausbeute in diesem Verfahren war gewöhnlich geringer

gebenen Medium unter Schütteln gezüchtet und lieferte als bei einem Ionenaustauschharzverfahren, das nach-

nach einer Züchtung von 7 bis 10 Tagen 100 mcg/ml stehend beschrieben wird.

Bleomycin. Bei der maximalen Erzeugung betrug das Bleomycin ist basisch und wasserlöslich. Daher pH der gezüchteten Brühe 8,0 bis 8,2. Es ist allgemein 5 kann zur Extraktion und Reinigung des Bleomycins bekannt, daß die Zusammensetzungen sehr ergiebiger ein Ionenaustauschharzverfahren angewendet werden, Medien für die Herstellung eines Antibiotikums in das eine hohe Ausbeute ergibt. Ionenaustauschharze Abhängigkeit von - den Stämmen verschieden sind, mit Carboxyl- oder Phenolradikalen können Bleoselbst wenn die Stämme von -demselben Ursprungs- mycin auf Grund seiner basischen Eigenschaft und auf stamm abgeleitet sind. Im Falle der Bleomycin er- io Grund der van der Waalschen Kraft adsorbieren, zeugenden Stämme muß es sich genauso verhalten. Kationenaustauschharze des Carboxyl-Typs und Carb-Die für die Bleomycinerzeugung geeigneten Medium- oxymethylcellulose sind geeignete Adsorbentien für zusammensetzungen müssen in Abhängigkeit von die. Extraktion und Reinigung des Bleomycins. durch die Monosporenauswahl oder durch die Be- Beispielsweise wird Bleomycin an ein Kationenhandlung mit ultravioletten Strahlen od. dgl. her- 15 austauschharz, wie z. B. Amberite IRC-50, adsorbiert, gestellten Stämmen verschieden sein. Die Erzeugung Die Verwendung dieses Harzes in Η-Form ist günstiger von Bleomycin in großen Mengen läßt sich mit Hilfe als in Na-Form. Dieses Harz wird in Η-Form in eine bekannter Verfahren erzielen, z. B. durch die Ver- Säule eingebracht. Dann wird die Bleomycin entbesserung des Stammes durch die Monosporenaus- haltende wäßrige Lösung durch die Säule hindurchwahl, die Behandlung mit ultraviolettem Licht, Röntgen- 20 geleitet, wobei das Züchtungsnitrat beispielsweise strahlen oder anderen Mutagenen und durch die Aus- auf einen pH-Wert von 4 bis 6,5 eingestellt ist. Die wahl von Medien, die für die Bleomycinerzeugung Säule wird anschließend durch Hindurchleiten von durch jeden verbesserten Stamm geeignet sind. Wasser gewaschen. Dann erfolgt die Elution mit ver-

Bleomycin ist hauptsächlich in dem flüssigen Teil dünnter Chlorwasserstoffsäure. Das erhaltene Bleoder Gärbrühe vorhanden. Der Bleomycin enthaltende 25 mycineluat wird auf einen pH-Wert von 5 bis 7 eingeflüssige Teil wird von der festen Masse in der ge- stellt und lyophilisiert oder im Vakuum getrocknet, züchteten Brühe durch bekannte Verfahren, wie z. B. Das Bleomycin in dem Eluat kann durch Zugabe von Filtrieren oder Zentrifugieren, abgetrennt. Wie später Lösungsmitteln, z. B. der lOfachen Menge Aceton, noch beschrieben werden wird, wird das Bleomycin worin das Bleomycin unlöslich ist, ausgefällt werden, an ein Ionenaustauschharz adsorbiert. Das Bleomycin 30 und das Präzipitat wird getrocknet,
wird nach der · Entfernung der festen Masse aus der Das Bleomycin in dem getrockneten Pulver wird in gezüchteten Brühe an das Harz adsorbiert. Das Methanol aufgelöst. Aus der Methanollösung läßt sich Ionenaustauschharzverfahren kann jedoch auch zur das Bleomycin durch Zugabe von Aceton, Äther usw. direkten Adsorption des Bleomycins aus der ge- ausfällen. Waschen des Bleomycin enthaltenden Pulzüchteten Brühe nach der Entfernung von großen 35 vers mit Äthanol dient zur Entfernung von Unrein-Partikeln in' der Brühe durch ein geeignetes Sieb heiten.

angewendet werden. Das in der gezüchteten Brühe Zur Reinigung des Bleomycins in Abhängigkeit

oder in dem Filtrat vorhandene Bleomycin ist für die von seiner Molekulargröße dienen Verfahren zur

Verdampfung im Vakuum oder die Zerstäubungs-. Trennung von Stoffen auf der Grundlage von Moleku-

trocknung ausreichend stabil. Der so gewonnene 40 largrößen, z. B. Verfahren, bei denen Sephadex-Säulen

getrocknete Stoff läßt sich für landwirtschaftliche verwendet werden. Eine wäßrige Bleomycinlösung

Zwecke verwenden. wird durch eine Sephadex-G25-Säule geleitet und das

Bleomycin wird praktisch nicht aus wäßriger aktive Eluat im Vakuum konzentriert oder lyophili-

Lösung in Lösungsmittel, wie z. B. Butanol, Äthyl- siert. Auf diese Weise wird Bleomycin gereinigt,

acetat, Äther oder Benzol, übergeführt. Die Lösungs- 45 Durch die Sephadex-Säulenchromatographie wurde

mittelextraktion kann gegebenenfalls zur Entfernung Bleomycin in Bleomycin A mit einem Rf-Wert von

von Unreinheiten angewendet werden. 0,94 bis 0,88 und Bleomycin B mit einem Rf-Wert

Die das Bleomycin enthaltende wäßrige Lösung von 0,70 bis 0,66 getrennt. Diese Rf-Werte ergaben

kann durch die Destillation im Vakuum konzentriert sich bei einer Papierchromatographie, bei der 10 %

und getrocknet werden. Während dieses Vorgangs 50 Ammoniumchlorid verwendet wurden. Außer diesen

wird der pH-Wert vorzugsweise auf 6 bis 7 gehalten, beiden Hauptkomponenten des Bleomycins wurden

weil das Bleomycin in diesem pH-Bereich am stabilsten zwei oder drei antibakterielle Stoffe in sehr geringen

ist. Das Waschen des getrockneten Stoffes mit Lösungs- Mengen festgestellt. Das so erhaltene gereinigte Bleo-

mitteln, wie z. B. Aceton, Butanol, Äthanol oder mycin A und B ist weiß oder weiß mit einem blaß-

