DE1182393B - Herstellung und Gewinnung eines neuen Antibiotikums - Google Patents

Description

• Herstellung und Gewinnung eines neuen Antibiotikums Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung eines neuen Antibiotikums, das im folgenden mit der Nr. 9671 R.P. bezeichnet wird. Dieses neue Produkt ist auf Grund seiner beträchtlichen antibakteriellen Wirkung auf die grampositiven Keime, insbesondere Staphylokokken und Streptokokken, von Interesse.
• Dieses neue Antibiotikum wird durch Züchtung eines im nachfolgenden vollständiger identifizierten Mikroorganismus, der dem Genus Streptomyces angehört und mit »Streptomyces 40037« oder »Streptomyces actuosus« bezeichnet wird, unter künstlichen Bedingungen erzeugt. Der Stamm Streptomyces actuosus, der das Antibiotikum Nr. 9671 R.P. erzeugt, ist beim Northern Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois, USA., unter der Nummer NRRL 2954 hinterlegt worden.
• Das kristallisierte 9671 R.P. ist in Chloroform, Dioxan, Pyridin, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxyd löslich und in Methanol, Äthanol, Essigsäureäthylester und Benzol schwach löslich. In Wasser und Petroläther ist es unlöslich.
• 9671 R.P. ergibt in folgenden Reaktionen negative Teste: Biuretreaktion, Reaktion nach S a k a g u c h i, Ninhydrinreaktion, Reaktion nach M i 11 o n, Reaktion nach F o 1 i n - D e n i s, Ferrichloridreaktion, Reaktion nach M o 1 i s c h, Reaktion mit Fehlingscher Lösung, Reaktion nach T o 11 e n s, Reaktion nach E h r 1 i c h, Ferrisalzreaktion des Maltols, Reaktion nach Zimmermann. Nach Hydrolyse liefert es einen positiven Test bei der Reaktion mit Ninhydrin, was zeigt, daß eine Polypeptidkette vorhanden ist.
• Das Antibiotikum enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel. Seine Elementarzusammensetzung ist die folgende: C 49,60/0, H = 4,0 0/,), 0 = 16,7 (/" N = 14,4 0/0, S 15,8 0/0.
• Das Antibiotikum besitzt die folgenden physikalischen Eigenschaften: Aussehen Gelbes mikrokristallines Pulver (Nadeln) Schmelzpunkt 310 bis 320'C (Zersetzung im Block Maquenne) Drehvermögen = + 38' (c = 10/, in Pyridin) Ultraviolettspektrum (die Messung wurde mit einer IOVg/cm3 enthaltenden Lösung in Wasser mit einem Gehalt von 10/, Dimethylformamid durchgeführt) Absorptionsmaximum bei 242 mp, Ell! = 525 Absorptionsmaximum bei 322 m[L Ell = 229 Infrarotspektrum (die Messung wurde an festen, mit Kaliumbromid verpreßten Produkten vorgenommen) Dieses Spektrum ist in der Figur wiedergegeben, in der als Abszisse einerseits die Wellenlängen in Mikron (unterer Maßstab) und andererseits die Wellenzahlen in cm-' (oberer Maßstab) und als Ordinaten die Transmissionen in % aufgetragen sind-In der nachfolgenden Tabelle I sind die Hauptbanden der Infrarotabsorption für dieses Produkt wiedergegeben.

  Tabelle 1

  3350 st 1342 m 1017 m

  3125 1308 m 990 sch

  2930 1235 m 940 sch

  1745 m 1210 m 918 m

  1655 s st 1168 m 890

  1532 sst 1150 m 843 m

  1484 st 1112 822 sch

  1425 m 1101 m 790 m

  1385 sch 1061 m 752 st

  s st = sehr stark,

  st = stark,

  rn = mittel,

  sch = schwach.

  Das Antibiotikum 9671 R.P. kann durch die Papierchromatographie identifiziert werden. Es wurde auf Papier Arches Nr.302, das mit einem m/15-Phosphatpuffer von pH 7 imprägniert war, chromatographiert, wobei absteigend mit verschiedenen Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen entwickelt wurde. Die Auswertung der Chromatogramme erfolgte durch Bioautographie auf Nähragarplatten, die mit S. aureusoder B. subtilis beimpft waren. Die erhaltenen Rf-Wertesind indernachfolgendenTabellellangegeben.

