DE1111341B - Herstellung und Gewinnung von Actinomycin P - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND KL.30h 6

EMTERNAT.KL. C 12 d

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT 1111341

P24574IVa/30h

ANMELDETAG: 10. MARZ 1960

BEKANNTMACHUNG
DER ANMELDUNG
UNDAUSGABE DER
AUSLEGESCHRIFT: 20. JULI 1961

Die Erfindung betrifft das Antibioticum ActinomycinP₂ in roher sowie in gereinigter Form und seine Herstellung, Konzentrierung und Isolierung. Actinomycin P₂ eignet sich zur Bekämpfung bösartiger Tumore bei Tieren und auch bei Menschen. Darüber hinaus wirkt es wachstumshemmend auf grampositive Bakterien, wodurch es sich für viele Anwendungsarten in der Human- und Veterinärmedizin, Industrie und Landwirtschaft eignet. Es eignet sich auch als Desinfektionsmittel und zur Trennung von Gemischen von Microorganismen für medizinische Diagnostik- und Forschungszwecke.

Der neu entdeckte Microorganismus, der bei dem erfindungsgemäßen Vorgang Verwendung findet, unterscheidet sich von anderen gewöhnlich Antibiotica erzeugenden Arten. Da es die schwachen Hyphen und Sporenketten, typisch für Mitglieder der Gattung Streptomyces, aufwies, wurde es auf Medien gepflanzt, die im allgemeinen zur Bestimmung von Organismen dieser Gattung dienen. Endgültige Prüfungen der Medien wurden nach 2wöchiger, in geeigneter Weise vorgenommener Inkubation durchgeführt.

Der neu entdeckte Microorganismus wurde als ein neuer Stamm von Streptomyces aurefaciens Duggar bestimmt. Es ist in der Kulturensammlung der Chas. Pfizer & Co., Inc., als Kultur A-500 genau festgelegt. Eine Kultur dieses Microorganismus wurde in der American Type Culture Collection, Washington, D. C, deponiert; dort erhielt er die Nummer 13 336. Das Aussehen der Kultur, das in der Tabelle I beschrieben ist, stimmt gut mit der Beschreibung dieser Species überein, doch weist sie die folgenden geringen Unterschiede auf: sie erzeugte in Milch ein lösliches rosa Pigment, während für S. aureofaciens keine Farbe beschrieben ist; sie Herstellung und Gewinnung von Actinomycin P₂

Anmelder:

Chas. Pfizer & Co., Inc., Brooklyn, N. Y. (V. St. A.)

Vertreter: Dr. W. Beil, A. Hoeppener und Dr. H. J. Wolff, Rechtsanwälte,

Frankfurt/M.-Höchst, Antoniterstr. 36

Beanspruchte Priorität: V. St. v. Amerika vom 10. März 1959

Koppaka Visveswara Rao, Pinebrook, N. J.,

William Stephen Marsh, Ringwood, N. J., und Donald Walter Renn, New Milford, N. J.

(V. St. A.),
sind als Erfinder genannt worden

wies auf Kartoffel-Nährböden ein orangefarbenes bis orangebraunes, lösliches Pigment auf, während Duggar feststellte: »Farbe der Kultur unverändert«; das Pigment der Kulturen wechselte in verschiedenen Medien von gelbbraun oder gelbgrün bis gelb und orangebraun, wogegen S. aureofaciens ein »goldgelbes« Pigment aufweist, wie beschrieben ist.

Tabelle I
Charakteristische Eigenschaften von Streptomyces aureofaciens, ATCC 13336

Medium	Wachstum	Luftmycel	Sporen bildung	Lösliches Pigment	Bemerkungen
Entrahmte Milch Glucose-Agar	gering gut	mäßig weißgrau gut; weiß bis gelbgrau, wird dunkler	keine grau	rosagelbbraun tiefgelbbraun	Vegetatives Mycel cremefarben bis fahlgelb bis stecknadel- kopfgroße dunkelgraue Punkte; Milch nicht geronnen, peptonisiert oder hydrolysiert; pH-Wert nicht verändert. Vegetatives Mycel nicht erkenn bar; Rückseite leuchtendgelb.

