DE69535214T2

DE69535214T2 - Verfahren zur diagnose des glaukoms

Info

Publication number: DE69535214T2
Application number: DE69535214T
Authority: DE
Inventors: D. Thai Mill Valley NGUYEN; R. Jon Mill Valley POLANSKY; Weidong San Francisco HUANG
Original assignee: University of California; University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Current assignee: University of California; University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Priority date: 1994-11-03
Filing date: 1995-10-27
Publication date: 2007-08-02
Anticipated expiration: 2015-10-28
Also published as: EP0789762B1; CA2204375C; NO972024D0; US5861497A; DE69535214D1; MX9703194A; US6248867B1; AU2432897A; NO972024L; AU4279296A; NO323252B1; WO1998044107A1; US5606043A; JP4099829B2; ATE338818T1; JPH10509866A; AU705420B2; CA2204375A1; WO1996014411A1; NZ297601A

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liegt im Bereich der Diagnose und betrifft Verfahren und Reagenzien zum Diagnostizieren des Glaukoms und verwandter Erkrankung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
"Glaukomen" sind eine Gruppe von hinderlichen Augenkrankheiten, welche die Hauptursache von vermeidbarer Blindheit in den Vereinigten Staaten und anderen entwickelten Nationen darstellen. Das primäre Offenwinkelglaukom („POWG") ist die häufigste Form des Glaukoms. Die Krankheit ist durch die Degeneration des trabekulären Netzwerks gekennzeichnet, die zu einer Behinderung der normalen Fähigkeit der wässrigen Flüssigkeit führt, das Auge ohne Verschluss des Zwischenraums (z.B. des "Winkels") zwischen der Iris und der Hornhaut zu verlassen (siehe Vaughan, D. et al., In: General Ophthamology, Appleton & Lange, Norwalk, CT, S. 213–230 (1992)). Ein Kennzeichen einer derartigen Einschränkung bei dieser Krankheit ist ein erhöhter Augeninnendruck ("IOP"), der zu einem fortschreitendem Sehverlust und Blindheit führt, wenn er nicht angemessen und rechtzeitig behandelt wird.
Es wird geschätzt, dass die Krankheit zwischen 0,4% und 3,3% aller Erwachsenen über 40 Jahren betrifft (Leske, M.C., et al., Amer. J. Epidemiol. 113: 1843–1846 (1986); Bengtsson, B., Br. J. Ophthamol. 73: 483–487 (1989); Strong, N.P., Ophthal. Physiol. Opt. 12: 3–7 (1992)). Zudem steigt die Verbreitung dieser Krankheit mit dem Alter auf über 6% derer mit einem Alter von 75 und älter (Strong, N.P., Ophthal. Physiol. Opt. 12: 3–7 (1992)).
Es wurde lange vermutet, dass es eine Verbindung zwischen der IOP-Reaktion von Patienten gegenüber Glukokortikoiden und der POWG-Erkrankung gibt. Während nur 0,5% der normalen Population einen starken IOP-Anstieg (16 mm Hg) in Tests mit topischem Glukokortikoid zeigen, zeigen über 90% der Patienten mit POWG diese Reaktion. Zusätzlich kann ein Offenwinkelglaukom durch Exposition gegenüber Glukokortikoiden ausgelöst werden. Diese Beobachtung legte nahe, daß eine erhöhte oder anormale Glukokortikoidreaktion in trabekulären Zellen an dem POWG beteiligt sein könnte (Zhan, G.L., et al., Exper. Eye Res. 54: 211–218 (1992); Yun, A.J. et al., Invest. Ophthamol. Vis. Sci. 30: 2012–2022 (1989); Clark, A.F., Exper. Eye Res. 55: 265 (1992); Klemetti, A., Acta Opthamol. 68: 29–33 (1990); Knepper, P.A., US-Patent Nr. 4,617,299).
Die Eigenschaft von Glukokortikoiden, einen Glaukomähnlichen Zustand auszulösen, hat zu Bemühungen geführt, Gene oder Genprodukte zu identifizieren, die von Zellen des trabekulären Netzwerkes als Reaktion auf Glukokortikoide induziert werden (Polansky, J.R., et al., In: Glaucoma Update IV, Springer-Verlag, Berlin, S. 20–29 (1991)). Anfängliche Versuche mit einer Kurzzeitexponierung mit Dexamethason zeigte nur Veränderungen bei der spezifischen Proteinsynthese. Es wurde jedoch gefunden, dass eine verlängerte Exponierung mit verhältnismäßig hohen Gehalten an Dexamethason die Expression von verwandten Proteinen von 66 kDa und 55 kDa induziert, die mittels Ge-lelektrophorese sichtbar gemacht werden konnten (Polansky, J.R., et al., In: Glaucoma Update IV, Springer-Verlag, Berlin, S. 20–29 (1991)). Die Induktionskinetiken dieser Proteine wie auch ihre Dosis-Wirkungs-Eigenschaften waren den Kinetiken ähnlich, die für eine Steroid-induzierte Erhöhung des IOP in menschlichen Patienten benötigt werden (Polansky, J.R., et al., In: Glaucoma Update IV, Springer-Verlag, Berlin, S. 20–29 (1991)). Probleme mit Aggregationen und eine offensichtliche Instabilität oder ein Verlust von Protein in dem Aufreini gungsverfahren stellten Hindernisse beim Erlangen einer unmittelbaren Proteinsequenz dar.
Da ein erhöhter IOP eine einfach meßbare Eigenschaft des Glaukoms ist, wird zur Diagnose der Krankheit größtenteils der Augeninnendruck gemessen (Tonometrie) (Strong, N.P., Ophthal. Physiol. Opt. 12: 3–7 (1992), Greve, M. et al., Can. J. Ophthamol. 28: 201–2106 (1993)). Da sich unglücklicherweise glaukomatöse und normale Druckbereiche überlappen, sind solche Verfahren von eingeschränktem Wert, sofern nicht mehrfache Messungen durchgeführt werden (Hitchings, R.A., Br. J. Ophthamol. 77: 326 (1993); Tuck, M.W. et al., Ophtal. Physiol. Opt. 13: 227–232 (1993); Vaughan, D. et al., In: General Ophthamology, Appleton & Lange, Norwalk, CT, S. 213–230 (1992); Vernon, S.A., Eye 7: 134–137 (1993)). Aus diesem Grund werden zusätzliche Verfahren, wie beispielsweise eine direkte Untersuchung der Sehnervenpapille ("optic disk") und eine Bestimmung des Ausmaßes des Verlustes des Sehfeldes beim Patienten durchgeführt, um die Genauigkeit der Diagnose zu verbessern (Greve, M. et al., Can. J. Ophthamol. 28: 201–206 (1993)).
Angesichts der Bedeutung von Glaukomen und der zumindest teilweisen Unzulänglichkeiten von bisherigen Diagnoseverfahren wäre es wünschenswert, ein verbessertes, genaueres Verfahren zum Diagnostizieren des Glaukoms zu haben. Die vorliegende Erfindung stellt derartige verbesserte diagnostische Mittel und Verfahren zur Verfügung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die ein Fragment von 15 bis 250 Nukleotiden eines Polynukleotids mit der Sequenz der SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 umfassen, und Nukleinsäuremoleküle, welche deren Komplemente umfassen.
Die Erfindung betrifft weiterhin gereinigtes TIGR-Protein, das die Sequenz der SEQ ID NO: 1 aufweist, ebenso wie anti-TIGR-Antikörper oder antigenbindende Fragmente davon, oder Einzelkettenantigen-bindende Moleküle oder antigenbindende Fragmente davon, die in der Lage sind, spezifisch an ein gereinigtes TIGR-Protein zu binden, das die Sequenz der SEQ ID NO: 1 aufweist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Diagnostizieren des Glaukoms, Schritte umfassend, bei denen man:
ein Marker-Nukleinsäuremolekül, wobei das Marker-Nukleinsäuremolekül ein TIGR-Nukleinsäuremolekül wie oben definiert umfasst, und ein komplementäres Nukleinsäuremolekül, das von einer Zelle oder einer Körperflüssigkeit eines Patienten erhalten wurde, unter Bedingungen inkubiert, die eine Nukleinsäurehybridisierung ermöglichen, wobei die Nukleinsäurehybridisierung zwischen dem Markernukleinsäuremolekül und dem komplementären Nukleinsäuremolekül, das von dem Patienten erhalten wurde, den Nachweis eines Polymorphismus ermöglicht, dessen Gegenwart auf eine Mutation hinweist, welche die Sekretion eines TIGR-Proteins, wie es oben definiert ist, in dem Patienten beeinflusst;
die Hybridisierung zwischen dem für TIGR kodierenden Marker-Nukleinsäuremolekül und dem komplementären Nukleinsäuremolekül, das von dem Patienten erhalten wurde, ermöglicht, und
die Gegenwart des Polymorphismus nachweist, wobei der Nachweis des Polymorphismus für Glaukom diagnostisch ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUR
Die 1A–1D stellen die Aminosäuresequenz des TIGR-Proteins und die Sequenz der cDNA, die für das TIGR-Protein kodiert, zur Verfügung.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
I. Überblick über die Erfindung
Wie oben angegeben, wurde für das trabekuläre Netzwerk eine wichtige Rolle in dem normalen Fluß der wäßrigen Flüssigkeit vorgeschlagen, und es wurde angenommen, dass es der Hauptort der Ausflußresistenz in glaukomatösen Augen ist. Zellen des humanen trabekulären Netzwerkes (HTN) sind endothel-ähnliche Zellen, welche die Ausflusskanäle auskleiden, durch welche die wäßrige Flüssigkeit das Auge verläßt, wobei eine veränderte synthetische Funktion dieser Zellen an der Pathogenese der Steroidglaukomen und anderen Glaukomtypen beteiligt sein kann. Eine anhaltende Steroidbehandlung dieser Zellen ist interessant, da sie einen großen Unterschiede im Vergleich zu einer Exponierung mit Glukokortikoid (GC) von 1–2 Tagen zeigte, der für den klinischen Beginn des Steroidglaukoms (1–6 Wochen) relevant zu sein scheint.
Trotz jahrzehntelanger Forschung vor der vorliegenden Erfindung konnte die molekulare Grundlage des Glaukoms nicht ermittelt werden (Snyder, R.W., et al., Exper. Eye Res. 57: 461-468 (1993); Wiggs, J.L. et al., Genomics 21: 299–303 (1994)).
Obwohl gezeigt wurde, dass Zellen des trabekulären Netzwerkes als Reaktion auf Glukokortikoide spezifische Proteine induzieren (siehe Polansky, J.R., In: "Schriftenreihe der Akademie der Wissenschaften und der Literatur, Mainz," 307–318 (1993)), wurden Bemühungen, das exprimierte Protein aufzurei nigen, durch Unlöslichkeit und andere Probleme erschwert. Nguyen, T.D. et al., (In: "Schriftenreihe der Akademie der Wissenschaften und der Literatur, Mainz," 331–343 (1993) verwendeten einen molekularen Klonierungsansatz, um eine hochgradig induzierte mRNA-Art aus Glukokortikoid-induzierten humanen trabekulären Zellen zu isolieren. Die mRNA zeigte einen Zeitverlauf der Induktion, der denen von Glukokortikoid-induzierten Proteinen glich. Der Klon wurde als "II.2" bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung rührt teilweise von der Erkenntnis her, dass der isolierte II.2-Klon für ein neues sekretorisches Protein (als "Trabecular Meshwork Induced Glucocorticoid Response"-Protein oder "TIGR"-Protein bezeichnet) kodiert, das in Zellen des trabekulären Netzwerkes bei Exponierung mit Glukokortikoiden induziert wird. Es wurde vorgeschlagen, dass dieses Protein in die extrazellulären Räume des trabekulären Netzwerkes abgelagert werden könnte und an die Oberfläche der endothelialen Zellen bindet, die das trabekuläre Netzwerk auskleiden, und dadurch eine Abnahme des wäßrigen Flusses verursachen. Quantitative Dot-Blot-Analysen und PCR-Untersuchungen haben gezeigt, dass die TIGR-mRNA mit der Zeit eine schrittweise Induktion aufweist, während andere bekannte GC-Induktionen aus anderen Systemen und den in HTN-Zellen gefundenen (Metallothionin, alpha-1-Säureglykoprotein und alpha-1-Antichymothrypsin) nach 1 Tag oder früher einen Maximalgehalt erreichten. Von besonderem Interesse ist, dass das Induktionsniveau dieses Klons sehr hoch war (4–6% der zellulären Gesamt-mRNA) bei Kontrollgehalten, die ohne PCR-Verfahren nicht nachweisbar sind. Auf Grundlage von Untersuchungen mit ³⁵S-Methionin-Zellmarkierung weist der Klon die Eigenschaften auf, die kürzlich für das "Major GC-induced extracellular blycoprotein (glycoprotein)" in diesen Zellen nachgewiesen wurden, das ein "sialenated", N-glykosyliertes Molekül mit einem mutmaßlichen Inositolphosphatanker ist. Die Induktion der TIGR-RNA erreich te 4% der zellulären Gesamt-mRNA. Die mRNA nahm schrittweise während einer 10-tägigen Dexamethason-Behandlung zu.