Äthylacetat, in denen Bleomycin praktisch unlöslich 55 grünen bis bläulichen Farbton,

ist, ist zweckmäßig, um Unreinheiten, die in den Bei der Probe mit der Papierchromatographie unter

verwendeten Lösungsmitteln löslich sind, zu entfernen. Verwendung von 10 % Ammoniumchlorid zeigten die

Das Bleomycin in dem getrockneten Stoff läßt sich in gezüchtete Brühe und der aus der gezüchteten Brühe

Wasser oder Methanol auflösen. Das in Wasser oder durch die Verwendung des Amberite-IRC-50-Harzes

Methanol aufgelöste Bleomycin läßt sich mit Lösungs- 60 gewonnene Extrakt gewöhnlich zwei große Punkte

mitteln ausfällen, in denen Bleomycin unlöslich ist und zwei oder drei kleine Punkte, die eine antibakte-

und die sich mit Wasser oder Methanol vermischen rielle Wirkung gegen Mycobacterium phlei aufwiesen,

können. Bleomycin bedeutet hier jeden der Stoffe oder die

Das Bleomycin in wäßriger Lösung oder in der Mischung der Stoffe, die die beiden Hauptpunkte

gezüchteten Brühe wird an Aktivkohle adsorbiert 65 haben. Mit anderen Worten, die Mischung dieser

und aus der Kohle an der Säureseite durch wäßriges beiden Hauptstoffe oder jeder dieser Stoffe wird Bleo-

Methanol, wäßriges Äthanol, wäßriges Aceton oder mycin genannt, sofern nicht anders angegeben. Unter

mit Wasser gesättigtes Butanol eluiert. Die Bleomycin- diesen Stoffen wird der Stoff mit dem Rf-Wert

0,94 bis 0,88 mit Bleomycin A und der Stoff mit dem Rf-Wert 0,70 bis 0,66 mit Bleomycin B bezeichnet. Mit Ausnahme ihres unterschiedlichen Rf-Wertes sind sich Bleomycin A und B sehr ähnlich.

Die Eigenschaften des Bleomycins werden wie folgt beschrieben. Bleomycin liegt in Form eines blaßgrünlich- oder -bläulichweißen Pulvers vor. Ein eindeutiger Schmelzpunkt wurde nicht festgestellt, jedoch zersetzte sich das abgetrennte. Bleomycin-A-Pulver und Bleomycin-B-Pulver bei über 196⁰C.

Bleomycin und das-Chlorhydrat von Bleomycin sind löslich in Wasser/löslich in Methanol, etwas löslich in Äthanol und schwer löslich in Aceton, Äthylacetat, Butylacetat und Äther.

Bleomycin wird an ein Kationenaustauschharz ad-■ sorbiert und mit wäßrigen anorganischen Säuren eluiert.

F i g. 1 zeigt die ultravioletten Absorptionsspektren des Bleomycins A und B, wo die Absorptionen bei 243 bis 244 ΐημ und die Maximalabsorptionen bei 290 bis 295 ΐημ, liegen;

F i g. 2 zeigt die infraroten Absorptionsspektren des Bleomycins A und B in KBr-Pastillenf orm, wo die Maximalabsorptionen bei den Wellenzahlen (cm-¹) 3380 bis 3220, 2940, 1715 (kurz), 1650, 1635 bis 1605, 1560 bis 1540, 1510, 1450 bis 1440, 1380 bis 1365, 1250, 1090 bis 1045 und 1010 (kurz) liegen.

Bleomycin ergibt positive Pauly-, Ehrlich-, Dragendorf- und Permanganat-Reaktionen, jedoch negative Molish-, Biuret-, Elson-Morgan- und Maltol-Reaktionen. Wie nachstehend beschrieben werden wird, wird das Bleomycin A ferner in sechs Komponenten getrennt, die alle eine negative Sakaguchi-Reaktion ergeben. Bleomycin Al, A2 und A3 ergeben eine negative Ninhydrin-Reaktion und Bleomycin A4, A5 und A 6 eine positive Ninhydrin-Reaktion. Das Bleomycin B wird in fünf Komponenten getrennt, die alle eine negative Ninhydrin-Reaktion und eine positive Sakaguchi-Reaktion ergeben. Somit ergibt das Bleomycin, d. h. Bleomycin A und B, je nach der Menge der Komponenten positive oder negative Ninhydrin- und Sakaguchireaktionen.

Auf einem mit 10 % Ammoniumchlorid entwickelten Papierchromatogramm erschien BleomycinA bei einem Rf-Wert von 0,94 bis 0,88 und Bleomycin B bei einem Rf-Wert von 0,70 bis 0,66. Auf einem mit n-Propanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser (15:10: 3 :12) entwickelten Papierchromatogramm erschien Bleomycin A bei einem Rf-Wert von 0,50 bis 0,42 und Bleomycin B bei einem Rf-Wert von 0,57 bis 0,54. Bei einer Papierchromatographie, bei der 2% p-Toluolsulfonsäure enthaltendes, mit Wasser gesättigtes n-Butanol verwendet wurde, verschob sich selbst nach einer 72stündigen Entwicklung weder das Bleomycin A noch das Bleomycin B vom Rf-Wert 0.
DiewäßrigeBleomycinlösung absorbierte dieD-Linie,

ίο und es war schwierig, ihre optische Rotation festzustellen.

Da das Bleomycin nicht im kristallinen Zustand gewonnen wird, ist es schwierig, die Molekularformel des Bleomycins festzustellen, bis- die Struktur bestimmt wird. Ferner läßt sich die vollständige Reinigung des Bleomycins A und B schwer erreichen. Jedoch ergaben sich bei einem Chlorhydrat des Bleomycins A und B, das im höchstmöglichen Maße gereinigt worden war* folgende analytische Werte: Chlorhydrat des Bleo-

ao mycins A: C 45,28, H 6,83, N 15,42, O 22,96, S. 5,13, C14,12;ChlorhydratdesBleomycinsB:C42,01,H6,58, N 15,04, O 23,82, S 5,06, Cl 7,16. Eine Probe des Chlorhydrats des Bleomycins B wurde blaßblau gefärbt, und es wurde durch eine Untersuchung mittels fluoreszierender Röntgenstrahlen festgestellt, daß sie Metalle enthielt. Cu, F und K wurden in dem Verhältnis Cu28:Fe8:K0,05 angezeigt. Dementsprechend enthielt Bleomycin B O,33^fl/o Cu, als alle in Bleomycin B enthaltenen Metalle als Cu berechnet wurden. Im Falle des Bleomycins A betrug der berechnete Cu-Wert 0,26%. Somit ergibt die Addition der analytischen Werte sowohl beim Bleomycin A als auch beim Bleomycin B 100,00%. Es war im Verlauf der Reinigung des Bleomycins unmöglich, die grünliche Farbe aus dem Bleomycin zu entfernen, und

es wurde festgestellt, daß Bleomycin eine Chelat-Bildung mit Kupfer aufrechterhält. Eine Probe gereinigtes Bleomycin A enthielt jedoch nahezu kein Kupfer.

