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Technisches Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung betrifft Verfahren zum Diagnostizieren und Behandeln einer
Herzkrankheit.
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Hintergrund der Erfindung
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Herzkrankheit
ist ein allgemeiner Begriff, der verwendet wird, um viele verschiedene
Zustände
des Herzens zu beschreiben. Zum Beispiel ist eine Krankheit der
Koronararterie, was die häufigste
Herzkrankheit ist, durch eine Konstriktion oder Verengung der Arterien
charakterisiert, die das Herz mit sauerstoffreichem Blut versorgen,
und kann zu einem myokardialen Infarkt führen, welcher den Tod eines
Teil des Herzmuskels darstellt. Die Herzinsuffizienz ist ein Zustand,
der aus der Unfähigkeit
des Herzens resultiert, eine adäquate
Menge Blut durch den Körper
zu pumpen. Die Herzinsuffizienz ist nicht ein plötzlicher, abrupter Stopp der
Herzaktivität,
sondern entwickelt sich typischerweise vielmehr langsam über viele
Jahre, indem das Herz schrittweise seine Fähigkeit verliert effektiv,
Blut zu pumpen. Risikofaktoren für
Herzinsuffizienz schließen
eine Krankheit der Koronararterie, Bluthochdruck, einen Herzklappenfehler,
Kardiomyopathie, eine Krankheit des Herzmuskels, Übergewicht,
Diabetes und eine familiäre
Vorgeschichte von Herzinsuffizienz ein.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
Erfindung stellt diagnostische, Wirkstoffscreening- und therapeutische
Verfahren auf Grundlage der Beobachtung bereit, dass die Mutation
des Titin-Gens in einem Zebrafisch zu einem Phänotyp führt, der einer Herzinsuffizienz
eines Säugers ähnlich ist.
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In
einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum
Bestimmen, ob ein Testsubjekt (z.B. ein Säuger wie zum Beispiel ein Mensch)
eine(n) Titin-bezogene(n) Krankheit oder Zustand (z.B. eine Herzinsuffizienz)
besitzt oder gefährdet
ist, eine solche zu entwickeln, bereit. Dieses Verfahren bezieht
das Analysieren eines Nukleinsäuremoleküls einer
Probe aus einem Testsubjekt ein, um zu bestimmen, ob das Testsubjekt
eine Mutation (z.B. eine Mutation in einem herzspezifischen Exon,
wie z.B. dem N2B-Exon; z.B. die Pickwick-Mutation; siehe nachfolgend)
in einem Titin-Gen besitzt. Die Gegenwart einer solchen Mutation ist
ein Anzeichen dafür,
dass das Testsubjekt eine Titin-bezogene Krankheit besitzt oder
gefährdet
ist, eine solche zu entwickeln. Dieses Verfahren kann weiterhin
das Verwenden von Nukleinsäuremolekülprimern,
die für das
Titin-Gen spezifisch sind, für
eine Nukleinsäuremolekülamplifikation
des Titin-Gens durch Polymerase-Kettenreaktion oder das Sequenzieren
von Titin-Nukleinsäuremolekülen aus
dem Testsubjekt einbeziehen.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Screeningverfahren
zum Identifizieren einer Verbindung bereit, die verwendet werden
kann, um eine Herzinsuffizienz zu behandeln oder einer solchen vorzubeugen.
Dieses Verfahren bezieht das Inkontaktbringen eines Organismus (zum
Beispiel eines Zebrafischs) mit einer Titin-Mutation (zum Beispiel
einer Mutation in einem herzspezifischen Exon, wie z.B. dem N2B-Exon;
z.B. der Pickwick-Mutation) und einem Phänotyp, der für Herzinsuffizienz
charakteristisch ist, mit der Verbindung und das Bestimmen der Wirkung
der Verbindung auf den Phänotyp
ein. Der Nachweis einer Verbesserung des Phänotyps zeigt die Identifikation
einer Verbindung an, die verwendet werden kann, um eine Herzinsuffizienz zu
behandeln oder einer solchen vorzubeugen.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Behandeln
von oder Vorbeugen vor einer Herzkrankheit, wie zum Beispiel Herzinsuffizienz,
in einem Patienten bereit. Dieses Verfahren bezieht das Verabreichen
einer Verbindung, die unter Verwendung des vorstehend beschriebenen
Screeningverfahrens identifiziert wurde, an einem Patienten ein.
Ein unter Verwendung dieses Verfahrens behandelter Patient kann
eine Mutation in dem Titin-Gen besitzen.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein nicht menschliches
Tier (z.B. einen Zebrafisch oder eine Maus) bereit, das eine Mutation
in einem Titin-Gen besitzt. Die Mutation kann zum Beispiel in einem
herzspezifischen Exon des Titin-Gens, wie zum Beispiel dem N2B-Exon
sein, und kann in der Produktion eines trunkierten Titin-Produkts,
zum Beispiel durch Einführen
eines Stoppkodons, resultieren.
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Mit „Polypeptid" oder „Polypeptidfragment" ist eine Kette von
zwei oder mehr Aminosäuren,
ungeachtet jeglicher posttranslationaler Modifikation (z.B. Glycosylierung
oder Phosphorylierung), gemeint, die ein vollständiges oder einen Teil eines
natürlich
oder nicht natürlich
vorkommenden Polypeptids darstellt. Mit „posttranslationaler Modifikation" ist jede Veränderung
eines Polypeptids oder Polypeptidfragments während oder nach Synthese gemeint.
Posttranslationale Modifikationen können natürlicherweise hergestellt werden
(wie z.B. während
der Synthese in einer Zelle) oder künstlich erzeugt werden (wie
z.B. durch rekombinante oder chemische Mittel). Ein „Protein" kann aus einem oder
mehreren Polypeptiden gebildet werden.
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Mit „Titin", „Titin-Protein" oder „Titin-Polypeptid" ist ein Polypeptid
gemeint, das mindestens 45%, vorzugsweise mindestens 60%, weiter
bevorzugt mindestens 75% und am meisten bevorzugt mindestens 90% Aminosäuresequenzidentität mit der
Sequenz des humanen (siehe nachstehend) oder des Zebrafisch-Titin-Polypeptids
besitzt. Polypeptidprodukte aus Splice-Varianten von Titin-Gensequenzen
und Titin-Genen, die Mutationen enthalten, sind auch in diese Definition
eingeschlossen. Ein Titin-Polypeptid, wie hierin definiert, spielt
bei der Entwicklung des Herzens, dem Modelling, der Struktur und
Kontraktilität
des Herzens eine Rolle. Es kann als ein Marker für eine Herzkrankheit wie zum
Beispiel Herzinsuffizienz verwendet werden.
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Mit
einem „Titin-Nukleinsäuremolekül" ist ein Nukleinsäuremolekül wie zum
Beispiel ein genomisches DNA-, cDNA- oder RNA-(z.B. mRNA-)-Molekül gemeint,
das Titin, ein Titin-Protein, ein Titin-Polypeptid oder einen Teil
davon, wie vorstehend definiert, kodiert.
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Der
Begriff „Identität" wird hierin verwendet,
um die Beziehung der Sequenz eines bestimmten Nukleinsäuremoleküls oder
Polypeptids zu der Sequenz eines Referenzmoleküls des gleichen Typs zu beschreiben. Zum
Beispiel wird von einer „Identität" an einer Position
gesprochen, wenn ein Polypeptid oder ein Nukleinsäuremolekül an einer
gegebenen Position im Vergleich zu einem Referenzmolekül, mit welchem
es/sie abgeglichen wird, den gleichen Aminosäure- oder Nukleotidrest besitzt.
Der Grad der Sequenzidentität
eines Nukleinsäuremoleküls oder
eines Peptids mit dem Referenzmolekül wird typischerweise unter
Verwendung von Sequenzanalysesoftware mit den hierin spezifizierten
voreingestellten Parametern, wie zum Beispiel der Einführung von
Aussparungen, gemessen, um einen optimalen Abgleich zu erreichen
(z.B. Sequenz-Analyse-Softwarepaket von der „Genetics Computer Group", „University
of Wisconsin Biotechnology Center", 1710 University Avenue, Madison, WI
53705, BLAST- oder PILEUP/PRETTYBOX-Programme). Diese Softwareprogramme
stimmen identische oder ähnliche
Sequenzen ab, indem Grade an Identität verschiedenen Substitutionen, Deletionen
oder anderen Modifikationen zugewiesen werden. Konservative Substitutionen
schließen
typischerweise Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen ein:
Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin und Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin
und Glutamin; Serin und Threonin; Lysin und Argin; und Phenylalanin
und Tyrosin.