Der II.2-Klon ist 2,0 kBp groß, während der Northern-Blot eine Bande von 2,5 kBp zeigt. Obwohl sie keinen poly A-Schwanz einschließt, enthält das 3'-Ende des Klons zwei Konsensus-Polyadenylierungssignale. Southern-Analyse legte zwei Gruppen von genomischen Sequenzen nahe, und zwei genomische Klone wurden isoliert. In situ-Hybridisierung unter Verwendung dieser genomischen Sonde zeigte die Genorte auf Chromosom 1, p36 und Chromosom 12, p13, p15. Untersuchungen von Cyclohexamidbehandlung in Abwesenheit und im Beisein von GC legen nahe, dass die Induktion des TIGR Faktoren zusätzlich zu dem GC-Rezeptor einbeziehen kann. Das TIGR-Gen könnte an der zellulären Streßantwort beteiligt sein, da es auch durch Stimulanzien, wie beispielsweise H₂O₂, TPA, Glukose und Hitze induziert wird, wobei diese Tatsache mit der Glaukom-Pathogenese und -behandlung in Zusammenhang stehen kann.
Die Aminosäuresequenz von TIGR, die cDNA-Sequenz, die für TIGR kodiert, und die 2,0 kBp-Nukleotidsequenz, welche diesen kodierenden Bereich enthält, sind in den 1A–1D gezeigt. Die Aminosäuresequenz des TIGR ist in den 1A–1D (und in SEQ ID NO: 1) gezeigt. Die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 ist die des TIGR-cDNA-Moleküls, das in den 1A–1D gezeigt ist. Der Teil der SEQ ID NO: 2, die in den Figuren 1A-1D als für das TIGR-Protein kodierend gezeigt wird, ist als SEQ ID NO: 3 dargestellt.
Die Primärstruktur des TIGR startet mit einer ATG-Initiierungsstelle (SEQ ID NO: 2, Rest 1) und schließt eine Konsensus-Signalsequenz von 20 Aminosäuren an einem zweiten ATG ein (SEQ ID NO: 2, Rest 15), was darauf hindeutet, dass das Protein ein sekretorisches Protein ist. Das Protein enthält eine N-verknüpfte Glykosylierungsstelle, die in dem hy drophilsten Bereich des Moleküls angeordnet ist. Der aminoterminale Bereich des Proteins ist hochgradig polarisiert und nimmt eine alpha-helikale Struktur an, wie durch sein Hydropathieprofil und die Garnier-Robison-Strukturanalyse gezeigt wird. Im Gegensatz dazu enthält das Protein einen hydrophoben Bereich von 25 Aminosäuren nahe seinem Carboxyterminus. Dieser Bereich kann eine GIP-verankernde Sequenz umfassen. Daher betrifft die Erfindung zwei TIGR-Proteine: TIGR und eine prozessierte Form des TIGR.
Das TIGR-Protein enthält außerdem 5 mutmaßliche O-verknüpfte Glykosylierungsstellen über das Molekül verteilt. "Leucin-Zipper"-Bereiche definieren eine helikale Struktur, die das Eintreten einer Protein-Protein-Bindung erlauben (siehe im Allgemeinen Tso, J.Y. et al., PCT-Patentanmeldung WO 93/11162; Land, K.H. et al., PCT-Patentanmeldung WO 93/19176). Das TIGR-Protein enthält 7 Leucin-Zipper-Einheiten. Die Gegenwart der Zipper-Bereiche stellt den TIGR-Molekülen ein Hilfsmittel zur Verfügung, um einander unter Bildung von Makromolekülen zu binden sowie für eine mögliche Aggregation. Studien, welche die spezifische Bindung dieses Moleküls an HTN-Zellen (aber nicht an Fibroblastenzellen) zeigen, unterstützen die Ansicht, dass es den Ausflußweg in HTN-Gewebe beeinflussen kann, wodurch der erhöhte Augeninnendruck erzeugt wird, der ein Glaukom und seine verwandten Krankheiten kennzeichnet. Das TIGR-Protein wurde weiterhin unter Verwendung des Baculovirus-Systems und Sf9-Insektenzellen erfolgreich exprimiert. Die rekombinanten Hauptproteine sind die zwei zellulären Proteine von 55 kD, die durch die TIGR-cDNA kodiert werden. Durch diese Proteine gebildete Antikörper erkennen sowohl die zellulären Proteine von 55 kD, als auch die sekretierte, glykosylierte Form dieser Proteine von 66 kD in Dexamethason-behandelten HTN-Zellen und in Organkultursystemen. In situ-Analysen von glaukomatösen Gewebsproben zeigen ein hohes Expressionsniveau dieses Proteins im Verhältnis zu normalen Kontrollen.
Die Anwesenheit, Induzierung und der Gehalt des sekretorischen TIGR-Proteins spiegeln den Ausbruch und die Kinetiken wieder, mit denen Glukokortikoide Glaukom induzieren, und die Glukokortikoid-induzierte Expression dieses sekretorischen Proteins beinhaltet die molekulare Basis des Glaukoms und dessen verwandte Krankheiten. Ein derartiges Verstehen der molekularen Basis erlaubt die Definierung von diagnostischen Wirkstoffen für Glaukom und dessen verwandte Krankheiten.
II. Die bevorzugten Wirkstoffe der Erfindung
Der Begriff "Glaukom", wie hier verwendet, hat seine im Fachgebiet anerkannte Bedeutung und schließt sowohl primäre Glaukomen, sekundäre Glaukomen als auch familiäre (d.h. vererbte) Glaukomen ein. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind für die Diagnose von POWG, OWG, juvenilem Glaukom und vererbten Glaukomen besonders relevant. Eine Krankheit oder eine Erkrankung wird als mit Glaukom in Beziehung stehend bezeichnet, wenn sie ein Symptom des Glaukoms aufweist oder zeigt, z.B. einen erhöhten Augeninnendruck, der von einer wäßrigen Ausflußresistenz herrührt (siehe Vaughan, D. et al., In: General Ophthamology, Appleton & Lange, Norwalk, CT, S. 213–230 (1992)). Die bevorzugten erfindungsgemäßen Wirkstoffe werden unten eingehend diskutiert.
Die Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, für die Diagnose des Vorliegens oder der Schwere eines Glaukoms und seiner verwandten Krankheiten in einem Patienten verwendet zu werden, der unter einem Glaukom leidet (einem "glaukomatösen Patienten"). Derartige Wirkstoffe können entweder natürlich vorkommen oder nicht auf natürliche Weise vorkommen. Wie hierin verwendet, kann ein natürlich vorkommendes Molekül, sofern gewünscht, "im Wesentlichen aufgereinigt" sein, so daß ein oder mehrere Moleküle, das/die in einer natürlich vorkommenden, das Molekül enthaltenden Zubereitung vorliegt/vorliegen oder vorliegen könnte(n) entfernt werden oder in einer geringeren Konzentration vorliegen werden als der, in der es normalerweise vorliegen würde.
Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Wirkstoffe entweder hinsichtlich einer strukturellen Eigenschaft, wie beispielsweise der Fähigkeit einer Nukleinsäure, an ein weiteres Nukleinsäuremoleküle zu hybridisieren, oder der Fähigkeit eines Proteins, durch einen Antikörper gebunden zu werden (oder mit einem anderen Molekül um eine solche Bindung zu konkurrieren), "biologisch aktiv" sein. Alternativ kann eine solche Eigenschaft katalytisch sein und daher die Fähigkeit des Wirkstoffs beinhalten, eine chemische Umsetzung oder Reaktion zu vermitteln.
Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe umfassen Nukleinsäuremoleküle, Proteine und organische Moleküle.
A. Nukleinsäuremoleküle
Eine bevorzugte Klasse von erfindungsgemäßen Wirkstoffen umfaßt TIGR-Nukleinsäuremoleküle ("TIGR-Moleküle"). Derartige Moleküle können entweder DNA oder RNA sein.
In einer Ausführungsform werden solche Nukleinsäuremoleküle für das gesamte oder für ein Fragment des TIGR-Proteins, seinen „Promotor" oder flankierende Gensequenzen kodieren. Der Begriff "Promotor", wie hier verwendet, wird in einem weitreichenden Sinn verwendet, um sich auf die regulatorische(n) Sequenz (en) zu beziehen, welche die mRNA-Produktion kontrollieren. Derartige Sequenzen beinhalten RNA-Polymerasebindungsstellen, Glukokortikoid-Response-Elemente, Verstärker, etc.
Alle derartigen TIGR-Moleküle können verwendet werden, um das Vorkommen von Glaukom und die Schwere des Glaukoms zu diagnostizieren.
TIGR-Nukleinsäuremolekülfragmente können für einen wesentlichen Teil/wesentliche Teile des oder tatsächlich den Großteil des TIGR-Proteins kodieren. Alternativ können die Fragmente kleinere Oligonukleotide (mit von ungefähr 15 bis ungefähr 250 Nukleotidresten und bevorzugter ungefähr 15 bis ungefähr 30 Nukleotidresten) umfassen. Derartige Oligonukleotide können als Sonden für TIGR-mRNA verwendet werden. Für eine derartigen Zweck müssen die Oligonukleotide in der Lage sein, spezifisch an ein TIGR-Nukleinsäuremoleküle zu hybridisieren. Wie hier verwendet, werden zwei Nukleinsäuremoleküle als zur spezifischen Hybridisierung untereinander imstande bezeichnet, wenn diese zwei Moleküle in der Lage sind, anti-parallele, doppelsträngige Nukleinsäurestrukturen zu bilden, wobei sie nicht in der Lage sind, eine doppelsträngige Struktur zu bilden, wenn sie mit einem nicht-TIGR-Nukleinsäuremolekül inkubiert werden. Ein Nukleinsäuremolekül wird als das "Komplement" eines anderen Nukleinsäuremoleküls bezeichnet, wenn beide vollständige Komplementarität aufweisen. Wie hier verwendet, werden Moleküle als "vollständige Komplementarität" aufweisend bezeichnet, wenn jedes Nukleotid des einen Moleküls komplementär zu einem Nukleotid des anderen ist. Zwei Moleküle werden als "minimal komplementär" bezeichnet, wenn sie miteinander mit ausreichender Stabilität hybridisieren können, um es ihnen zu ermöglichen, unter den am wenigsten gewöhnlichen Bedingungen "niedriger Stringenz" aneinander angelagert zu verbleiben. Gleichermaßen werden die Moleküle als "komplementär" bezeichnet, wenn sie miteinander mit ausreichender Stabilität hybridisieren können, um unter herkömmlichen Bedingungen "hoher Stringenz" aneinander angelagert zu verbleiben. Herkömmliche Stringenz-Bedingungen werden von Sambrook, J., et al., (In: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, (1989)) und von Haymes, B.D., et al. (In: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)) beschrieben. Abweichungen von der vollständigen Komplementarität sind daher zulässig, solange derartige Abweichungen die Fähigkeit der Moleküle nicht vollständig ausschließen, eine doppelsträngige Struktur zu bilden. Daher muss ein Oligonukleotid, um als Primer zu dienen, in der Sequenz nur ausreichend komplementär sein, um in der Lage zu sein, unter den jeweiligen eingesetzten Lösungs- und Salzkonzentrationen eine stabile, doppelsträngige Struktur zu bilden.
