DE10360956A1

DE10360956A1 - System und Verfahren zum Nachweis von diabetischer Nephropatie oder einer Prädisposition dafür

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Publication number: DE10360956A1
Application number: DE2003160956
Authority: DE
Inventors: Fokko van der Prof. Woude; Benito Dr. Yard; Bart Dr. Janssen; Daniela Dr. Hohenadel; Hanns Dr. Köppel; Hans Baelde; Emile de Dr. Heer; Stephan Bakker
Original assignee: Universitaet Heidelberg
Current assignee: Universitaet Heidelberg
Priority date: 2003-12-23
Filing date: 2003-12-23
Publication date: 2005-07-28

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues System und Verfahren zum Nachweis einer diabetischen Nephropathie oder deren Vorstufen oder einer genetischen Prädisposition dafür in einem Patienten unter Verwendung von mit dem Carnosin-Metabolismus assoziierten Genen und deren Sequenzvarianten. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung einer diabetischen Nephropathie insbesondere bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 1 oder 2. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Auffinden von Verbindungen, welche zur Behandlung oder Vorbeugung einer diabetischen Nephropathie geeignet sind.

Description

Die diabetische Nephropathie (DN), d.h der diabetesassoziierte Verlust der Nierenfunktion, ist eine der Hauptkomplikationen des Diabetes mellitus. Sie ist Hauptursache der Morbidität und Mortalität von Patienten mit Diabetes mellitus und tritt bei etwa einem Drittel dieser Patienten auf. Der Verlauf der Nephropathie ist exakt definiert und bis zu einem gewissen Ausmaß bei Typ 1- und 2-Diabetikern ähnlich (Hasslacher C: Diabetische Nephropathie – Prävention und Therapie. 1. Auflage. Bremen: UNI-MED, 2003). Die Patienten entwickeln zunächst eine Mikroalbuminurie (Albuminexkretionsraten (AER) zwischen 20 und 200 μg/min), dann die eigentliche Nephropathie (Proteinurie) (AER > 200 μg/min), und schließlich einen Abfall der glomerulären Filtrationsrate (GFR), der im terminalen Nierenversagen endet. Der Diabetes mellitus Typ 2 beginnt normalerweise im mittleren Lebensalter oder später, kann jedoch auch bei jungen Individuen vorkommen. Nach den Angaben der Internationalen Diabetes Federation ist der Typ 2 für 90% aller Diabeteserkrankungen verantwortlich, die Prävalenz liegt bei ca. 4% (Andersen et al: Diabetic nephropathy in type 1 (insulindependent) diabetes: an epidemiologic study. Diabetologia 25: 496–501, 1983).

Obwohl Patienten mit Mikroalbuminurie meistens im Verlauf eine Proteinurie und nachfolgend den Verlust der Nierenfunktion entwickeln, kann die Mikroalbuminurie mit sehr strenger Blutdruck- und Glukoseeinstellung manchmal noch rückgängig gemacht werden. Dies trifft jedoch nicht für die manifeste Proteinurie zu. Wenn einmal eine Proteinurie bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 1 entstanden ist, nimmt zudem die kardiovaskuläre Mortalität bei Frauen und Männern um das 75–100-fache zu. Für den Diabetes mellitus Typ 2 fehlen solche genauen Angaben.

Folgende therapeutische Möglichkeiten sind bislang bekannt: Optimale Stoffwechselkontrolle, frühzeitige und intensivierte Hypertoniebehandlung, diätetische Proteinrestriktion und lipidsenkende Therapie.

Eine optimale Stoffwechselkontrolle verringert das Risiko einer Nephropathie bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 1 und 2. Normoglykämie kann die Hyperfiltration und Renomegalie günstig beinflussen, die Mikroalbuminurie kann sogar verschwinden. Bei den meisten Patienten ist jedoch eine zusätzliche medikamentöse Behandlung nowendig.

Bluthochdruck ist ein großes Problem bei Diabetikern. Er kommt zweimal häufiger als in der normalen Bevölkerung vor. Bluthochdruck kommt häufiger bei Typ 2 (30–50%) als bei Typ 1 Diabetikern vor, auch wenn man das Alter der Patienten mit in Betracht zieht. Die Hälfte der Hochdruckfälle bei Diabetikern wird durch "essentiellen" Hochdruck verursacht, die andere Hälfte entsteht im Rahmen der Nephropathie. Die Hyperglykämie induziert eine afferente (präglomeruläre) Vasodilatation, so daß sich der Hochdruck ohne Widerstand bis in die Glomeruli fortsetzen kann. Dies bedeutet, dass bei Diabetikern der Blutdruck niedriger sein sollte als bei Nicht-Diabetikern, um einem glomerularen Schaden vorzubeugen. Eine Senkung des Blutdrucks bei Diabetes hat eine stärkere Auswirkung auf kardiovaskuläre Komplikationen als die Blutdrucksenkung bei Nichtdiabetikern.

Mehrere Arbeitsgruppen in Europa, Nordamerika und Japan haben deshalb strenge Richtlinien für die Behandlung des Bluthochdrucks bei Diabetikern aufgestellt. Es ist schon länger bekannt, dass ein niedrigerer Blutdruck das Tempo des Nierenfunktionsverlusts verzögern kann. Diese Ergebnisse wurden in den letzten 10 Jahren vor allem durch die Behandlung mit ACE-Hemmern erreicht. In mehreren Metaanalysen wurden die akuten und chronischen Auswirkungen von ACE-Hemmern in Patientenkollektiven mit Diabetes mellitus evaluiert. Eine akute Abnahme der Nierenfunktion, z.B. eine Erhöhung des Serumkreatinins um bis zu 30% oder bis zu 3 mg/dl, innerhalb von 4 Monaten nach Therapiebeginn korreliert mit einer niedrigen Nierenfunktionsverlustrate nach 3 oder mehr Jahren. Es wurde gezeigt, dass die Nierenfunktion besser erhalten blieb, wenn der Blutdruck auf Werte unter 130/80 mmHg gesenkt wurde. Die Lage ist noch extremer, wenn eine Proteinurie besteht. Es wurde gezeigt, dass Patienten mit einer Proteinurie über einem Gramm pro Tag, unabhängig von der Ätiologie, bei Blutdruckwerten unter 125/75 mmHg ein langsameres Tempo des Nierenfunktionsverlustes aufwiesen.