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Ein
Nukleinsäuremolekül oder Polypeptid
wird als „im
Wesentlichen identisch" mit
einem Referenzmolekül
bezeichnet, wenn es über
die gesamte Länge
mindestens 51%, vorzugsweise mindestens 55%, 60% oder 65% und am
meisten bevorzugt 75%, 85%, 90% oder 95% Identität mit der Sequenz des Referenzmoleküls zeigt.
Für Polypeptide
beträgt
die Länge
der Vergleichssequenzen mindestens 16 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens
20 Aminosäuren,
weiter bevorzugt mindestens 25 Aminosäuren und am meisten bevorzugt mindestens
35 Aminosäuren.
Für Nukleinsäuremoleküle beträgt die Länge der
Vergleichssequenzen mindestens 50 Nukleotide, vorzugsweise mindestens
60 Nukleotide, weiter bevorzugt mindestens 75 Nukleotide und am
meisten bevorzugt mindestens 110 Nukleotide.
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Ein
Titin-Nukleinsäuremolekül oder Titin-Polypeptid
wird „analysiert" oder einer „Analyse" unterzogen, wenn
ein Testarbeitsablauf mit diesem durchgeführt wird, der die Bestimmung
seiner biologischen Aktivität oder,
ob es Wildtyp oder mutiert ist, erlaubt. Zum Beispiel kann man die
Titin-Gene eines Tiers (z.B. eines Menschen oder Zebrafisches) durch
Amplifizieren der genomischen DNA des Tiers unter Verwendung der
Polymerase-Kettenreaktion und anschließendem Bestimmen, ob die amplifizierte
DNA eine Mutation, zum Beispiel die Pickwick-Mutation, zum Beispiel
durch Nukleotidsequenz- oder Restriktionsfragmentanalyse enthält, analysieren.
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Mit „Sonde" oder „Primer" ist ein einzelsträngiges DNA-
oder RNA-Molekül
einer definierten Sequenz gemeint, das mit einem zweiten DNA- oder
RNA-Molekül,
das eine komplementäre
Sequenz („Target") enthält, eine
Basenpaarung eingehen. Die Stabilität des resultierenden Hybrides
hängt von
dem Ausmaß der
Basenpaarung, die auftritt, ab. Seine Stabilität wird durch Parameter, wie
zum Beispiel dem Grad der Komplementärität, zwischen der Sonde und dem
Zielmolekül
und dem Grad der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen beeinflusst.
Der Grad der Hybridisierungsstringenz wird durch Parameter, wie
zum Beispiel der Temperatur, der Salzkonzentration und der Konzentration
organischer Moleküle,
wie zum Beispiel Formamid, beeinflusst und wird durch Verfahren,
die dem Fachmann gut bekannt sind, bestimmt. Sonden und Primer,
die für
Titin-Nukleinsäuremoleküle spezifisch
sind, haben vorzugsweise mehr als 45% Sequenzidentität, weiter
bevorzugt mindestens 55 bis 75% Sequenzidentität, weiter bevorzugt mindestens
75 bis 85% Sequenzidentität,
noch weiter bevorzugt mindestens 85 bis 99% Sequenzidentität und am
meisten bevorzugt 100% Sequenzidentität mit der Sequenz des humanen
(siehe nachfolgend) oder Zebrafisch-Titins.
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Die
Sonden können
durch Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, nachweisbar
markiert, entweder radioaktiv oder nicht radioaktiv, sein. Die Proben
können
für Verfahren
verwendet werden, die Nukleinsäurehybridisierung,
zum Beispiel Nukleinsäuresequenzierung,
Nukleinsäureamplifikation
durch die Polymerase-Kettenreaktion, Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-(SSCP;
single stranded conformational polymorphism)-Analyse, Restriktionsfragment-Polymorphismus-(RFLP)-Analyse,
Southern-Hybridisierung, Northern-Hybridisierung, In-situ-Hybridisierung, „electrophoretic
mobility shift assay" (EMSA)
und andere Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, einbeziehen.
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Ein
Molekül,
z.B. ein(e) Oligonukleotidsonde oder -primer, ein Gen oder Fragment
hiervon, ein cDNA-Molekül,
ein Polypeptid oder ein Antikörper
kann als „nachweisbar
markiert" bezeichnet
werden, wenn er/sie/es in einer solchen Weise gekennzeichnet ist,
dass seine Gegenwart in einer Probe direkt identifiziert werden
kann. Verfahren für
nachweisbar markierte Moleküle
sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen – ohne Beschränkung – radioaktive
Markierung (z.B. mit einem Isotop wie zum Beispiel 32P oder 35S) und nichtradioaktive Markierung (z.B.
mit einer Fluoreszenzmarkierung wie zum Beispiel Fluorescein) ein.
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Mit
einem „im
Wesentlichen reinen Polypeptid" ist
ein Polypeptid (oder ein Fragment hiervon) gemeint, das von Proteinen
und organischen Molekülen,
die es natürlicherweise
begleiten, getrennt wurde. Typischerweise ist ein Polypeptid im
Wesentlichen rein, wenn es zu mindestens 60 Gew.-% frei von den
Proteinen und natürlicherweise
vorkommenden organischen Molekülen,
mit welchen es natürlicherweise
assoziiert ist, ist. Vorzugsweise ist das Polypeptid ein Titin-Polypeptid,
das zu mindestens 75%, weiter bevorzugt zu mindestens 90% und am
meisten bevorzugt zu mindestens 99% des Gewichts rein ist. Ein im
Wesentlichen reines Titin-Polypeptid kann zum Beispiel durch Extraktion
aus einer natürlich
Quelle (z.B. isoliertem Herzgewebe), durch Expression eines rekombinanten
Nukleinsäuremoleküls, das
ein Titin-Polypeptid kodiert, oder durch chemische Synthese erhalten
werden. Die Reinheit kann durch jedes beliebige geeignete Verfahren
gemessen werden, zum Beispiel durch Säulenchromatographie, Polyacrylamid-Gelelektrophorese
oder HPLC-Analyse.
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Ein
Polypeptid ist im Wesentlichen frei von natürlich assoziierten Bestandteilen,
wenn es von jenen Proteinen und anorganischen Molekülen getrennt
wird, die es in seinem natürlichen
Zustand begleiten. So ist ein Protein, das chemisch synthetisiert
oder in einem zellulären
System produziert wird, das von der Zelle, in welcher es natürlicherweise
produziert wird, verschieden ist, im Wesentlichen frei von seinen
natürlicherweise assoziierten
Bestandteilen. Folglich schließen
im Wesentlichen reine Polypeptide nicht nur jene ein, die von eukaryotischen
Organismen stammen, sondern auch jene, die in E. coli oder anderen
Prokaryonten synthetisiert werden.
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Ein
Antikörper
wird als an ein Polypeptid „spezifisch
bindend" bezeichnet,
wenn er es erkennt und spezifisch an das Polypeptid (z.B. ein Titin-Polypeptid)
bindet, aber im Wesentlichen andere Moleküle (z.B. nicht Titin-bezogene
Polypeptide) in der Probe, zum Beispiel einer biologischen Probe,
die natürlicherweise
das Polypeptid einschließt,
nicht erkennt und bindet.
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Mit „hoch-stringenten
Bedingungen" sind
Bedingungen gemeint, die eine Hybridisierung vergleichbar mit der
Hybridisierung erlauben, die auftritt, wenn eine DNA-Probe mit mindestens
500 Nukleotiden Länge
in einem Puffer enthaltend 0,5 M NaHPO4,
pH 7,2, 7% SDS, 1 mM EDTA und 1% BSA (Fraktion V) bei einer Temperatur
von 65°C
oder einem Puffer enthaltend 48% Formamid, 4,8 × SSC, 0,2 M Tris-Cl, pH 7,6,
1 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und
0,1% SDS bei einer Temperatur von 42°C verwendet wird. (Dieses sind typische
Bedingungen für
hoch-stringente Northern- oder Southern-Hybridisierungen). Eine hoch-stringente Hybridisierung
beruht auch auf dem Erfolg einer Vielzahl von Techniken, die routinemäßig von
Molekularbiologen durchgeführt
werden, wie zum Beispiel hoch-stringente PCR, DNA-Sequenzierung,
Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse
und In-situ-Hybridisierung. Im Gegensatz zu Northern- und Southern-Hybridisierungen
werden diese Techniken für
gewöhnlich
mit relativ kurzen Sonden (z.B. üblicherweise
16 Nukleotide oder länger
für PCR
oder Sequenzierung und 40 Nukleotide oder länger für In-situ-Hybridisierung) durchgeführt. Die
hoch-stringenten Bedingungen, die in diesen Techniken verwendet
werden, sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie gut
bekannt und Beispiele davon können
zum Beispiel im Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology
John Wiley & Sons,
New York, NY, 1998, gefunden werden, welches hiermit durch Bezugnahme
aufgenommen wird.