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Noch Tabelle I

Medium	Wachstum	Luftmycel	Sporen bildung	Lösliches Pigment	Bemerkungen
Nähragar	dürftig bis	dürftig, meist am	dunkel	leuchtendgelb	Vegetatives Mycel farblos wo
	mäßig	Grund des	grau		sichtbar; Rückseite gelb bis
		Schrägnähr			olivgrau.
		bodens weiß bis
		ganz dunkel
		grau
Synthetischer	mäßig	mäßig bis gut,	dunkel	gelb	Vegetatives Mycel farblos, so
Agar		weiß bis hell	grau		weit sichtbar; Unterseite gelb
		grau bis dunkler			bis olivgrau.
		grau
Calciummalat-	gut	gut; weiß bis	grau	gelb	Vegetatives Mycel gelb, soweit
agar		hellgrau bis			sichtbar; Rückseite gelb; Malat
		dunkelgrau			digeriert.
Stärke-	dürftig	fehlt	fehlt	kein	Vegetatives Mycel gelb; Unter
plättchen					seite gelb; Zone teilweiser Hy
					drolyse, 2,0 cm Durchmesser.
Gelatine-	dürftig	sehr dürftig;	fehlt	kein	Vegetatives Mycel gelblichhell
plättchen		weiß bis ganz			braun; Rückseite gelblichhell
		dunkelgrau			braun; Verflüssigungszone,
					Durchmesser 1,5 cm.
Cellulose	ausge	gut; weiß bis	dunkel	nichts, doch	Vegetatives Mycel nicht erkenn
	zeichnet	dunkelgrau	grau	Kante des ge	bar.
				spannten Strei
				fens gelborange
Kartoffel	ausge	mäßig bis gut;	hellgrau	gelb	Vegetatives Mycel goldgelb bis
stückchen	zeichnet	weiß bis gelb			tiefrötlichorangefarben; Rück
		lich bis hellgrau			seite rötlichorangefarben.
Dextrose-	gut	gut; weiß bis	dunkel	gelb	Vegetatives Mycel farblos bis
Nitrat-Brühe		dunkelgrau	grau		gelb; Nitrate werden zu Ni
					triten reduziert.
Emerson-Agar	ausge	gut; weiß bis	gelblich	gelblichbraun	Vegetatives Mycel nicht erkenn
	zeichnet	gelblichgrau	grau		bar; Rückseite gelblichbraun.
Glucose-	dürftig bis	sehr spärlich;	fehlt	nichts	Vegetatives Mycel farblos bis
Asparagin-	mäßig	gelblichweiß			gelb; Rückseite gelb.
Plättchen
					Auf zur Sporenbildung geeig
					neten Medien; Sporen werden
					in langen verschlungenen Ket
					ten gebildet, oval bis zylin
					drisch, 1,0 bis 1,3 · 1,6 bis
					1,9 μ, gebildet durch Teilung.

Selbstverständlich wird die erfindungsgemäße Herstellung des Antibioticums, Actinomycin P₂, nicht auf die erwähnten Organismen beschränkt. Vor allem wird beabsichtigt, auch Mutanten einzubeziehen, die durch verschiedene Mittel wie Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder Ultraviolettbehandlung, mit Senfgaskörpern, Einzelzellkulturverfahren u. ä. erhalten werden.