Es ist nicht immer einfach, einen niedrigen Blutdruck bei Diabetikern zu erreichen. Neben Veränderungen in Diät und Lebenstil ist meist eine medikamentöse Behandlung notwendig. Studien haben gezeigt, dass im Durchschnitt 3,2 antihypertensive Medikamente pro Patient notwendig sind, um den Zielblutdruck zu erreichen. Dabei treten folgende Vor- und Nachteile der unterschiedlichen Antihypertensiva bei Diabetes mellitus auf:
Betablocker reduzieren effektiv bei nichtdiabetischen Patienten die kardiovaskuläre Mortalität und Morbidität. Dies trifft auch für Diabetiker zu, die einen Myokardinfarkt erlitten haben. Eine Kombination von Betablockern und Diuretika kann die Mortalität und Progression der Niereninsuffizienz im Stadium 3 und 4 senken. Allerdings besteht die Gefahr, daß die Betablocker bei Diabetes mellitus die Symptome einer Hypoglykämie maskieren können.

Thiazid-Diuretika verschlechtern die Glukose-Toleranz, desweiteren werden Triglyzeridspiegel und Cholesterinspiegel dosisabhängig erhöht. Die Ausbildung einer Hypokaliämie ist eine Komplikation, die durch die gleichzeitige Gabe kaliumsparender Diuretika oder ACE-Hemmer ausgeglichen werden kann. Liegt eine diabetische Neuropathie vor, können Diuretika die orthostatischen Beschwerden nachteilig beeinflussen. Bei einer GFR < 70 ml/min sollten Schleifendiuretika verabreicht werden, da hier die Wirkung der Thiazide nachläßt. Eine niedrig dosierte Thiazid-Therapie (12,5–25 mg/d) ist ein wichtiger Bestandteil der antihypertensiven Behandlung bei Diabetikern, da bereits eine Monotherapie mit Diuretika die Mortalität bei Diabetes mellitus Typ 2 senkt.

ACE-Hemmer haben keine negativen Auswirkungen auf den Glukose- oder Lipidmetabolismus. Sie sind stärker antiproteinurisch wirksam als andere blutdrucksenkende Medikamente. Die antiproteinurische Wirkung hängt nur teilweise mit den hämodynamischen Wirkungen zusammen. Es konnte nachgewiesen werden, dass ACE Hemmer die Progression der Niereninsuffizienz bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 1 und Niereninsuffizienz hemmen. Deshalb werden ACE-Hemmer bei dieser Patientengruppe bevorzugt angewendet. Die Anwendung von ACE-Hemmern erfordert allerdings große Sorgfalt: die Dosierung muß bei eingeschränkter Nierenfunktion angepaßt werden, wobei – vor allem in Kombination mit Diuretika oder bei Herzinsuffizienz – darauf geachtet werden sollte, dass der Blutdruck nicht zu stark gesenkt wird. Die Nierenfunktion kann gefährlich eingeschränkt werden, wenn eine Nierenarteriestenose vorliegt, die bei Diabetikern vermehrt vorkommt. Viele Studien haben die günstige Auswirkung der ACE Hemmer bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 1 mit diabetischer Nephropathie gezeigt. Es ist jedoch nicht völlig geklärt, ob ACE-Hemmer besser gegen harte Endpunkte schützen als Betablocker oder andere Antihypertensiva. In manchen Studien war der Blutdruck in der Patientengruppe ohne ACE-Hemmer weniger stark gesenkt worden. Bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 ist zur Zeit die Überlegenheit von ACE-Hemmern gegenüber Betablockern nicht nachgewiesen.

AT1-Rezeptor Antagonisten sind Medikamente mit relativ wenig Nebenwirkungen. Die antihypertensive Auswirkung ist in der Praxis der der ACE-Hemmer gleich zu setzen. Mehrere große Studien haben, zumindest für den Typ 2 Diabetes, gezeigt, daß Irbesartan (Parving et al. The Effect of Irbesartan on the development of diabetic nephropathy in patients with type 2 diabetes. N Engl J Med 345: 870–8, 2001; Lewis et al. Renoprotective effect of the angiotensin-receptor antagonist Irbesartan in patiens with nephropathy in type 2 diabetes. N Engl J Med 345: 851–60, 2001) und Losartan (Brenneret al. Effects of Losartan on renal and cardiovascular outcomes in patients with type 2 diabetes and nephropathy. N Engl J Med 345: 861–9, 2001) nephroprotektiv wirken. Dies scheint unabhängig vom blutdrucksenkenden Effekt zu sein.

Da Calciumantagonisten vom Nifedipin-Typ über eine Dilatation der Vasa afferentes zum Anstieg des intraglomerulären Drucks führen können, wird die bevorzugte Gabe von Verapamil oder Diltiazem empfohlen. Diese Medikamente können die Mortalität bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und isoliertem systolischem Hochdruck senken. Im allgemeinen wird empfohlen, Calciumantagonisten nicht als Monotherapie bei Diabetikern zu verabreichen. Sie können jedoch in Kombination mit ACE-Hemmern und Diuretika nützlich sein.

Andere Substanzen wie Minoxidil, Hydralazin, Clonidin und Methyldopa werden zusätzlich eingesetzt, um den Zielblutdruck zu erreichen. Clonidin soll wegen der Gefahr einer Bradykardie nicht mit Betablockern kombiniert werden.

Eine diätetische Eiweißrestriktion (0,6–0,8 g Eiweiß/kg Körpergewicht pro Tag) kann die Progression des Nierenversagens auch bei diabetischer Nephropathie hemmen. Bei diabetischen Ratten wurde gezeigt, dass eine Eiweißrestriktion den intraglomerulären Druck senkt. Bei Menschen mit diabetischer Nephropathie werden GFR und Mikroalbuminurie nach Beginn der Eiweißrestriktion zunächst gesenkt, längerfristig wird die Verschlechterung der Nierenfunktion jedoch signifikant gehemmt.

Auch eine lipidsenkende Therapie ist bei diabetischer Nephropathie wichtig. Oxidiertes LDL ist toxisch für Endothelzellen. Bei Patienten mit diabetischer Nephropathie ist die endotheliale Dysfunktion bereits sehr ausgeprägt. Vor allem bei einem Serum-Cholesterin-Wert > 5,7 mmol/l werden HMG-CoA-Reduktase-Hemmer verschrieben.