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Mit „Probe" ist eine Gewebebiopsie,
Fruchtwasser, Zelle, Blut, Serum, Urin, Stuhl oder andere Probe, die
von einem Patienten oder einem Testsubjekt erhalten wird, gemeint.
Die Probe kann zum Nachweis einer Mutation in einem Titin-Gen oder
der Expressionsniveaus eines Titin-Gens durch Verfahren, die dem
Fachmann bekannt sind, analysiert werden. Zum Beispiel können Verfahren,
wie zum Beispiel Sequenzieren, Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-(SSCP;
single-strand conformational polymorphism)-Analyse oder Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus-(RFLP)-Analyse
von PCR-Produkten,
die von einer Patientenprobe stammen, verwendet werden, um eine
Mutation in einem Titin-Gen nachzuweisen; ELISA kann verwendet werden,
um die Spiegel eines Titin-Polypeptids zu messen; und PCR kann verwendet
werden, um den Spiegel eines Titin-Nukleinsäuremoleküls zu messen.
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Mit „Titin-bezogener
Krankheit" oder „Titin-bezogenem
Zustand" ist eine
Krankheit oder ein Zustand gemeint, die/der aus einer unpassend
hohen oder niedrigen Expression eines Titin-Gens oder einer Mutation in
einem Titin-Gen, die die biologische Aktivität eines Titin-Nukleinsäuremoleküls oder
-Polypeptids ändert,
resultiert. Titin-bezogene Krankheiten und Bedingungen können in
jedem beliebigen Gewebe auftreten, in welchem Titin während des
pränatalen
oder postnatalen Lebens exprimiert wird. Titin-bezogene Krankheiten
und Bedingungen schließen
Herzkrankheiten, wie zum Beispiel Herzinsuffizienz, ein. Spezifische
Beispiele verschiedener Typen von Herzinsuffizienz sind nachfolgend
dargestellt.
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Die
Erfindung stellt einige Vorteile bereit. Zum Beispiel ist es unter
Verwendung der erfindungsgemäßen diagnostischen
Verfahren möglich,
einen Anstieg der Wahrscheinlichkeit von Herzkrankheit, wie zum
Beispiel Herzinsuffizienz, in einem Patienten nachzuweisen, so dass
eine geeignete Intervention eingeleitet werden kann, bevor irgendein
Symptom auftritt. Dies kann zum Beispiel bei Patienten in Hochrisikogruppen
für Herzinsuffizienz
(siehe vorstehend) verwendbar sein. Die erfindungsgemäßen diagnostischen
Verfahren ermöglichen
auch die Bestimmung der Ätiologie
eines existierenden Herzzustand, wie zum Beispiel Herzinsuffizienz,
in einem Patienten, so dass ein geeigneter Ansatz zur Behandlung
ausgewählt
werden kann. Zusätzlich können die
erfindungsgemäßen Screeningverfahren
verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die verwendet
werden können,
um Herzzustände,
wie zum Beispiel Herzinsuffizienz, zu behandeln oder ihnen vorzubeugen.
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Andere
Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen
Beschreibung und den Ansprüchen
offensichtlich werden.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnung
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1 ist
eine schematische Darstellung der Struktur der Domänen des
humanen Titin-Filaments.
Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen
von humanem Titin sind in SEQ ID Nr. 1 bzw. 2 bereitgestellt. Die
modulare Architektur des Herz-Titins, wie sie durch die Volllängen-cDNA
vorhergesagt wird, ist dargestellt.
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In
dem Molekül
sind insgesamt 244 Kopien von 100 Repeats von Resten, wie durch
die vertikalen Rechtecke angezeigt, enthalten. 112 dieser gehören zu der
Ig-Domäne
und 132 gehören
zu der FN3-Superfamilie. Sowohl die Titin-Kinasedomäne als auch
die Rest163-Variante
des PEVK-Elements N2-B sind ebenfalls gezeigt. Innerhalb der A-Bande
enthält
die D-Zone sechs Tandem-Repeats der sieben gezeigten Domänen (A1
bis A42) und die C-Zone
enthält
11 Tandem-Repeats der 11 gezeigten Domänen (A43 bis A163). Die Positionen
der als Tandem wiederholten RMSP- und VKSP-Motive in der Z-Scheibe
und der M-Linien-Region sind auch gezeigt.
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Ausführliche Beschreibung
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Die
Erfindung stellt Verfahren zur Diagnose von Herzkrankheit, Screeningverfahren
zum Identifizieren von Verbindungen, die zum Behandeln von oder
Vorbeugen vor Herzkrankheit verwendet werden können, und Verfahren zum Behandeln
von oder Vorbeugen vor Herzkrankheit unter Verwendung dieser Verbindungen
bereit. Die Erfindung stellt auch Systeme für Tiermodelle zur Verfügung, die
in den erfindungsgemäßen Screeningverfahren
verwendet werden können.
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Insbesondere
haben wir entdeckt, dass eine Mutation (die Pickwick-Mutation) in
dem Titin-Gen mit einer Herzkrankheit, wie zum Beispiel Herzinsuffizienz,
verbunden ist. Titin, welches auch als „Connectin" bekannt ist, ist das größte bekannte
einzelkettige Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 3.000
kDa. Titin ist ein Strukturprotein und spielt eine zentrale Rolle
beim Aufbau und der Elastizität
des Wirbeltierskelett- und Herzmuskels. So beziehen die erfindungsgemäßen diagnostischen
Verfahren den Nachweis von Mutationen in dem Titin-Gen ein, während die
erfindungsgemäßen Verbindungsidentifikationsverfahren
das Screenen von Verbindungen einbeziehen, die den Phänotyp von
Titin-Mutanten oder anderen Modellen von Herzkrankheit, wie zum
Beispiel Herzinsuffizienz, beeinflussen. Die auf diese Weise identifizierten
Verbindungen können
in Verfahren zum Behandeln von oder Vorbeugen vor Herzkrankheit
(z.B. Herzinsuffizienz) verwendet werden. Die erfindungsgemäßen diagnostischen
Screening- und therapeutischen
Verfahren wie auch die erfindungsgemäßen Systeme für Tiermodelle
sind im Folgenden näher
beschrieben.
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Diagnostische Verfahren
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Titin-Nukleinsäuremoleküle, -Polypeptide
und -Antikörper
können
in Verfahren verwendet werden, um Krankheiten und Zustände zu diagnostizieren
oder überwachen,
die Mutationen in Titin-Genen oder unpassende Expression hiervon
einbeziehen. Wie ausführlich
nachfolgend diskutiert, ist die Pickwick-Mutation im Zebrafisch,
die in dem Titin-Gen vorhanden ist, durch einen Phänotyp charakterisiert,
der zu dem von Herzinsuffizienz beim Menschen ähnlich ist. So kann der Nachweis
von Abnormalitäten
in Titin-Genen oder ihrer Expression in Verfahren verwendet werden,
um eine Herzkrankheit, wie zum Beispiel Herzinsuffizienz, zu diagnostizieren
oder ihre Behandlung oder Entwicklung zu überwachen. Zur Verwendung als
Referenzen kann die humane Herz-Titin-cDNA-Sequenz
gefunden werden unter:
http://www.embl-heidelberg.de/ExternalInfo/Titin/cardiacseq.html
(SEQ ID Nr. 1), während
die entsprechende Proteinsequenz gefunden werden kann unter: http://www.emblheidelberg.de/ExternalInfo/Titin/cardiacpep.html
(SEQ ID Nr. 2).
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Wie
vorstehend bemerkt, können
die erfindungsgemäßen diagnostischen
Verfahren zum Beispiel mit Herzpatienten, die eine Herzinsuffizienz
haben, in dem Bestreben verwendet werden, ihre Ätiologie zu bestimmen und so
die Auswahl eines geeigneten Verlaufs der Behandlung zu ermöglichen.
Die diagnostischen Verfahren können
auch bei Patienten, die bisher noch keine Herzinsuffizienz entwickelt
haben, die aber gefährdet sind,
eine solche Krankheit zu entwickeln, oder bei Patienten verwendet
werden, die in einem frühen
Stadium der Entwicklung einer solchen Krankheit sind. Die erfindungsgemäßen diagnostischen
Verfahren können
auch beim pränatalen
genetischen Screening verwendet werden, zum Beispiel um Eltern zu
identifizieren, die Träger
einer rezessiven Titin-Mutation
sein könnten.