Actinomycin P₂ zeigt starke Wirksamkeit bei der Behandlung vieler verschiedener Infektionen, unter anderem Tumoren und anderen bösartigen Erkrankungen. Für diese Zwecke kann entweder die reine, kristalline Substanz oder eine der hierin an späterer Stelle genauer beschriebenen Rohformen Verwendung finden. Der ausgewählte Stoff muß weitgehend frei von dem bekannten giftigen Actinomycin B sein. Er muß so viel Antibioticum enthalten, daß dem Patienten eine tägliche Dosis von mindestens 50 bis etwa 500 γ reines Actinomycin P₂ pro Kilogramm Körpergewicht zugeführt werden. Actinomycin P₂ als reines kristallines Material oder in einer seiner rohen Formen kann in medizinischen Zusammensetzungen zusammen mit einem therapeutisch annehmbaren Trägermittel benutzt werden. Im allgemeinen enthält eine Zusammensetzung dieser Art mindestens 0,0001 Gewichtsprozent Antibioticum, kann aber auch 90 Gewichtsprozent oder noch mehr enthalten. Eine Zusammensetzung, die weniger als 0,0001% enthält, kann wohl wirksam sein, ist jedoch im allgemeinen nicht zufriedenstellend, da die Verabreichung einer ungewöhnlich großen Menge an Trägersubstanz erforderlich ist. Der Ausdruck therapeutisch annehmbarer Träger in dieser Erfindung umfaßt die üblichen Trägersubstanzen, die Mensch und Tier

unbedenklich verabreicht werden können. Sie können flüssig oder fest sein. Es können z. B. Trägersubstanzen wie Wasser, wäßriges Äthanol, einfacher Sirup, isotonische Salzlösung oder Glucose, Stärke, Lactose, Calciumphosphat usw. verwendet werden.

Bei Tieren mag es von Vorteil sein, die aktive Substanz in das Futter zu mischen. Der aktive Stoff kann oral oder parenteral verabreicht werden. Im Anfangsstadium der Behandlung ist parenterale Verabrei-

chung vorzuziehen, bis eine für den Patienten geeignete Behandlung gefunden ist; danach kann man weiterhin so vorgehen oder eine andere Verabreichungsart wählen.

Um die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Antibioticums gegen Tumore deutlich zu machen, ist die prozentuale Hemmwirkung von verschiedenen Arten des erfindungsgemäßen Mittels bei einer Anzahl Tumore bei Mäusen und Ratten in der Tabelle II angegeben.

Tabelle II Antitumor-Aktivität

Probe und Beschreibung	Dosierung (mg/kg)	Sterblichkeits rate	Prozentvergleich	72 (Durchschnitt aus fünf Versuchen)	Art des Tumors *
Actinomycin P2 (roh)	0,25 0,3 0,40 0,60	0/10 0/10 0/6 0/6	27 40 54 55 (Durchschnitt aus zwei Versuchen)	CA-755 CA-755 Sa-180 Sa-180
	0,75	1/6	13	Sa-180
	0,2	Tiere lebten l,75mal langer als Vergleichstiere (Durchschnitt aus zwei Versuchen)	L-1210
	0,1	0/8	HS Nr. 1

Wirksame Mindestkonzentration 0,03 y/cm³ HeLa

Actinomycin P2 (reines kristallines Material)	0,375 0,3	0/10 0/10	12 24 (Durchschnitt aus drei Versuchen)	0/6 1/6	57 54	CA-755 CA-755
	0,25	0/10	40 (Durchschnitt aus zwei Versuchen)	Tiere lebten 0,7mal langer als Vergleichstiere	CA-755
	0,5	0/6	58 (Durchschnitt aus zwei Versuchen)	Sa-180
	0,6 0,75	0/6 1/6	33 58	Sa-180 Sa-180
	0,45	Tiere lebten l,3mal langer als Vergleichstiere	L-1210
	0,375	Tiere lebten l,6mal langer als Vergleichstiere (Durchschnitt aus zwei Versuchen)	L-1210
	0,25	Tiere lebten l,7mal langer als Vergleichstiere	L-1210
	Wirksame Mindestkonzentration 0,05 bis 0,10 jVcm3 HeLa
Actinomycin P1 (reiner kristalliner Stoff	0,1 0,05	Sa-180 Sa-180
	0,25	L-1210

Wirksame Mindestkonzentration 0,02 y/cm^s HeLa

* In der Literatur angegebene Methoden zur Auswertung von Versuchen bei Tumoren sind die folgenden: S-180 (Sarcoma 180) — Reilly und Mitarbeiter, Cancer Research, 13, S. 684 (1953). HS Nr. 1 (Human sarcoma Nr. 1) — To ο lan, a. a. O., 13, S. 389 (1953). CA-755 (Mammary adenocarcinoma 755) — Gi 11 hör η und Mitarbeiter, Cancer Research Supplement, IH, S. 38 (1955). L-1210 (Lymphoid leukemia 1210) — L. W. Law, Journal Nat. Cancer Inst., 10, S. 179 (1949).