Abgesehen von ihren diagnostischen Verwendungen können derartige Oligonukleotide verwendet werden, um andere TIGR-Nukleinsäuremoleküle zu erhalten. Derartige Moleküle schließen die für die TIGR-kodierenden Nukleinsäuremoleküle von nichtmenschlichen Tieren (insbesondere Katzen, Affen, Nagetieren und Hunden), deren Fragmente ebenso wie deren Promotoren und flankierenden Sequenzen ein. Derartige Moleküle können durch Verwendung der oben beschriebenen Primer zum Durchmustern von cDNA-Bibliotheken oder genomischen Bibliotheken, die von nicht-menschlichen Arten erhalten wurden, einfach erhalten werden. Verfahren zum Erstellen derartiger Bibliotheken sind im Fachgebiet gut bekannt. Derartige Analoga können in ihren Nukleotidsequenzen von denen der SEQ ID NO: 1 abweichen, da eine vollständige Komplementarität für eine stabile Hybridisierung nicht benötigt wird. Die erfindungsgemäßen TIGR-Nukleinsäuremoleküle schließen daher Moleküle ein, denen, obwohl sie in der Lage sind, mit TIGR-Nukleinsäuremolekülen zu hybridisieren, "vollständige Komplementarität" fehlen kann.
Ein jedes aus einer Vielzahl von Verfahren kann verwendet werden, um die oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle zu erhalten. Die SEQ ID NO: 2 kann verwendet werden, um das vollständige oder einen Teil des TIGR-Proteins oder der TIGR-cDNA zu synthetisieren (Zamechik et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 83: 4143 (1986); Goodchild et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 5507 (1988); Wickstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 1028; Holt, J.T. et al., Molec. Cell. Biol. 8: 963 (1988); Gerwirtz, A.M. et al., Science 242: 1303 (1988); Anfossi, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 3379 (1989); Becker, D., et al., EMBO J. 8: 3679 (1989)). Für diesen Zweck können automatisierte Nukleinsäuresynthetisierer eingesetzt werden. Anstelle einer derartigen Synthese kann die offenbarte SEQ ID NO: 2 verwendet werden, um ein Paar Primer zu definieren, das mit der Polymerasekettenreaktion verwendet werden kann (Mullis, K. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263–273 (1986); Erlich H. et al., EP 050 424 ; EP 084 796 , EP 258 017 , EP 237 362 ; Mullis, K., EP 201 184 ; Mullis K. et al., US 4,683,202 ; Erlich, H., US 4,582,788 ; und Saiki, R. et al., US 4,683,194 )), um jedes gewünschte, für TIGR-kodierende DNA-Molekül oder -Fragment zu amplifizieren und zu erhalten.
Die TIGR-Promotorsequenz(en) und TIGR-flankierenden Sequenzen können auch unter Verwendung der hier bereitgestellten SEQ ID NO: 2-Sequenz erhalten werden. In einer Ausführungsform werden solche Sequenzen durch Inkubieren von Oligonukleotidsonden von TIGR-Oligonukleotiden mit Elementen aus humanen genomischen Bibliotheken und Gewinnen von Klonen, die an diese Sonden hybridisieren, erhalten. In einer zweiten Ausführungsform können Verfahren des "Chromosome Walking", oder 3'- oder 5'-RACE verwendet werden (Frohman, M.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 8998–9002 (1988); Ohara, O. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 5673–5677 (1989)), um derartige Sequenzen zu erhalten.
B. TIGR-Protein- und -Peptidmoleküle
Eine zweite bevorzugte Klasse von Wirkstoffen ("TIGR-Moleküle") umfasst das TIGR-Protein, seine Peptidfragmente, Fusionsproteine und Analoga. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "TIGR-Protein" auf ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist. Das TIGR-Protein kann mittels chemischer Synthese oder, bevorzugter, durch Exprimieren von für TIGR-kodierende cDNA in einem geeigneten bakteriellen oder eukaryotischen Wirt gebildet werden. Am bevorzugtesten kann die Untersequenz einer derartigen cDNA, die für TIGR kodiert, für diesen Zweck verwendet werden (SEQ ID NO: 3). Alternativ kann die gesamte, in den 1A-1D gezeigte cDNA (SEQ ID NO: 2) eingesetzt werden. Geeignete Verfahren für die Expression werden von Sambrook, J., et al., (In: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, (1989)) oder in ähnlichen Texten beschrieben.
Ein "TIGR-Fragment" ist ein Peptid oder Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz eine Untergruppe der Aminosäuresequenz des TIGR-Proteins umfasst. Ein TIGR-Protein oder Fragment davon, das eine oder mehrere zusätzliche nicht-TIGR-Peptidbereiche umfasst, ist ein "TIGR-Fusionsprotein". Derartige Moleküle können derivatisiert werden, um Kohlenhydrat oder andere Seitenketten (wie beispielsweise das Hämocyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke, etc.) zu enthalten. Wie in dem Fall des TIGR-Proteins werden die erfindungsgemäßen Fragmente und Fusionen bevorzugt über rekombinante Mittel erzeugt.
Die Analoga der TIGR-Moleküle umfassen TIGR-Proteine, Fragmente oder Fusionen, in denen nicht-essentielle oder nichtrelevante Aminosäurereste zugefügt, ersetzt oder entfernt wurden. Ein Beispiel eines derartigen Analogons ist das TIGR-Protein von nicht-menschlichen Arten, wie beispielsweise Pri maten, Hunden, Katzen, etc. Derartige Analoga können leicht mit Hilfe eines aus einer Vielzahl von Verfahren erhalten werden. Am bevorzugtesten wird, wie oben angegeben, die offenbarte SEQ ID NO: 2 verwendet werden, um ein Paar Primer zu definieren, die verwendet werden können, um die für TIGR kodierenden Nukleinsäuremoleküle aus jeder gewünschten Art zu isolieren. Derartige Moleküle können durch rekombinante Mittel exprimiert werden, um TIGR-Analoga hervorzubringen.
C. Antikörper, die gegen TIGR reaktiv sind
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Antikörper, Einzelkettenantigen-bindende Moleküle oder andere Proteine, die spezifisch an TIGR-Protein oder seine Analoga, Fusionen oder Fragmente binden. Derartige Antikörper sind "anti-TIGR-Antikörper" und können verwendet werden, um Glaukom und seine verwandten Krankheiten zu diagnostizieren. Wie hier verwendet, wird ein Antikörper oder Peptid als "spezifisch" an TIGR „bindend" beschrieben, wenn derartiges Binden durch die Anwesenheit von Nicht-TIGR-Molekülen nicht kompetitiv inhibiert wird.
Nukleinsäuremoleküle, die für das gesamte oder einen Teil des TIGR-Proteins kodieren, können über rekombinante Mittel exprimiert werden, um TIGR-Protein oder -Peptide hervorzubringen, die wiederum verwendet werden können, um Antikörper hervorzubringen, die in der Lage sind, TIGR zu binden. Derartige Antikörper können in immundiagnostischen Assays für Glaukom verwendet werden. Derartige, für TIGR-kodierende Moleküle oder ihre Fragmente können ein "Fusionsmolekül" sein (d.h. ein Teil eines größeren Nukleinsäuremoleküls), so dass bei Expression ein Fusionsprotein gebildet wird.
Die Antikörper, die TIGR-Proteine und -Proteinfragmente spezifisch binden, können polyklonal oder monoklonal sein, und können intakte Immunglobuline, oder antigenbindende Teile von Immunglobulinen (wie beispielsweise (F(ab')-, F(ab')₂-Fragmente) oder Einzelketten-Immunglobuline umfassen, die beispielsweise mittels rekombinanter Mittel herstellbar sind.
Monoklonale Antikörper aus der Maus sind besonders bevorzugt. BALB/c-Mäuse sind für diesen Zweck bevorzugt, jedoch können ebenso vergleichbare Stämme verwendet werden. Die Tiere werden bevorzugt mit ungefähr 25 μg des gereinigten TIGR-Proteins (oder eines Fragmentes davon) immunisiert, das mit einem geeigneten Hilfsmittel (wie beispielsweise TiterMax-Adjuvans (Vaxcel, Norcross, GA)) emulgiert wurde. Die Immunisierung wird bevorzugt an zwei intramuskulären Stellen, einer intraperitonealen Stelle und einer subkutanen Stelle an der Basis des Schwanzes durchgeführt. Eine zusätzliche intravenöse Injektion von ungefähr 25 μg des Antigens wird bevorzugt drei Wochen später in normaler Salzlösung verabreicht. Nach ungefähr 11 Tagen nach der zweiten Injektion kann die Maus ausgeblutet und das Blut auf die Anwesenheit von anti-TIGR-Antikörpern durchmustert werden. Ein direkter Bindungs-ELISA wird für diesen Zweck bevorzugt eingesetzt.
Am bevorzugtesten wird der Maus mit dem höchsten Antikörpertiter eine dritte intravenöse Injektion von ungefähr 25 μg des TIGR-Proteins oder -Fragments verabreicht. Die Leukozyten dieses Tiers aus der Milz können 3 Tage später entnommen werden, und ihnen wird ermöglicht, am bevorzugtesten unter Verwendung von Polyethylenglykol mit Zellen einer geeigneten Myelomzellinie (wie beispielsweise der P3X63Ag8.653-Myelomzelllinie) zu fusionieren. Hybridomzellen werden durch Kultivieren der Zellen unter "HAT" (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymin)-Selektionsbedingungen für ungefähr eine Woche selektiert. Die entstehenden Klone können dann, bevorzugt durch direkten ELISA, auf ihre Fähigkeit hin durchmustert werden, monoklonale Antikörper ("mAbs") gegen TIGR-Protein zu bilden.
In einer Ausführungsform werden monoklonale anti-TIGR-Antikörper unter Verwendung von TIGR-Fusionen oder -Konjugaten als Immunogene isoliert. So kann z.B. eine Gruppe von Mäusen unter Verwendung eines TIGR-Fusionsproteins, das in Freund's vollständigen Adjuvans emulgiert ist, immunisiert werden (ungefähr 50 μg des Antigens pro Immunisierung). In Dreiwochenintervallen wird eine identische Menge Antigen in Freund's unvollständigem Adjuvans emulgiert und verwendet, um die Tiere zu immunisieren. Zehn Tage nach der dritten Immunisierung werden Serumproben entnommen und auf die Anwesenheit von Antikörper getestet. Wenn die Antikörpertiter zu niedrig sind, kann ein vierte Verstärkung („Booster") eingesetzt werden. Polyseren, die in der Lage sind, TIGR in einer Verdünnung von 1:5000 zu binden, können ebenfalls durch Anwendung dieses Verfahrens erhalten werden.
In einem bevorzugten Verfahren zum Erhalten monoklonaler Antikörper werden die Milzen der oben beschriebenen, immunisierten Mäuse entfernt, aufgebrochen und Immunsplenozyten über einen Ficoll-Gradienten isoliert. Die isolierten Splenozyten werden unter Verwendung von Polyethylenglykol mit aus BALB/c-abgeleiteten HGPRT (Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase)-defizienten P3x63xAg8.653-Plasmazytomzellen fusioniert. Die fusionierten Zellen werden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen ausplattiert und nach Hydridomfusionszellen anhand ihrer Fähigkeit durchmustert, in Kulturmedium für ungefähr 2–3 Wochen zu wachsen, das mit Hypothanthin, Aminopterin und Thymidin ergänzt wurde. Im Mittel entsteht aus jeweils 10⁶-Milzzellen, die einer Fusion unterzogen wurden, ein lebensfähiges Hybridom. Eine typische Milz ergibt 5–10 × 10⁷-Milzzellen.