Bleomycin bildet saure Salze, wie z. B. Chlorhydrat und Sulfat, und es werden Reineckat und Helianthat ausgefällt.

Bleomycin A und B weisen eine antimikrobische Aktivität gegen verschiedene Bakterien und Fungi, einschließlich Erregern von Krankheiten bei Pflanzen, auf. Die Aktivität, die nach dem Agarstreifenverfahren ermittelt wurde, ist in der folgenden Tabelle angegeben:

Organismen

Minimale Hemmungskonzentration
(mcg/ccm)

Bleomycin A I Bleomycin B

Staphylococcus aureus (FDA 209P)

Staphylococcus aureus (Terajima)

Bacillus anthracis

Bacillus subtilis (NRRL B-558)

Bacillus subtilis (PCI 219)

Sarcina lutea (PCI 1001) ,

Micrococcus flavus (M-16)

Escherichia coli NIHJ

Escherichia coli (beständig gegen Streptomycin)

Escherichia coli (beständig gegen Neomycin) .......

Escherichia coli (beständig gegen Chloramphenicol)

Escherichia coli -(beständig gegen Kanamycin)

Escherichia coli (beständig gegen Streptomycin)

Klebsiella pneumoniae PCI 602

Salmonella typhi 63

Salmonella typhimurium 1406

Salmonella paratyphi A 1015

1,6	bis	0,05	0,8	bis	6,25
0,1			0,4	bis	0,1
25-			12,5
1,6			0,2
0,025			0,1	bis	0,8
1,6			1,6	bis	0,4
3,125	bis	1,6	1,6	bis	0,8
3,125	bis	1,6	0,8	bis	0,8
3,125	bis	1,6	1,6	bis	0,4
3,125	bis	0,8	1,6	bis	0,8
1,6	bis	1,6	0,8	bis	0,8
3,125	bis	1,6	1,6	bis	0,8
3,125	bis	1,6	1,6
3,125	bis	1,6	1,6	bis	0,2
3,125	bis	0,8	1,6
1,6	bis	0,8	0,4
1,6		1,6

Organismen

Minimale Hemmungskonzentration

(mcg/ccm)
Bleomycin A I Bleomycin B

Salmonella paratyphi B 8006

Salmonella paratyphi C Hirschfeld S-33

Salmonella cholerac suis 1348

Shigella dysenteriae 2-1684

Shigella dysenteriae Ohara

Shigella flexneri la-1701

Shigella boydii 1-65

Shigella sonnei 1-1196

Proteus vulgaris OX-19

Pseudomonas pyogenes A3

Corynebacterium xerosis

Mycobacterium phlei

Mycobacterium 607

Mycobacterium (beständig gegen Streptomycin) Mycobacterium (beständig gegen Kanamycin) .

Cladosporium sphaersperum

Colletrichum phomoides

Corticium centrifuges

Fusarium lini

Fusarium oxysporum

Fusarium roseum

Gibberella fujikuroi

Gibberella saubinetii

Gloeosporium kaki

Glomerella laginarium

Helminthosporium seanum

Oiricularia grisea

Piricularia oryzae

Selerotium roefsii

Pseudomonas solanacearum

Xanthomanas oryzae

Aspergillus niger

Candida albicans 3417

Candida albicans YU-1200

Cryptococcus neoformans 7496

Histoplasma capsulatum 4206

Trichophyton mentagrophytes 640

Botritis bassiana

Saccharomyces cervisiae 11299

Saccharomyces cervisiae, petit

1,6	bis 0,8	3,125	bis 1,6
0,8		0,2
0,8	bis 0,4	0,4	bis 0,2
0,2		0,4	bis 0,2
50	bis 25	12,5
0,2		0,4	bis 0,2
1,6	bis 0,8	0,8	bis 0,4
1,6	bis 0,8	0,4
0,4		0,2
	>100		>100
0,1	bis 0,05	0,2	bis 0,1
0,0004	bis 0,0002	0,0004	bis 0,0002
0,2		0,4
0,1	bis 0,05	0,1
0,1	bis 0,05	0,2	bis 0,1
50		100
25		50
1,6		3,2
25			>100
50			>100
1,6 ■		6,2
	>100		>100
	>100		>100
0,8		1,6
1,6		6,2
0,4 ■		0,8
50		100
	>100		>100
0,2		1,8
100			>100
0,4		0,8
	>100		>100
	>100		>100
	>100		>100
6,2		100
0,4		1,6
	>100		>100
	>100		>100
25		100
12,5		25

Die Toxizität des Bleomycins war gering. Die intravenöse Injektion von 8 mg pro Maus führte nicht zum Tode.

Bleomycin wirkte hemmend auf Tumore bei Versuchstieren, z. B. Sarcoma 180, und auf den Ehrlich-Tumor bei Mäusen, als es 10 Tage lang in einer Menge von täglich 25 meg pro Maus injiziert wurde. HeLa-Zellen in einer Gewebezüchtung wurden bei 25 bis 12,5 mcg/ccm gehemmt, jedoch wurden Yoshida-Sarcoma-Zellen in einer Gewebezüchtung bei 10 meg/ ecm nicht gehemmt. Bleomycin A zeigte Ehrlich-Carcinoma und Sarcoma 180 eine stärkere Aktivität als Bleomycin B.

Um zu bestätigen, daß Bleomycin ein neuer Stoff ist, muß das Bleomycin mit bekannten Antibiotika verglichen werden. Von den bekannten Antibiotika, die wachstumshemmend auf grampositive und -negative Bakterien wirken, können Streptomycin, Kanamycin und Paromomycm leicht von Bleomycin unterschieden werden, und zwar im Hinblick auf die Papierchromatographie, bei der p-Toluolsulfonsäure enthaltendes, mit Wasser gesättigtes Butanol verwendet wird, auf die Wachstumshemmung ihrer resistenten Organismen, das antibakterielle Spektrum und die Wirkung gegen Tumore. Da Bleomycin von Windungen bildendem Streptomyces erzeugt wird, muß es mit Actinospectacin oder Phleomycin verglichen werden, die von Windungen bildenden Streptomycetes erzeugt werden. Actinospectacin unterscheidet sich dadurch von Bleomycin, daß es auf Staphylococci bei 10 bis 100 mcg/ccm wachstumshemmend wirkt und gegen Sarcoma 180 bei Mäusen keine hemmende Wirkung hat.