Wenn die Nierenfunktion verloren geht, bleiben nur Dialyse und gegebenenfalls die Nierentransplantation als Behandlungsmöglichkeiten übrig. Es gibt in Deutschland ungefähr 60.000 dialysepflichtige Patienten. Die Hälfte aller neuen Fälle wird durch die diabetische Nephropathie verursacht. In Nordamerika und Europa ist die DN die häufigste Ursache von tödlichem Nierenversagen.

Obwohl lange angenommen wurde, dass die metabolische Kontrolle zur Entwicklung der Nephropathie beiträgt, wurde diese Hypothese erst in den letzten Jahren bewiesen. Eine größere Anzahl von Beobachtungsstudien hat den Zusammenhang zwischen glykämischer Kontrolle und der Entwicklung verschiedener Schweregrade der Albuminurie und des Abfalls der GFR gezeigt. Große prospektive, randomisierte und interventionelle Langzeitstudien haben definitiv bewiesen, dass eine verbesserte metabolische Kontrolle, die beinahe Normoglykämie erreicht, die Entwicklung und Progression der DN signifikant verzögern kann (Phillips CA and Molitch ME: The relationship between glucose control and the development and progression of diabetic nephropathy. Curr Diab Rep 2: 523–529, 2002).

Trotz schlecht kontrollierter Blutzucker entwickelt jedoch eine große Subgruppe von Patienten mit Typ 1 Diabetes [Andersen et al: Diabetic nephropathy in type 1 (insulin-dependent) diabetes: an epidemiologic study. Diabetologia 25: 496–501, 1983; Krolewski et al: The changing natural history of nephropathy in type I diabetes. Am J Med 78: 785–794, 1985; Krolewski et al Epidemiologic approach to the epidemiology of diabetes mellitus and its complications. N Engl J Med 317: 1390–1398, 1987; Nathan DM: Long-term complications of diabetes mellitus. N Engl J Med 328: 1676–1685, 1993) und Typ 2 Diabetes (Nathan DM: Long-term complications of diabetes mellitus. N Engl J Med 328: 1676–1685, 1993; Nelson et al: Assessment of risk of overt nephropathy in diabetic patients from albumin excretion in untimed urine specimens. Arch Intern Med 151: 1761–1765, 1991) niemals Nephropathie. Frühere Untersuchungen konnten zeigen, daß die Suszeptibilität für die DN (zumindest teilweise) genetisch determiniert ist. Diese Beobachtung und die familiäre Häufung von DN bei Typ 1 [Seaquist et al.: Familial clustering of diabetic kidney disease: evidence for genetic susceptibility to diabetic nephropathy. N Engl J Med 320: 1161–1165, 1989; Quinn et al.: Familial factors determine the development of diabetic nephropathy in patients with IDDM. Diabetologia 39: 940–945, 1996) und Typ 2 Diabetes (Pettitt et al: Familial predisposition to renal disease in two generations of Pima Indians with type 2 (non-insulin dependent) diabetes mellitus. Diabetologia 33: 438–443, 1990; Freedman et al.: Familial predisposition to nephropathy in African-Americans with non-insulin dependent diabetes mellitus. Am J Kidney Dis 5: 710–713, 1995) deuten darauf hin, dass nur ein Teil der Diabetiker für die Entwicklung einer DN empfindlich ist. Seaquist et al. fanden bei diabetischen Geschwistern von Patienten, die bereits eine DN entwickelt hatten, eine Prävalenz der DN von 83%, wohingegen die Prävalenz bei diabetischen Geschwistern von Diabetikern ohne Proteinurie nur 17% betrug. Quinn et al. und Krolewski bestätigten, dass das Risiko abhängig vom Status des Probanden variiert und hypothetisierten die Existenz eines dominanten Gens, das bei Diabetikern die Nephropathie verursacht (Quinn et al.: Familial factors determine the development of diabetic nephropathy in patients with IDDM. Diabetologia 39: 940–945, 1996; Krolewski et al.: Genetics of diabetic nephropathy: Evidence for major and minor gene effects. Kidney Int. 55 1582–1596, 1999).

Das häufige Auftreten von DN bei Diabetikern weist darauf hin, dass ein oder mehrere häufige – und deshalb wahrscheinlich alte – DNA-Polymorphismen den Diabetesphänotyp zu einem Phänotyp, der auch die DN enthält, modifizieren. Bei gesunden Individuen könnte das Vorhandensein dieser Polymorphismen keine oder nur eine geringe klinische Relevanz haben.

Vardarli et al. (Gene for susceptibility to diabetic nephropathy in type 2 diabetes maps to 18q22.3-23. Kidney Int 62: 2176–2183, 2002) führte eine Linkage-Studie durch, deren Ziel es war, die Lokalisation von Genen, die für die Suszeptibilität für diabetische Nephropathie in großen türkischen Familien mit Typ 2 Diabetes verantwortlich sind, zu finden. Achtzehn türkische Familien mit insgesamt 368 Personen wurden untersucht. Von 125 Personen wurde DNA gewonnen. Familienmitglieder ohne Diabetes wurden als „unbekannter Status", Personen mit einer Diabetesdauer von mindestens 15 Jahren und Normoalbuminurie wurden als „nicht betroffen" und Personen mit Diabetes und Proteinurie als „betroffen" definiert. Bei den türkischen Familien wurde eine Linkage-Analyse durchgeführt, indem Mikrosatelliten-Marker auf 12 humanen Chromosomen verwendet wurden, und auch Regionen einschlossen, für die bereits vorher Hinweise auf Linkage mit DN bestanden (3q, 7q, 9q und 20q) (Imperatore et al: Sib-pair linkage analysis for susceptibility genes for microvascular complications among Pima Indians with type 2 diabetes. Diabetes 47: 821–830, 1998; Moczulski et al: Major susceptibility locus for nephropathy in type 1 diabetes mellitus on chromosome 3q: Results of novel discordant sib-pair analysis. Diabetes 47: 1164–1169, 1998). Die Ergebnisse konnten die Hinweise für Linkage von DN mit einer der vorgeschlagenen Regionen nicht bestätigen. Die Daten der 11 größten Familien zeigten jedoch einen signifikanten paarweisen LOD-Score beim Typieren von Markern auf Chromosom 18 g22.3-23 unter Verwendung des autosomal dominanten Modells (max. LOD score 3,5; p = 0,0001). Auf Chromosom 18 blieb der LOD-Score signifikant und erhöhte sich auf 6,1, wenn zusätzliche Familien und zusätzliche Marker in einer Multipoint Analyse eingeschlossen wurden. Der maximale LOD-Score für Linkage mit dem Krankheitslokus, der als DIANPH bezeichnet wurde, wurde zwischen den Markern D18S469 und D18S58 gefunden. Unter Verwendung der „maximum LOD-1"-Methode wurde ein Konfidenzintervall mit einer asymptotischen Konfidenz über 95% konstruiert. Das DIANPH Konfidenzintervall wird von den Markern D18S43 (proximal) und D18S50 (distal) flankiert.