Hybridomzellen, die aus einer derartigen Inkubation entstehen, werden bevorzugt auf ihre Fähigkeit hin durchmustert, ein Immunglobulin zu bilden, das an das TIGR-Protein bindet. Ein indirekter ELISA kann für diesen Zweck verwendet werden. In Kurzform dargestellt, werden die Überstände von Hybridomen in Mikrotitervertiefungen, die immobilisiertes TIGR-Protein enthalten, inkubiert. Nach dem Waschen kann durch Verwenden von beispielsweise einem Ziegen-anti-Maus-Antikörper, der an Meerrettich-Peroxidase konjugiert ist, der Titer von gebundenem Immunglobulin bestimmt werden. Nach zusätzlichem Waschen wird die Menge des immobilisierten Enzyms bestimmt (z.B. durch die Verwendung eines chromogenen Substrats). Ein solches Durchmustern wird nach der Identifizierung des Hybridoms so schnell wie möglich durchgeführt, um sicherzustellen, dass der gewünschte Klon nicht von nicht-sekretierenden Nachbarn überwachsen wird. Die Fusionsplatten werden wünschenswerterweise mehrere Male durchmustert, da die Wachstumsraten der Hybridomen variieren kann. In einer bevorzugten Unterausführungsform kann eine andere antigene Form des TIGR verwendet werden, um die Hybridomen zu durchmustern. Demnach können die Splenozyten z.B. mit einem TIGR-Immunogen immunisiert werden, die sich bildenden Hybridomen jedoch unter Verwendung eines anderen TIGR-Immunogens durchmustert werden.
Wie unten diskutiert, können derartige Antikörpermoleküle oder ihre Fragmente für diagnostische Zwecke verwendet werden. Wo die Antikörper für diagnostische Zwecke eingesetzt werden sollen, kann es wünschenswert sein, sie zu derivatisieren, zum Beispiel mit einer Ligandengruppe (wie beispielsweise Biotin) oder einer nachweisbaren Markergruppe (wie beispielsweise einer fluoreszierenden Gruppe, einem Radioisotop oder einem Enzym).
Die Fähigkeit, Antikörper zu bilden, welche die TIGR-Moleküle binden, erlaubt die Identifizierung von nachahmenden ("mimetic") Verbindungen des TIGR. Eine nachahmende Verbindung des TIGR ist eine Verbindung, die kein TIGR oder kein Fragment des TIGR ist, die aber nichtsdestotrotz eine Fähigkeit zeigt, spezifisch an anti-TIGR-Antikörper zu binden. Derartige Moleküle können verwendet werden, um anti-TIGR-Antikörper zu erzeugen und können folglich verwendet werden, um die Diagnose von Glaukom und seinen verwandten Krankheiten zu unterstützen.
III. Verwendungen der erfindungsgemäßen Moleküle in der Diagnose von Glaukom und verwandten Krankheiten
Eine besonders gewünschte Verwendung der vorliegenden Erfindung betrifft die Diagnose von Glaukom, POWG, pigmentärem Glaukom, Hochdruckglaukom und Niedrigdruckglaukom und ihrer verwandten Krankheiten. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Glaukom" auf Glaukom, POWG, pigmentäres Glaukom und Niederdruckglaukom und ihre verwandten Krankheiten. Wie oben angegeben, leiden Verfahren zum Diagnostizieren von Glaukom unter Ungenauigkeit oder sie erfordern mehrfache Untersuchungen. Die erfindungsgemäßen Moleküle können verwendet werden, um bessere Tests für Glaukom zu definieren. Abgesehen von einer derartigen Verwendung, können die erfindungsgemäßen Moleküle verwendet werden, um die Empfindlichkeit eines Individuums gegenüber erhöhtem Augeninnendruck bei Verabreichung von Steroiden (wie beispielsweise Glukokortikoiden oder Kortikosteroiden) zu diagnostizieren oder vorherzusagen. Dexamethason, Kortisol und Prednisolon sind für diesen Zweck bevorzugte Steroide. Medizinische Zustände, wie beispielsweise entzündliche oder allergische Störungen, ebenso wie Organtransplantationsempfänger profitieren von einer Behandlung mit Glukokortikoiden. Bestimmte Individuen zeigen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber solchen Steroiden (d.h. "Steroidempfindlichkeit"), die sich durch einen unerwünschten Anstieg des Augeninnendruckes manifestiert. Die vorliegende Erfindung kann eingesetzt werden, um eine derartige Empfindlichkeit ebenso wie Glaukom und verwandte Krankheiten zu diagnostizieren oder vorherzusagen.
In einer ersten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen TIGR-Moleküle verwendet, um zu bestimmen, ob ein Individuum eine Mutation aufweist, die den Grad (d.h. die Konzentration von TIGR-mRNA oder -Protein in einer Probe, etc.) oder das Muster (d.h. die Kinetiken der Expression, die Rate des Abbaus, das Stabilitätsprofil, etc.) der TIGR-Expression (zusammenfassend die "TIGR-Reaktion" einer Zelle oder Körperflüssigkeit) (zum Beispiel eine Mutation in dem TIGR-Gen oder in (einem) regulatorischen Bereich(en) oder in (einem) anderen Gen(en), welche(s) die Expression von TIGR kontrollieren oder beeinflussen) beeinflussen und für Individuen voraussagend sind, die für Glaukom, verwandte Krankheiten oder Steroidempfindlichkeit prädisponiert sind. Wie hier verwendet, wird die TIGR-Reaktion, die sich in einer Zelle oder Körperflüssigkeit manifestiert, als "verändert" bezeichnet, wenn sie von der TIGR-Reaktion von Zellen oder Körperflüssigkeiten von normalen Individuen abweicht. Eine derartige Abweichung kann sich entweder durch eine abnorm erhöhte oder abnorm verminderte TIGR-Reaktion manifestieren. Um zu bestimmen, ob eine TIGR-Reaktion verändert ist, wird die durch die Zelle oder Körperflüssigkeit des Patienten manifestierte TIGR-Reaktion mit der einer ähnlichen Zellprobe (oder Körperflüssigkeitsprobe) von normalen Individuen verglichen. Wie anzuerkennen ist, ist es nicht notwendig, die TIGR-Reaktion der Zellprobe (oder Körperflüssigkeitsprobe) von normalen Individuen jedes Mal, wenn ein solcher Vergleich durchgeführt wird, erneut zu bestimmen, stattdessen kann die TIGR-Reaktion eines bestimmten Individuums mit vorher erhaltenen Werten von anderen Individuen verglichen werden.
In einer untergeordneten Ausführungsform wird eine derartige Analyse durch Bestimmen des Vorkommens und/oder der Identität eines Polymorphismus/von Polymorphismen in dem TIGR-Gen oder seinen flankierenden Bereichen, die mit Glaukom oder ei ner Prädisposition für Glaukom, verwandte Krankheiten oder Steroidempfindlichkeit assoziiert sind, durchgeführt.
Jedes aus einer Vielzahl von Molekülen kann verwendet werden, um (einen) derartige(n) Polymorphismus/Polymorphismen zu identifizieren. In einer Ausführungsform kann eine TIGR-cDNA-Sequenz (oder eine ihrer Untersequenzen) als ein Marker-Nukleinsäuremolekül eingesetzt werden, um solch(e) (einen) Polymorphismus/Polymorphismen zu identifizieren. Alternativ können solche Polymorphismen durch die Verwendung eines Marker-Nukleinsäuremoleküls oder eines Markerproteins nachgewiesen werden, das genetisch mit (einem) derartigen Polymorphismus/Polymorphismen genetisch verknüpft ist (d.h. ein Polynukleotid, das mit solchen Polymorphismen co-segregiert). Wie oben angegeben, wurde das TIGR-Gen auf p36 des Chromosoms 1 und auf p13, q15 der Chromosomen 10, 11 oder 12 kartiert. Marker-Nukleinsäuremoleküle werden hier beschrieben, welche die Nukleotidsequenz eines Polynukleotids aufweisen, das mit (einem) solchen Polymorphismus/Polymorphismen genetisch eng verknüpft ist (z.B. Marker, die auf Chromosom 1, p, und Chromosom 12, p, und bevorzugter auf Chromosom 1, p34–p38, und Chromosom 12, p11–p17, lokalisiert sind). Polynukleotidmarker, die an solchen Stellen kartieren, sind gut bekannt und können eingesetzt werden, um solch(e) (einen) Polymorphismus/Polymorphismen zu identifizieren.
Derartige Polymorphismen können auch durch die Verwendung eines Marker-Nukleinsäuremoleküls nachgewiesen werden, das mit (einem) solchen Polymorphismus/Polymorphismen physisch gekoppelt ist. Für diesen Zweck können Marker-Nukleinsäuremoleküle eingesetzt werden, die eine Nukleotidsequenz eines Polynukleotids umfassen, das innerhalb von 1 MB des/der Polymorphismus/Polymorphismen, bevorzugter innerhalb von 100 kBp des/der Polymorphismus/Polymorphismen und am bevorzugtesten innerhalb von 10 kBp des/der Polymorphismus/Polymorphismen angeordnet ist.
Die Genome von Tieren und Pflanzen unterliegen natürlicherweise im Verlauf ihrer anhaltenden Evolution spontaner Mutation (Gusella, J.F., Ann. Rev. Biochem. 55: 831–854 (1986)).
Ein "Polymorphismus" in dem TIGR-Gen oder seinen flankierenden Bereichen ist eine Abweichung oder ein Unterschied in der Sequenz des TIGR-Gens oder seiner flankierenden Bereiche, der in einigen Mitgliedern einer Art entsteht. Die abweichende Sequenz und die "Original"-Sequenz kommen nebeneinander in der Population der Art vor. In einigen Fällen liegt eine solche Koexistenz in einem stabilen oder quasi-stabilen Gleichgewicht vor.
Ein Polymorphismus wird daher als "allelisch" bezeichnet, da einige Mitglieder einer Art wegen des Vorkommens des Polymorphismus die Originalsequenz (d.h. das Original-"Allel") aufweisen, während andere Mitglieder die abweichende Sequenz (d.h. das abweichende "Allel") aufweisen. Im einfachsten Fall kann nur eine abweichende Sequenz vorliegen und der Polymorphismus wird dann als di-allelisch bezeichnet. In anderen Fällen kann die Population der Art multiple Allele enthalten und der Polymorphismus wird als tri-allelisch, etc. bezeichnet. Ein einzelnes Gen kann mehrere unterschiedliche, nicht miteinander in Beziehung stehende Polymorphismen aufweisen. Beispielsweise kann es einen di-allelischen Polymorphismus an einer Stelle, und einen multi-allelischen Polymorphismus an einer anderen Stelle aufweisen.
Die Abweichung, die den Polymorphismus definiert, kann von einer Einzelnukleotidabweichung bis zur Einfügung oder Entfernung von großen Bereichen innerhalb eines Gens reichen. In einigen Fällen liegen die DNA-Sequenzabweichungen in Bereichen des Genoms vor, die durch kurze tandemartige Wiederholungen („short tandem repeats", STRs) gekennzeichnet sind, die tandemartig wiederholte di- oder tri-Nukleotidmotive von Nukleotiden beinhalten. Polymorphismen, die durch solche tandemartige Wiederholungen gekennzeichnet sind, werden als "tandemartige Wiederholungen mit abweichender Anzahl"-Polymorphismen ("variable number tandem repeat polymorphisms", VNTR) bezeichnet. VNTRs wurden in Identitäts- und Vaterschaftsanalysen verwendet (Weber, J.L., US-Patent 5,075,217; Armour, J.A.L. et al FEBS Lett. 307: 113–115 (1992); Jones, L. et al., Eur. J. Haematol. 39: 144–147 (1987); Horn, G.T. et al., PCT-Anmeldung WO 91/14003; Jeffreys, A.J., EP 370 719 ; Jeffreys, A.J. US-Patent 5,175,082; Jeffreys, A.J. et al., Amer. J. Hum. Genet. 39: 11–24 (1986); Jeffreys, A.J. et al., Nature 316: 76–79 (1985); Gray, I.C. et al., Proc. R. Acad. Soc. Lond. 243: 241-253 (1991); Moore, S.S. et al., Genomics 10: 654–660 (1991); Jeffreys, A.J. et al., Anim. Genet. 18: 1l–15 (1987); Hillel, J. et al., Anim. Genet. 20: 145-155 (1989); Hillel, J. et al., Genet. 124: 783–789 (1990)).
