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Verfahren zum Trennen der Komponenten eines Actinomycingemisches Als
Actinomycine sind rote, kristalline, antibiotisch wirksame Stoffwechselprodukte
von gewissen Streptomyceten bekanntgeworden. Nach dem deutschen Patent 944 395 erhält
man auf biosynthetischem Wege neue Actinomycine, wenn man Aminosäuren oder deren
Derivate zu den Nährlösungen der Streptomyceten hinzugibt. So wird im Beispiel 7
des deutschen Patents 944 395 durch Zusatz von Sarkosin zur Kultur des Actinomycin-C-bildenden
Streptomyceten Bo P 476 ein Actinomycingemisch erhalten, das nach dem Ringverteilungschromatogramm
zu gleichen Teilen aus fünf Hauptkomponenten mit den RC,- Werten 0,6, 0,8, 1,0,
1,3 und 1,6 besteht. Die RC2 W erte 0,6, 1,0 und 1,6 entsprechen den Actinomycinen
Cl, C2 und C3. Diese Komponenten werden auch erhalten, wenn der Actinomycin-C-bildende
Stamm BoP 476 ohne Sarkosin kultiviert wird. Nach dem deutschen Patent 930 579 und
dem deutschen Patent 934 715 können Actinomycingemische durch Verteilungschromatographie
an Cellulosepulversäulen unter Verwendung von Lösungsvermittlern in der wäßrigen
Phase, insbesondere des Natriumsalzes der m-Kreosotinsäure, in ihre Komponenten
zerlegt werden. Bei der Verteilung des nach dem deutschen Patent 944 395, Beispiel
7, mit Sarkosin erhaltenen Actinomycingemisches wurden die nach dem Ringverteilungschromatogramm
zu erwartenden fünf Actinomycine isoliert.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
neuer Actinomycine, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß nach dem deutschen Patent
944395 unter Zusatz von Sarkosin oder solcher Verbindungen, die unter den Kulturbedingungen
in Sarkosin übergehen, erhaltene Actinomycingemische außer durch Verteilungschromatographie
noch zusätzlich durch Adsorptionschromatographie in die reinen Komponenten zerlegt
werden.
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Es wurde nämlich gefunden, daß eine weitere Trennung dieser Actinomycingemische
an Aluminiumoxyd möglich ist. Während alle bisher bekannten Actinomycingemische
sich bei der Elution vom Aluminiumoxyd mit Benzol -Essigester wie einheitliche Substanzen
verhalten, trennt sich das mit Sarkosin nach dem deutschen Patent 944 395, Beispiel
7, erhaltene Actinomycingemisch in drei Zonen, die fraktioniert aufgefangen
werden konnten. In der ersten Zone waren die Actinomycine Cl, C2 und C3 enthalten,
die Komponenten also, die nach dem obengenannten RingverteilungschromatogrammdieRC,-Werte
0,6, 1,0 und 1,6 besitzen. In der zweiten Zone der Aluminiumoxydsäule sind
neben einer nur in Spuren vorkommenden Komponente (F,) zwei Actinomycine enthalten,
die nach dem obengenannten Ringverteilungschromatogramm die RC,- Werte 0,8 und 1,3
besitzen. Sie wurden Actinomycine F2 und F4 genannt. In der dritten Zone der Aluminiumoxydsäule
mußten, da ja alle fünf Actinomycine des Ringverteilungschromatogramms bereits eluiert
waren, neue Actinomycine enthalten sein. Diese neuen Actinomycine mußten außerdem
gleiche RC,- Werte wie die in der ersten und zweiten Zone der Aluminiumoxydsäule
eluierten Actinomycine besitzen. Auf dem Ringverteilungschromatogramm zeigte sich
dann auch, daß neben kleineren Anteilen F2 und F4, die als zurückhängende Bestandteile
der zweiten Zone der Aluminiumoxydsäule anzusehen sind, zwei neue Actinomycine mit
den gleichen RC,- Werten wie Actinomycin Cl und C2, also 0,6 und 1,0 enthalten sind.
Diese beiden neuen Actinomycine erhielten die Bezeichnung F1 und F3.
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Sie lassen sich in reiner Form gewinnen, wenn man das durch Züchtung
eines Actinomycin-C-Bildners auf sarkosinhaltigen Nährlösungen gebildete Actinomycingemisch
entweder zunächst auf der Cellulosepulversäule in einzelne Fraktionen aufteilt und
anschließend die Fraktionen, die in ihren RC,- Werten den Komponenten C1 und C2
entsprechen, chromatographisch an Aluminiumoxyd weiterfraktioniert. Man kann auch
das Actinomycingemisch zunächst an Aluminiumoxyd auftrennen und dann die am schwersten
eluierbare Fraktion auf der Cellulosesäule in die einzelnen Komponenten zerlegen.