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Beispiele
von Herzinsuffizienz, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren
diagnostiziert (und behandelt) werden können, schließen ein
Herzdekompensation, welche durch Flüssigkeit in der Lunge oder
dem Körper
charakterisiert ist, was aus der Insuffizienz des Herzens bei der
Wirkung als eine Pumpe resultiert, rechtsseitige Herzinsuffizienz
(rechtsventrikulär),
welche durch eine Insuffizienz der Pumpwirkung des rechten Ventrikels
charakterisiert ist, was in einem Anschwellen des Körpers, insbesondere
der Beine und des Abdomens resultiert; linksseitige Herzinsuffizienz
(linksventrikulär),
was durch eine Insuffizienz der Pumpwirkung der linken Seite des
Herzens verursacht wird, was in einer Kongestion der Lunge resultiert;
vorwärtsgerichtetes
Herzversagen, was durch eine Unfähigkeit
des Herzens charakterisiert ist, Blut in einer ausreichenden Geschwindigkeit
vorwärts
zu pumpen, um dem Sauerstoffbedarf des Körpers bei Ruhe oder während Anstrengung
zu entsprechen; rückwärtsgerichtetes
Herzversagen, was durch die Fähigkeit
des Herzens charakterisiert ist, den Bedürfnissen des Körpers nur
zu entsprechen, wenn die Herzfüllungsdrücke abnorm
hoch sind; Low-Output-Syndrom, welches durch eine Insuffizienz bei
der Beibehaltung des Blutminutenvolumens charakterisiert ist; ein
High-Output-Syndrom, welches durch Herzinsuffizienzsymptome charakterisiert
ist, sogar wenn das Herzminutenvolumen hoch ist.
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Titin
kann auch bei kardiovaskulären
Krankheiten, die nicht Herzinsuffizienz sind, eine Rolle spielen, wie
zum Beispiel einer Krankheit der Koronararterie oder Zuständen, die
mit Klappenbildungsdefekten verbunden sind, und so kann der Nachweis
von Abnormalitäten
in Titin-Genen oder ihrer Expression in Verfahren zur Diagnose oder Überwachung
dieser Zustände
ebenfalls benutzt werden. Die erfindungsgemäßen Verfahren können verwendet
werden, um Zustände,
die hierin beschrieben sind, in jedem beliebigen Säuger, zum
Beispiel Haustieren oder Viehbestand, zu diagnostizieren (oder zu
behandeln).
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Titin-Abnormalitäten, die
unter Verwendung der erfindungsgemäßen diagnostischen Verfahren
nachgewiesen werden können,
schließen
jene ein, die zum Beispiel charakterisiert sind durch (i) abnormale
Titin-Polypeptide, (ii) Titin-Gene, die Mutationen enthalten, die
in der Produktion solcher Polypeptide resultieren und (iii) Titin-Mutationen,
die in der Produktion abnormaler Mengen von Titin resultieren. Der
Nachweis solcher Abnormalitäten
kann in Verfahren zur Diagnose von humaner Herzkrankheit, wie zum
Beispiel Herzinsuffizienz, verwendet werden. Beispielhaft für die Titin-Mutationen,
die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen
werden können,
ist die Pickwick-Mutation (siehe nachfolgend).
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Der
Nachweis von Titin-Mutationen kann unter Verwendung jeder beliebigen
diagnostischen Technik durchgeführt
werden. Zum Beispiel kann eine biologische Probe, die von einem
Patienten erhalten wurde, auf eine oder mehrere Mutation(en) in
Titin-Nukleinsäuremolekülen (z.B.
die Pickwick-Mutation) unter Verwendung eines Mismatch-Nachweisansatzes
analysiert werden. Im Allgemeinen bezieht dieser Ansatz Polymerase-Kettenreaktion-(PCR)-Amplifikation
der Nukleinsäuremoleküle aus einer
Patientenprobe, gefolgt von der Identifikation einer Mutation (d.h.
eines Mismatches) durch Nachweis einer veränderten Hybridisierung, abweichender
elektrophoretischer Gelmigration, Bindung oder Spaltung vermittelt
von Mismatch-Bindeproteine oder durch direktes Sequenzieren eines
Nukleinsäuremoleküls ein.
Jede dieser Techniken kann verwendet werden, um den Nachweis von
mutiertem Titin-Genen zu ermöglichen,
und jedes ist im Stand der Technik gut bekannt. Beispiele dieser
Techniken sind beschrieben von Orita et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86: 2766–2770,
1989) und Sheffield et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 232–236, 1989).
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Mutationsnachweistests
stellen auch eine Möglichkeit
bereit, eine Titin-vermittelte Prädisposition für eine Herzkrankheit
vor dem Einsetzen von Symptomen zu diagnostizieren. Zum Beispiel
könnte
ein Patient, der für
eine Titin-Mutation heterozygot ist, die die normale biologische
Aktivität
oder Expression von Titin unterdrückt, keine klinischen Symptome
einer Titin-bezogenen Krankheit zeigen und dennoch ein höheres als das
normale Risiko für
die Entwicklung einer Herzkrankheit, wie zum Beispiel Herzinsuffizienz,
besitzen. Angesichts einer solchen Diagnose kann ein Patient Vorsichtsmaßnahmen
ergreifen, um die Aussetzung gegenüber nachteiligen Umweltfaktoren
zu minimieren, und kann seinen medizinischen Zustand sorgfältig überwachen,
zum Beispiel durch häufige
körperliche
Untersuchungen. Wie vorstehend erwähnt, kann diese Art des diagnostischen
Ansatzes auch verwendet werden, um Titin-Mutationen in pränatalen Screens nachzuweisen.
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Die
diagnostischen Titin-Assays, die vorstehend beschrieben sind, können unter
Verwendung jeder beliebigen biologischen Probe (z.B. einer Muskelgewebeprobe),
in welcher Titin normal exprimiert wird, durchgeführt werden.
Aufgrund der begrenzten Anzahl an Geweben, in welchen Titin exprimiert
wird, wie auch den relativen Schwierigkeiten, die in das Erhalten
von Proben dieser Gewebe einbezogen sind, könnte es vorteilhaft sein, mutierte
Titin-Gene in anderen, leichter zu erhaltenen Probentypen, wie zum
Beispiel Blut- oder Fruchtwasserproben, unter Verwendung von zum
Beispiel Mismatch-Nachweistechniken nachzuweisen. Vorzugsweise wird
die DNA in einer solchen Probe vor der Analyse einer PCR-Amplifikation
unterzogen.
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Die
Niveausan Titin-Expression in einer Patientenprobe können durch
Verwenden einer beliebigen einer Anzahl von Standardtechniken, die
in der Technik bekannt sind, bestimmt werden. Zum Beispiel kann
die Titin-Expression in einer biologischen Probe (z.B. einer Blut-
oder Gewebeprobe oder Fruchtwasser) aus einem Patienten durch Standard-Northern-Blot-Analyse
oder durch quantitative PCR (siehe z.B. Ausubel et al., supra; PCR
Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.
A. Ehrlich, Hrsg., Stockton Press, NY; Yap et al., Nucl. Acids.
Res. 19: 4294, 1991) überwacht
werden.
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In
einem noch anderen erfindungsgemäßen diagnostischen
Ansatz wird ein Immunoassay verwendet, um Titin-Proteinspiegel in
einer biologischen Probe nachzuweisen oder zu überwachen. Titin-spezifische
polyklonale oder monoklonale Antikörper können in jedem beliebigen Standard-Immunoassay-Format
(z.B. ELISA, Western Blot oder RIA; siehe z.B. Ausubel et. al.,
supra) verwendet werden, um Titin-Polypeptidspiegel zu messen. Diese
Spiegel werden mit Wildtyp-Titin-Spiegel verglichen. Zum Beispiel
könnte
eine Abnahme der Titin-Produktion für einen Zustand oder eine Prädisposition
für einen
Zustand indikativ sein, der in eine unzureichende biologische Titin-Aktivität einbezogen
ist.
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Immunhistochemische
Techniken können
auch zu einem Titin-Nachweis verwendet werden. Zum Beispiel kann
eine Gewebeprobe von einem Patienten erhalten werden, geschnitten
und auf die Gegenwart von Titin unter Verwendung eines Antikörper gegen
Titin und jedes beliebigen Standardnachweissystems (z.B. eines,
das einen Meerrettich-Peroxidase
konjugierten Zweitantikörper
einschließt)
gefärbt
werden. Eine allgemeine Anleitung hinsichtlich solcher Techniken
kann zum Beispiel in Bancroft et al., Theory and Practice of Histological
Techniques, Churchill Livingstone, 1982, und in Ausubel et al.,
supra, gefunden werden.