In der Tumortherapie kann Actinomycin P₂ vorteilhaft zusammen mit einem oder mehreren krebshemmenden Mitteln Verwendung finden. Zu diesem Zweck eignen sich Zusammensetzungen, die 10 bis 90 Gewichtsprozent aktive Bestandteile dieses Antibioticums enthalten. In derartigen Zusammensetzungen mit diesem Antibioticum verwendbare, krebshemmende Mittel sind die senfgasartigen, krebshemmenden Mittel, 6-Mercaptopurin, 8-Azaguanin, Urethan, 6-Diazo-5-oxo-l-norleucin (DON), Azaserin,

Triäthylenmelamin, Mitomycin C, Triäthylenphosphoramid, 1,4-Dimethylsulfonyloxybutan und die krebshemmenden Folsäureanalogen, Äthylcaramat

und ähnliche.

Zur Herstellung des Antibioticums verwendet man

ein wäßriges Nährmedium das pro Liter 10 g Glucose, 15 g Sojaöl, 50 g Maismehl, 2,5 g lösliche Rückstände aus der Alkoholdestillation (Distillers Solubles) und 2 g Calciumcarbonat enthält. Dieses Nährmedium wird vor der Behandlung im Autoklav auf den

p_H-Wert 7,0 gebracht. Als Impfmaterial können entweder Sporensuspensionen oder vorher hergestellte Züchtungen des Organismus benutzt werden. Die Gärung wird bei 28° C durch Schüttelkultur oder Gärung in kleinen, mechanisch belüfteten Gefäßen etwa 60 bis 80 Stunden lang durchgeführt. Man beobachtet den Gärungsverlauf durch Versuchsmethoden mit Normalplättchen unter Verwendung von B. subtilis oder Staph. aureus, Nr. 376.

Es ist eine Vielzahl von Gärungsmedien untersucht und als zufriedenstellend befunden worden. Es ist ein Medium erforderlich, das in der Hauptsache aus einer Stickstoffquelle, einem Kohlehydrat und Mineralstoffen besteht. Zu den den Anforderungen genügenden Stickstoffquellen gehören eine Vielzahl proteinartiger Stoffe wie verschiedene Arten hydrolysierter Caseine, Sojabohnenmehl, Casein, lösliche Rückstände aus der Alkoholdestillation, Maismehl usw. Geeignete Kohlehydratquellen sind Dextrose, Glycerin, Dextrin, Stärke usw. Weniger zufriedenstellende Ergebnisse werden mit Gemischen aus Lactose und gequollenem Mais erzielt. Obige Stoffe enthalten oft genügend Mineralien, um den Mineralstoffbedarf des Organismus zu decken, ohne daß zusätzlich größere Mengen Mineralbestandteile zugegeben werden müssen.

Sobald ein zufriedenstellendes Maß an antibiotischer Wirksamkeit erreicht ist, wird die Gärflüssigkeit nach 60- bis 80stündiger Gärung unter Verwendung von 3 bis 5 Gewichtsprozent Diatomeen-Filterhilfsmittel filtriert. Der Antibioticumgehalt des FiI-trats kann mit Hilfe eines nicht mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittels, wie vorzugsweise Butanol, Methylisobutylketon, Äthylacetat oder, weniger zufriedenstellend, Äther, Benzol, Toluol, Methylenchlorid, Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff, aus dieser entfernt werden. Ein Teil des antibiotisch wirksamen Gesamtstoffes bleibt in dem Mycelkuchen zurück, wenn das Nährmedium bei einem p_H-Wert von 4,0 filtriert wird. Dieser Teil kann ohne weiteres durch Extraktion des Kuchens mit einem niederen Alkanol wie Methanol, Äthanol oder Isopropanol gewonnen werden.