Um eine unabhängige Bestätigung der Befunde in der türkischen Bevölkerung zu erhalten wurde eine Geschwisterpaarstudie bei Pima Indianern durchgeführt. Ein Gen für die Suszeptibilität für diabetische Nephropathie konnte auch anhand der Pima Daten auf 18g22.3-23 lokalisiert werden.

Halama et al. (The Kruppel-like zinc-finger gene ZNF236 is alternatively spliced and excluded as susceptibility-gene for diabetic nephropathy. Genomics, 82: 406–411, 2003) konnte ZNF236, das auf 18g22.3-23 lokalisiert ist als potentielles Empfänglichkeitsgenen für DN ausschließen.

WO 00/50637 beschreibt ein Verfahren zur Identifikation für Empfänglichkeitsgenen von DN, durch welches die Gene Fibronectin, Caldesmon, Thrombospondin, Plasminogenaktivator-Inhibitor, CTGF identifiziert wurden.

EP 1 122 307 beschreibt die Sequenz des humanen Carnosinasegen 2 und eine Anzahl möglicher Anwendungen, die auf die Behandlung von kognitiven Erkrankungen, Entwicklungsabnormalitäten und fetalen Defiziten, neurodegenerativen Erkrankungen, Parkinson'scher Erkrankung, Schizophrenie, abnormaler mentaler Zustände, ischämischer Schock, Epilepsie, Polyarthritis, Bluthochdruck, Krampfanfälle, ischämischer Herzerkrankung, Ulcera, adrenaler corticaler Funktion, Wundheilung, Trauma und entzündliche Erkrankungen gerichtet sind. DN wird nicht erwähnt.

EP 1 097 997 beschreibt die Sequenz des humanen Carnosinasegen 1. Auch hier werden kognitiven Erkrankungen, Entwicklungsabnormalitäten und fetale Defizite, neurodegenerativen Erkrankungen, Parkinson'scher Erkrankung, Schizophrenie, abnormale mentale Zustände, ischämischer Schock und Epilepsie als mögliche Anwendungsgebiete erwähnt. DN wird nicht erwähnt.

Die Diagnose von DN ist bisher nur zuverlässig über eine Nierenbiopsie möglich, die mit einem deutlichen Komplikationsrisiko für den Patienten und mit hohen Kosten verbunden ist. Dementsprechend besteht der Bedarf neue Nachweismöglichkeiten für DN zu entwickeln, die eine zuverlässige Bestimmung des Patientenstatus ohne operativen Eingriff ermöglichen. Ferner besteht der Bedarf an einer kausalen Therapie der DN, durch die mögliche Folgeerscheinungen der DN wie Dialyse- und Nierentransplantation vermieden werden, sowie die Lebenserwartung und die Lebensqualität des Patienten erhöht werden. Dies erfordert ein detailliertes Verständnis des molekularen Mechanismus, auf dem die DN beruht.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein neues System und Verfahren bereitzustellen, die eine zuverlässige Aussage zu einer diabetischen Nephrophathie sowie zu einer möglichen Prädisposition für eine diabetische Nephropathie liefern sollen und somit frühzeitig therapeutische und/oder vorbeugende Maßnahmen für den Patienten eingeleitet werden können.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.

Insbesondere wird die Verwendung eines oder mehrerer mit dem Carnosin-Metabolismus assoziierten Gene und Varianten oder Teilen davon, und deren 5'-und 3'- flankierende Bereiche zum Nachweis einer diabetischen Nephropathie (DN) oder einer Prädisposition für DN bereitgestellt. Beispielsweise ist ein mit dem Carnosin-Metabolismus assoziiertes Gen das Carnosinase 1 (CN1)-Gen oder das Carnosinase 2 (CN2)-Gen. Die 5'- und 3'-flankierenden Bereiche weisen bevorzugt jeweils etwa 100 kb auf. Die 5'- und 3'-flankierenden Bereiche enthalten beispielsweise regulatorische Sequenzen für das mit dem Carnosin-Metabolismus assoziierten Gen und/oder mit dem Auftreten von DN oder deren Vorstufen oder einer Prädisposition dafür assoziierte Sequenzen, wie beispielsweise das LOC 125704 Gen. Im Vergleich zum Wildtyp können die 5'- und 3'-flankierenden Bereiche bei deren Verwendung zum Nachweis einer DN oder deren Vorstufen oder einer Prädisposition dafür Deletionen, Substitutionen, und/oder Insertionen im Vergleich zum Wildtyp aufweisen und/oder Splicevarianten sein.

Im Vergleich zum Wildtyp können die Varianten oder Teile der mit dem Carnosin-Metabolismus assoziierten Gene (kodierende und/oder nicht-kodierende Regionen) Deletionen, Substitutionen, und/oder Insertionen aufweisen und/oder Splicevarianten sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Teile aus der Gruppe, bestehend aus SEQ-ID-Nrn. 1 bis 31, ausgewählt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die mit dem Carnosin-Metabolismus assoziierte Gensequenz aus der Region von etwa 100 kb stromaufwärts und/oder etwa 100 kb stromabwärts des Exons 1 des CN1- oder CN2-Gens ausgewählt, wobei diese Region zumindestens teilweise das LOC 125704 Gen enthält.

Das mit dem Carnosin-Metabolismus assoziierte Gen ist beispielsweise die kodierende oder regulatorische Teil- oder Gesamtsequenz des CN1- und/oder CN2-Gens oder ein biologisch aktives Derivat davon oder eine Gensequenz, welche die Expression von CN1 und/oder CN2 reguliert. Erfindugsgemäß bedeutet der Begriff „biologisch aktives Derivat" jegliche nukleinsäureartige, modifizierte Verbindung mit im wesentlichen gleicher biologischer Funktion wie die kodierenden oder regulatorischen Gensequenzen des CN1- und CN2-Gens. Die Modifikationen im biologisch aktiven Derivat können eine oder mehrere Deletionen, Substitutionen und/oder Insertionen von Nukleinsäuren enthalten und/oder Splicevarianten sein.