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Identifikation von Molekülen, die
verwendet werden können
um Herzinsuffizienz zu behandeln oder ihr vorzubeugen
-
Die
Identifikation einer Mutation in Titin als in einem Phänotyp resultierend,
der mit Herzinsuffizienz verbunden ist, ermöglicht die Identifikation von
Molekülen
(z.B. kleinen organischen Molekülen,
Peptiden oder Nukleinsäuremolekülen), die
verwendet werden können,
um Herzinsuffizienz zu behandeln oder ihr vorzubeugen. Die Wirkungen
von Kandidatenverbindungen auf Herzinsuffizienz können unter
Verwendung von zum Beispiel dem Zebrafischsystem erforscht werden.
Der Zebrafisch, Danio rerio, ist ein zur Verwendung bei der genetischen
Analyse der Gefäßentwicklung
praktischer Organismus. Zusätzlich
zu seinem kurzen Generationszyklus und seiner Fruchtbarkeit besitzt
er einen zugänglichen
und transparenten Embryo, der die direkte Beobachtung der Blutgefäßfunktion
von den frühesten
Stadien an erlaubt. Wie nachfolgend ausführlicher diskutiert, sind der
Zebrafisch und andere Tiere mit Mutationen in dem Titin-Gen, die
in diesem Verfahren verwendet werden, auch in die Erfindung einbezogen.
-
In
einem Beispiel der erfindungsgemäßen Screeningverfahren
wird ein Zebrafisch mit einer Mutation in dem Titin-Gen (z.B. ein
Zebrafisch mit der Pickwick-Mutation; siehe nachfolgend) mit einer
Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht und die Wirkung der Verbindung
auf die Entwicklung einer Herzabnormalität, die charakteristisch für Herzinsuffizienz
ist, oder auf den Status einer solchen existierenden Herzabnormalität im Vergleich
zu einer unbehandelten identisch mutierten Kontrolle wird überwacht.
Wie nachfolgend ausführlicher diskutiert,
ist der Zebrafisch mit der Pickwick-Mutation charakterisiert durch
zum Beispiel eine Reduktion der systolischen Spitzendrücke, gestrecktes
oder dünnes
Myokard, einen Überschuss
an Herzgallerte („cardiac jelly"), der Abwesenheit
von A–V-Kissen
und einem obstruktiven ventrikulären
Ausflusstrakt. Diese Eigenschaften (zusätzlich zu anderen Eigenschaften
von Herzinsuffizienz) können
folglich unter Verwendung der erfindungsgemäßen Screeningverfahren überwacht
werden.
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Nachdem
von einer Verbindung gezeigt wurde, dass sie eine gewünschte Wirkung
in dem Zebrafischsystem besitzt, kann sie in anderen Modellen für Herzkrankheit,
zum Beispiel in Mäusen
oder anderen Tieren, mit einer Mutation in dem Titin-Gen getestet
werden.
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Alternativ
kann ein Testen in solchen Tiermodellsystem in Abwesenheit von Zebrafischtesten
durchgeführt
werden.
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Kandidatenverbindungen
können
gereinigte (oder im Wesentlichen gereinigte) Moleküle sein
oder können
ein Bestandteil einer Mischung von Verbindungen (z.B. einem Extrakt
oder Überstand,
erhalten von Zellen; Ausubel et al., supra) sein. In einem Test
mit einer Mischung von Verbindungen wird die Wirkung auf einen Phänotyp von
Herzinsuffizienz gegen stufenweise kleiner werdende Untersätze des
Pools an Kandidatenverbindungen getestet (z.B. hergestellt durch
Standardreinigungstechniken, z.B. HPLC oder FPLC), bis von einer
einzelnen Verbindung oder einer minimalen Mischung von Verbindungen
gezeigt wurde, dass sie die gewünschte
Wirkung besitzt.
-
Die
Testverbindungen, die mit den vorstehend beschriebenen Verfahren
gescreent werden können, können Chemikalien
sein, die natürlich
vorkommen oder künstlich
erlangt wurden. Solche Verbindungen können zum Beispiel Polypeptide,
synthetisierte organische Moleküle,
natürlich
vorkommende organische Moleküle,
Nukleinsäuremoleküle und Bestandteile
hiervon einschließen.
Die Kandidatenverbindung kann zum Beispiel in einem Zellextrakt,
Säugerserum
oder Wachstumsmedium, in welchem Säugerzellen kultiviert wurden, gefunden
werden.
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Im
Allgemeinen können
neue Wirkstoffe zur Vorbeugung vor oder Behandlung von Herzkrankheiten, die
mit mutiertem Titin in Verbindung stehen, aus großen Bibliotheken
von sowohl natürlichen
Produkten, synthetischen (oder semi-synthetischen) Extrakten als
auch chemischen Bibliotheken unter Verwendung von Verfahren, die
in der Technik gut bekannt sind, identifiziert werden. Die Fachleute
auf dem Gebiet der Wirkstoffentdeckung und -entwicklung werden verstehen,
dass die präzise
Quelle der Testextrakte oder Verbindungen für die erfindungsgemäßen Screeningverfahren
nicht kritisch ist. Folglich kann praktisch jede Anzahl chemischer
Extrakte oder Verbindungen unter Verwendung dieser Verfahren gescreent
werden. Beispiele solcher Extrakte oder Verbindungen schließen ein,
sind jedoch nicht darauf beschränkt,
Extrakte auf Grundlage von Pflanzen, Pilzen, Prokaryonten oder Tieren,
Fermentationsbrühen
und synthetische Verbindungen wie auch Modifikationen existierender
Verbindungen.
-
Eine
Vielzahl von Verfahren sind auch zum Erzeugen von zufälliger oder
gerichteter Synthese (z.B. Semi-Synthese oder Totalsynthese) einer
beliebigen Anzahl chemischer Verbindungen erhältlich, einschließlich, ohne
darauf beschränkt
zu sein, Verbindungen auf Grundlage von Sacchariden, Lipiden, Peptiden
und Aminosäuren.
Bibliotheken synthetischer Verbindungen sind kommerziell erhältlich von
Brandon Associates (Merrimack, NH) und Aldrich Chemical (Milwaukee,
WI). Alternativ sind Bibliotheken natürlicher Verbindungen in Form
von Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- und Tierextrakten aus einer Anzahl
von Quellen kommerziell erhältlich, einschließlich Biotics
(Sussex, UK), Xenova (Slough, UK), Harbor Branch Oceanographic Institute
(Ft. Pierce, FL) und PharmaMar, USA (Cambridge, MA). Zusätzlich können natürlich oder
synthetisch hergestellte Bibliotheken, falls gewünscht, nach in der Technik
bekannten Verfahren, z.B. durch Standardextraktion und -fraktionierung,
hergestellt werden. Darüber
hinaus kann jede beliebige Bibliothek oder Verbindung, falls gewünscht, leicht
unter Verwendung von chemischen, physikalischen oder biochemischen
Standardverfahren modifiziert werden.
-
Zusätzlich werden
die Fachleute auf dem Gebiet der Wirkstoffentdeckung und -entwicklung
leicht verstehen, dass Verfahren zur Dereplikation (z.B. taxonomische
Dereplikation, biologische Dereplikation und chemische Dereplikation
oder jede beliebige Kombination davon) oder die Eliminierung von
Replikaten oder Wiederholungen von Materialien, die für ihre therapeutischen
Aktivitäten
bei Herzinsuffizienz bereits bekannt sind, wenn immer möglich, eingesetzt
werden können.
-
Wenn
von einem Rohextrakt gefunden wird, dass er eine Wirkung auf die
Entwicklung oder Persistenz von Herzinsuffizienz hat, kann eine
weitere Fraktionierung des positiven Leitextrakts durchgeführt werden,
um chemische Bestandteile, die für
die beobachtete Wirkung verantwortlich sind, zu isolieren. So ist
das Ziel des Extraktions-, Fraktionierungs- und Reinigungsverfahrens
die sorgfältige
Charakterisierung und Identifizierung einer chemischen Funktionseinheit
innerhalb des Rohextrakts mit einer gewünschten Aktivität. Die gleichen Tests,
die hierin für
den Nachweis von Aktivitäten
in Mischungen von Verbindungen beschrieben sind, können verwendet
werden, um den aktiven Bestandteil zu reinigen und die Derivate
dieser Verbindungen zu testen. Verfahren der Fraktionierung und
Reinigung solcher heterogenen Extrakte sind in der Technik gut bekannt. Falls
gewünscht,
können
Verbindungen, von denen gezeigt wurde, dass sie für die Behandlung
verwendbare Mittel sind, nach in der Technik bekannten Verfahren
chemisch modifiziert werden.