  Tabelle 11

  Entwicklungslösungsmittel (obere Schicht des Gemisches der verschiedenen Bestandteile) Rf

  Benzol -# n-Butanol 4.- Wasser (95:5:25 Volumina) ........................................... 0,15

  Essigsäureäthylester + Methylisobutylketon --#- Wasser (20:80:25 Volumina) .................... 0,15

  Essigsäureäthylester + Methylisobutylketon + Wasser (50:50:25 Volumina) .................... 0,30

  Essigsäureäthylester + Benzol + Wasser (40:60:25 Volumina) ............................ 0,05

  Cyclohexan #- n-Butanol + Wasser (80:20:25 Volumina) ...................................... 0

  Mit Wasser gesättigter Essigsäureäthylester ............................................... 0,50

  Die bakteriostatische Wirkung von 9671 R.P. gegenüber einer gewissen Zahl von Keimen wurde durch eine der üblicherweise zu diesem Zweck angewendeten Verdünnungsmethoden bestimmt. Für jeden Keim wurde die kleinste Konzentration an Substanz, die jegliche sichtbare Entwicklung in einer geeigneten Nährbouillon verhindert, bestimmt. Die Ergebnisse der verschiedenen Bestimmungen sind in nachfolgender Tabelle 111 zusammengestellt, in der die minimalen bakteriostatischen Konzentrationen in Mikrogramm Substanz je Kubikzentimeter Versuchsmedium ausgedrückt sind.

  Tabelle 111

  Minimale

  Geprüfter Mikroorganismus bakteriostatische

  Konzentration

  in #tgfcml

  Staphylococcus aureus, Stamm 209 P - ATCC 6538 P .............................. 0,0009

  Staphylococcus aureus, Stamm 133 (Institut Pasteur) ................................ 0,0019

  Staphylococcus aureus, Stamm B, (resistent gegen Streptomycin und Penicillin) ...... 0,003

  Staphylococcus aureus, Stamm Hb (resistent gegen Tetracyclin und Penicillin) .......... 0,003

  Staphylococcus aureus, Stamm Launoy 1 (resistent gegen Tetracyclin, Streptomycin,

  Chloramphenicol und Penicillin) ............................................... 0,0038

  Staphylococcus aureus, Stamm Launoy 2 (resistent gegen Tetracyclin, Streptomycin und

  Penicillin) ................................................................... 0,0021

  Staphylococcus aureus, Stamm Beaujon 3 (resistent gegen Tetracyclin, Streptomycin,

  Chloramphenicol und Penicillin) .................................. » ............ 0,003

  Staphylococcus aureus, Stamm 2700 R (resistent gegen Streptothriein) ................. 0,0025

  Staphylococcus aureus, Stamm 1142 R (resistent gegen Congocidin) ................... 0,0005

  Staphylococcus aureus, Stamm 3486 R (resistent gegen Spiramycin) ................... 0,0009

  Staphylococcus aureus, gegen Carbomycin resistenter Stamm ........................ 0,0005

  Staphylococcus aureus, gegen Erythromycin resistenter Stamm ....................... 0,0033

  Staphylococcus aureus, gegen Chloramphenicol resistenter Stamm .................... 0,0012

  Stapbylococcus aureus, gegen Novobiocin resistenter Stamm ......................... 0,001

  Staphylococcus aureus, gegen Aclinomycin resistenter Stamm ........................ 0,0012

  Mierococcus citreus - ATCC 8411 ............................................... 0,0038

  Micrococcus lysodeikticus - ATCC 4698 ......................................... 0,003

  Gaffkya tetragena (Facult6 de Pharmacie) ......................................... 0,0042

  Sarcina lutea - ATCC 9341 ..................................................... 0,0011

  Sarcina alba (Facult# de Pharmacie) .............................................. 0,0019

  Streptococcus faecalis (Enterococcus von Thiercelin Facult6 de Pharmacie) ............ 0,0106

  Streptococcus faecalis - ATCC 9790 ............................................. 0,0007

  Streptococcus viridans (Institut Pasteur) ........................................... 0,0065

  Streptococcus pyogenes haemolyticus (Stamm Dig. 7 Institut Pasteur) ................. 0,00028

  Diplococcus pneumoniae (Stamm Til, Institut Pasteur) .............................. 0,00015

  Neisseria catarrhalis (Facult6 de Pharmacie) ....................................... 0,0017

  Lactobaeillus casei - ATCC 7469 ................................................ 0,0007

  Bacillus subtilis - ATCC 6633 .................................................. 0,003

  Bacillus subtilis (Stamm ZO 5 A, Facult6 de Pharmacie) ............................. 0,01

  Bacillus subtilis (Stamm 3 R 9675, Merck) - ATCC 9524 ........................... 0,13