Der Nachweis einer Polymorphismusstelle in einer DNA-Probe kann durch die Verwendung von Nukleinsäureamplifikationsverfahren erleichtert werden. Derartige Verfahren erhöhen spezifisch die Konzentration von Polynukleotiden, die sich über die polymorphe Stelle erstrecken oder diese Stelle und Sequenzen, die entweder distal oder proximal von ihr angeordnet sind, einschließen. Solche amplifizierte Moleküle können durch Gelelektrophorese oder andere Mittel leicht nachgewiesen werden.
Das bevorzugteste Verfahren zum Erzielen einer derartigen Amplifikation nutzt die Polymerasekettenreaktion ("PCR") (Mul-lis, K. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263-273 (1986); Erlich H. et al., Europäische Patentanmeldung 50 424; Europäische Patentanmeldung 84 796, Europäische Patentanmeldung 258 017, Europäische Patentanmeldung 237 362; Mullis, K., Europäische Patentanmeldung 201 184; Mullis K. et al., US-Patent 4,683,202; Erlich, H., US-Patent 4,582,788 und Saiki, R. et al., US-Patent 4,683,194)) unter Einsatz von Primerpaaren, die in der Lage sind, an die proximalen Sequenzen zu hybridisieren, die einen Polymorphismus in seiner doppelsträngigen Form definieren.
Anstelle von PCR können alternative Verfahren, wie die "Ligase-Kettenreaktion" ("LCR") verwendet werden (Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 189–193 (1991)). Die LCR verwendet zwei Paare von Oligonukleotidsonden, die ein spezifisches Target exponentiell amplifizieren. Die Sequenzen von jedem Oligonukleotidpaar werden so gewählt, daß sie es dem Paar ermöglichen, an aneinandergrenzende Sequenzen des selben Stranges des Targets zu hybridisieren. Eine derartige Hybridisierung bildet ein Substrat für eine Matrizen-abhängige Ligase. Wie bei der PCR dienen die entstehenden Produkte dann als eine Matrize in nachfolgenden Zyklen und eine exponentielle Amplifizierung der gewünschten Sequenz wird erreicht.
Die LCR kann mit Oligonukleotiden durchgeführt werden, welche die proximalen und distalen Sequenzen des gleichen Stranges von einer polymorphen Stelle aufweisen. In einer Ausführungsform sind beide Oligonukleotide so gestaltet, daß sie die eigentlich polymorphe Stelle des Polymorphismus einschließen. In einer derartigen Ausführungsform werden die Reaktionsbedingungen so gewählt, daß die Oligonukleotide nur miteinander ligiert werden können, wenn das Zielmolekül das spezifische Nukleotid, welches zu der polymorphen Stelle auf dem Oligonukleotid komplementär ist, entweder enthält oder dieses fehlt. Alternativ können die Oligonukleotid so gewählt werden, daß sie die polymorphe Stelle nicht enthalten (siehe Segev, D., PCT-Anmeldung WO 90/01069).
Der "Oligonukleotid-Ligations-Assay" ("OLA") kann alternativ eingesetzt werden (Landegren, U. et al., Science 241: 1077-1080 (1988)). Das OLA-Protokoll verwendet zwei Oligonukleotide, die so gestaltet sind, daß sie in der Lage sind, an aneinandergrenzende Sequenzen eines einzelnen Stranges eines Targets zu hybridisieren. OLA ist, ähnlich wie LCR, besonders für den Nachweis von Punktmutationen geeignet. Anders als LCR führt OLA jedoch eher zu einer "linearen", als zu einer exponentiellen Amplifikation der Zielsequenz.
Nickerson, D.A. et al. haben einen Nukleinsäurenachweisassay beschrieben, der Eigenschaften von PCR und OLA vereint (Nickerson, D.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87: 8923–8927 (1990)). Bei diesem Verfahren wird eine PCR verwendet, um die exponentielle Amplifizierung einer Ziel-DNA zu erreichen, die dann unter Verwendung von OLA nachgewiesen wird. Zusätzlich zum Erfordernis mehrfacher, und getrennter, Prozessierungsschritte ist ein weiteres Problem, das mit derartigen Kombinationen verbunden ist, daß sie alle Probleme, die mit PCR und OLA assoziiert sind, mit übernehmen.
Systeme, die auf der Ligation von zwei (oder mehr) Oligonukleotiden im Beisein von Nukleinsäure beruhen, welche die Sequenz des entstehenden "di-Oligonukleotids" aufweisen, und dabei das di-Oligonukleotid amplifizieren, sind ebenfalls bekannt (Wu, D.Y. et al., Genomics 4: 560 (1989)) und können an die Zwecke der vorliegenden Erfindung leicht angepasst werden.
Andere bekannte Nukleinsäureamplifikationsverfahren, wie beispielsweise allel-spezifische Oligomere, die "branched DNA"-Technologie, Transkriptions-basierte Amplifikationssysteme oder isothermische Amplifikationsverfahren können ebenfalls eingesetzt werden, um solche Polymorphismen zu amplifizieren und zu analysieren (Malek, L.T. et al., US-Patent 5,130,238; Davey, C. et al., Europäische Patentanmeldung 329 822; Schu ster et al, US-Patent 5,169,766; Miller, H.I., PCT-Patentanmeldung WO 89/06700; Kwoh, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 1173 (1989); Gingers, T.R. et al., PCT-Patentanmeldung WO 88/10315; Walker, G.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89: 392–396 (1992)). Jedes der vorangehenden Nukleinsäureamplifikationsverfahren könnte auch verwendet werden, um Glaukom vorherzusagen oder zu diagnostizieren.
Die Identifizierung eines Polymorphismus in dem TIGR-Gen kann auf eine Vielzahl von Weisen bestimmt werden. Durch Korrelieren des Vorkommens oder des Fehlens eines Glaukoms in einem Individuum mit dem Vorkommen oder dem Fehlen eines Polymorphismus in dem TIGR-Gen oder seinen flankierenden Bereichen ist es möglich, die Prädisposition eines Patienten ohne Symptome für Glaukom, verwandte Krankheiten oder Steroidempfindlichkeit zu diagnostizieren. Wenn ein Polymorphismus eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle erzeugt oder zerstört oder wenn er zu dem Verlust oder dem Einfügen von DNR führt (beispielsweise ein VNTR-Polymorphismus), wird er die Größe oder das Profil der DNA-Fragmente verändern, die durch Verdau mit der Restriktionsendonuklease erzeugt werden. Somit können Individuen, die eine abweichende Sequenz aufweisen, durch Restriktionsfragmentanalyse von denen unterschieden werden, welche die Originalsequenz besitzen. Polymorphismen, die auf diese Weise identifiziert werden können, werden als "Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen" ("RFLPs") bezeichnet. RFLPs wurden in der genetischen Analyse von Menschen und Tieren weit verbreitet verwendet (Glassberg, J., UK-Patentanmeldung 2135774; Skolnick, M.H. et al., Cytogen. Cell Genet. 32: 58–67 (1982); Botstein, D. et al., Ann. J. Hum. Genet. 32: 314–331 (1980); Fischer, S.G. et al. (PCT-Anmeldung WO 90/13668); Uhlen, M., PCT-Anmeldung WO 90/11369)). Die Rolle des TIGR in der Glaukompathogenese deutet darauf hin, daß das Vorkommen von genetischen Veränderungen (zum Beispiel DNA-Polymor phismen), welche die TIGR-Antwort beeinflussen, verwendet werden kann, um Glaukom vorherzusagen.
In Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform der Erfindung wird eine Proben-DNA aus einer Patientenzelle erhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die DNA-Probe aus dem Blut eines Patienten erhalten. Es kann jedoch jede Quelle für DNA verwendet werden. Die DNA wird einem Restriktionsendonukleaseverdau unterzogen. TIGR wird in Übereinstimmung mit den oben beschriebenen RFLP-Verfahren als eine Sonde verwendet. Durch Vergleichen der RFLP-Muster des TIGR-Gens, das von normalen und von glaukomatösen Patienten erhalten wurde, kann man die Prädisposition eines Patienten für Glaukom bestimmen. Der in diesem Ansatz erhaltene Polymorphismus kann dann kloniert werden, um die Mutation in dem kodierenden Bereich zu identifizieren, welche die Proteinstruktur oder den regulatorischen Bereich des Gens, der sein Expressionsniveau beeinflußt, verändert. Veränderungen, die Promotorinteraktionen mit anderen regulatorischen Proteinen mit sich ziehen, können beispielsweise durch Gelshift-Assays unter Verwendung von HTN-Zell-extrakten, Flüssigkeit aus der vorderen Augenkammer, Serum, etc. identifiziert werden. Interaktionen des TIGR-Proteins in glaukomatösen Zellextrakten, Flüssigkeit aus der vorderen Augenkammer, Serum, etc. kann mit Kontrollproben verglichen werden, um so Veränderungen in den Eigenschaften des TIGR zu identifizieren, die mit der Pathogenese des Glaukoms zusammenhängen. Auf die gleiche Weise können derartige Extrakte und Flüssigkeiten ebenso wie andere (Blut etc.) verwendet werden, um eine Steroidempfindlichkeit zu diagnostizieren oder vorherzusagen.
Durch derartige Verfahren können mehrere verschiedene Klassen von Polymorphismen identifiziert werden. Beispiele solcher Klassen beinhalten: (1) Polymorphismen, die in der TIGR-cDNA von verschiedenen Individuen vorkommen, (2) Polymorphismen in nicht-translatierten TIGR-Gensequenzen einschließlich des Promotors oder anderer regulatorischer Bereiche des TIGR-Gens; (3) Polymorphismen in Genen, deren Produkte mit TIGR-regulatorischen Sequenzen interagieren, (4) Polymorphismen in Gensequenzen, deren Produkte mit dem TIGR-Protein interagieren oder an die das TIGR-Protein bindet.
In einer alternativen Unterausführungsform wird die Bewertung unter Verwendung von Oligonukleotid-"Sonden" durchgeführt, deren Sequenz zu der eines Teils der TIGR-mRNA komplementär ist. Solche Moleküle werden dann mit Zellextrakten eines Patienten unter Bedingungen inkubiert, die ausreichen, um Nukleinsäurehybridisierung zu ermöglichen. Für diese Unterausführungsform sind Zellen des trabekulären Netzwerkes bevorzugt. Der Nachweis von doppelsträngigen Sonden-mRNA-Hybridmolekülen weist auf das Vorkommen von TIGR-mRNA hin; die Menge eines derartigen gebildeten Hybrids ist proportional zu der Menge der TIGR-mRNA. Daher können solche Sonden verwendet werden, um das Niveau und das Ausmaß der Bildung von TIGR-mRNA in den Zellen eines Patienten festzustellen. Eine derartige Nukleinsäurehybridisierung kann unter quantitativen Bedingungen durchgeführt werden (und stellt auf diese Weise einen numerischen Wert für die Menge der vorhandenen TIGR-mRNA zur Verfügung). Alternativ kann der Assay als qualitativer Assay durchgeführt werden, der entweder angibt, daß TIGR-mRNA vorhanden ist, oder daß sein Gehalt einen vom Benutzer gesetzten vordefinierten Wert überschreitet.
Wie oben diskutiert, wird das TIGR-Protein extrazellulär aus dem trabekulären Netzwerk in die extrazelluläre Matrix des trabekulären Netzwerkes sekretiert und kann so in die Körperflüssigkeit gelangen. Diese Eigenschaft erlaubt einem, die TIGR-Konzentrationen im Blut, in Lymphe oder Serum zu testen und auf diese Weise zu bestimmen, ob die TIGR-Gehalte in einem Patienten die in dem Blut eines Individuums gefundenen über schreiten, das kein Glaukom hat und nicht für Glaukomverwandte Krankheiten oder Steroidempfindlichkeit prädisponiert ist. Patienten, bei denen festgestellt wurde, daß sie veränderte Gehalte von TIGR aufweisen, können auf diese Weise als Glaukom(-tragend) diagnostiziert werden.