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Behandlung von oder Vorbeugung
vor Herzinsuffizienz
-
Verbindungen,
die unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Screeningverfahren
identifiziert wurden, können
verwendet werden, um Patienten zu behandeln, die eine Herzkrankheit,
wie zum Beispiel Herzinsuffizienz, besitzen oder gefährdet sind,
eine solche zu entwickeln. Solche Behandlungen können nur für eine kurze Zeitdauer erforderlich
sein oder können
in gewisser Weise über
die Lebensdauer des Patienten erforderlich sein. Jedwelcher fortbestehender
Bedarf für
eine Behandlung kann allerdings unter Verwendung der vorstehend
beschriebenen diagnostischen Verfahren bestimmt werden. Bei der
Erwägung
verschiedener Therapie wird verstanden, dass solche Therapien vorzugsweise
auf das beeinträchtigte
oder potentiell beeinträchtigte
Organ, nämlich
das Herz, zielen.
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Die
Behandlung von oder Vorbeugung vor Krankheiten, die aus einem mutierten
Titin-Gen resultieren, kann zum Beispiel durch Modulieren der Funktion
eines mutierten Titin-Proteins, Überführen eines
normalen Titin-Proteins an geeignete Zellen, Verändern der Spiegel eines normalen
oder mutierten Titin-Proteins, Ersetzen eines mutierten Titin-Gens
durch ein normales Titin-Gen oder Verabreichen eines normalen Titin-Gens durchgeführt werden.
Es ist auch möglich,
einen Titin-Defekt durch Modifizieren des physiolgischen Wegs (z.B. eines
Signaltransduktionsweges), an welchem das Titin-Protein teilnimmt,
zu korrigieren.
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In
einem Patienten, der als heterozygot für eine Titin-Mutation oder
als empfänglich
für Titin-Mutationen
oder hinsichtlich der Titin-Expression als abweichend diagnostiziert
wurde (sogar wenn jene Mutationen oder Expressionsmuster noch nicht
in Veränderungen
der Titin-Expression oder biologischen Aktivität von Titin resultieren), kann
jede der vorstehend beschriebenen Therapien vor dem Auftreten eines
Krankheitsphänotyps verabreicht
werden. Insbesondere können
Verbindungen, von denen gezeigt wurde, dass sie die Titin-Expression
modulieren oder eine Wirkung auf den Phänotyp von Titin-Mutanten besitzen,
an Patienten, für
die eine potentielle oder akute Herzkrankheit diagnostiziert wurde,
durch jede beliebige Standarddosierung und jeden beliebigen Verabreichungsweg
verabreicht werden.
-
Jeder
geeignete Verabreichungsweg kann erfindungsgemäß eingesetzt werden, um eine
Verbindung zu verabreichen, von der gefunden wurde, dass sie bei
der Behandlung von oder Vorbeugung vor Herzkrankheit wirksam ist.
Zum Beispiel kann die Verabreichung parenteral, intravenös, intraarteriell,
subkutan, intramuskulär,
intraventrikulär,
intracapsulär,
intraspinal, intracisternal, intraperitoneal, intranasal, als Aerosol
oder oral sein. Allerdings ist eine lokale Verabreichung an das
betroffene Gewebe, das heißt
das Herz, wie vorstehend bemerkt, bevorzugt. Therapeutische Formulierungen
können
in Form von flüssigen
Lösungen
oder Suspensionen sein; für
orale Verabreichung können
die Formulierungen in Form von Tabletten oder Kapseln sein; und für intranasale
Formulierungen in Form von Pulvern, Nasentropfen oder Aerosolen.
-
Eine
erfindungsgemäße therapeutische
Verbindung kann innerhalb eines pharmazeutisch geeigneten Verdünnungsmittels,
Trägers
oder Hilfsstoffs in Einheitsdosierungsform verabreicht werden. Die
Verabreichung kann beginnen, vor oder nachdem der Patient Symptome
zeigt. Verfahren zur Herstellung von Formulierungen, die im Stand
der Technik gut bekannt sind, werden zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical
Sciences (18. Auflage), Hersg. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing
Company, Easton, PA gefunden. Formulierungen für die parenterale Verabreichung
können
zum Beispiel Hilfsstoffe; steriles Wasser; oder Salzlösung; Polyalkylenglycole
wie zum Beispiel Polyethylenglycol; Öle pflanzlichen Ursprungs;
oder hydrierte Naphtaline enthalten. Biokompatible, biologisch abbaubare
Lactidpolymere, Lactid-/Glycolid-Copolymere oder Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymere
können
verwendet werden, um die Freisetzung der Verbindungen zu kontrollieren.
Andere potentiell verwendbare parenterale Überführungssysteme für Verbindungen,
die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert
wurden, schließen
Ethylen-Vinylacetat-Copolymer-Partikel, osmotische Pumpen, implantierbare
Infusionssysteme und Liposomen ein. Formulierungen zur Inhalation
können
Hilfsstoffe, zum Beispiel Lactose, enthalten oder können wässrige Lösungen sein,
die zum Beispiel Polyoxyethylen-9-Laurylether, Glycocholat und Desoxycholat
enthalten oder können ölige Lösungen zur
Verabreichung in Form von Nasentropfen oder als Gel sein.
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Titin-Nukleinsäuremoleküle und -Polypeptide
können
auch beim Gewebe-Engineering, zum Beispiel bei der Herstellung von
künstlichen
oder teilweise künstlichen
Herzen, verwendet werden. Wie vorstehend erwähnt, spielt Titin bei der kardiovaskulären Elastizität, Integrität und Kontraktivität eine Rolle.
Folglich kann ein Titin-Nukleinsäuremolekül oder -Polypeptid,
wie vorstehend beschrieben, verwendet werden, um solche Eigenschaften
an ein künstliches
oder teilweise künstliches
Herz weiterzugeben.
-
Tiermodellsysteme
-
Die
Erfindung stellt Tiermodellsysteme zur Verwendung bei der Durchführung der
vorstehend beschriebenen Screeningverfahren bereit. Beispiele dieser
Modellsysteme schließen
Zebrafisch und andere Tiere, wie zum Beispiel Mäuse, ein, die Mutationen in
einem Titin-Gen haben. Zum Beispiel kann ein Zebrafischmodell, das
innerhalb der Erfindung verwendet werden kann, eine Mutation einschließen, die
in einem Mangel an Titin-Produktion oder der Produktion eines trunkierten
(z.B. durch Einführung
eines Stopp-Kodons) oder anderweitig veränderten Titin-Genprodukts resultiert.
Die Mutation kann zum Beispiel in der Gegenwart eines Stopp-Kodons
in einem herzspezifischen Exon, wie zum Beispiel dem N2B-Exon (z.B.
in der IS3-Region; siehe nachfolgend), resultieren. Die Mutation
kann in einer Region sein, die die I-Bande kodiert, was in der Produktion
eines Proteins resultiert, in welchem die I-Bande trunkiert ist
und die A-Bande und die M-Linie
abwesend sind, oder kann in einer Region sein, die für einen
anderen Teil des Moleküls
kodiert, zum Beispiel die A-Bande oder M-Linien-Region. Als ein
spezifisches Beispiel kann ein Zebrafisch mit der Pickwick-Mutation
verwendet werden.
-
Experimentelle Ergebnisse
-
Während des
Mutagenese-Screenings des Zebrafischgenoms in großem Maßstab wurde
eine Gruppe von Mutationen identifiziert, die die Herzkontraktilität beeinflussen.
Eine dieser Mutationen, Pickwick (pik) genannt, reduziert die Funktion
beider Kammern drastisch, was eine rezessive, letale Form von Herzinsuffizienz in
dem Zebrafischembryo verursacht.
-
Eine
direkte In-vivo-Aufnahme der ventrikulären Drücke durch ein Feedback-System
mit Nullabgleich zeigt, dass Pickwick eine 5,8fache Reduktion der
systolischen Spitzendrücke
im Vergleich zu altersabgestimmten Kontrollen bewirkt (0,084 +/– 0,008
vs. 0,49 +/– 0,06
mm Hg). Die morphologische Analyse von Pickwick ergab ein gestrecktes
und dünnes
Myokard, einen Überschuss
an Herzgallerte, eine Abwesenheit von A–V-Kissen und einen obstruktiven
ventrikulären
Ausflusstrakt. Umfangreiche ultrastrukturelle Defekte, die die Zusammensetzung
der Z-Scheiben und die Organisation der Myofilamente beeinflussen,
wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie gefunden. Reziproke
Blastomertransplantate identifizerten Pickwick als eine Mutation
der Myoblasten-Abstammungslinie, die zellautonom wirkt.
-
Ein
Ansatz mit Positionsklonierung wurde für die Genidentifikation angepasst.