Das von den jetzigen Erfindern entdeckte Phleomycin besitzt wachstumshemmende Aktivität ■ gegen grampositive und -negative Bakterien, Ehrlich-Carcinoma und Sarcoma 180 bei Mäusen, und der Phleomycin bildende Stamm hat viele gemeinsame Eigenschaften mit dem Bleomycin bildenden Stamm.

Bleomycin muß also mit Phleomycin sorgfältig verglichen werden. Bei einem Vergleich ihrer antibakteriellen Aktivität wurden folgende bedeutende Unterschiede festgestellt:

Versuchsorganismen

Minimale Hemmungskonzentration

(mcg/ccm)
Bleomycin A I Bleomycin B I Phleomycin

Staphylococcus aureus FDA 209 P

Bacillus subtilis PGI219

Escherichia coli NIHJ

Klebsiella pneumoniae PCI 602 ...

Salmonella typhi 63

Mycobacterium phlei

Mycobacterium 607

Selerotium roefsii ,

0,8

0,025

3,125

3,125

3,125

bis 1,6
bis 1,6
bis 1,6

0,0004 bis 0,0002

0,2

0,2

1,6

0,1

0,8 bis 0,4

1,6 bis 0,8

1,6

0,0004 bis 0,0002

0,4

1,8

0,025
0,0001
0,1
0,4
1,6

0,0004
0,0125
50

Bleomycin läßt sich von Phleomycin auch hinsieht-Hch der Stabilität im sauren und alkalischen Zustand unterscheiden. So wurde eine wäßrige Lösung von Bleomycin A und B von 100 mcg/ccm auf einen pH-Wert von 2 und 9 eingestellt und bei Zimmertemperatur gehalten. Nach mehrstündiger Aufbewahrung wurde ein Teil der jeweiligen Lösungen entfernt und hinsichtlich seiner Aktivität gegen Mycobacterium phlei gemessen. Das Ergebnis ist in der folgenden Tabelle angegeben, und es ist ersichtlich, daß Bleomycin erheblich stabiler an der Säure- und Alkaliseite als Phleomycin ist.

Stoffe

0 Minuten

Verbliebene Aktivität (%) nach einer Aufbewahrung von
Minuten I 30 Minuten I 60 Minuten I 120 Minuten I 240 Minuten

Bleomycin A
Bleomycin B
Phleomycin

Bleomycin A
Bleomycin B
Phleomycin

100

100

89

100
78

100

100

85

100

61

87

80-

53

74

49

85
84
39

65

37

59
63
21

53
46
20

20
20

Bleomycin und Phleomycin lassen sich ferner bei einer mit 10% Ammoniumchlorid entwickelten Papierchromatographie voneinander unterscheiden. So ergibt Bleomycin A einen Rf-Wert 0,94 bis 0,88, während Phleomycin zwei bis sechs Punkte bei einem Rf-Wert unter 0,81 zeigt. Bleomycin B läßt sich nicht leicht durch die Papierchromatographie von Phleomycin unterscheiden, jedoch können sie durch die unterschiedlichen Absorptionsspektren des ultravioletten Lichts voneinander unterschieden werden. Phleomycin zeigt zwei Absorptionsmaxima bei 244 bis 246 und 301 ΐημ, während Bleomycin B Absorptionen bei 243 bis 244 mp, und maximale Absorptionen bei 291 bis 295 ταμ zeigt, wobei Elf_m größer als bei Phleomycin bei 301 πιμ ist.

Die oben beschriebenen Eigenschaften des Bleomycins, Bleomycins A und Bleomycins B, die mit dem Ionenaustauschharz und mit der Sephadex-G25-Chromatographie aus der gezüchteten Brühe gewonnen wurden, reichen aus, um Bleomycin von bekannten Antibiotika zu unterscheiden. Bei der Dünnschichtchromatographie des Bleomycins, bei der Silikagel G und 10% Ammoniumacetat—Methanol (1:1) verwendet wurden, ergaben sich Bleomycin Al, A2, A3, A4, A5 und A6 im Bleomycin A und Bleomycin Bl, B 2, B 3, B 4 und B 5 im Bleomycin B. Bleomycin A und B haben die Eigenschaft, eine'Chelatbildung mit Kupfer aufrechtzuerhalten, und wurden mit größerer Leichtigkeit in ihren Kupfer enthaltenden Formen gereinigt. Daher erfolgte die weitere Reinigung, d. h. die Trennung in die Komponenten, in den Kupfer enthaltenden Formen des Bleomycins A und B. Die Tonerdechromatographie war ebenfalls ein nützliches Reinigungsverfahren, und obgleich es nahelag, daß durch dieses Verfahren die Toxizität erhöht würde, wurde die Tonerdechromatographie angewendet, um die physikalisch-chemischen Eigenschaften jeder Komponente des Bleomycins zu klären. Als Bleomycin in Methanol aufgelöst und mit der Tonerdechromatographie unter Verwendung von Methanol behandelt wurde, erhöhte sich beim Bleomycin die Toxizität bei Mäusen (drei- bis vierfach), und der therapeutische Index des so behandelten Bleomycins verkleinerte sich gegenüber dem Bleomycin vor der Behandlung um das Drei- bis Vierfache. Daher wurde veranlaßt, daß eine geringfügige Strukturänderung während dieses Verfahrens eintrat. Zweckmäßig wurde das mit der Tonerdechromatographie behandelte Bleomycin A und B mit Bleomycin At bzw. Bt bezeichnet. Das Kupfer enthaltende Bleomycin At und Bt wurde mit Cu-At bzw. Cu-Bt bezeichnet und durch Zugahe von Kupferchlorid gewonnen. Bleomycin Cu-At und Cu-Bt wurde durch die Steigungssäulenchromatographie unter Verwendung einer CM-Sephadex-C25-Säule und von wäßrigem Ammoniumformiat, dessen Konzentration von 0,1- auf l,0molar erhöht wurde, weitergereinigt. Cu-At wurde in sechs aktive Komponenten, nämlich Cu-AtI, Cu-At2, Cu-At 3, Cu-At4, Cu-At 5 und Cu-At 6, getrennt. Cu-Bt wurde in fünf Komponenten, nämlich Cu-BtI, Cu-Bt2, Cu-Bt3, Cu-Bt4und Cu-Bt5, getrennt. Im allgemeinen waren Cu-At2 und Cu-At5 die Hauptkomponenten von Cu-At und Cu-Bt2 und Cu-Bt4 die Hauptkomponenten von Cu-Bt. In der folgenden Tabelle sind die Konzentrationen des Ammoniumformiats, bei denen diese Komponenten eluiert wurden, der Rf-Wert jeder Komponente bei einer Papierchromatographie mit Verwendung von 10 % NH₄Cl (PC)₃ die Rf-Werte bei einer Dünnschichtchromatographie mit Verwendung von Silikagel G und 10% Ammoniumacetat—Methanol (1:1) (DSC)

und die Relativbeweglichkeit (Rb) bei der Hoch-Spannungselektrophorese mit Verwendung von Ameisensäure — Essigsäure — Wasser (Volumenverhältnis 25: 72: 900, pH-Wert 1,8) bei 2000 V und 25 mA (HSE) angegeben. Die Rb-Werte wurden unter Verwendung von L-Alanin als Bezugsstoff berechnet (Rb 1,0).