Vorzugsweise umfaßt die mit dem Carnosin-Metabolismus assoziierte regulatorische Gensequenz die regulatorischen Elemente am 5'-Ende des CN1- oder CN2-Gens innerhalb von einem Bereich von etwa 100 kb stromaufwärts vom Transkriptionsbeginn.

In einer Ausführungsform umfaßt die mit dem Carnosin-Metabolismus assoziierte regulatorische Gensequenz Veränderungen einer Locus-Control-Region (LCR), innerhalb des CN1/CN2-Locus, welche die Expression von Carnosinase 1 und/oder 2 kontrolliert.

Der Nachweis von DN oder einer Prädisposition für DN kann auf genomischer Ebene, transkriptionaler, translationaler und/oder post-translationaler Ebene erfolgen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer DN oder deren Vorsstufen oder einer Prädisposition für DN, umfassend

(a) die Bereitstellung einer Patientenprobe, beispielsweise Vollblut,
(b) die Bereitstellung einer Kontrollprobe, von beispielsweise einem Patienten mit Diabetes mellitus ohne Nephropathie,
(c) das Bestimmen eines Zustands von mindestens einem, wie vorstehend definierten, mit dem Carnosin-Metabolismus assoziierten Gens auf genomischer, transkriptionaler, translationaler und/oder post-translationaler Ebene in der Patientenprobe und der Kontrollprobe und
(d) das Vergleichen und Auswerten der Zustände von der Patientenprobe und der Kontrollprobe.

Vorzugsweise betrifft der in (c) zu bestimmende Zustand die Expression des mit dem Carnosin-Metabolismus assoziierten Gens, wobei die Genexpression z.B. durch PCR wie RT-PCR, Northern-Blot, Western-Blot und/oder EIA, wie z.B. ELISA, bestimmt werden kann. Ferner kann auf genomischer Ebene der zu bestimmende Zustand durch im Stand der Technik bekannte PCR-Anwendungen, Invader^®-Assays oder Hybridisierungsmethoden unter Verwendung geeigneter Nukleinsäuresonden ermittelt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit zum Nachweis von DN oder einer Prädisposition dafür, enthaltend Mittel zum Bestimmen eines Zustands von einem, wie vorstehend definierten, mit dem Carnosin-Metabolismus assoziierten Gens auf genomischer, transkriptonaler, translationaler und/oder post-translationaler Ebene in einer Patientenprobe, wobei die Mittel beispielsweise Primer für eine PCR zur Bestimmung der Genexpression des mit dem Carnosin-Metabolismus assoziierten Gens oder Nukleinsäuresonden für eine Hybridisierung umfassen.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiter die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche native oder rekombinante CN1 oder CN2 oder biologisch wirksame Derivate davon und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel enthält. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann zur Behandlung und/oder Vorbeugung von DN insbesondere bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 1 und 2 eingesetzt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden von Verbindungen, welche zur Behandlung und/oder Vorbeugung von DN geeignet sind, umfassend

(a) das Zugeben einer zu testenden Verbindung zu einem Zellkultursystem, welches vorzugsweise renale Zellen umfasst, oder zu einem Tier, welches gegebenenfalls transgen bzw. genetisch verändert ist, oder zu einem Menschen, und
(b) das Bestimmen der Expression von mit dem Carnosin-Metabolismus assoziierten Genen.

Mit dem erfindungsgemäß gekennzeichneten Verfahren zum Nachweis von DN ist es möglich, ohne Nierenbiopsie DN oder Vorstufen von DN oder eine Prädisposition für DN nachzuweisen, wobei der Nachweis beispielsweise auf ein verändertes Expressionsmuster (Veränderung in den kodierenden Sequenzen) und eine veränderte Expressionsmenge von CN1 und CN2 (Veränderungen in den regulatorischen Sequenzen) und biologisch aktiven Derivaten davon oder Veränderungen in Genen, die auch an der Regulation der Expression von diesen Genen beteiligt sein können, beruht. Durch die molekulargenetische Analyse der Gensequenzen können Träger für die Entwicklung einer DN als Risikopersonen identifiziert werden. Derartige Risikopersonen können durch gesunde Ernährung und durch Anpassung des Lebensstils eine Diabetes vermeiden. Falls bereits eine Diabetes besteht, können derartige Risikopersonen frühzeitig erkannt und therapiert werden, bevor die Nierenfunktion eingeschränkt ist.

Patienten und Risikogruppen können eine kausale Therapie – gezielt auf die Korrektur des Carnosin-Metabolismus – bekommen und so optimal vor der Entstehung/Weiterentwicklung der DN geschützt werden. Somit kann die Dialyse vermieden werden und die Lebensqualität und Lebenserwartung verbessert werden. Da die Mehrheit der neuen Patienten, die sich jährlich für die Dialyse anmelden, DN-Patienten sind, ist ein großer Teil der sehr hohen Kosten der Dialyse direkt auf DN zurückzuführen. Deshalb kann eine frühzeitig präventive Therapie der DN durch Diagnostizierung und Behandlung von Risikopersonen wesentlich zur Kostensenkung im Gesundheitssystem beitragen. Ferner werden weniger Patienten Nierentransplantationen brauchen und die Wartezeit auf ein Organ für die verbleibenden Patienten würde sinken.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung und sind nicht als Beschränkung des beanspruchten Schutzumfangs aufzufassen.

Figur

1 zeigt verschiedene Sequenzen, die den kodierenden Teil der LOC125704, CN1 and CN2 Gene charakterisieren. Polymorphe Stellen sind fett gedruckt.