Die Pickwick-Mutation wurde einem kleinen chromosomalen Intervall
zugeordnet, das von BAC-Klonen abgedeckt wurde. Das Titin-Gen überspannt
dieses Intervall und folglich beruht der Pickwick-Phänotyp auf
einer Mutation in dem Titin-Gen. Insbesondere wurde das Pickwick-Gen
in einer Verbindungsgruppe (LG; linkage group) 9 durch Bulk-Segregant-Analyse
unter Verwendung des pikm242-Allel kartiert, welches eine der fünf herzspezifischen Allele
(pikm242, pikm171, pikm740, pikm186, pikmnm2) ist. Ein Panel von
Z-Markern in der Linkergruppe wurde auf einfache Sequenzlängen-Polymorphismen
(SSLPs) unter Verwendung von 931 homozygoten mutierten Embryonen
getestet. Von den Markern Z8363 und Z26463 wurde gezeigt, dass sie
den Pickwick-Lokus flankieren, wodurch ein 1,2 cM Intervall enthaltend
das Gen definiert wird. Man glaubt, dass 1 cM 500 bis 600 kb DNA
in dem Zebrafischgenom entspricht (Postlethwait et al., Science
264: 699–703,
1994). Folglich initiierten wir ein chromosomales Walking von dem
Z8363 Marker, der 0,7 cM von der Mutation entfernt ist (12 Rekombinanten
aus 1750 Meiosen).
-
Ein
positiver YAC-Klon (YAC5) wurde identifiziert, der ein T7-Ende besaß, das zu
den human Titin-kodierenden Sequenzen hoch homolog ist. Da die genomische
Region von Titin beim Menschen auf über 300 kb geschätzt wurde,
entschieden wir uns, BAC-Klone auf Grundlage der Sequenzinformation
der Titin-EST-Klone des Zebrafisches zu identifizieren. Ein physikalisches
Contig, das das gesamte genomische Gebiet von Titin abdeckte, wurde
auf Grundlage dieser Sequenzen konstruiert. Einzelsträngige konformationelle
Polymorphismen (SSCPs) wurden von den Enden entwickelt und interne
Sequenzen dieser Klone wurden für
eine genaue rekombinatorische Kartierung verwendet. Ein SSCP-Marker
innerhalb des genomischen Gebiets von Titin (B9F2) wählt eine
Rekombinante aus der Z26463-Stelle aus. Vier SSCP-Marker innerhalb
des genomischen Gebiets von Titin (B4SP1, B2T7, B7SP und B6SP) wählten null
Rekombinanten aus 1750 Meiosen aus. Diese genetischen Daten zeigten,
dass der Pickwick-Lokus sehr nahe an oder innerhalb der genomischen
Region von Titin ist.
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Da
die Titin-cDNA alleine rund 82 kb umfasst, könnte sich das Retten des Phänotyps durch
RNA-Injektion als ziemlich schwierig erweisen. Allerdings fanden
wir durch Identifikation von Punktmutationen in einem der Pickwick-Allele
einen Beleg, dass der Pickwick-Lokus innerhalb des Titin-Gens liegt.
Da die meisten Allele von Pickwick einen herzspezifischen Phänotyp besitzen,
nahmen wir an, dass die Punktmutation in einem herzspezifischen
Exon lokalisiert ist. Wir fokussierten uns auf die N2B-Domäne in der
I-Bande von Titin, da alle Herzisoformen auf der N2B-Domäne begründet waren.
Die N2B-Domäne
aus Zebrafisch wurde mittels RT-PCR kloniert. Sie ist eine 4,3 kb
lange cDNA, die Infrastrukturen kodiert, die denen beim Menschen
und bei Mäusen ähnlich sind,
und die 4 IG-Repeats und drei einzigartige Sequenzen enthält, einschließlich längerem IS3
und kürzerem
IS1.
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Die
N2B-Domänen
aus mutierten Pickwick-Embryonen wurden dann kloniert. Eine RNA-Mismatch-Analyse
wurde durchgeführt,
um die Lokalisation der Punktmutation zu identifizieren. Ein Mismatch
zwischen den PCR-Produkten von pikm171 und pikm242 wurde identifiziert.
Ein Sequenzieren des PCR-Produkts resultierte in der Identifikation
eines T->G-Übergangs
in dem pikm171-Allel. Diese Mutation resultiert in einem Wechsel
von Leucin in dem IS3-Fragment der N2B-Domäne (N2B-IS3) zu einem Stopp-Codon.
Diese Mutation wurde in allen sieben homozygoten mutierten pikm171-Embryonen,
aber keiner der vier homozygoten pikm242-Embryonen bestätigt. Von
einer trunkierten Version von Titin wurde vorhergesagt, dass sie
in der pikm171-Mutante nur als eine herzspezifische Isoform vorhanden
ist. Sie sollte eine Z-Scheibe und einen Teil der I-Bande enthalten und
auf Grundlage eines Vergleichs mit der homologen humanen Titin-Sequenz, welche eine
Gesamtlänge
von 27.000 Aminosäuren
aufweist, in dem Größenbereich
von 4.000 Aminosäuren
liegen. Die Identifikation einer Nonsens-Mutation in der herzspezifischen
N2B-Domäne
in dem pikm171-Allel bestätigte
die Hypothese, dass Titin das Pickwick-Gen ist.
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Titin
wurde in dem Zebrafischembryo während
der Phase exprimiert, in der der Pickwick-Phänotyp
zuerst entdeckt wurde. Eine „whole
mount in situ"-Hybridisierungsanalyse
zeigte, dass Titin sowohl im Herzen als auch den Somiten bei 24
hpf stark exprimiert war. Die Titin-mRNA-Expression im Herzen in
pikm171 ist normal. Wir bestätigten
die Vorstellung, dass N2B ein herzspezifisches Exon im Zebrafisch
ist, indem eine Sonde in der IS3-Domäne für die „whole mount in situ"-Hybridisierung markiert
wurde.
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Die
Identifikation einer Punktmutation in der N2B-Domäne begründete somit
Pickwick als das erste In-vivo-Vertebratensystem zum Studium der
Funktion von Titin im Herzen. Wenn Titin, wie vorgeschlagen, als eine
Feder wirkt, wird erwartet, dass die Kontraktion sehr viel schwächer sein
wird. Das ist genau das, was bei mutierten Pickwick-Embryonen beobachtet
wurde. Wenn Titin als ein Template während der Sarcomer-Zusammensetzung
wirkt, würde
ein „stiller
Herz"-Phänotyp bei
der Titin-Nullmutation erwartet werden. Nach dem gegenwärtigen Modell
der Myofibrillogenese (Dabiri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
94: 9493–9498,
1997) könnten
sich das dicke Element und/oder das Sarcomer nicht zu einer schlagenden
Maschinerie zusammensetzen. Im Gegensatz dazu schlagen die Herzen
der homozygoten mutierten pikm171-Embryonen und all der anderen Pickwick-Allele
noch, wenn auch schwächer.
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Die
Mutation in pikm171 sagt ein trunkiertes Protein voraus, in welchem
das meiste der elastischen I-Bande deletiert ist und die C-terminalen
Regionen der A-Bande und der M-Linie
eliminiert sind. Sie könnte daher
als eine Nullmutation im Hinblick auf die Funktion als eine Feder
und eine potentiell dominante negative Mutation im Hinblick auf
ihre Funktion als ein Template für
die Sarcomerzusammensetzung betrachtet werden (Turnacioglu et al.,
Mol. Biol. Cell 8: 705–717,
1997). Die Beobachtung des schwachen Schlagens bei den mutierten
Pickwick-Embryonen lässt
die Existenz einer primären
kontraktilen Maschinerie ohne Titin vermuten. In der Tat können dicke
und dünne
Elemente in den ventrikulären
Myokardzellen nachgewiesen werden. Sie haben die Fähigkeit,
sich in Abwesenheit von Titin in eine funktionierende schlagende
Struktur zusammenzusetzen.
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Wir
haben daher eine detaillierte physiologische und morphologische
Analyse von Pickwick, einer Herzfunktionsmutation beim Zebrafisch,
durchgeführt,
die die Kontraktilität
beider Kammern reduziert. Einige Beweisstücke weisen darauf hin, dass
Titin das Pickwick-Gen ist. Die genetische Analyse verknüpfte den
Pickwick-Locus eng mit dem genomischen Gebiet von Titin. Die Identifikation
des pikmVO62H, einem Pickwick-Allel, das einen zusätzlichen
Somiten-Phänotyp
besitzt, kann mit dieser Titin-Hypothese
erklärt
werden. Von der Punktmutation wird erwartet, dass sie in den üblichen
Exons ist, die von den Herz- und somatischen Isoformen von Titin
geteilt werden. Ein Beleg, der diese Hypothese bestätigt, kam
von der Identifikation einer Punktmutation, in der herzspezifischen
N2B-Domäne
von Titin in einem der Pickwick-Allele, pikm171. Wir fuhren damit fort
zu zeigen, dass die Sarkomärstruktur
in den Myokardzellen von pikm171, aber nicht in somatischen Muskelzellen,
gestört
ist. Das Expressionsmuster von Titin ist mit diesem Phänotyp konsistent.