  Bacillus cereus - ATCC 6630 ................................................... 0,0071

  Bacillus brevis - ATCC 2185 ................................................... > 138

  Tabelle Ill (Fortsetzung)

  Minimale

  Geprüfter Mikroorganismus bakteriostatische

  Konzentration

  in #tg/cml

  Bacillus mycoides .............................................................. 0,0043

  Mycobacterium smegmatis - ATCC 607 .......................................... > 138

  Mycobacterium smegmatis - ATCC 607 NR (gegen Neomycin resistenter Stamm) ..... 5,07

  Mycobaeterium smegmatis - ATCC 607 SR (gegen Streptomycin resistenter Stamm) ... > 138

  Mycobacterium phlei (Bakteriologisches Institut von Lyon) .......................... 0,17

  Mycobacterium para-smegmatis (A 75 - Lausanne) ................................ 19,2

  Escherichia coli - ATCC 9637 .................................................. > 138

  Shigella dysenteriae - Shiga L (Institut Pasteur) ................................... > 138

  Salmonella typhimurium (Institut Pasteur) ......................................... 138

  Salmonella paratyphi A (Lacasse, Institut Pasteur) ................................... > 138

  Salmonella schottmuelleri (paratyphi B) - (Fougenc, Institut Pasteur) ...... ........ . . > 138

  Bacillus lactis aerogenes (Facult6 de Pharmacie) .................................... > 138

  Aerobacter aerogenes - ATCC 8308 ............................................. > 138

  Alcaligenes faecalis - ATCC 8740 ..................................... ......... 0,0015

  Proteus vulgaris (Facult6 de Pharmacie) ........................................... > 138

  Proteus X 19 ........................................................ i ....... . . > 138

  Klebsiella pneumoniae - ATCC 10031 ....................... . ................... > 138

  Serratia marceseens (A. 476, Lausanne) ..... > 138

  Pseudomonas aeruginosa (Stamm Bass - Institut Pasteur) ................. > 138

  Brucella bronchiseptica (CN 387 - Welcome Institute) ............................... 138

  Pasteurella multocida (A. 125, Institut Pasteur) ........................... , ......... 0,0024

  Insgesamt zeigen die Ergebnisse, daß das Antibiotikum 9671 R.P. seine antibakterielle Wirkung insbesondere auf Bakterien ausübt, die die Färbung nach G r am annehmen. Außerdem ist das Antibiotikum 9671 R.P. bei Staphylokokkenstämmen wirksam, die gegen eines oder mehrere der folgenden Antibiotika resistent sind: Penicillin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Erythromycin, Novobiocin, Actinomycin, Streptothricin, Congocidin, Spiramycin, Carbomycin.
• Das Antibiotikum 9671 R.P. besitzt keine Wirkung auf folgende hefe- oder fadenförmige Pilze: Pestalozzia palmarum, Saccharomyces pastorianus, Steinphylium radicinum, Aspergillus niger, Candida albicans, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Penicillium chrysogenum.
• Außerdem wurde im Laboratorium gezeigt, daß das 9671 R.P. besonders wirksam gegen Staphylokokkeninfektionen der Maus war, wenn es in situ verabreicht wurde. Die Toxizität des Antibiotikums wurde hauptsächlich bei der Maus geprüft. Die maximal vertragene Dosis, d. h. die maximale Dosis, für welche bei den Tieren kein Todesfall beobachtet wird (DLJ, wurde durch Verabreichung des Produkts auf subcutanem, oralem und intraperitonealem Weg bestimmt.