Es scheint, daß sich während des Gärprozesses von Streptomyces aureofaciens ATCC 13 336 mehr als eine antibiotisch wirksame Substanz bildet.

Der gewünschte Stoff kann durch die verschiedensten Mittel wie die bereits angegebenen isoliert werden. Als günstige Methode zur Isolierung der aktiven Stoffe empfiehlt sich die Verwendung von n-Butanol als Extraktionsmittel. Sie können gewonnen werden, indem einfach das Lösungsmittel bei vermindertem Druck verdampft wird; doch um die Zersetzung in möglichst kleinen Grenzen zu halten, ist es, wenn auch nicht notwendig, doch vorzuziehen, die Butanollösung azeotrop zu entfernen. Dies erreicht man durch die kontinuierliche Zugabe kleiner Mengen Wasser, während das Extraktionsmittel unter vermindertem Druck destilliert wird. Bei Atmosphärendruck enthält das azeotrope Gemisch 38% Wasser und 62% Butanol. Das Mischungsverhältnis kann bei vermindertem Druck etwas unterschiedlich sein, doch der Effekt ist der gleiche. Ist der größte Teil des Butanols entfernt, wird die verbleibende Lösung mit dem Mycelextrakt, vorzugsweise einem Methanolextrakt, vereinigt und das Gemisch unter vermindertem Druck fast bis zur Trockne konzentriert. Es wird in einer chromatographisch geeigneten Lösung, z. B.

Äthylacetat, aufgenommen und die Lösung durch eine mit dem gewählten Lösungsmittel befeuchtete Säule aus mit Säure gewaschener Tonerde geleitet. Zur Herstellung der Säule benutzt man annähernd 5 bis 15 g Tonerde pro Gramm rohes Antibioticum. Diese Säule wird mit dem Lösungsmittel — vorzugsweise Äthylacetat — gewaschen, bis der dunkelrote Streifen von ActinomycinB vollkommen eluiert ist. Man eluiert weiter, indem man stufenweise in zunehmendem Maße den Methanolgehalt in einem Gemisch aus Methanol und Äthylacetat erhöht. Die Fraktionen werden papierchromatographisch untersucht. Fraktionen, die 5 bis 10% Methanol — Äthylacetat enthalten, enthalten normalerweise auch den größten Teil des wertvollen erfindungsgemäßen Antibioticums. Diese Fraktionen werden vereinigt, fast bis zur Trockne konzentriert und aus einem Gemisch von Methylenchlorid kristallisiert.

Diese Produkt ist rohes Actinomycin P₂, in Wirk-

zo lichkeit ein Gemisch aus Actinomycin P₁, Actinomycin P₂ und Actinomycin P₃. Es kann medizinisch, d. h. zur Behandlung von Menschen und Tieren, die einen Tumor haben, verwendet werden. Daß die verschiedenen Fraktionen in dem Rohgemisch vorhanden

as sind, wird durch Papierchromatographie mit einem Benzol-Formamid-Gemisch nachgewiesen. Die Papierbögen werden in ein Gemisch aus Methanol und Formamid, Verhältnis 1:1, getaucht und vollgesaugt. Dann werden die Proben aufgetragen und mit Benzol, das mit Formamid gesättigt ist, entwickelt. Unter diesen Umständen ergaben sich für das Actinomycingemisch die folgenden R_rWerte: P₁ = 0,8 bis 1,0, P₂ = 0,5 bis 0,6, P₃ = 0,0 bis 0,2. Im Gegensatz zu den bekannten Actinomycinen wie Actinomycin B, C und D folgen die erfindungsgemäßen Actinomycinarten nicht der Lösungsmittelfront des Systems.

Ein Vergleich mit den bekannten Actinomycinarten hat ergeben, daß Actinomycin P₂ diesen gegenüber die folgenden Unterschiede aufweist:

1. Durch 16stündige Hydrolyse mit 6n-HCl bei 100° C und papierchromatographischem Vergleich wurde die Anwesenheit der folgenden Aminosäuren in Actinomycin P₂ festgestellt:

«-Hydroxyprolin,

Valin,

Sarcosin,

Threonin,

(Spuren von Prolin).