Cu-At und Cu-Bt	Konzentration des Formiats in Mol	Rf bei PC	Rf bei DSC	Rb bei HSE
Cu-AtI	0,10 bis 0,15	0,92	0,74	0,66
Cu-BtI	0,10 bis 0,15	0,71	0,75	0,58
Cu-At2	0,15 bis 0,20	0,83	0,40	0,79
Cu-Bt2	0,20 bis 0,25	0,72	0,68	0,74
Cu-At 3	0,20 bis 0,25	0,85	0,13	0,91
Cu-At4	0,30 bis 0,35	0,85	0,49	0,92
Cu-Bt3	0,30 bis 0,35	0,71	0,68	0,80
Cu-At 5	0,35 bis 0,40	0,86	0,51	0,84
Cu-Bt4	0,40 bis 0,45	0,72	0,60	0,78
Cu-Bt 5	0,55 bis 0,60	0,70	0,52	0,86
Cu-At6	0,55 bis 0,60	0,88	0,30	0,84

Bei der Papierchromatographie, bei der 10% Ammoniumchlorid verwendet wurden, zeigten alle Cu-At-Komponenten des Bleomycins Rf-Werte zwischen 0,83 und 0,92 und alle Cu-Bt-Komponenten Rf-Werte zwischen 0,70 und 0,72. Alle Gu-At- und Cu-Bt-Komponenten ergaben positive Pauly-, Ehrlich-, Dragendorf- und Permanganat-Reaktionen. Cu-AtI, Cu-At2 und Cu-At 3 ergaben eine negative Ninhydrin-Reaktion. Cu-At 4, Cu-At 5 und Cu-At 6 ergaben eine positive Ninhydrin-Reaktion. Alle Cu-Bt-Komponenten ergaben eine negative Ninhydrin-Reaktion. Alle Cu-At-Komponenten ergaben eine negative Sakaguchi-keaktion und alle Cu-Bt-Komponenten eine positive Sakaguchi-Reaktion. Alle Cu-At- und Cu-Bt-Komponenten ergaben negative Tollens-, Ferrichlorid-, Fehling- und Molish-Reaktionen. Alle Cu-At- und Cu-Bt-Komponenten zeigten ähnliche ultraviolette Absorptionsspektren mit Maxima bei 244 und 295 ηιμ. F i g. 3 zeigt die ultravioletten Absorptionsspektren von Cu-At2, Cu-At5 und Cu-BtI F i g. 4 zeigt, die infraroten Absorptionsspektren von Cu-At 2, Cu-At 5 und Cu-Bt2. Die Elementaranalyse von Cu-At2 ergab folgendes Resultat: C 41,16, H 5,98, N 14,76, O 26,86, S 5,09, Cl 0,45, Cu 3,74, insgesamt 98,04. Cu-At und Cu-Bt ergaben ihre kupferfreie .Form durch die Behandlung mit 8-Hydroxyquinolin oder mit Dithizon an der Säureseite. Bei einem Vergleich der Antitumor-Aktivität zeigten Cu-At 2 und Cu-At 5 einen höheren therapeutischen Index als Cu-Bt, und Cu-Bt 4. Cu-At 5 zeigte den höchsten therapeutischen Index.

Ein genauerer Vergleich zwischen Bleomycin und Phleomycin läßt sich durch die Gegenüberstellung jeder Komponente des Bleomycins mit jeder Komponente des Phleomycins anstellen. Ein blaues, 4,38 % Kupfer enthaltendes Phleomycinpulver, das durch das Ionenaustauschharzverfahren mit anschließender Tonerdechromatographie gewonnen worden war, wurde durch die stufenweise Elution aus einer CM-Sephadex-C25-Säule unter Verwendung von Ammoniumformiat (1 bis 5%)» d.h. grundsätzlich durch das gleiche Verfahren, wie es für Bleomycin angewendet wurde, weitergereinigt. Dann wurde Phleomycin in Phleomycin A, B, C, Dl, D 2, E, F, G, H und I getrennt. Die Konzentrationen des Ammoniumformiats, bei denen die Komponenten eluiert wurden, waren wie folgt: A und B 0,79molar, C 0,16molar, Dl und D 2 0,24molar, E0,32molar, F 0,395molar, G 0,47molar, H 0,63molar, I 0,71molar. Jedes Phleomycin wurde von jedem Bleomycin Cu-At durch eine Papierchromatographie, bei der 10% NH₄Cl verwendet wurden, und- eine Sakaguchi-Reaktion unterschieden. Jedes Phleomycin zeigte einen Rf-Wert

ίο unter 0,80 und ergab eine positive Sakaguchi-Reaktion. Jedes Phleomycin mit Ausnahme von C, D 2 und F hatte Maxima bei 244 ΐημ (EiS_n 120 bis 140) und 301 πιμ (Εΐ™ 40 bis 50) und unterschied sich dadurch von allen Cu-At- und Cu-Bt-Komponenten des Bleomycins. Phleomycin C, D 2 und F hatte Maxima bei 244 πιμ (Elä, 120 bis 145) und 295 πιμ (EU 90 bis 115), und dieses ultraviolette Spektrum war dem der Cu-At- und Cu-Bt-Komponenten des Bleomycins ähnlich. Daher wurden C, D 2 und F mit der Cu-Bt-Gruppe

ao des Bleomycins sorgfältig verglichen. Es ergab sich, daß Bleomycin Cu-Bt2 und Cu-Bt 5 nicht von Phleomycin C bzw. F unterschieden werden konnten. Die anderen wurden durch die Dünnschichtchromatographie unterschieden. Somit wurde jedes Bleomycin außer Cu-Bt 2 und Cu-Bt 5 von jedem Phleomycin unterschieden. Phleomycin ergab eine positive Ehrlich-, Dragendorf- und Sakaguchi-Reaktion, jedoch eine negative Ninhydrin-Reaktion.
Es wird erwartet, daß Bleomycin für die Therapie gegen infektiöse Krankheiten beim Menschen, beim Tier und bei Pflanzen und insbesondere für die Therapie gegen bösartige Tumore nutzbar ist, und zwar wegen seiner relativ geringen Toxizität, seiner starken antimikrobischen Aktivität und seiner starken Antitumoraktivität.