  Subcutan ..... DL,) über oder gleich 1 g/kg

  Oral ......... DL,) über oder gleich 2,5 g/kg

  Intraperitoneal DL, = 0,5 g/kg

  Wenig toxisch für die Maus und gut vertragen vom Kaninchen bei Anwendung auf die Schleimhäute ist dieses Produkt ein Medikament der Wahl zur lokalen Behandlung von Infektionen mit grampositiven Kokken beim Menschen wie auch beim Tier. Insbesondere ist es sehr wirksam bei Euterentzündungen der Kuh. Der das neue Antibiotikum 9671 R.P. erzeugende Organismus gehört zum Genus Streptomyces und wird mit dem Namen »Streptomyces 40 037« bezeichnet.
• Dieser Organismus wurde aus einer, in der Nähe von Corrientes in Argentinien entnommenen Erdprobe' isoliert. Die Isolierungsmethode ist die folgende: Die entnommene Erdprobe wird in destilliertem sterilem Wasser suspendiert und die Suspension dann auf verschiedene Konzentrationen verdünnt. Ein kleines Volumen jeder Verdürmung wird auf die Oberfläche von Petrischalen aufgebracht, die ein Nährrnedium nach E m e r s o n oder irgendein anderes geeignetes Medium enthalten. Nach Inkubation von einigen Tagen bei 26'C werden die Kolonien der Mikroorganismen, die man isolieren will, auf Schrägagar versetzt, um reichlichere Kulturen zu erhalten.
• In der Klassifizierung von »Bergey's manual of determinative Bacteriologyej 7. Auflage (1957), für den Genus Streptomyces findet man keine Beschreibung einer Species, deren Züchtungscharakteristiken und biochemischen Eigenschaften mit denjenigen des Streptomyces 40 037 überemistimmen. Dieser Organismus kann daher als eine neue Species betrachtet werden, die den Namen »Streptomyces aetuosus« auf Grund ihrer großen Wirksamkeit erhalten hat. Mikroskopische Morphologie Die Kulturen auf Streifen im Medium nach B e n e t t zeigen, mikroskopisch untersucht, die Bildung von verzweigten Mycelfäden sowie Sporenketten, die für den Genus Streptomyces charakteristisch sind. Die Mycelfäden tragen sehr zahlreiche Sporenketten: Die Sporenfäden sind gewunden und verschieden lang. Die Sporen sind oval, etwa 1 #t breit und etwa 1,5 #t lang. Die Mycelfäden sind viel dünner als die Sporenfäden: sie besitzen eine Breite von etwa 0,6 bis 0,8#L. Allgemeine Eigenschaften Auf Medien, die »synthetische« genannt werden, weist S. actuosus im allgemeinen ein ungefärbtes bis blaß orange gefärbtes vegetatives Mycel auf und erzeugt kein lösliches Pigment oder schwach ockerfarbige oder braune Pigmente. Auf Medien, die »organische« genannt werden, bildet er ein vegetatives Mycel, dessen Färbung von gelbbraun bis dunkelbraun geht, und mehr oder weniger intensiv braune lösliche Pigmente je nach dem Medium und Alter der Kultur. Nicht auf allen diesen Medien erscheint ein Luftmycel. Wenn es erzeugt wird, ist es stets zu Beginn seiner Entwicklung weiß und färbt sich dann mittelgrau.
• Form der isolierten Kolonien Die Monosporenkulturen in Petrischalen auf einem Medium nach B e n e t t zeigen an den Rändern nicht ausgefranste, runde Kolonien: Die Kolonien sind ziemlich gewölbt und können eine zentrale Verdickung aufweisen. Das vegetative Mycel bildet zahlreiche Falten in Richtung der Radien: es ist blaßorangefarbig, ebenso wie seine Rückseite. Das Luftmycel erscheint ziemlich bald; es ist zunächst weiß und ändert sich dann mit fortschreitender Entwicklung, um mittelgrau zu werden, wenn es reif ist. Es bildet sich ein schwaches braunes Pigment in dem Agar.
• Eigenschaften der Kulturen und biochemische Eigenschaften Die Züchtungseigenschaften und die biochernischen Eigenschaften des Streptomyces actuosus wurden auf in üblicher Weise für die Identifizierung der Stämme von Streptomyces verwendeten Agar-Nährmedien und Nährbouillons untersucht. Die gemachten Beobachtungen sind in nachfolgender TabelleIV angegeben. Sie beziehen sich auf Kulturen, die 27 Tage lang bei 26'C inkubiert wurden. Der größte Teil der verwendeten Züchtungsmedien wurde nach den in *The Actinomycetes«, S. A. W a k s m a n, S. 193 bis 197, Chronica Botanica Company, Waltham (Mass.), USA., 1950, beschriebenen Formulierungen hergestellt. In diesem Falle sind sie durch die in »The Actinomycetes« gegebenen Zahlen bezeichnet.
• Die Kulturen wurden auf Schrägagar durchgeführt. Die Inkubation erfolgte bei 26'C. Zu den Stoffen, die ein rasches und vollständiges Wachstum mit Bildung von Luftmycel und Sporen innerhalb von 10 Tagen hervorrufen, gehören Glucose, Maltose, Lactose, Saccharose, Stärke, Dextrin, Xylose, Rafflnose, Ribose, Inulin, Fructose, Mannose, Arabinose, Rhanmose, Galactose, Mannit, Inosit, Mesoinosit, Glycerin, Natriumacetat, Natriumcitrat, Bernsteinsäure.
• Sorbose, Sorbit, Erythrit, Adonit und Dulcit ermöglichen keine Entwicklung oder führen nur zu einer außerordentlich beschränkten Entwicklunng. Man kann daher sagen, daß diese Stoffe nicht verwendbar sind.
• Vergleich von S. actuosus mit zwei in »Bergeys Manual of deterrninative Baeteriology« beschriebenen Streptomycesstämmen Diese beiden Stämme, Streptomyces fasciculus (ursprünglich von Krassilnikov beschrieben) und Streptomyces carnosus (von M i 11 a r d und B u r r beschrieben), sind diejenigen, die am meisten mit dem das Antibiotikum 9671 R.P. erzeugenden, Streptomyces actuosus genannten Stamm übereinstimmen. Die Unterschiede in den Züchtungseigenschaftenund den biochemischen Eigenschaften sind in Tabelle V angegeben.