2. Die Elementaranalyse von drei bestimmten, aus verschiedenen Gärungsprozessen gewonnenen Proben ergab in sehr guter Übereinstimmung folgende Durchschnittswerte: C=56,19,H=7,29,N=12,37, 0 (Differenz)=24,15. Eine N-Methyl-Bestimmung ergab den Durchschnittswert 12,5.

3. Auf Grund der Anwesenheit des «-Hydroxyprolins in Actinomycin P₂ wird die Möglichkeit ausgeschlossen, daß dieses in den deutschen Patentschriften 944 395, 934715, 925 064 oder 930 579 als Actinomycin C₁, C₂ oder C₃ beschrieben ist. Die

darin beschriebenen Trennungsverfahren und -systeme sind nicht die gleichen wie jene, die bei Actinomycin P₂ Anwendung finden.

"Α. Bezüglich der deutschen Patentschrift 912010 (Actinochrysin) ist zu sagen, daß das Actinomycin P₂ bei den darin beschriebenen Bedingungen nicht aus Merck-Tonerde eluiert wird. Der Schmelzpunkt des Actinomycins P₂ liegt tiefer als bei Actinochrysin.

5. Ein Vergleich mit Actinomycin F₁ und F₃ (deutsche Auslegeschrift 1021131) zeigt, daß die Analyse von P₂ zwar mit F₁ übereinstimmt, doch enthält dieses kein Hydroxyprolin und kann deshalb nicht der gleiche Stoff wie P₂ sein. Die Analyse von F₃ sowie der Gehalt an Aminosäure beweisen, daß dieses nicht mit P₂ identisch ist.

Zur technischen Herstellung von Actinomycin P₂ benutzt man Tauchkulturen in den üblichen, dem Fachmann bekannten Geräten. Geeignete Behälter haben eine Größe zwischen 7500 und 76001 oder mehr und sind mit zweckdienlichen Rührwerken und Vorrichtungen zur aseptischen Belüftung des Inhalts mit bis zu 2 Volumen oder mehr Luft pro Minute ausgerüstet. Ein geeignetes Medium zur Produktion auf breiter Basis ist im vorhergehenden angegeben. Die Züchtigung des Microorganismus und die Erzeugung des Antibioticums erreicht normalerweise nach etwa 60 bis 80 Stunden bei 28⁰C ihren Höhepunkt, wie durch eines der oben angeführten Untersuchungsverfahren festgestellt wurde. Doch Unterschiede in der verwendeten Ausrüstung, dem Ausmaß der Belüftung, beim Rühren usw. beeinflussen oft die bis zum Aktivitätsmaximum vergehende Zeitdauer. Eine Zeitspanne von mindestens etwa 24 Stunden ist in jedem Falle erforderlich. Zur Belüftung des Mediums werden bei submerser Züchtung etwa ¹h bis 2 Volumen Luft pro Minute und pro Volumen Gärflüssigkeit durchgeführt. Natürlich müssen während der Übertragung der Impfsubstanz und der Züchtung des Microorganismus aseptische Bedingungen eingehalten werden. Die Entfernung des Mycels und die Gewinnung des Antibioticums wird wie beschrieben, vorgenommen.

Wie viele krebshemmende Mittel ist der Stoff Actinomycin P₂ etwas giftig. Therapeutische Dosierungen können jedoch ohne wesentliche schädliche Wirkung verabreicht werden, was durch die Daten in der Tabelle III deutlich gemacht wird. Man machte bei Schweizer weißen Mäusen fünf aufeinanderfolgende tägliche Einspritzungen von 1 cm³ wäßrigen Lösungen, in welchen die angegebenen Antibioticumdosierungen enthalten waren. Sterblichkeitsrate und durchschnittlicher Gewichtsverlust sind angegeben.