Nachstehend werden Verfahren zur Herstellung und Isolierung von Bleomycin beispielsweise beschrieben. Es ist naheliegend, daß sich auf Grund der bekannten Züchtungseigenschaften von Streptomycetes und auf Grund der oben beschriebenen' Eigenschaften des Bleomycins leicht Variationen oder Änderungen an den beschriebenen Verfahren durchführen lassen.

Die folgenden Beispiele dienen lediglich zur Erläuterung, und die Erfindung ist nicht auf sie beschränkt.

Beispiel 1

Der Stamm B80-Z2 wurde in einem Medium, das aus 1% Glucose, 1% Stärke, 0,75% Fleischextrakt, 0,75 % Pepton und 0,3 % NaCl (anfänglicher pH-Wert 7,0) bestand, 5 Tage lang bei 27 bis 28 ⁰C unter Schütteln gezüchtet. Myceliummasse wurde aus der gezüchteten Brühe durch Filtrieren entfernt, und das Filtrat von 3,41 enthielt 1,23 mg Bleomycin. Das Filtrat (pH-Wert 7,8) wurde auf den pH-Wert 6,4 eingestellt und durch eine Säule aus 300 ecm IRC-50 (Η-Form; Durchmesser 2,8 cm) hindurchgeleitet. Die Fließgeschwindigkeit betrug 10 ecm pro Minute. Nach dem Hindurchleiten des Brühenfiltrats wurde die Säule mit destilliertem Wasser gewaschen. Der Ausfluß und das Wasser zeigten keine Potenz, was auf die Adsorption des Bleomycins schließen ließ. Durch die Säule wurde 0,2n-HCl mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ecm pro Minute hindurchgeführt und das Eluat in jeweils 50 ecm fraktioniert. Bis zur zwölften Fraktion betrug der pH-Wert 5,4 bis 4,8 und war kein Bleomycin enthalten. Bei der dreizehnten Fraktion und danach sank der pH-Wert auf 2,0 ab. Bei der

609 570/502

vierzehnten Fraktion verringerte sich der pH-Wert auf unter 1. Bleomycin war in den 450 ecm der dreizehnten bis einundzwanzigsten Fraktion enthalten. Diese Fraktionen wurden unmittelbar nach der Elution mit Amberite IR-4B (OH-Form) neutralisiert. Die aktiven Fraktionen wurden kombiniert und lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver wurde mit Methanol (30 ecm) extrahiert und vom Rückstand abgetrennt. Der Rückstand wurde zweimal mit jeweils 10 ecm Methanol extrahiert. Diese Methanolextrakte wurden kombiniert und in 500 ecm Äthyläther getan. Das entstandene Präzipitat. wurde 4urch Zentrifugieren gesammelt und bei Zimmertemperatur im Vakuum getrocknet, und man erhielt 1,808 g eines bräunlichen Pulvers. Dieses Pulver enthielt 1,2 mg Bleomycin, und lmg des Pulvers enthielt 0,67 meg Bleomycin.

Beispiel 2

Von dem Bleomycinchlorhydratpulver, das im Beispiel 1 gewonnen worden war und das eine Aktivität von 0,67 mcg^mg aufwies, wurden 1,7 g genommen und mit 25 ecm Äthanol extrahiert. Das in Äthanol un-* lösliche Pulver wurde in Methanol aufgelöst und die Methanollösung dureh eine Säule (Durchmesser 1,3 cm) aus 5 g Tonerde (Sorte 1) hindurchgeleitet. Die Elution aus dieser Säule wurde nacheinander mit Methanol, 10%igem wäßrigem Methanol und 20°/oigan wäßrigem Methanol vorgenommen. Bleomycin wurde in absolutem Methanol und 10%igem wäßrigem Methanol eluiert. Dieses Bleomycin enthaltende Eluat wurde im Vakuum konzentriert und getrocknet, und man erhielt 550 mg eines bräunlichen Pulvers, das 1,7 meg Bleomycinchlorhydrat pro Milligramm enthielt.

Beispiel3

In zwei Gärbehälter (301 Fassungsvermögen) aus rostfreiem Stahl wurden jeweils 101 eines Mediums eingebracht, das aus 3,5% Sojabohnenmehl, 2,5% Stärke, 0,5% Glucose, 0,3% NaCl, 0,1% K₂HPO₄, 0,05% Zinksulfat und 0,01% CuSO₄ bestand (anfänglicher pH-Wert 7,0). Nach der Sterilisierung des Mediums wurden 600 ecm einer Brühe des Stamms B 80-Z2, die 2 Tage lang in dem gleichen Medium unter Schütteln gezüchtet worden war, in das Medium eingeimpft. Die Gärung erfolgte bei 27 bis 29 ⁰C unter Zuführung von 101 Luft pro Minute und unter Verrühren bei 500 U/min. Dem Medium wurden als Antischaummittel vor Beginn der Gärung 0,0033% Silikonöl und während der Gärung insgesamt 50 ecm Sojabohnenöl zugesetzt. 10 ecm der Brühe wurden an verschiedenen Tagen der Gärung entnommen, und der pH-Wert und der Bleomycingehalt waren wie folgt:

Gär behälter	2	3	4	Ta 5	ge 6	8	9	10
Nr. 1 pH ...	58	58	64	64	6?	54	57	6?
meg/ ecm ...					4,5	5,8	18,2	80,0
Nr. 2 pH ... meg/ ecm ...	5,8	5,8	5,4	5,8	5,0	5,0	5,8	6,0
—	—	—	—	4,5	5,1	13,7	29,5

Nach einer Gärung von 10 Tagen wurde die Brühe in den beiden Gärbehältern gekühlt und mit HCl auf den pH-Wert 4,6 eingestellt. Das Mycelium wurde durch eine kontinuierlich arbeitende Kaltzentrifuge entfernt und mit Filterpapier filtriert, worauf man ein klares Filtrat erhielt. Das so erhaltene Filtrat von 111 entMelt 358,5 mg Bleomycin. Dieses Filtrat wurde durch eine Säule (Durchmesser 5,5 cm) aus 1750 ecm Amberite IRC-50 hindurchgeleitet. Nach dem Waschen der Säule mit destilliertem Wasser wurde die Elution mit 0,2n-HCl durchgeführt.