Das Verfahren soll nicht beschränkt sein auf den Actinomycinbildner BoP 476, NRRL
2580, auch andere Stämme, wie Streptomyces chrysomallus NRRL 2550, sind für die
Gewinnung von Actinomycingemischen mit einem für
die Isolierung
ausreichenden Gehalt an Actinomycin FT und F, brauchbar.
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Die Actinomycine enthalten als Chromopeptide neben einem Chromophor
zwei Seitenketten, welche Aminosäurereste enthalten. Während alle bisher bekannten
Actinomvcine in diesen Seitenketten Prolin oder Hydroxyprolin enthalten, zeigt-
es sich nach Hydrolyse der neuen Actinomycine FT und F3, daß diese beiden Aminosäuren
in dem Hydrolysat von F, und F3 fehlen. Actinomycin FT und F3 stellen damit einen
neuen Typus der Actinomycine dar. Auch noch in anderer Hinsicht zeigen sich Unterschiede
zu den bekannten Actinomycinen. Beide Komponenten sind bedeutend weniger toxisch.
Während unter bestimmten Versuchsbedingungen die Toxizität der Actinomycine Cl,
C2, C3, I und X 0,8 mg/`kg Maus intravenös beträgt, liegt sie beim Aetinomycin F1
bei 5 mg/kg, beim Actinomycin F3 7 mgjkg Maus intravenös.
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Trotzdem lassen die Actinomycine FT und F3 bereits in niedrigen Dosen
bei experimentellen Tumoren im Tierversuch eine Hemmungswirkung auf das Tumorwachstum
erkennen.
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So zeigt das Actinomycin FT schon bei Dosen von 5 - 60 yjkg Ratte
beim Rous- und Jensen-Sarkom einen deutlichen Hemmungseffekt, der mit steigenden
Dosen immer deutlicher wird, ohne daß toxische Erscheinungen zu beobachten sind.
Actinomycin C ist mit 5 - 60 y !kg Ratte ebenfalls wirksam, jedoch schon bei etwas
höheren Dosen, z. B. bei 5 - 100 y/kg, treten bei der Mehrzahl der Versuchstiere
schwere toxische Schädigungen ein.
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Actinomycin F3 zeigt beim Walker-Carcinom bei Dosen von 6 - 60 bis
6 - 500 y(kg eine Beeinflussung des Wachstums. Bemerkenswert ist, daß die Körpergewichtszunahme
im Vergleich zu den Kontrollen nicht gestört wird. In einem Wiederholungsversuch
wurden noch höhere Dosen verabreicht. Eine Dosierung von 5 - 1000 ykg führte bei
einem von sieben Tieren zum Tode. 5 - 500 y wurden von allen Tieren vertragen. Das
Tumorwachstum des Walker-Carcinoms wurde in diesem Bereich von 5 - 100 bis 5 - 1000
y/ kg deutlich gehemmt.
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Die beiden neuen Actinomycine haben Wirkung bei neoplastischen Erkrankungen,
insbesondere bei der Hodgkinschen Krankheit.
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Die Ultraviolettspektren der beiden Actinomycine FT und F3 (s. Abb.
1) sowie die Ultrarotspektren (s. Abb. 2) sind typische Actinomy cinspektren. Actinomycin
F, ergab bei der Verbrennungsanalyse 56,80 0,r'0 C, 7,35 00 H und 13,05 0/0 N, Actinomycin
F3 57,85 0j0 C, 7,29 0 0 H und 9,55 0/0 N. Im Hydroly sat des Actinomycins FT wurden
die Aminosäuren ihreonin, Sarkosin, Valin, Isoleucin und N-Methylvalin, im Hydrolysat
des Actinomycins F3 die Aminosäuren Threonin, Sarkosin, Isoleucin und N-Methylvaiin
gefunden. Beide Actinomycine wurden 24 Stunden bei 100 mit konzentrierter Salzsäure
liydrolisiert und die Aminosäuren papierchromatographiscli bestimmt.
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Während die bekannten Aetinomycine, z. B. C I, C.,, C.;, I und X,
in rhombischen Bi-pyramiden kristallisieren, kristallisieren die neuen Actinomycine
FT und F, in rechteckigen Plättchen.
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Die Abbildungen zeigen das Ultraviolettspektrum der Actinomycine FT
und F3 (Abb. I), das Infrarotspektrum von Actinomycin FT (Abb. 1I) und das Infrarotspektrum
von Actinomycin F; (Abb. III).