	f	P2 (roh)	r	P., (reiner kristalliner	Tabelle	III	Gewichts verlust
Actinomycin				Stoff)	Giftigkeit Dosis: mg/kg	Sterblich keitsrate
		1,2	5/6	—
	1,0	3/6	—
	0,8 0,6	1/6 0/6
P1 (reiner	0,4	0/6	—
kristalliner ■	0,2	0/6
Stoff)	2,5	6/6	5
	2,0	4/6	3,6 4,1 4,0
1,1 1,0 0,9	1/6 1/6 0/6	4,0
0,8	0/6	3,7
0,7	0/6	2,5
0,6	0/6
0,2	6/6	5,7
0,15	5/6	5,1
0,125	2/6	3,7
0,1	3/6	0,3
0,05	0/6

Aus diesen Daten geht hervor, daß die erfindungsgemäßen Actinomycine sehr viel weniger giftig sind als die bekannten Actinomycinarten B, C und D.

Beispiel I

Ein Nährmedium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt, auf den p_H-Wert 7,0 gebracht und sterilisiert:

Cerelose 10 g/l

Maisstärke 10 g/l

N-Z-AminB 5 g/l

Curbay 5 g/l

Natriumchlorid 5 g/l

Sojaöl 15 g/l

Calciumcarbonat lg/1

Leitungswasser, um auf das Volumen
aufzufüllen.

Die Impfsubstanz wird hergestellt, indem die Zucht eines Nährbodens von Streptomyces aureofaciens ATCC 13 336, der gute Sporenbildung aufweist, mit einem Teil dieses Mediums in Berührung gebracht wird. Etwa 36 bis 40 Stunden bei 28° C wird in einem rotierenden Schüttelapparat incubiert.

Der Hauptteil des Mediums wird dann geimpft, indem er mit 5 Volumprozent des so hergestellten Inoculums gemischt wird. Zur Belüftung werden etwa 2 Volumen Luft pro Minute pro Volumen des Mediums durchgeleitet, und während der Incubation bei 26 bis 30° C wird stark gerührt. Das Fortschreiten der Gärung wird durch Plättchenuntersuchung des filtrierten Mediums in Abständen unter Verwendung von B. subtilis als Untersuchungsorganismus verfolgt. Das Gärprodukt wird nach 48 bis 72 Stunden gewonnen.

Die Gärflüssigkeit wird dann unter Benutzung von Diatomeenerde als Filterhilfe filtriert; das Filtrat wird mit dem halben Volumen n-Butanol extrahiert. Der Mycelkuchen wird ohne Unterbrechung mit 500 cm³ Methanol extrahiert. Das n-Butanol wird bei vermindertem Druck verdampft und der Methanolextrakt zugegeben. Die vereinigten Extrakte werden fast bis zur Trockne verdampft und mit Äthylacetat aufgenommen. Das Äthylacetat wird über mit Säure gewaschene Tonerde geleitet, die mit zusätzlichem Äthylacetat befeuchtet wurde. Es werden annähernd 5 bis 15 g Tonerde pro Gramm rohes Material verwendet. Die Säule wird gewaschen, indem noch mehr Äthylacetat zugegeben wird, bis das dunkelrote Band des Actinomycins B vollkommen eluiert ist. Die Säule wird dann mit verschiedenen Methanol-Äthylacetat-Gemischen gewaschen, wobei jedes Gemisch zunehmend mehr Methanol enthält. Die Fraktionen, die 5 bis 10% Methanol enthalten, werden vereinigt und bei vermindertem Druck fast bis zur Trockne verdampft. Der.Rückstand wird aus einem Gemisch von Methylenchlorid und Äther umkristallisiert. Das Produkt wird durch Filtration erhalten. Es enthält Actinomycin P₂, außerdem eine kleinere Menge Actinomycin P₁ und Actinomycin P₃. In dem Gärmedmm wird nicht so viel Tetracyclin oder Chlortetracyclin festgestellt, daß es abgetrennt werden könnte.