Eine starke Expression sowohl in Herz- als auch in Skelettmuskeln
wurde beim Einsetzen des Pickwick-Phänotyps nachgewiesen.
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Folglich
ist unsere Beobachtung im Zebrafisch konsistent mit der Vorstellung,
dass Titin als eine Feder während
der Muskelkontraktion wirkt. Da Titin ein Sarkomärstrukturprotein ist, ist es
vorstellbar, dass das Myokard zellautonom in mutierten Pickwick-Embryonen
beeinflusst wird. Die dünne
und gestreckte Morphologie könnte
auf der mechanischen Spannung beruhen, die von dem Fehlen der Bildung
einer übergeordneten
Sarkomärstruktur
und dem Verlust der Feder erzeugt wird. Die mechanische Spannung
könnte
auch der Grund für
die Trennung zwischen den Myokardzellen und den endokardialen Zellen
sein, was den Überschuss
an Herzgallerte erzeugt. Allerdings besteht die Möglichkeit,
dass das Differenzierungsprogamm des Myokards bei der Titin-Mutation
beeinflusst war. Der Phänotyp
der Klappenbildung bei mutierten Pickwick-Embryonen könnte ein
sekundärer
Defekt sein. Es wurde vorgeschlagen, dass der Prozess der Endothelinvasion
während
der Klappenbildung unter der Kontrolle eines lokalisierten Myokardsignals
steht (als Übersichtsartikel
siehe Fishman et al., Development 124: 2099–2117, 1997). Der körperliche
Abstand zwischen Myokard und Endokard und/oder das abgestumpfte
(„stalked") Differenzierungsprogramm
im Myokard könnte
der Grund sein, der eine normale Kissenbildung verhindert.
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Material und Methoden
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Zebrafischstämme und
-haltung
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Die
Zebrafische wurden wie beschrieben gehalten und bereitgestellt.
pikm242, pikm171, pikm740, pikm186 wurden in einem Screening auf
den AB-Background erzeugt (Stainier et al., Development 123: 285–292, 1996).
pikmVO62H und pikmnml2 wurden in einem Screen auf dem TL-Background
erzeugt. Stämme
zum Kartieren wurden durch Kreuzen von pikm242 in India-Stämme erzeugt.
pikm171-Embryonen, die für die
Expressionsanalyse verwendet wurden, und EM wurde durch paarweise
Paarung von pikm171/TL-Heterozygoten
erhalten.
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In situ-Hybridisierung
-
„Whole
mount in situ "-Hybridisierung
wurde, wie beschrieben, durchgeführt
(Thisse et al., Development 119: 1203–1215, 1993). Eine T5-Sonde
wurde durch Verdauung des EST-Klons
AI629069 (Research Genetics) erzeugt. Die N2B- und N2A-Sonden wurden
durch PCR mit einem markierten T7-Promotor erzeugt. Die Primerpaare
waren:
-
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Kartieren von Pickwick
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Eine
Verbindung wurde unter Verwendung von DNA aus 16 homozygoten Mutationen
und 16 Heterozygoten oder Wildtyp-Pick pikm242/India-Embryonen in
der „Bulk-Segregations"-Analyse (Michelmore
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9828–9832, 1991) etabliert. Z-Marker
(einfache Sequenzlängen-Polymorphismen,
SSLP) wurden in diesem Labor entwickelt (Knapik et al., Nat. Genet.
18: 338–343,
1998; Shimoda et al., Genomics 58: 219–232, 1999). Die Produkte der
Genotypisierung wurden in 6% PAGE-Gelen aufgelöst.
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Chromosomales Walkin
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YAC-
und BAC-Klone wurden mittels PCR als Pools für Klone (Research Genetics)
nach den Angaben des Herstellers gescreent. YAC-Enden wurden durch
Plasmidrettung (Zhong et al., Genomics 48: 136–138, 1998) kloniert. Chimäre Enden
wurden durch das RH-Panel (Geisler et al., Nat. Genet. 23: 86–89, 1999)
bestimmt. Die BAC-DNA wurde unter Verwendung des QIAgene-Kits extrahiert
und die Endsequenzen wurden durch direktes Sequenzieren bestimmt.
BLAST-X wurde zur Suche nach homologen Sequenzen in Genebank durchgeführt. EST-Klone
wurden mittels des „Washington
University zebrafish EST"-Projekts
erzeugt und von Research Genetics erhalten. Oligonukleotide, die
von den Endsequenzen der YAC- und BAC-Klone stammten, wurden in
Standard-PCR-Reaktionen verwendet, um das Klonüberlappen zu bestimmen. Das
Primerpaar B9F2 stammte von einem Fragment, das durch Verdauen von
BAC5 mit BamHI und dann Subklonieren in den pUC19-Vektor erzeugt
wurde. Dieser Klon kann mittels eines Primerpaars, das von dem T7-Ende
von BAC7 stammt, getroffen werden. Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus (SSCP)
wurde auf 6% MDE Acrylamid-(FMC Bioproducts)-Gelen bei 40°C getestet.
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Klonieren der Zebrafisch-N2B-Domäne
-
Langzeit-RT-PCR
wurde durchgeführt,
um die N2B-Domäne
aus mRNA-Extrakten des Herzens adulter Zebrafische zu amplifizieren.
Die mRNA wurde aus Pools von zehn adulten Herzen des Zebrafisches
unter Verwendung von TRIzole-Reagenz (GibcoIBRL), wie beschrieben,
extrahiert. Die cDNA wurde unter Verwendung von SuperScripTMII RNase
H-reverser Transkriptase (GibcoBRL) synthetisiert und dann mit RNase
H behandelt. Der Primer stammt von EST3: I19R1:
-
-
Die
lange PCR wurde unter Verwendung des Expand 20 kb Plus PCR Systems
(Roch), wie beschrieben, durchgeführt. Die Primerpaare sind:
-
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Das
4,6 kb große
Produkt wurde unter Verwendung des „TOPO TA Cloning Kit" (Invitrogen), wie
beschrieben, subkloniert. Die Sequenz wurde durch Primerwalking
bestimmt. 48 Auslesungen wurden durch Phred/Phrad-Software angelagert,
um ein großes
Contig zu erhalten, das nur einen Leserahmen mit ungefähr dreifacher
Abdeckung enthält.
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Um
die N2B-Region aus den homozygoten mutierten Zebrafischembryonen
zu amplifizieren, wurden drei überlappende
Primerpaare gemäß der adulten
N2B-Sequenz entwickelt. Die Kontamination aus der skelettmuskelspezifischen
Titin-Isoform wurde so eliminiert. Die mRNA wurde aus Pools von
zehn Zebrafischembyonen von Tag 2 unter Verwendung von TRIzole-Reagenz
(GibcoBRL), wie beschrieben, extrahiert. Die Sequenzierungsergebnisse
zeigten, dass das embryonale Herz-Titin in dem Gebiet eine IG-Domäne weniger
enthält.
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Identifikation der Punktmutation
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Die
N2B-Domänen
aus den homozygoten mutierten Embryonen wurden weiter durch Primerpaare amplifiziert,
die sechs überlappende
PCR-Produkte in einer Größe zwischen
0,6 kb und ungefähr
1 kb erzeugen. Die RNA-Mismatch-Analyse wurde unter Verwendung des "MutationScreenerTM" (Ambion) nach dem Protokoll
des Herstellers durchgeführt.
Ein Mismatch wurde zwischen pikm171 und pikm242 unter Verwendung
der folgenden Primerpaare identifiziert:
Die Sequenzierungsergebnisse
zeigen eine T->G-Nonsense-Mutation
in der cDNA der homozygoten pikm171-Embryonen.
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Die
genomische Sequenz in dieser Region wurde unter Verwendung des folgenden
Primerpaars amplifiziert:
und direkt
zum Sequenzieren nach der Reinigung unter Verwenden des „Geneclean
Spin Kits" (BIO101)
versandt.
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Elektronenmikroskopie
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48
Stunden alte Embryonen wurden über
Nacht bei 4°C
in 1,5% Glutaraldehyd, 1% Paraformaldehyd, 70 mM NaPO4,
pH 7,2, 3% Saccharose fixiert. Sie wurden dann dreimal fünf Minuten
lang jeweils in 0,1 M Cacodylat-Puffer, pH 7,4 gewaschen.
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Beansprucht
wird:
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