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Beispiel 3 g des nach der deutschen Patentschrift 944 395, Beispiel
7, durch Zusatz von Sarkosin zur Nährlösung des Actinomycin-C-Bildners BoP 476 gewonnenen
Actinomycin-C-Gernisches werden in 150 ccm Benzol gelöst. Die Lösung wird
durch eine mit Benzol eingeschlämmte Aluminitimoxydsätile von -15 cm Höhe und 5,0
cm Durchmesser filtriert. Durch Nachwaschen mit 3 1 einer Mischung aus 60 Volumprozent
Benzol und -10 Volumprozent Essigester wird an der- Aluininiumoxyclsäule eine Trennung
des Actinomycingeinisches in drei Zonen erreicht. Beim weiteren Nachwascheil mit
deri Flenzol-Essigester-Gemisch werden die unterste und die mittlere Zone eluiert,
die oberste Zone wird dann mit reinem Essigester ausgewaschen. Aus den einzelnen
Eluaten «erden Benzol und Essigester im schwachen Vakuum abdestilliert. Der feste
Rückstand wird in wenig Aceton aufgenommen, aus dieser Lösung werden die Actinomycine
mit Ligroin odei-Petroläther ausgefällt. Die Ausbeuten betragen aus der ersten Zone
. . . . . . . . . . 0,36 g = 12 °; 0 aus der zweiten Zone . . . . . . . . 1,08 g
= 36O. O aus der dritten Zone. . . . . . . . . . 1,23 g = 41 °. o Die Gesamtausbeute
beläuft sich auf 89 0, 0.
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Die Zusammensetzung der einzelnen Zonen wird im Ringchromatogramm
ermittelt. Nach dem Auftragen der einzelnen Zonen wird das Papier mit der wäßrigen
Phase eines Gemisches aus 5 Volumprozent Di-n-butyläther, 35 Volumprozent Di-n-propylätlier,
10 Volumprozent Butanol und 50 Volumprozent einer wäßrigen Lösung des m-kresotinsauren
Natriums besprüht und mit der organischen Phase dieses Gemisches entwickelt. Die
Lage der einzelnen Actinonlycinzoneli im Chromatogramm wird durch den RC.- Wert
allgegeben. Der RC,-Wert errechnet sich durch Division der Weglänge der betreffenden
Komponente durch die Weglänge des Actinomycins C.", das als Bezugs Actinomycin ausgewählt
wurde.
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Die erste Zone enthält drei Actinomycine finit den RC.,- Werten 0,6
(= Actinomycin CI), 1,0 (= Actinomycin C.,) und 1,6 (= Actinomvcili (.'3), die zweite
Zone, außer der in geringer Menge vorkommenden Komponente F0, zwei Actinomycine
mit den RCWerten 0,8 (= Actinomycin F2) und 1,3 (- Aetinomycin F_,), die dritte
Zone vier Actinomycine mit den RC;,,-Werten 0,6 (= Actinomycin FT), 0,8 (= Actinomvein
F,), 1,0 (= Actinomycin F.l) und 1,3 (= Actinomycin F,).
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250 g feingemahlenes Zellulosepulver wird mit 1,11 der wäßrigen
Phase eines Gemisches aus 10 Volumprozent Di-n-butyläther, 27 Volumprozent Di-n-propyläther,
13 Volumprozent Butanol und 50 Volumprozent einer wäßrigen Lösung in-kresotinsauren
Natriums zu einem luftblasenfreien Brei angerührt und dieser Brei in ein Chroniatographierohr
von 40 cm Höhe und 5 cm Durchmesser eingeschlämmt. Unter Anwendung eines geringen
L berdruckes filtriert man die organische Phase so lange durch die Säule, bis die
ersten Anteile- der organischen Phase aus der Säule tropfen. liilrCli die so vorbehandelte
Säule werden 5001n- der dritten Zone der Aluminiumexydsäule, gelöst in 100 ccm der
organischen Phase des obergenannten Systems, filtriert. Beim weiteren Durchlauf
der organischen Phase trennt sich das Actinomycingemisch der drittc-n Zotie der
:yluminiumox5-dsäule in vier Zonen, die, fraktioniert mit der organischen Phas:,
elnlert würden. Aus Clen C'lIÜilti@'n loliei: @S@I'Cleli in bekannter Weise die
reinen Actinomycine kristallin ge-«-onnen. Die Ausbeuten betragen 160 mg Acllnomycin
FT, 146 mg Actinomvcin F.., 76 mg Actinoniycin P.; und 37 mg _-'@ctinom ;-ein F,.
Die Gesaintatisbeute beträgt 840.0. Nach dem Ringclironiatogramm wurden für die-,
gier Zonen der Zellulosesäule in der I\'.cihelifolge der Elution die RC,- @@'erte:
erste, am schnellsten wandernde Zone 1,3 (= Actinomycin F,), zweite Zone 1,0 (_
:@ctin<>mycin F.i),
dritte Zone 0,8 (= Actinomycin F2), vierte
Zone 0,6 (= Actinomycin F1), gefunden.