Diese drei Bestandteile werden durch Säulen-Teilungschromatographie getrennt. Ein Gemisch aus Benzol (41), Formamid (50 cm³) und Celite 545 (100 g) wird zu einem homogenen Brei verrührt, in eine geeignete Säule gegossen und durch Luftdruck

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festgepreßt. Celite545 ist die Handelsbezeichnung für eine Form von Diatomeenerde. Das Actinomycingemisch (5 g) wird in Formamid (10 ml) gelöst, und die Lösung wird mit Benzol (200 cm³) und Gelite 545 (20 g) geschüttelt. Dieser Brei wird an das obere Ende der gepackten Säule gebracht und zusammengepreßt. Dann wird die Säule mit Benzol, das mit Formamid gesättigt ist, entwickelt. Auf der Säule konnten drei Bänder unterschieden werden, deren Wandern mit Hilfe der optischen Dichte bei 440 ταμ ίο und der Aktivität gegen B. subtilis verfolgt wurde. Actinomycin P₂ erschien als zweite und größte Fraktion. Die erste Fraktion, Actinomycin P₁, und die dritte Fraktion, Actinomycin P₃, wurden angereichert und die entsprechenden Actinomycinarten aus einem Gemisch von Methylenchlorid und Äther umkristallisiert.

Nach Konzentrieren und Umkristallisieren wurde die größte Fraktion, Actinomycin P₂, durch Gegenstromverteilung unter Verwendung von einer oder einer sukzessiven Kombination der folgenden Systeme gereinigt: (1:1) Benzol—Formamid; (4:2:1,1:2) Isopropyläther—Äthylacetat—Pyridin—Wasser und (2: 2:1,2: 2) Pyridin—Wasser—Ligroin—Benzol. Die Fraktionen, die Actinomycin P₂ enthalten, werden konzentriert, und der Rückstand wird aus Aceton und Äther (1:9) umkristallisiert. Das Antibioticum scheidet sich in leuchtendroten, rechteckigen Plättchen ab, die bei 242 bis 245° C (Zersetzung) schmelzen. Die Elementaranalyse zeigt folgende Ergebnisse: C=56,2°/o, H=7,3°/o, N=12,4«/o. Das ultraviolette Adsorptionsspektrum in Methanol zeigt ein Maximum bei 234, 425 und 443 ταμ, E}*_m-Werte sind 197, 85 bzw. 85. Das Infrarotspektrum des Antibioticums in Kaliumbromid zeigt Maxima an folgenden Punkten: 2,93, 305 (Schulter), 3,42, 5,72, 6,04, 6,15, 6,31, 6,60, 6,73, 7,09, 7,35, 7,55, 7,65, 7,85. 8,15 (Schulter), 8,36, 8,50 (Schulter), 8,90 (Schulter), 9,15, 9,30, 9,45, 9,95, 10,15, 10,60, 11,00, 11,50 und 12,10 m«. Actinomycin ist eine neutrale, ein wenig in Wasser lösliche und in niederen Alkanolen, Aceton, Äthylacetat, Methylenchlorid und Benzol mäßig lösliche Substanz.

Beispiel II

Das im Beispiel I hergestellte, rohe Produkt wird in einer Dosierung von 0,6 mg pro Kilogramm Körpergewicht Mäusen parenteral verabreicht, die einen Tumor Sa-180 haben. Es bewirkt einen 65°/oigen Rückgang des durchschnittlichen Tumorgewichts der behandelten Mäuse im Vergleich zu nicht behandelten Vergleichstieren.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH:

   Die Verwendung von Streptomyces aureofaciens ATCC 13 336 oder dessen Mutanten oder Varianten zur Herstellung von Actinomycin P₂ auf üblichem fermentativem Wege unter submersen aeroben Bedingungen und gegebenenfalls Abtrennung des Antibioticums aus dem Nährmedium gegebenenfalls durch Lösungsmittelextraktion.

   In Betracht gezogene Druckschriften:
   Deutsche Patentschriften Nr. 912 010, 925 064,
   930579, 934715, 944395;
   deutsche Auslegeschrift Nr. 1 021131.

   Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

   © 109 648/356 7.61