  Tabelle V

  S. fasciculus S. eamosus S.actuosus

  Sporenfäden gerade gewunden

  Form der Sporen länglich zylindrisch oval

  Synthetischer Agar vegetatives Mycel blaß- ungefärbtes vegetatives

  mit Saccha- rauchgrau - ungefärb- Mycel: kein Exsudat

  rose (1) tes Exsudat über die

  gesamte Oberfläche in

  Tröpfchen

  Synthetischer Agar vegetatives Mycel ungefärbtes vegetatives

  mit Glucose (C) blaßgrauoliv Mycel

  Nähragar (5) Luftmycel wenig ent- kein Luftmycel

  wickelt, grau

  Gelatine (F) mittlere Verflüssigung rasche Verflüssigung langsame und unvollstän-

  dige Verflüssigung

  Milch (K) Koagulation, rasche Koagulation, anschließend keine Koagulation,

  Peptonisation Verflüssigung langsame Peptonisation

  Stärke (19) rasche Hydrolyse Hydrolyse langsame unvollständige

  Hydrolyse (im Dextrin-

  stadium aufgehört)

  Nitrat (H) schwache Reduktion zu Reduktion gute Reduktion

  Nitrit

  Das Herstellungsverfahren des Antibiotikums 9671 R.P. besteht im wesentlichen darin, den Streptomyces 40037 auf einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und anschließend das im Verlaufe der Züchtung gebildete Antibiotikum abzutrennen.
• Die Züchtung des Streptomyces 40037 kann nach jeder aeroben Oberflächenzüchtung oder Immersionszüchtung erfolgen, doch ist letztere aus Gründen der Bequemlichkeit zu bevorzugen. Man verwendet zu diesem Zweck die verschiedenen Apparaturtypen, die jetzt üblicherweise in der Technik der Fermentationen verwendet werden.
• Insbesondere kann man den folgenden Weg für die Durchführung der Arbeitsgänge einschlagen:

  Streptomyces 40037 - Stammansatz

  Kultur auf Agar

  Kultur im Kolben unter Bewegung

  Impfkultur im Fermentationsgefäß

  Produktionskultur im Fermentationsgefäß

  Das Fermentationsmedium soll eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und Mineralsalze und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese Elemente in Form von gut definierten Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können.
• Als assimilierbare Kohlenstoffquelle kann man Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Dextrine, Stärke, Melasse, oder andere Kohlehydratderivate, wie beispielsweise Zuckeralkohole, wie Glycerin, Mannit u. dgl., oder gewisse organische Säuren, wie Milchsäure, Citronensäure, Weinsäure u. dgl., verwenden. Gewisse tierische oder pflanzliche Öle, wie beispielsweise Schmalzöl oder Sojaöl, können mit Vorteil diese verschiedenen Kohlehydratquellen ersetzen oder ihnen beigefügt werden.
• Die geeigneten assimflierbaren Stickstoffquellen sind außerordentlich verschieden. Sie können sehr einfache chemische Substanzen sein, wie beispielsweise Nitrate, anorganische und organische Ammoniumsalze, Harnstoff und Aminosäuren. Sie können auch in Form von komplexen Substanzen, die den Stickstoff hauptsächlich in proteidischer Form enthalten, zugeführt werden, wie beispielsweise in Form von Casein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysaten, Sojamehlen, Arachismehlen, Fischmehlen, Fleischextrakten, Hefeextrakten, Distillers Solubles und Maisquellwasser.
• Unter den zugefügten mineralischen Elementen können gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder Calcium- oder Magnesiumcarbonat.
• Andere bewirken das zur Entwicklung des Streptoinyces 40037 und zur Erzeugung des Antibiotikums erforderliche Ionengleichgewicht, wie beispielsweise die Alkali- und Erdalkalichloride und -sulfate. Schließlich wirken gewisse in speziellerer Art als Aktivatoren der Stoffwechselreaktionen des Streptomyces 40037: Zu diesen gehören die Zink-, Cobalt-, Eisen-, Kupferi und Mangansalze.
• Zu Beginn der Züchtung soll der pH-Wert des Fermentationsmediums zwischen 6,0 und 7-5 liegen. Die zur Züchtung optimale Temperatur be#igt,26 bis 27'C, doch wird auch bei Temperaturen zwischen 23 und 35'C eine befriedigende Produktion erzielt. Die Belüftung der Züchtung kann zwischen ziemlich weiten Grenzwerten schwanken. Es wurde jedoch gefunden, daß Belüftungen von 0,5 bis 2 1 Luft je Liter Kulturflüssigkeit und Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute an Antibiotikum wird nach 3 bis 5 Tagen Züchtung erhalten, wobei diese Zeitspanne hauptsächlich von dem verwendeten Medium abhängt.
• Aus den vorstehenden Ausführungen ist ersichtlich, daß die zur Produktion des Antibiotikums angewendeten allgemeinen Bedingungen der. Züchtung des Streptomyces 40037 in ziemlich weitem Maße variieren können und jedem besonderen Erfordernis angepaßt werden können.
• Das Antibiotikum 9671 R.P. kann aus den Kulturmedien nach verschiedenen Methoden isoliert werden. Das Kulturmedium kann bei einem pH-Wert zwischen 6 und 9 filtriert werden, doch bleibt in diesem Falle ein beträchtlicher Teil der Aktivität in dem Filterkuchen, der zur Extraktion des Wirkstoffes ebenfalls behandelt werden muß. Es ist daher zu bevorzugen, die Filtration in einem pH-Intervall zwischen 1 und 6 durchzuführen. Unter diesen Bedingungen verbleibt die Aktivität in dem Filterkuchen, aus dem sie mit einem Lösungsmittel aus der Gruppe der aliphatischen Alkohole, wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Propanole oder Butanole, aus der Gruppe der Ketone, wie beispielsweise Aceton oder Methyhsobutylketon, oder aus der Gruppe der Ester, wie beispielsweise Essigsäureäthylester, extrahiert werden kann. Man kann das Fermentationsmedium auch mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel aus der Gruppe der aliphatischen Alkohole mit 4 oder 5 Kohlenstoffatomen, der Ketone oder der Ester extrahieren. In diesem Falle geht die Aktivität in die organische Phase, die von der wäßrigen Phase durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt wird.
• Das Rohprodukt kann aus den obengenannten organischen Lösungen durch Einengen der organischen Lösung auf ein geringes Volumen isoliert werden. Durch Abkühlen oder durch Zugabe eines Mittels, daß das Antibiotikum 9671 R.P. schlecht löst, wie beispielsweise Petroläther oder Cyclohexan fällt das rohe Antibiotikum aus. Wenn sich das Antibiotikum in dem Filtrat der Züchtungsmedien befindet, so extrahiert man diese Lösung mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie beispielsweise einem aliphatischen Alkohol mit 4 bis 5 Kohlenstoffatomen, einem Keton, wie beispielsweise Methylisobutylketon, einem Ester, wie beispielsweise Essigsäureäthylester oder Essigsäureamylester, oder einem chlorhaltigen Lösungsmittel, wie beispielsweise Chloroform oder Dichloräthan. Man verfährt dann wie oben angegeben: Einengen auf ein geringes Volumen und Ausfällen.
• Das Antibiotikum 9671 R. P. kann dann durch Auflösung des so erhaltenen Niederschlags in Essigsäure unter schwachem Erwärm= und durch Abkühlen kristallisiert werden. Falls das Roliprodukt zu unrein ist, um direkt kristallisiert zu werden, oder falls man wünscht, ein sehr reines Produkt zu erhalten, unterwirft man vorteilhafterweise das rohe Antibiotikum einer doppelten Reinigung. Die erste Reinigung besteht darin, das rohe Antibiotikum mit einem organischen Lösungsmittel, in dem es wenig oder nicht löslich ist, beispielsweise Methanol, Äthanol, Benzol oder Petroläther zu waschen, zu filtrieren und zu trocknen. Die zweite Reinigung besteht darin, das durch das oben beschriebene Waschen bereits teilweise gereinigte Antibiotikum einer Chromatographie zu unterziehen. Diese kann unter Verwendung einer Aluminiumoxydsäule durchgeführt werden, auf die man eine Lösung des Produkts in einem geeigneten Lösungsmittel führt. Als Lösungsmittel kann man beispielsweise ein chlorhaltiges Lösungsmittel, wie Chloroform oder Dichloräthan, oder ein Gemisch eines dieser chlorhaltigen Lösungsmittel mit einem Lösungsmittel, in dem das Antibiotikum wenig löslich ist, wie beispielsweise Methanoi oder Äthanol, verwenden. Das Produkt wird mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert. Das Eluat wird eingeengt, und das Antibiotikum wird durch Zugabe eines wie oben angegebenen Mittels, das es schlecht löst, ausgefällt.
• Die so gereinigten Produkte werden unter schwachem Erwärmen in Eisessig oder wäßriger Essigsäure gelöst. Nach Filtrieren der Lösung und Zugabe von Wasser wird die Kristallisation durch Abkühlen unter langsamer Bewegung bewirkt.
• Es ist ersichtlich, daß die verschiedenen angegebenen Methoden nacheinander in verschiedener Reihenfolge angewendet oder mehrere Male wiederholt werden können je nach den Fabrikationserfordernissen, um das Antibiotikum 9671 R.P. in einer für die vorgesehenen Anwendungszwecke geeigneten Form zu erhalten.
• Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Im folgenden wird die Aktivität stets nach einer Trübungsmethode mit Staphylococcus aureus 209 P als empfindlichem Keim und bezogen auf eine Probe des reinen und kristallisierten Produkts als Eichmaß bestimmt. Diese Aktivität ist daher in Mikrogrammen (lig) kristallisiertes Produkt je Milligramm für feste Produkte und in #tg kristallisiertes Produkt je Kubikzentimeter für Lösungen ausgedrückt. Beispiel 1 In ein Fermentationsgefäß mit 751 Inhalt britigt man folgendes Medium ein:

  MaisqueRwasser

  (50 11/0 Trockenextrakt) .......... 800 g

  Saecharose ...................... 1200 g

  Ammoniumsulfat ................. 80 g

  Leitungswasser .................. 351

  Man stellt den pH-Wert durch Zugabe von 20 em3 Natronlauge (d = 1,33) auf etwa 5,2 ein. Dann gibt man 300 g Calciumcarbonat zu.
• Das Medium wird durch 40minutiges Durchleiten von Dampf bei 122'C sterilisiert. Nach Sterilisation und Abkühlen auf 27'C beträgt das Endvolumen des Mediums 401 und der pH-Wert 7,15. Das Medium wird dann mit 250 cm3 einer gerührten bzw. geschüttelten Erlenmeyerkultur des Stamms Streptomyces 40037 beimpft.
• Die Kultur im Ferinentationsgefäß wird mit 3 m3 steriler Luft je Stunde belüftet und mit einem Propeller mit 400 UpM in Bewegung gehalten. Die Temperatur wird bei 27'C gehalten. Der pH-Wert des Mediums bleibt 4 Stunden auf seinem Ausgangswert (7,15) und fällt dann langsam ab, um 6,85 zu erreichen. Die Entwicklung des Pilzes entspricht diesem niedrigen pH-Wert und ist 28 Stunden nach der Beimpfung geeignet für die Beimpfung der Produktionskultur.
• Die Produktionskaltur wird in einem Fermentationsgefäß von 350 1 Inhalt durchgeführt, das mit folgenden Substanzen beschickt ist:

  Sojamehl ........................ 8 kg

  Distillers Solubles ................ 1 kg

  Glucose (hydratisiert) ............ 1 kg

  Sojaöl .......................... 41

  Caleiumcarbonat ................ 2 kg

  Natriumchlorid .................. 2 kg

  Wasser .......................... 1751

  Der pH-Wert des Mediums beträgt vor der Sterilisation 6,95. Das Medium wird durch 40minutiges Durchleiten von Dampf bei 122'C sterilisiert. Nach Sterilisieren und Abkühlen auf 27'C beträgt das Endvolumen des Mediums 2001 und der pH-Wert 7,20. Das Medium wird dann mit 20 1 der obigen Kultur aus dem Fermentationsgefäß von 75 1 Inhalt beimpft. Das Medium wird durch eine Turbine mit 205 UpM gerührt, mit 10 m3 steriler Luft je Stunde belüftet und auf 27'C gehalten.
• Der pH-Wert fällt während 24 Stunden langsam ab, wonach er wieder ansteigt. Mit diesem Wiederanstieg des pH-Werts beginnt die Produktion des Antibiotikums. Das Ende der Fermentation ist nicht durch eine Unterbrechung in der Kurve der Entwicklung des pH-Werts markiert. Es tritt nach etwa 90 Stunden ein. Die Aktivität des Mediums beträgt dann 295 #Lg/cm3.
• 190 1 der wie oben hergestellten Gärmaische mit einem Gehalt von 295 #tg/cm3 werden in ein mit einer Rühr- bzw. Schüttelvorrichtung versehenes Gefäß eingebracht. Die Maische wird 1 Stunde mit 110 1 Butanol in Bewegung gehalten, wobei der pH-Wert mit verdünnter Salzsäure auf 5 eingestellt wird. Dann werden 19 kg Filterhilfe zugegeben. Das Gemisch wird auf einer Filterpresse filtriert und der Kuchen mit 50 1 Wasser gewaschen. Die organische Phase wird abgetrennt und mit 11 1 Wasser von pH 9 und dann mit 11 1 Wasser von pH 5 gewaschen. Man trennt erneut die organische Schicht ab und engt sie unter vermindertem Druck auf ein Hundertstel des ursprünglichen Volumens der Maische, d. h. auf 1,9 1 ein. Nach 24stündigem Stehenlassen in einem Kälteraum wird der erhaltene Niederschlag abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält 88 g Rohprodukt mit einer Aktivität von 434 #tg/ing.
• Beispiel 2 70 g des gemäß Beispiel 1 erhaltenen Produkts mit einer Aktivität von 434 #tg/nig werden in 1400 cm3 Methanol suspendiert und 1 Stunde bei 30'C gerührt bzw. geschüttelt. Das unlösliche Material wird abgesaugt und getrocknet. Man erhält 29 g eines Produkts mit einer Aktivität von 825 ligl/mg.
• Dieses Produkt wird in 750 cm3 eines Chloroform-Methanol-Gemisches (90: 10 Volumina) gelöst. Die Lösung wird filtriert und dann an einer Säule, die 600 g Aluminiumoxyd enthält (Höhe der Säule 61 cm, Durchmesser 3,5 cm) chromatographiert. Das Chromatogramm wird entwickelt und mit 1500 CM3 des gleichen Chloroform-Methanol-Gemisches eluiert. Die reichen Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck auf 40 cm" eingeengt und mit 400 cm3 Hexan gefällt. Der Niederschlag wird abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält 23 g Produkt mit einer Aktivität von 950 #tg/mg.
• Eine Suspension von 10 g des zuletzt genannten Produkts (950 #tg/mg) in 200 cm3 Eisessig wird 5 Minuten auf 50'C erhitzt. Die Lösung wird filtriert, mit 2,5 cm3 Wasser versetzt und langsam abgekühlt. Die erhaltenen Kristalle werden abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält 8 g reines Produkt mit einer Aktivität von 1000 #tg/mg.
• Beispiel 3 1701 Fermentationsmaische mit einer Aktivität von 166 pg/cm3 werden in ein mit einer Rühr- bzw. Schüttelvorrichtung ausgestattetes Gefäß eingebracht. Der pH-Wert wird mit verdünnter Schwefelsäure auf 5 eingestellt. Es werden 95 1 Essigsäureäthylester zugesetzt, und das Gemisch wird 1 Stunde in Bewegung gehalten. Die organische Phase wird auf einer Zentrifuge abzentrifugiert, die sich zur Abtrennung eines organischen Lösungsmittels von einer wäßrigen Suspension unlöslicher Materialien eignet (Westphalia SKOG 205). Man gewinnt 821 organische Lösung, die gewaschen und dann unter vermindertem Druck auf 1,71 eingeengt wird. Nach Behandlung, wie im Beispiel 2 beschrieben, erhält man 61 g Produkt mit einer Aktivität von 320 #tg/mg.
• 35 g dieses Produkts werden in 700 cm3 Methanol suspendiert und 1 Stunde bei 30'C in Bewegung gehalten. Der Niederschlag wird abgesaugt und getrocknet. Man erhält 11,1 g Produkt mit einer Aktivität von 725 #tg/mg.
• Durch Auflösen von 10 g dieses Produkts in 200 cm3 Eisessig und Behandlung, wie im Beispiel 2 angegeben, erhält man 6,3 g kristalEsiertes Produkt mit einer Aktivität von 925 #tg/mg.

Claims (1)

1. Patentanspruch: Die Verwendung von Streptomyces actuosus (NRRL 2954) zur Herstellung des Antibiotikums 9671 R.P. durch übliche Züchtung, Gewinnung des Antibiotikums aus dem Kulturmedium und Reindarstellung.