Wie oben diskutiert, zeigt das TIGR-Protein eine Fähigkeit zur Selbstaggregation, zumindest teilweise wegen des Vorkommens von Leucin-Zippern in dem Molekül. Da kleine Peptidfragmente des TIGR, die solche Zipper-Bereiche aufweisen, an TIGR binden können, können derartige Peptide als Alternativen für die anti-TIGR-Antikörper in diagnostischen Assays verwendet werden. Die Verwendung von solchen Peptiden ist wünschenswert, da die Peptide verändert werden können, um sowohl die lipophile als auch hydrophile Gruppen zu besitzen. Das Vorkommen solcher Gruppen erlaubt es dem Peptid, die Hornhautmembran zu durchqueren. Auf diese Weise können solche Wirkstoffe topisch in einem Augentropfen oder einer Salbe bereitgestellt werden, und können auf die gleiche Weise wie anti-TIGR-Antikörper verwendet werden, um die Diagnose von Glaukom zu bewirken. Das Peptid wird wünschenswerterweise mit einer fluoreszierenden Gruppe markiert, um den Nachweis zu erleichtern.
Jedes geeignete Peptidfragment des TIGR kann für diesen Zweck verwendet werden, obwohl es bevorzugt ist, ein Fragment zu verwenden, das allen oder einem Teil der Reste 85–92, 92-99, 121–128, 128–135, 135–142, 142–149, 149–156, 241–248 und 374–381 von SEQ ID NO: 1 entspricht. Geeignete lipophile und hydrophile Gruppen sind im Fachgebiet bekannt (siehe Remington's Pharmaceutical Sciences) und umfassen aliphatische Gruppen, Lipide, etc. (lipophile Gruppen) und organische Säuren, Ester, ionische Gruppen, etc. (hydrophile Gruppen). Derartige Gruppen können leicht an die erfindungsgemäßen TIGR-Moleküle durch beispielsweise Derivatisieren der Seitenkettengruppen geeigneter Aminosäuren angeheftet werden.
Cysteinylreste können mit a-Haloacetalen (und entsprechenden Aminen), wie beispielsweise Chloressigsäure oder Chloracetamid umgesetzt werden, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethyl-Derivate zu erzeugen. Cysteinylreste können auch durch Umsetzen mit Bromtrifluoraceton, a-Bromo-b-(5-imidozoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert werden.
Histidylreste können durch Umsetzen mit Diethylprocarbonat bei pH 5,5-7,0 derivatisiert werden, da dieses Mittel für die Histidylseitenkette verhältnismäßig spezifisch ist. Para-Bromphenacylbromid ist ebenfalls verwendbar, die Reaktion wird bevorzugt in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0 durchgeführt.
Lysinyl- und aminoterminale Reste können mit Anhydriden der Bernsteinsäure oder anderen Carboxylsäuren umgesetzt werden. Die Derivatisierung mit diesen Mitteln bewirkt die Umdrehung der Ladung des Lysinylrestes. Andere geeignete Reagenzien zum Derivatisieren von a-Amino-enthaltenden Resten beinhalten Imidoester, wie beispielsweise Methylpicolinimidat, Pyridoxalphosphat, Pyridoxal, Chlorborhydrid, Trinitrobenzensulfonsäure, O-Methylissharnstoff, 2,4-Pentandion und Transaminasekatalysierte Umsetzung mit Glyoxylat.
Arginylreste können durch Umsetzen mit einem oder verschiedenen herkömmlichen Reagenzien umgesetzt werden, zu denen Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin gehören. Die Derivatisierung von Argininresten erfordert, daß die Umsetzung wegen des hohen pKa der funktionellen Gruppe des Guanidins unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird. Weiterhin können diese Reagenzien mit den Gruppen des Lysins ebenso wie mit der epsilon-Aminogruppe des Arginins reagieren.
Carboxyl-Seitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) können durch Umsetzen mit Carbodiimiden (R'-N-C-N-R'), wie beispielsweise 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-(4-ethyl)-carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)-carbodiimid selektiv modifiziert werden. Weiterhin können Aspartyl- und Glutamylreste durch Umsetzen mit Ammoniumionen in Asparaginyl- und Glutaminylreste umgewandelt werden.
IV. Verfahren der Verabreichung
Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können bekannten Verfahren entsprechend formuliert werden, um pharmakologisch verträgliche Zusammensetzungen herzustellen, wobei diese Materialien oder ihre funktionellen Derivate, die den gewünschten Reinheitsgrad aufweisen, durch Beimischung mit einem physiologisch verträglichen Träger, Hilfsstoff oder Stabilisator vereint werden. Solche Materialien sind bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen für den Empfänger nicht toxisch. Die aktive Komponente derartiger Zusammensetzungen kann/können das TIGR-Protein, TIGR-Fusionsproteine oder Fragmente des TIGR-Proteins oder Analoga oder Mimetika von solchen Molekülen sein. Wo Nukleinsäuremoleküle eingesetzt werden, können solche Moleküle Sinn-, Gegensinn- oder Triplex-Oligonukleotide der TIGR-cDNA oder des TIGR-Gens sein.
Eine Zusammensetzung wird als "pharmakologisch verträglich" bezeichnet, wenn ihre Verabreichung durch den empfangenden Patienten toleriert wird. Ein Wirkstoff ist physiologisch bedeutsam, wenn seine Anwesenheit zu einer nachweisbaren Veränderung in der Physiologie eines empfangenden Patienten führt.
Geeignete Vehikel und ihre Formulierung, einschließlich anderer menschlicher Proteine, z.B. von menschlichem Serumalbumin, werden zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Scien ces beschrieben (16. Auflage, Osol, A., Hrsg., Mack, Easton PA (1980)).
Wenn die Zusammensetzung wasserlöslich sein soll, kann sie in einem Puffer, wie beispielsweise Phosphat oder dem Salz einer anderen organischen Säure, bevorzugt bei einem pH von ungefähr 7 bis 8 formuliert werden. Wenn die Zusammensetzung nur teilweise in Wasser löslich ist, kann sie als eine Mikroemulsion durch Formulieren mit einem nicht-ionischen Benetzungsmittel, wie beispielsweise Tween, Pluronics oder PEG, zum Beispiel Tween 80, in einer Menge von zum Beispiel 0,04–0,05 (w/v) formuliert werden, um ihre Löslichkeit zu erhöhen. Der Begriff "wasserlöslich", wie er auf die Polysaccharide und Polyethylenglykole angewendet wird, soll kolloidale Lösungen und Dispersionen einschließen. Im Allgemeinen wird die Löslichkeit der Cellulosederivate durch den Grad der Substitution von Ethergruppen bestimmt, und die hier nützlichen stabilisierenden Derivate sollten eine ausreichende Menge solcher Ethergruppen pro Anhydroglukoseeinheit in der Cellulosekette aufweisen, um die Derivate wasserlöslich zu machen. Ein Ethersubstitutionsgrad von mindestens 0,35 Ethergruppen pro Anhydroglukoseeinheit ist im Allgemeinen ausreichend. Zusätzlich können die Cellulosederivate in Form von Alkalimetalsalzen, zum Beispiel den Li-, Na-, K- oder Cs-Salzen vorliegen.
Wahlweise können andere Inhaltsstoffe zugegeben werden, wie beispielsweise Antioxidanzien, zum Beispiel Ascorbinsäure, Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als ungefähr zehn Reste), zum Beispiel Polyarginin oder Tripeptide, Proteine, wie beispielsweise Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline, hydrophile Polymere, wie beispielsweise Polyvinylpyrrolidon, Aminosäuren, wie beispielsweise Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin, Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Cellulose und ihren Derivaten, Glukose, Mannose oder Dextrin, komplexbildende Mittel, wie beispielsweise EDTA, und Zuckeralkohole, wie beispielsweise Mannitol oder Sorbitol.
Zusätzliche pharmazeutische Verfahren können eingesetzt werden, um die Dauer der Wirkung zu kontrollieren. Zubereitungen mit kontrollierter oder verlängerter Freisetzung können durch die Verwendung von Polymeren erhalten werden, welche das/die TIGR-Molekül(e) aus der Zusammensetzung komplexieren oder absorbieren. Die kontrollierte Verabreichung kann durch Auswahl geeigneter Makromoleküle (zum Beispiel Polyestern, Polyaminsäuren, Polyvinylpyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Methylceilulose, Carboxymethylcellulose und Protaminsulfat) und der Konzentration der Makromoleküle ebenso wie der Verfahren der Beimischung praktiziert werden, um die Freisetzung zu kontrollieren.
Formulierungen mit verzögerter Freisetzung können ebenfalls zubereitet werden und schließen die Bildung von mikrokapsulären Partikeln und implantierbaren Artikeln ein. Für die Herstellung von Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung wird/werden das/die TIGR-Molekül(e) aus der Zusammensetzung bevorzugt in eine biologisch abbaubare Matrix oder Mikrokapsel aufgenommen. Ein für diesen Zweck geeignetes Material ist ein Polylaktid, obwohl andere Polymere der Poly-(a)-hydroxycarboxylsäuren), wie beispielsweise Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133 988 A ) verwendet werden können. Andere biologisch abbaubare Polymere schließen Poly-(laktone), Poly-(orthoester), Polyaminosäuren, Hydrogele oder Poly(orthocarbonate)poly(acetale) ein. Das polymere Material kann auch Polyester, Poly(milchsäuren) oder Ethylenvinylacetat-Copolymere umfassen. Für Beispiele für Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung siehe US-Patent Nr. 3,773,919, EP 58 481 A , US-Patent Nr. 3,887,699, EP 158 277 A , Kanadisches Patent Nr. 1176565, Sidman, U. et al., Biopolymers 22: 547 (1983) und Langer, R. et al., Chem. Tech. 12: 98 (1982).
Anstatt das/die TIGR-Molekül(e) aus der Zusammensetzung in polymere Partikel aufzunehmen, ist es wahlweise möglich, diese Materialien in Mikrokapseln einzuschließen, die beispielsweise durch Koazervationstechniken oder durch Polymerisierung zwischen zwei Flächen („interfacial polymerization") hergestellt wurden, zum Beispiel Hydroxymethylcellulose- oder Gelatinemikrokapseln bzw. Poly(methylmethacylat)-Mikrokapseln oder in kolloidalen Wirkstoffverabreichungssystemen, zum Beispiel Liposomen, Albuminmikrosphären, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln oder in Makroemulsionen. Derartige Techniken werden in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) offenbart.
In einer alternativen Ausführungsform werden Liposomformulierungen und Verfahren eingesetzt, welche die intrazelluläre Aufnahme des Moleküls erlauben. Geeignete Verfahren sind im Fachgebiet bekannt, siehe zum Beispiel Chicz, R.M. et al. (PCT-Anmeldung WO 94/04557), Jaysena, S.D. et al. (PCT-Anmeldung WO 93/12234), Yarosh, D.B. (US-Patent Nr. 5,190,762), Callahan, M.V. et al. (US-Patent Nr. 5,270,052) und Gonzalezro, R.J. (PCT-Anmeldung 91/05771).