Beispiel 1
Screening der Region D18S43-D18S50 auf Empfänglichkeitsgene für DN
Um die potentielle Empfänglichkeitsgene für direkte funktionelle Studien auszuwählen, wurde ein cDNA-Mikroarray konstruiert. Alle bekannten Gene der Region 18g22.3-23 – zwischen den Markern D18S43 und D18S50 –, einschließlich einer Anzahl von Genen, die vorläufig auf diese Region kartiert worden waren, wurden in den Array aufgenommen und wurden als potentieller Kandidat für die DN betrachtet. Diese Gene sind in Tabelle 1 aufgeführt.
ZNF236 konnte durch eine vor kurzem durchgeführte Untersuchung bereits ausgeschlossen werden (Halama N, Yard A, Vardarli I, et al.: The Kruppel-like zinc-finger gene ZNF236 is alternatively spliced and excluded as susceptibilitygene for diabetic nephropathy. Genomics, 82: 406–411, 2003).
Für das Design des Chips wurden Daten aus der NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) und der Ensembl Datenbank des Sanger Instituts (www.ensembl.org) verwendet. Die Chips wurden nach Standardprotokollen hybridisiert.
Table 1: Für den Array ausgewählte Gene
cDNA Klone, die in der 40k Genbank in Leiden oder im RZPD Resourcenzentrum in Berlin vorhanden waren, wurden von diesen Quellen bestellt. Die anderen Gene wurden mittels RT-PCR amplifiziert, Primer hierfür wurden mit Hilfe der Primer-3-Software (Whitehead Institute) ausgewählt. Mittels RT-PCR wurden cDNA-Segmente von 18 Genen erhalten. Zehn weitere Gene konnten nicht in den Array aufgenommen werden, da sie nicht amplifiziert werden konnten. Ferner wurden verschiedene Kontrollelemente aufgenommen. Alle Elemente des Arrays wurden sequenziert und mittels BLAST überprüft.
Die Gesamt-RNA wurde aus Glomeruli von drei menschlichen Nieren mit histologisch bestätigter DN und drei Nieren gesunder Spender isoliert. Diese 6 Proben wurden in vergleichenden Hybridisationen verwendet. In jedem Experiment wurde eine DN-RNA-Probe mit einer Kontroll-RNA, die andersfarbig markiert war, verglichen. Da jede Kombination mit dem Array hybridisiert wurde, wurden insgesamt 3 × 3 = 9 Experimente durchgeführt. Die Ergebnisse jedes individuellen Genes wurden mit den Ergebnissen für das GAPDH-Housekeeping-Gen verglichen.
Die Expression der Kandidatengene wurde mit einem Mikroarray untersucht. Einige Gene zeigten signifikante Veränderungen. Nach der Reevaluation der genomischen Lokalisation dieser Gene blieben drei Kandidatengene übrig. Alle Signale wurden genau untersucht um auszuschließen, daß sie durch Artefakte auf dem Objektträger verursacht worden waren. Gene, die eine signifikante Veränderung in nur einer von neun Hybridisationen zeigten, wurden ebenfalls ausgeschlossen. Die übrigen Gene, die in Tabelle 2 aufgelistet sind, zeigten einen konstanten Expressionsunterschied.
Table 2: Mittelwerte
Eines der Kandidatengene, das durch die oben beschriebene Prozedur identifiziert werden konnte, war SDCCAG33. Der cDNA Klon (IMAGE Nr. 795612) stammte aus der Research Genetics Datenbank in Leiden. Alternative Symbole für SDCCAG33 sind: NY-CO-33. Die Größe des aus der Soares testis NHT Bibliothek amplifizierten PCR-Produkts war 270 bp. Das Gen SDCCAG33 kodiert ein Kolonkarzinomantigen, das durch serologische Analyse rekombinanter cDNA Espressionsbibliotheken durch Scanlan und Mitarbeiter identifiziert wurde (Scanlan et al.: Characterization of human colon cancer antigens recognized by autologous antibodies. Int J Cancer. 76: 652–658, 1998). Das Gen SDCCAG33 (NY-CO-33) ist innerhalb des DN-Konfidenzintervalls, das durch die Linkage-Analyse definiert worden war, nahe D18S815 kartiert.
DKFZp434N199 war ein Kandidatgen, das an der proximalen Grenze des DN-Konfidenzintervalls kartiert ist. Der cDNA Klon stammte vom RZPD in Berlin. Wir erhielten ein 1151 bp großes PCR-Produkt bei Amplifikation aus Hodengewebe. Im Moment nehmen wir an, daß DKFZp434N199 kein echtes Transkript ist. Das Gen hat keine Introns, und die Mehrheit der RT-PCR Experimente zeigte nicht das erwartete Produkt.
Der dritte Kandidat war FLJ10830. Dieses Gen kodiert die zytosolische nichtspezifische Dipeptidase, die auch als CN2 (Carnosinase-2) oder Gewebscarnosinase bekannt ist. Ein weiterer alternativer Locusname ist Glutamat-Carboxypeptidase-ähnliches-Protein 1 (CGL1). Der cDNA Klon stammte aus der 40 k Genbank des LUMC (Leiden, Niederlande). Mittels RT-PCR mit RNA aus Ovarkarzinomgewebe wurde ein 635 bp großes Produkt erhalten. Es konnte eine verminderte Expression des CN2-Gens in glomerulärer RNA von Nieren mit diabetischer Nephropathie nachweisen werden.
Beispiel 2
Zellkulturexperimente zur glukoseabhängigen Expression der Kandidatengene CN 2 und SDCCAG33
Für die Zellkultur/RT-PCR Experimente wurden Glomeruli aus homogenisiertem renalem Gewebe von 4 verschiedenen Individuen durch differentielles Sieben durch die Meshstärken 60, 80, 100 und 120 isoliert. Der Phänotyp dieser Individuen war unbekannt. Das Material von den Sieben mit Meshstärke 80, 100 und 120 wurde gesammelt, einer Kollagenase Verdauung (1 μg/ml Kollagenase I, 30 Minuten, 37°C) unterzogen, und in eine T75 Kulturflasche, die 10 ml DMEM Medium, angereichert mit 20% FCS enthielt, gegeben. Das Medium wurde nach den ersten 7 Tagen gewechselt und danach zweimal wöchentlich.
Die renalen Zellen wurden in Gegenwart von hohen Konzentrationen D-Glukose (25 mM) für mindestens 4 Wochen kultiviert und die Expression von CN2 in diesen Zellen wurde mit RNA-Leveln, die in den gleiche Zelllinien unter Kontrollbedingungen (5 mM D-Glukose oder 25 mM L-Glukose) beobachtet wurden, verglichen. Die RNA wurde mit Hilfe des Trizol-Reagenz (Gibco BRL), entsprechend der Herstelleranleitung, isoliert.
Die Expression von CN2 und GAPDH wurden in jeder Probe durch RT-PCR oder quantitative PCR mittels Light Cycler System (Roche) gemessen. Zu diesem Zweck wurde die cDNA-Synthese in einem Gesamtvolumen von 20 μl, das aus 1 μg RNA, 2 μl eines 10 × Reaktionspuffers (Roche), 5 mM MgCl₂, 1 mM Deoxynukleotiden, 1,6 μg oligo p(dT)15, 50 U RNAse Inhibitor und 20 U AMV Reverse Transkriptase bestand, durchgeführt. Vor der cDNA Synthese wurden alle RNA-Proben einer DNAse Behandlung, wie vom Hersteller (Gibco BRL) angegeben, unterzogen. Für die qualitative Analyse der CN2-Expression in renalen Zellen wurde RT-PCR verwendet. Die Amplifikation wurde durch Zusatz von 1,0 mM Tris-HCl, 0,15 mM MgCl₂, 7,5 mM KCl, 1 μl cDNA, 2,5 mM jedes dNTP, 2,5 U Taq DNA Polymerase und 20 pmol jedes Primers zu einem Gesamtvolumen von 20 μl durchgeführt. Insgesamt wurden 30 Amplifikationszyklen, die jeweils aus 30 Sekunden 94°C, 60 Sekunden 62°C (CN2 und SDCCAG33) oder 55°C (GAPDH) und 50 Sekunden 72°C bestanden, durchgeführt. Vor dem Start der Amplifikation wurden die Proben für 90 Sekunden bei 94°C denaturiert. Für die quantitative PCR wurden serielle Verdünnungen von cDNA in einem Gesamtvolumen von 20 μl, bestehend aus 2 mM MgCl₂, 10 pmol jedes Primers, 2,5 U Taq DNA Polymerase und 1,8 μl FastStart SYBR Green I (Roche) amplifiziert. Für die Light Cycler PCR wurden 60 bzw. 45 Amplifikationszyklen für CN2 bzw. GAPDH durchgeführt. Sie bestanden aus je 15 Sekunden bei 95°C, 5 Sekunden bei 62°C (CN2), oder 55°C (GAPDH) und 12 Sekunden bei 72°C. Vor dem Start der Amplifikation wurde die Proben für 5 Sekunden bei 95°C inkubiert. Die Primersequenzen für CN2, SDCCAG33 und GAPDH waren wie folgt:

forward (CN2)	CACCTCACCCTTTTCCAACTTGC (SEQ-ID-No. 32)
reverse (CN2)	CCCAAAGTGCTCGATTATAGGTGT (SEQ-ID-No. 33)
forward (SDCCAG33)	TCATGGACATCTCCGACATGG (SEQ-ID-No. 34)
reverse (SDCCAG33)	AATTTCGTTCCCCCTGTCCTC (SEQ-ID-No. 35)
forward (GAPDH)	GTCTTCACCACCATGGAGAA (SEQ-ID-No. 36)
reverse (GAPDH)	ATCCACAGTCTTCTGGGTGG. (SEQ-ID-No. 37).

Die qualitativen RT-PCR Experimente zeigten, daß die Expression von CN2 in zumindest einer der vier Zelllinien glukoseabhängig war. Dies konnte nicht für SDCCAG33 beobachtet werden. Die Zelllinie, die eine glukoseabhängige Expression von CN2 zeigte, wurde für die quantitative RT-PCR zusammen mit einer nicht-glukoseabhängigen Kontrolle ausgewählt.
In der ausgewählten Zelllinie zeigte die RT-PCR, daß CN2 mRNA nach einer Woche Kultur in 25 mM D-Glukose herunterreguliert wird. CN2 war jedoch hochreguliert nach zweiwöchiger Kultur unter diesen Konditionen. In der anderen Zelllinie konnte kein Beweis für eine CN2-Regulation gefunden werden, weder nach einer, noch nach 2 Wochen Kultivation in 25 mM D-Glukose. Unsere Daten machen deutlich, daß die CN2 Regulation durch hohe Glukosekonzentrationen interindividuell variiert. Deshalb zeigen diese Ergebnisse, daß – zumindest bei manchen Individuen – die Expression von CN2 glukoseabhängig ist. Die Ergebnisse belegen, daß CN2 und nicht SDCCAG33 das krankheitsverursachende Gen für DN ist.
Beispiel 3
Mikrosatelliten-Marker im Bereich des CN2-Gens
Assoziationsstudien wurden bei 32 deutschen Patienten und acht niederländischen Patienten mit Diabetes Typ 2 und diabetischer Nephropathie durchgeführt. Zwei Verwandte 1. Grades (meist Ehepartner und Kind) wurden gebeten, ebenfalls Blut abzugeben. Die Proben der Ehepartner dienten als gematchte Kontrollen. DNA wurde mittels Standard-Aussalzungstechniken isoliert. Die Genotypen wurden durch Standard-PCR-Techniken unter Verwendung von normalen und Cy5 gelabelten Primern (MWG, Ebersberg, Deutschland) erhalten. Die Primer wurden so gewählt, daß sie repetitive Sequenzen flankierten, von denen erwartet wurde, daß sie im Hinblick auf ihre Kopienanzahl polymorph sind (DN12). Andere Primer (CN2-PM) wurden so gewählt, daß sie Single Nucleotid Polymorphismen (SNPs) flankieren. Die folgenden Primer wurden verwendet:

DN12f:	AGGCAGGGATGGAAAAGG (CY5 labelled) (SEQ-ID-No. 38)
DN12r:	GGATGCCAGCCATTCATTAG (SEQ-ID-No. 39)
CN2-PM-fw2:	CTGTCGCAGACGCTCAAAC (SEQ-ID-No. 40)
CN2-PM-rv2:	CGGAGATTTCGTGGGTTG (SEQ-ID-No. 41).