Das Bleomycin in dem Eluat ist in der folgenden Tabelle angegeben:

Fraktion	Volumen	T)H	Bleomycingehalt	mg
Nr.	ecm	pn	mcg/ccm	0
1	580	4,8	0	2,9
2	1830	4,8	1,62	69,5
3	480	2,0	145,5	252,5
4	650	I4O	387,5	24,4
5	550	1,0	62,5	14,6
6	430	1,0	34,5

Die Fraktionen Nr. 3 bis 6 wurden kombiniert und mit Amberite IR-4B (OH-Form) neutralisiert. Das neutrale Eluat wurde im Vakuum konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das so erhaltene bräunliche Pulver wurde mit Methanol (150 ecm) extrahiert. Der in Methanol unlösliche Teil (11,59 g) enthielt 57,5 mg Bleomycin (4,98 mcg/mg). Die Methanollösung wurde destilliert und zu Pulver getrocknet. Das Pulver wurde mit 100 ecm Äthanol extrahiert. Das in Äthanol unlösliche Pulver (4,038 g) enthielt 293 mg Bleomycin (72,5 mcg/mg). Dieses gräuliche Pulver wurde in 5 ecm destilliertes Wasser aufgelöst und durch eine Sephadex-G25-Säule (200 ecm, Durchmesser 2,0 cm) hindurchgeleitet. Danach wurde die Elution mit destilliertem Wasser durchgeführt. Der Ausfluß wurde in Fraktionen von jeweils 5 ecm getrennt, und jede Fraktion wurde lyophilisiert.

	Ausfluß	Farbe	Bleomycingehalt	mg	Lyophilisiertes Pulver	Gewicht	Bleomycingehalt	mg
Fraktion Nr.		Farblos	mcg/ccm	0	mg	mcg/mg
	• Blaßbraun	0	—	_		0,15
1 bis 10	Blaßbraun	—		62,3	0,24	0,17
11 bis 13	Blaßbraun		0,11	29,5	5,6	0,13
14	Blaßbraun	0,02	0,42	36,4	3,49	0,13
15	Blaßbraim	0,084	0,92	45,1	2,84	0,88
16	Blaßbraun	0,184	1,26	53,0	16,50	2,14
17		0,256	30,6	70,00
18

(Fortsetzung)

	Ausfluß	Farbe	Bleomycingehalt	mg	Lyophüisiertes Pulver	Gewicht	Bleomycingehalt	mg
Fraktion Nr.		Braun	mcg/mg	2,78	mg	mcg/mg	5,15
	Braun	0,555	1,53	68,0	76,00	3,53
19	Braun	0,21	1,04	115,0	30,60	1,83
20	Grünlichbraun	0,21	64,5	86,2	21,35	44,0
21	Grün	12,9	69,5	160,4	275,00	49,5
22	Grün	14,0	57,0	233,3	339,00	76,0
23	Grün	11,4	40,3	244,6	310,00	82,5
24	Bläßgelblichgrün	8,05	31,3	249,5	332,00	52,0
25	Blaßgelblichgrün	6,23	7,75	270,5	192,00	26,9
26	Blaßgelb	1,56	3,91	331,9	51,00	4,60
27	Blaßgelb	0,78	5,75	371,4	12,20	—
28		0,29	1192,5	—
29 bis 32

Die Bleomycin enthaltenden Fraktionen wurden einer Papierchromatographie unterzogen, bei der Toyo-Filterpapier Nr. 51 verwendet wurde und die mit 10%iger Ammoniumchloridlösung nach der aufsteigenden Methode entwickelt wurde. Nach 3- bis 4stündiger Entwicklung lief das Lösungsmittel etwa 30 cm, und das Filterpapier wurde luftgetrocknet. Die Bioautographie der Papierchromatogramme wurde gegen Mycobacterium phlei durchgeführt. Hierbei zeigten die Fraktionen Nr. 13 bis 15 eine kleine Hemmungszone bei Rf 0,51 bis 0,57, die Fraktionen Nr. 16 bis 23 eine große Hemmungszone bei Rf 0,94 bis 0,88 (Bleomycin A) und die Fraktionen Nr. 24 bis 29 eine Hemmungszone bei Rf 0,70 bis 0,66 (Bleomycin B). In den Fraktionen nach der dreißigsten Fraktion wurde neben Bleomycin B bei Rf 0,70 bis 0,66 ein anderer Stoff festgestellt, der eine teilweise Hemmung bei Rf 0,83 zeigte.

Beispiel 4

Die Fraktion Nr. 24 der Sephadex-G25-Chromatographie im Beispiel 3 ergab 244,6 mg Bleomycinpulver (Bleomycingehalt 76 mg, 310 mcg/mg), und dieses Pulver wurde im warmen Zustand in 20 ecm Methanol aufgelöst. Nach dem Kühlen wurde das unlösliche Pulver, das 35,5 mg betrug (Bleomycingehalt 1,49 mg, 42 mcg/mg), abfiltriert, und der Methanollösung wurden 20 ecm Äthanol zugesetzt, worauf man ein feinpulvriges Präzipitat erhielt. Dieses Pulver von 46,9 mg (Bleomycingehalt 1,87 mg, 39,8 mcg/mg) wurde durch Filtrieren entfernt, und das Filtrat erzeugte _kein weiteres Präzipitat durch Zugabe von 70 ml Äthanol. Diese Lösung wurde im Vakuum destilliert und ergab ein praktisch farbloses Bleomycinpräzipitat. Nach Konzentrierung auf ein Volumen von 20 ecm wurde es 6 Stunden lang bei einer Temperatur von 0 bis 5° C gehalten, und nach Filtrieren und Trocknen erhielt man 95 mg eines blaßbläulichen Pulvers. Dieses Pulver zersetzte sich bei 192 bis 196⁰C auf einem Mikroblock und enthielt 742,5 meg Bleomycinchlorhydrat pro Milligramm. Die Elementaranalyse ergab C 42,06%, H 6,52%, N 15,09%, 0 23,42%, Cl 12,24% und Cu 0,27% (die Asche wurde als Kupfer berechnet). Bei einer mit Ammoniumchlorid entwickelten Papierchromatographie wurde festgestellt, daß dieses Pulver hauptsächlich Bleomycin B enthielt.

Andererseits wurden 100 mg der Fraktion Nr. 22 (Bleomycingehalt 27,5 mg, 275 mcg/mg) wie oben beschrieben behandelt, und man erhielt schließlich 27,9 mg gereinigtes weißes Pulver. Die Elementaranalyse dieses gereinigten Bleomycinchlorhydratpulvers ergab folgendes Resultat: C 45,20%, H 6,84%, N 15,43%» O 23,52%, Cl 9,32% und Cu 0,08%.