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können sterilisiert werden, wie beispielsweise durch Filtration durch Sterilfiltrationsmembranen (z.B. 0,2 μm-Membranen). Die Zusammensetzungen können in lyophilisierter Form oder als eine flüssige Lösung gelagert werden. Es wird verständlich sein, daß die Verwendung von bestimmten der vorangehend genannten Hilfsmittel, Träger oder Stabilisatoren zu der Bildung von Salzen der Moleküle führen wird.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können topisch auf die Haut oder auf die Hornhaut aufgetragen werden. Bei topischer Anwendung können das/die Molekül(e) der Zusammensetzung auf geeignete Weise mit anderen Inhaltsstoffen kombiniert werden, wie beispielsweise Trägern und/oder Hilfsstoffen. Es gibt keine Beschränkungen hinsichtlich der Natur solcher anderer Inhaltsstoffe, mit der Ausnahme, daß sie pharmazeutisch verträglich und bei ihrer beabsichtigten Verabreichung wirksam sein sollen, und daß sie die Aktivität der aktiven Inhaltsstoffe aus der Zusammensetzung nicht herabsetzen können. Beispiele von geeigneten Vehikeln schließen Salben, Cremes, Gels oder Suspensionen mit oder ohne aufgereinigtem Kollagen ein. Die Zusammensetzungen können auch in transdermale Pflaster und Bandagen imprägniert werden, bevorzugt in flüssiger oder halbflüssiger Form.
Um eine Gelformulierung zu erhalten, können das/die Molekül(e) der Zusammensetzung, die in einer flüssigen Zusammensetzung formuliert sind, mit einer wirksamen Menge eines wasserlöslichen Polysaccharids oder synthetischen Polymers, wie beispielsweise Polyethylenglykol, gemischt werden, um ein Gel mit der für eine topische Verabreichung geeigneten Viskosität zu bilden. Die Polysaccharide, die verwendet werden können, schließen zum Beispiel Cellulosederivate, wie beispielsweise etherifizierte Cellulosederivate, einschließlich Alkylcellulosen, Hydroxyalkylcellulosen und Alkylhydroxyalkylcellulosen, zum Beispiel Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Hydroxypropylcellulose, Stärke und fraktionierte Stärke, Agar, Alginsäure und Alginate, Gummi arabikum, Pullullan, Agarose, Carrageenan, Dextrane, Dextrine, Fruktane, Inulin, Mannane, Xylane, Arabinane, Chitosane, Glykogene, Glukane, und synthetische Biopolymere ebenso wie Gummis, wie beispielsweise Xanthan, Guargummi, Johannesbrotkernmehl, Gummi arabikum, Traganthgummi und Karayagummi, und deren Derivate und Mischungen ein. Das hier bevorzugte Geliermittel ist eines, das gegenüber biologischen Systemen inert ist, nicht-toxisch ist, einfach herzustellen ist und nicht zu flüssig oder viskos ist, und das/die in ihm enthaltene(n) TIGR-Molekül(e) nicht destabilisieren wird. Das Polysaccharid ist bevorzugt ein etherifiziertes Cellulosederivat, bevorzugter eines, das gut definiert, gereinigt und in USP gelistet ist, zum Beispiel Methylcellulose und die Hydroxyalkylcellulosederivate, wie beispielsweise Hydroxypropylcellulose, Hydroxyethylcellulose und Hydroxypropylmethylcellulose. Methylcellulose wird hier am meisten bevorzugt.
Das zum Gelieren verwendbare Polyethylenglykol ist üblicherweise eine Mischung von Polyethylenglykolen mit niedrigem und hohem Molekulargewicht, um die richtige Viskosität zu erhalten. Zum Beispiel wäre eine Mischung eines Polyethylenglykols mit Molekulargewicht 400–600 mit einem mit Molekulargewicht 1500 für diesen Zweck wirksam, wenn diese in dem geeigneten Verhältnis gemischt werden, um eine Paste zu erhalten.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auch zur parenteralen Verabreichung durch Injektion, schnelle Infusion, nasopharyngeale Absorption (intranasopharyngeal), Dermaabsorption oder oral formuliert werden. Die Zusammensetzungen können wahlweise intramuskulär oder intravenös verabreicht werden. Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung beinhalten sterile, wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nicht-wässrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle, wie beispielsweise Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie beispielsweise Ethyloleat. Träger, Zusätze oder abschließendes Verbandsmaterial können verwendet werden, um die Gewebspermeabilität zu erhöhen und die Antigenabsorption zu verstärken. Flüssige Dosierungsformen für orale Verabreichung können im Allgemeinen eine Liposomenlösung einschließen, welche die flüssige Dosierungsform enthält. Geeignete Formen zum Suspendieren von Liposomen schließen Emulsionen, Suspensionen, Lösungen, Sirupe und Elixiere ein, die inerte Verdünnungsmittel enthalten, die normalerweise im Fachgebiet verwendet wer den, wie beispielsweise aufgereinigtes Wasser. Neben den inerten Verdünnungsmitteln können derartige Zusammensetzungen auch Benetzungsmittel, emulgierende und suspendierende Wirkstoffe oder süßende, geschmackgebende, farbgebende oder geruchgebende Mittel beinhalten.
Wenn Methylcellulose in dem Gel eingesetzt wird, umfaßt es bevorzugt ungefähr 2–5%, bevorzugter ungefähr 3% des Gels und das/die TIGR-Molekül(e) aus der Zusammensetzung liegt/liegen in einer Menge von ungefähr 300 bis 1000 μg pro ml des Gels vor. Die zu verwendende Dosis hängt von den oben beschriebenen Faktoren ab. Einem allgemeinen Vorschlag zufolge wird/werden das/die TIGR-Molekül(e) aus der Zusammensetzung in einer Dosis formuliert und an die Zielstelle oder in das Zielgewebe verabreicht, die in der Lage ist, in dem Gewebe eine maximale Dosis zu etablieren, die wirksam, aber nicht übermäßig toxisch ist.
In der bevorzugtesten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Moleküle der Hornhaut oder der Oberfläche des Auges bereitgestellt und es ihnen ermöglicht, durch die Hornhaut in die vordere Augenkammer zu absorbieren. Verfahren, die verwendet werden können, um eine derartige okuläre Verabreichung des Wirkstoffs zu erreichen, werden von Zun, L.S. (Emerg. Med. Clin. North. Amer. 6: 121 (1988) ), Lee, V.H. (J. Ocular Pharmacol. 6: 157 (1990)), Ellis, P.P. (In: Ocular Therapeutics and Pharmacology, 7. Auflage, Mosby, (1987)) und Vaughan, D. et al., In: General Ophthamology, Appleton & Lange, Norwalk, CT, S. 213–230 (1992) beschrieben.
Am bevorzugtesten wird eine derartige Verabreichung eines Wirkstoffs jedoch durch Kombinieren wirksamer Mengen des erfindungsgemäßen Wirkstoffs mit einem der ophthalmischen Verabreichungssysteme mit verzögerter Freisetzung erreicht, die von Davis, J.P. et al. (US-Patent Nr. 5,192,535) beschrieben werden.
Solche bevorzugten topischen, ophthalmischen Medikamentenverabreichungssysteme mit verzögerter Freisetzung umfassen eine wässrige Suspension bei einem pH von ungefähr 3 bis ungefähr 6,5 und einem osmotischen Druck von ungefähr 10 bis ungefähr 400 mOsM, die von ungefähr 0,1 Gew.-% bis ungefähr 6,5 Gew.-%, auf Grundlage des Gesamtgewichts der Suspension, ein Carboxyl-enthaltendes Polymer enthalten, das durch Polymerisieren eines oder mehrerer Carboxyl-enthaltender monoethylenischer ungesättigter Monomere hergestellt wurde, und weniger als ungefähr 5 Gew.-% eines kreuzvernetzenden Mittels, wobei solche Gewichtsprozente der Monomere auf das Gesamtgewicht der polymerisierten Monomere bezogen sind. Das Polymer wird bevorzugt durch Polymerisieren des Polymers mit dem kreuzvernetzenden Mittel in Suspension oder Emulsion bis zu einer Partikelgröße von nicht mehr als 50 μm, bevorzugt nicht mehr als ungefähr 30 μm als entsprechende Kugeldurchmesser hergestellt. Die Suspension hat eine anfängliche Viskosität von ungefähr 1000 bis ungefähr 30 000 Centipoises (cp) und ist dem Auge bei der anfänglichen Viskosität in Tropfenform verabreichbar. Das Polymer hat eine durchschnittliche Partikelgröße von nicht mehr als ungefähr 50 μm, bevorzugt nicht mehr als ungefähr 30 μm in entsprechenden Kugeldurchmessern. Im Allgemeinen wird das geschätzte Molekulargewicht derartiger Polymere von ungefähr 250 000 bis ungefähr 4 000 000, und bevorzugt von ungefähr 500 000 bis ungefähr 2 000 000 reichen.
Wässrige Suspensionen, die Polymerpartikel enthalten, die durch Polymerisierung in Suspension oder Emulsion wurden, deren durchschnittliche Größe trockener Partikel schätzungsweise größer ist als ungefähr 50 μm in entsprechenden Kugeldurchmessern, sind weniger angenehm bei Verabreichung in das Auge verabreicht werden, als Suspensionen, die ansonsten hinsichtlich der Zusammensetzung identisch sind, die aber Polymerpartikel enthalten, deren entsprechende Kugeldurchmesser im Durchschnitt kleiner als ungefähr 50 μm sind. Zusätzlich wird über der durchschnittlichen Größe von 50 μm der Vorteil einer wesentlich erhöhten Viskosität nach Verabreichung nicht erreicht.
Die leicht kreuzvernetzte Suspension ist in Tropfenform verabreichbar, wobei nach Kontakt der Niedrig-pH-Suspension mit dem höheren pH der Tränenflüssigkeit des Auges die Suspension schnell gelierbar ist hin zu einer wesentlich größeren Viskosität als der Viskosität der Suspension, die anfänglich in Tropfenform verabreicht wurde. Entsprechend kann das entstehende viskosere Gel in dem Auge für eine verlängerte Zeit verbleiben, um so freizusetzen.
Das Polymer des bevorzugten intraokulären Wirkstoffverabreichungsystems wird bevorzugt aus mindestens 50 Gew.-%, bevorzugter mindestens ungefähr 90 Gew.-% eines oder mehrerer Carboxyl-enthaltender, monoethylenischer, ungesättigter Monomere hergestellt. Acrylsäure ist das bevorzugte Carboxylenthaltende, monoethylenische ungesättigte Monomer, jedoch können andere ungesättigte, polymerisierbare Carboxylenthaltende Monomere, wie beispielsweise Methacrylsäure, Ethacrylsäure, b-Methacrylsäure (Crotonsäure), cis-a-Methylcrotonsäure (Angelinsäure), trans-a-Methylcrotonsäure (Tiglinsäure)), a-Butylcrotonsäure, a-Phenylacrylsäure, a-Benzylacrylsäure, a-Cyclohexylacrylsäure, b-Phenylacrylsäure (Zimtsäure), Cumarinsäure (o-Hydroxyzimtsäure), p-Hydroxycumarinsäure („umbellic acid") und dergleichen, zusätzlich oder an Stelle der Acrylsäure verwendet werden.
Derartige Polymere werden unter Verwendung eines kleinen Prozentsatzes, d.h. weniger als ungefähr 5%, wie beispielsweise von ungefähr 0,5% oder von ungefähr 0,1% bis ungefähr 5%, und bevorzugt von ungefähr 0,2% bis ungefähr 1% auf der Grundlage des Gesamtgewichts der vorliegenden Monomere, eines polyfunktionalen kreuzvernetzenden Mittels kreuzvernetzt. Die kreuzvernetzenden Mittel derartiger Zusammensetzungen schließen nicht-Polyalkenyl-Polyether-difunktionale Kreuzvernetzungsmonomere ein, wie beispielsweise Divinylglykol, 2,3-Dihydroxyhexa-1,5-dien, 2,5-Dimethyl-1,5-hexadien, Divinylbenzol, N,N-Diallylacrylamid, N,N-Diallylmethacrylamid und dergleichen. Ein bevorzugtes kreuzvernetzendes Mittel ist Divinylglykol. Ebenfalls eingeschlossen sind Polyalkenylpolyetherkreuzvernetzende Mittel, die zwei oder mehr Alkenylethergruppen pro Molekül enthalten, bevorzugt Alkenylethergruppen, die terminale H₂C=C<-Gruppen enthalten, die durch Etherifizierung eines polyhydrischen Alkohols, der mindestens vier Kohlenstoffatome und mindestens 3 Hydroxylgruppen enthält, mit einem Alkenylhalid, wie beispielsweise Allylbromid oder dergleichen, zum Beispiel Polyallylsaccharose, Polyallylpentaerythritol oder dergleichen, erhalten werden; siehe zum Beispiel Brown, US-Patent Nr,. 2,798,053. Diolefinische nicht-hydrophile Makromerkreuzvernetzungsmittel mit Molekulargewichten von ungefähr 400 bis ungefähr 8000, wie beispielsweise unlösliche Diund Polyacrylate und Methacrylate von Diolen und Polyolen, Diisocyanat-Hydroxyalkylacrylate oder Methacrylatumsetzungsprodukte und Umsetzungsprodukte von Isocyanat-terminierten Präpolymeren, die von Polyesterdiolen, Polyetherdiolen oder Polysiloxandiolen abgeleitet sind, mit Hydroxyalkylmethacrylaten und dergleichen, können ebenfalls als die kreuzvernetzenden Mittel eingesetzt werden; siehe zum Beispiel Mueller et al. US-Patente-Nr. 4,192,127 und 4,136,250.