Typische PCR-Bedingungen waren: 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 0,15–0,2 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 100 ng genomische DNA, 0,2 mM jedes dNTPs, 0,3 U Taq DNA Polymerase und 20 pmol jedes Primers in einem Gesamtvolumen von 20 μl.
Insgesamt wurden 30–40 Amplifikationszyklen, von denen jeder aus 30 Sekunden Denaturierung bei 94°C, 60 Sekunden Annealing bei 60°C und 120 Sekunden Extension bei 72°C, bestand, durchgeführt. Vor dem Start der Amplifikation wurden die Proben für 5 Minuten bei 94°C denaturiert. Für die SNPs wurde eine Annealing-Temperatur von 62°C verwendet. Die SNP PCR-Produkte wurden mit Hilfe von Microspin S400 Säulen (Amersham, Freiburg, Deutschland) gereinigt und auf einem ABI 3100 Sequenziergerät (Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland), unter Verwendung des ABI Big Dye Kit Version 1.1 und der forward (,fw' oder ,fw2') Primer sequenziert. Die statistische Analyse der Ergebnisse wurde mit dem Fisher's exact-Test durchgeführt. P-Werte unter 0,05 wurden als signifikant angesehen.
Mehrere neue Mikrosatelliten-Marker wurden in der CN2-Region etabliert. Signifikante Ergebnisse wurden mit einem Marker, der etwa 62 kb 5' vom Exon 1 von CN2 lag und DN12 genannt wurde (in der NCBI SNP Datenbank als rs3080862 aufgeführt), erzielt. Allel ,259', das eine Häufigkeit von 33% in gematchten Kontrollpersonen mit einem unbekannten Phänotyp hat, wurde sehr häufig bei Patienten mit DN gefunden. 32 von 40 Patienten waren Träger des Allels, wohingegen nur 20 von 44 Kontrollpersonen das ,259' Allel tragen (p < 0,01) in einem zweiseitigen Fisher's exact-Test). Wenn die Analyse auf süddeutsche Patienten beschränkt wurde, waren 28 von 32 (p = 0,004) Patienten Träger des ,259' Allels.
Ungefähr 437 bp vom Start des Exons 1 von CN2 wurde ein bisher nicht beschriebener c/t Polymorphismus festgestellt. Bei deutschen DN-Patienten und ihren Verwandten wurde dieser SNP mit den CN2-PM Primern, die oben angegeben sind, amplifiziert. Es fand sich kein signifikanter Unterschied zwischen dem Auftreten der SNP-Allele bei DN-Patienten und der Kontrollgruppe.
Daraus wurde geschlossen, daß eine Sequenzvariante bei DN12 oder in der Umgebung von DN12 die Mehrzahl der untersuchten Individuen für die DN prädisponiert. DN12 liegt stromaufwärts vom CN2 Gen und sehr nah am 3'-Ende des LOC 125704 Gens.

Claims

Verwendung eines oder mehrerer mit dem Carnosin-Metabolismus assoziierten Gene und/oder Varianten und/oder Teilen davon und/oder deren 5'- und 3'-flankierende Bereiche zum Nachweis einer diabetischen Nephrophathie (DN) oder deren Vorstufen oder einer Prädisposition dafür.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das mit dem Carnosin-Metabolismus assoziierte Gen das Carnosinase 1 (CN1)-Gen oder das Carnosinase 2 (CN2)-Gen ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die 5'- und 3'-flankierenden Bereiche jeweils etwa 100 kb betragen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die 5' und 3'-flankierenden Bereiche zumindest teilweise das LOC 125704 Gen enthalten.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die 5'- und 3'-flankierenden Bereiche regulatorische Sequenzen für das mit dem Carnosin-Metabolismus assoziierte Gen enthalten.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die mit dem Carnosin-Metabolismus assoziierten Gene Deletionen, Substitutionen, und/oder Insertionen aufweisen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Varianten Deletionen, Substitutionen und/oder Insertionen aufweisen und/oder Splicevarianten sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Teile kodierende und nicht-kodierende Regionen umfassen, welche gegebenenfalls Deletionen, Substitutionen und/oder Insertionen aufweisen und/oder Splicevarianten sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die 5'- und 3'-flankierenden Bereiche Deletionen, Substitutionen und/oder Insertionen aufweisen und/oder Splicevarianten aufweisen.
Verwendung nach einem der Anspruch 1 bis 9, wobei die Teile aus der Gruppe, bestehend aus SEQ-ID-Nrn. 1 bis 31, ausgewählt sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Nachweis von DN oder deren Vorstufen oder einer Prädisposition dafür auf genomischer, transkriptionaler, translationaler und/oder post-translationaler Ebene erfolgt.
Verfahren zum Nachweis einer DN oder deren Vorstufen oder einer Prädisposition dafür, umfassend (a) die Bereitstellung einer Patientenprobe, (b) die Bereitstellung einer Kontrollprobe, (c) das Bestimmen eines Zustands von mindestens einem, wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definierten, Gen und/oder Varianten und/oder Teilen davon und/oder dessen 5'- und/oder 3'-flankierende Bereiche auf genomischer, transkriptionaler, translationaler und/oder posttranslationaler Ebene in der Patientenprobe und der Kontrollprobe und (d) das Vergleichen und Auswerten der Zustände von der Patientenprobe und der Kontrollprobe.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der in (c) zu bestimmende Zustand die Expression des Gens betrifft.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Genexpression durch PCR, Northern-Blot, Western-Blot und/oder EIA bestimmt wird.
Kit zum Nachweis einer DN oder deren Vorstufen oder einer Prädisposition dafür, enthaltend Mittel zum Bestimmen eines Zustands von einem, wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definierten, Gen und/oder Varianten und/oder Teilen davon und/oder dessen 5'- und/oder 3'-flankierende Bereiche auf genomischer, transkriptionaler, translationaler und/oder post-translationaler Ebene in einer Patientenprobe.
Kit nach Anspruch 15, wobei die Mittel Primer für eine PCR zur Bestimmung der Genexpression des Gens und/oder Nukleinsäuresonden für eine Hybridisierung mit dem, wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definierten, Gen und/oder Varianten und/oder Teilen davon und/oder dessen 5'- und/oder 3'-flankierende Bereiche umfassen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein natives oder rekombinantes CN1- und/oder CN2- oder biologisch wirksame Derivate davon und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15 zur Behandlung oder Verbeugung von DN.
Verfahren zum Auffinden von Verbindungen, welche zur Behandlung und/oder Vorbeugung von DN geeignet sind, umfassend a) das Zugeben einer zu testenden Verbindung zu einem Zellkultursystem oder Tier oder Menschen, und b) das Bestimmen der Expression von mit dem Carnosin-Metabolismus assoziierten Genen.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Zellkultursystem renale Zellen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Tier ein transgenes Tier ist.