Beispiel 5

633 mg Pulver, das 0,65 mg Bleomycin enthielt (1,03 mcg/mg), wurden in eine Säule (Durchmesser 1 cm) aus Zellulosepulver (10 g) gegeben, die mit einer n-Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser-Mischung (Volumenverhältnis 15 :10: 3 : 2) behandelt wurde. Die Trennungschromatographie wurde mit der gleichen Lösungsmittelmischung durchgeführt. Als der Ausfluß in jeweils 5 ecm fraktioniert wurde, wurde das ganze Bleomycin in den Fraktionen Nr. 6 bis 16 gefunden. Diese aktiven Fraktionen wurden gesammelt und auf ein Volumen von etwa 5 ecm konzentriert. Diesen 5 ecm wurden 50 ecm Äthyläther zugesetzt, worauf man das Bleomycinpräzipitat erhielt. Nach dem

Trocknen des Präzipitats wurde mit Äthanol ge-

. waschen und der in Methanol unlösliche Teil wurde entfernt. Der in Methanol lösliche Teil wurde in eine zehnfache Menge Äthyläther getan und ergab 36,27 mg eines Pulvers mit einem Bleomycingehalt von 0,62 mg (1,7 mcg/mg).

Beispiel 6

1980 g eines braunen Pulvers, das eine Aktivität von 3 μg/mg aufwies und durch das IRC-50-Harz-Verfahren aus dem Züchtungsfiltrat gewonnen wurde, wurden in einer Menge von 4 ccm/g in Methanol aufgelöst. Der unlösliche Teil wurde entfernt. Die Methanollösung wurde im Vakuum bei 20 bis 30° C konzentriert, bis sie nahezu trocken war, und dann wurde Äthanol in einer Menge von 2 ccm/g zugesetzt. Das Äthanol wurde entfernt. Das erhaltene getrocknete Pulver enthielt Bleomycin und wurde ferner zweimal nach dem gleichen Verfahren behandelt, d. h. Auflösung in Methanol (4 ccm/g), Konzentration im Vakuum, Zugabe von Äthanol (2 ccm/g). Man erhielt dann 58,1 g eines bräunlichen Pulvers mit einer Aktivität von 93 μg/mg. 34 g dieses Pulvers wurden in

170 ecm Methanol aufgelöst, und dieser Methanollösung wurden 27,2 ecm 5%iges Kupferchlorid in Methanol zugesetzt. Die Menge der Kupferchloridlösung wurde dadurch bestimmt, daß die notwendige

Menge für die Chelatbildung gemessen wurde, die durch die optische Dichte bei 620 πιμ bestimmt wurde. Die Lösung wurde 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur gehalten und filtriert. Das Filtrat wurde in eine Tonerdesäule (340 g Tonerde in Methanol) gegeben. Ferner wurde Methanol hindurchgeleitet, und das aus dem blauen Ring gewonnene Eluat wurde im Vakuum verdampft, und man erhielt 7,9 g eines blauen Pulvers, das Bleomycin Cu-At und Cu-Bt enthielt. Wird die Aktivität im Vergleich mit der Arbeitsnorm des Bleomycins gezeigt, so ergibt sie 215 μg/mg. 4 g dieses Pulvers wurden in destilliertem Wasser aufgelöst, und die Lösung wurde durch eine Sephadex-625-Säule (4 · 80 cm) hindurchgeleitet. Die Fließgeschwindigkeit betrug 0,5 ccm/m. Als das blaue Band an der Säule nach unten kam, wurde das blaue Eluat in Abhängigkeit von den Ergebnissen der Analyse bei der Papierchromatographie in drei Teile getrennt. Aus dem ersten Teil erhielt man 517 mg eines bläuen Pulvers mit einer Aktivität von 506 μΐη/mg. Bei der Papierchromatographie mit Verwendung von 10% NH₄Cl ergab sich, daß dieses Pulver Bleomycin-Cu-At (Rf 0,85 bis 0,95) enthielt. Aus dem zweiten Teil erhielt man 166 mg eines bläuen Pulvers mit einer Aktivität von 520 μg/mg. Dieses Pulver enthielt Cu-At und Cu-Bt. Der dritte Teil ergab 3154 mg eines bläuen Pulvers mit einer Aktivität von 111,6 μg/mg und einem Cu-Bt-Gehalt (Rf 0,70 bis 0,75). Nach dem gleichen Verfahren erhielt man aus einem anderen Züchtungsfiltrat 1,903 g eines blauen Cu-At-Pulvers mit einer Aktivität von 269 μg/mg. Dieses Pulver wurde in 0,lmolarem Ammoniumformiat (pH 6,4) aufgelöst und in eine CM-Sephades-C25-Säule (2 · 35 cm) getan. Es wurde eine Stufenelution durch Erhöhen der Konzentration des Ammoniumformiats von 0,1- auf l,0molar vorgenommen. Die optische Dichte des Ausflusses wurde ständig bei 253 ΐημ abgelesen, und die einen einzigen Stoff enthaltenden Fraktionen wurden kombiniert und lyophilisiert. Man erhielt folgende Komponenten: Cu-AtI 33,9 mg (300μg/mg); Cu-At2 220 mg (644μg/mg); Cu-Bt2 (Verunreinigung in Cu-At) 7,2 mg (2240 μg/ mg); Cu-At3 15,1mg (67^g/mg); Cu-At4 3,6 mg; Cu-At5 72,7 mg (1460μg/mg); Cu-Bt4 (Verunreinigung in Cu-At) 8,8 mg (2800 μg/mg); Cu-At6 3,5 mg. Aus 1,908 g Cu-Bt mit einer Aktivität von 345 μg/mg wurden nach dem gleichen CM-Sephadex-C25-Chromatographieverfahren folgende aktive Komponenten gewonnen: Cu-Bt2 125,2 mg (2240μg/mg); Cu-Bt4 50 mg (2100 μg/mg). Aus anderen Proben erhielt man kleine Mengen Cu-BtI, Cu-Bt3 oder Cu-Bt5 zusammen mit Cu-Bt2 und Cu-Bt4.

Beispiel 7

525,2 mg Bleomycin-Cu-At mit einer Aktivität von 94 μg/mg, die nach dem im Beispiel 6 beschriebenen Verfahren gewonnen worden waren, wurden in 40 ml 0,In-HCl aufgelöst und wiederholt mit 0,5 % Dithizon enthaltendem Chloroform extrahiert, bis keine rötlichviolette Farbe zurückblieb. Nach der Entfernung des Chloroforms wurde die Lösung mit Dowex-3-Harz neutralisiert und lyophilisiert. Auf diese Weise wurde Kupfer entfernt, und man erhielt 475 mg eines weißen Pulvers mit einer Aktivität von 112 μg/mg.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verwendung von Streptomyces verticillus ATCC 15 003 zur Herstellung des neuen Antibiotikums Bleomycin auf üblichem biologischem Wege unter submersen aeroben Bedingungen und Gewinnung aus dem Kulturmedium.

   Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

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