In einem bevorzugten Verfahren zum Herstellen topischer ophthalmischer Verabreichungssysteme mit verzögerter Freisetzung werden in die vorangehenden Suspensionen hergestellt und bei der gewünschten Viskosität von ungefähr 1000 bis ungefähr 30000 Centipoise zur Verabreichung in das Auge in Tropfenform verpackt. In einer bevorzugten Verabreichungsmethode werden die vorangehenden Suspensionen, die das Medikament enthalten, in das Auge bei der anfänglichen Viskosität in Tropfenform verabreicht, um die verabreichte Suspension zu veranlassen, bei Kontakt mit dem höheren pH der Tränenflüssigkeit des Auges in situ zu einer wesentlich höheren Viskosität als der Viskosität der Suspension, wie sie anfänglich in Tropfenform verabreicht wurde, zu gelieren. Das viskosere Gel verbleibt für einen verlängerten Zeitraum in dem Auge, um so das Medikament, das in dem viskoseren, im Auge gebildeten Gel eingeschlossen ist, auf anhaltende Weise freizusetzen.
Es mag wünschenswert sein, bis ungefähr 40 Gew.-% des Carboxyl-enthaltenden, monoethylenischen ungesättigten Monomers durch ein oder mehrere kein Carboxyl enthaltende, monoethylenische, ungesättigte Monomere zu ersetzen, die nur physiologisch und ophthalmologisch unschädliche Substituenten enthalten.
Der gewünschte osmotische Druck wird bevorzugt durch Verwenden eines physiologisch und ophthalmologisch verträglichen Salzes in einer Menge von ungefähr 0,01 Gew.-% bis ungefähr 1 Gew.-% auf Grundlage des Gesamtgewichts der Suspension erreicht. Natriumchlorid ist ein bevorzugtes Salz.
Im Allgemeinen wird die Dosierung, die benötigt wird, um eine wirksame Menge der Zusammensetzung bereitzustellen, in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie dem Alter, dem Zustand, dem Geschlecht, und dem Ausmaß der Krankheit, soweit vorhanden, des Empfängers und anderer Variablen schwanken, und kann durch den Fachmann angepasst und ermittelt werden. Wirksame Mengen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können von ungefähr 0,01 bis 1000 mg/ml pro Dosis oder Anwendung reichen, obwohl kleinere oder größere Mengen verwendet werden können. Für ophthalmische Suspensionen werden die wirksamen Mengen be vorzugt von ungefähr 0,005 Gew.-% bis ungefähr 10 Gew.-% und am bevorzugtesten von ungefähr 0,01 Gew.-% bis ungefähr 5 Gew.-% auf Grundlage des Gesamtgewichts der Suspension reichen.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird dieselbe durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele einfacher verstanden, die als Veranschaulichung bereitgestellt werden und nicht gedacht sind, die vorliegende Erfindung einzuschränken, soweit dies nicht anders angegeben ist.
BEISPIEL 1
KLONIEREN VON TIGR-cDNA
Um die wichtigste DEX-induzierbare cDNA von HTN-Zellen zu klonieren, wurde ein Substraktionsscreening-Verfahren eingesetzt. Bei derartigen substraktiven Screening-Verfahren wird es cDNA-Molekülen, die aus einer vollständigen Population von Zellen erzeugt wurden, ermöglicht, mit einer cDNA-Bibliothek, die aus RNA von verschiedenen Unterpopulationen von Zellen konstruiert wurde, zu hybridisieren, um Klone zu identifizieren, die eine differentielle Expression aufweisen und die daher mRNA-Moleküle darstellen, die in jeder Population induziert oder unterdrückt sind (Lamar, E.E., et al., Cell 73: 171-177 (1984); Rubenstein, J.L.R., et al., Nucleic Acids Res. 18: 4833–4842 (1990); Hedrik, S.M. et al., Sci ence 308: 149–153 (1984); Duguid, J.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci (U.S.A.) 85: 5738–5742 (1988); Weiland, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci (U.S.A.) 87: 2720–2724 (1990)).
Daher wurde cDNA aus mRNA von Zellen des humanen trabekulären Netzwerkes (HTN) erstellt, die für 10 Tage in 100 nM Dexamethason inkubiert wurden, sowie von mRNA von unbehandelten HTN-Zellen. Die cDNA-Bibliothek wurde in lambda-ZapII unter Verwendung des Stammes XL-1 (Stratagene, San Diego) hergestellt. Ungefähr 30 bis 50 μg mRNA wurde aus 5 × 10⁷ Dexamethason-behandelten Zellen, wie von Nguyen, T.D. et al. (In: "Schriftenreihe de Akademie der Wissenschaften und der Literatur, Mainz", 331–343 (1993)) beschrieben, erhalten.
Zwei unabhängige Durchmusterungen von jeweils 20 000 Phagen wurden unter Verwendung eines differentiellen Durchmusterungsansatzes durchgeführt. Die Phagen wurden getrennt mit markierter cDNA beprobt, die aus mRNA von unbehandelten Zellen und von für 1 Tag und 10 Tage mit Dexamethason behandelten Zellen hergestellt wurde. Klone, die eine induzierbare Reaktion zeigten (d.h. eine verstärkte Markierung im Vergleich zur Kontroll-cDNA, wenn sie mit der Dexamethason-behandelten cDNA beprobt wurden), waren die gewünschten Kandidaten für weitere Analysen.
Verschiedene cDNA-Klone wurden erhalten, die mRNA entsprachen, die in Dexamethason-behandelten Zellen in größeren Mengen gebildet wurde. Ein cDNA-Klon, der mRNA entsprach, die in den Dexamethason-behandelten Zellen vorlag, jedoch in den unbehandelten Zellen fehlte, wurde als "Klon II.2" oder "TIGR" bezeichnet (T.D. Nguyen et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32: 789 (1991)). Ein zweiter Klon kodierte für alpha-1-Antichymotrypsin.
Das Ausmaß dieser Veränderungen wurde sowohl durch Dot-Blot- als auch durch PCR-Verfahren quantifiziert. Bei der Dot-Blot-Analyse wurde die DNA der Klone serienmäßig verdünnt und auf Membranen gegeben, die dann mit markierter Gesamt-cDNA von Kontrollzellen oder von Zellen hybridisiert wurde, die 1 Tag oder 10 Tage mit Dexamethason behandelt wurden. Die Dot-Blot-Analysen zeigten; daß die TIGR-mRNA die hauptsächlich induzierte Art war, die am Tag 10 3–4% der zellulären Gesamt-mRNA umfaßte. Ein unbedeutender Gehalt an TIGR-mRNA wurde in der Kontrolle nachgewiesen. Der Zeitverlauf der Dexamethason-Behandlung an den Tagen 2, 4, 7 und 10 zeigte, daß TIGR schrittweise induziert wurde (T.D. Nguyen et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32: 789 (1991)). Cycloheximid-Studien zeigten, daß die Induktion eine Proteinsynthese erforderte. Southern-Analysen und in situ-Hybridisierung zeigen mehrere Kopien des Gens. Für PCR-Amplifikationsanalysen wurde das PCR-Verfahren mit serienmäßiger Verdünnung (Chelly, J.D. et al., Eur. J. Biochem. 187: 691–698 (1990); Murphy, L.D. et al., Biochem. 29: 10350–10356 (1990); Singer-Sam, J.O. et al., Nucl. Acids Res. 18: 1255–1259 (1990)) modifiziert, um den exponentiellen Bereich der Amplifikation während des gesamten Quantifizierungsverfahrens zu erhalten, um die Hauptinduktion und die schrittweise Induktion der TIGR-mRNA während eines 10-tägigen Zeitraums der Induzierung mit Dexamethason zu messen und zu bestätigen. Quantitative PCR-Analysen zeigten ein ungefähr 20-faches Induktionsniveau verglichen mit dem Niveau, das in Zellen gefunden wurde, die für nur einen Tag mit Dexamethason behandelt wurden.
Northern-Analysen zeigten, daß der Klon TIGR ungefähr 2,5 kBp groß ist und für ein Protein mit einzigartiger Sequenz kodiert. Die Induktion der mRNA erforderte Proteinsynthese, und Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren verringerten die Induktionswirkung um 50%. Die Induktion der TIGR-mRNA wurde in Dexamethason-behandelten Fibroblasten, Keratinozyten oder cilliären Epithelzellen nicht beobachtet. Das Muster der Induktion in HTN-Zellen war von anderen Steroid-induzierten Proteinen, wie beispielsweise Metallothionin, alphal-Säure-Glykoprotein und TAT, die durch einen Tag Dexamethason-Behandlung maximal induziert waren, unterscheidbar. Zusätzlich zum Dexamethason wurde die TIGR-mRNA in HTN-Zellen induziert, die für 3–24 Stunden Wasserstoffperoxid, TPA oder Saccharose ausgesetzt waren. Dexamethason-Behandlung führte zu einem wesentlichen Verlust bei den mRNRs für Glukokortikoidrezeptoren und Hitzeschockproteinen (z.B. mRNA-Gehalte von hsp 90 fielen ungefähr 20-fach nach 10 Tagen Dexamethason-Behandlung).
BEISPIEL 2
EXPRESSION DES TIGR
Eine Möglichkeit, wesentliche Mengen des TIGR zu exprimieren, würde die Verwendung dieses Proteins für funktionelle Assays und die Entwicklung von anti-TIGR-Antikörpern erleichtern. Um eine derartige erhöhte Expression zu erhalten wurde der PVL1393-Baculovirus-Transfervektor von Invitrogen Corp. eingesetzt. Ein 2 kBp Eco R1-Fragment der TIGR-cDNA wurde in die Eco R1-Klonierungsstelle des PVL1393 eingeführt. PCR- und Sequenzierungsanalysen zeigten, daß das Insert in der richtigen Orientierung in den Polyhydrinpromotor des Vektors ligiert worden ist. Kotransfektion dieses Konstruktes und Wildtyp-Baculovirus-DNA in Sf9-Insektenzellen bildete hohe Titer des rekombinanten Proteins. Die Sf9-Insektenzellinie kann von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, US, mit der Hinterlegungs-Zugangsnummer ATCC CRL 1711 erhalten werden. Verfahren zum Verwenden solcher Vektoren und Zellen werden von Summers M.D. et al. (In: A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nr. 1555 (1987)) und Summers, M.D. (US-Patent Nr. 5,278,050) beschrieben.
Eine Überprüfung dieser Rekombinanten mittels PCR zeigte positive Signale für die exprimierten Gene. Eine SDS-Gelanalyse der Sf9-transfizierten zellulären Proteine zeigte, daß das neue Produkt ein Molekulargewicht von ungefähr 55 kDa aufwies und bis zu 90–95% des gebildeten Gesamtproteins ausmachte. Diese Werte korrelierten gut mit der Größe des HTN-Zellproteins, das durch Dexamethason (DEX) induziert wurde (Polansky, J.R. et al., Prog. Clin. Biol. Res. 312: 113–138, 1989) und dem kalkulierten MW der isolierten cDNA-Sequenz. Eine Aufreinigung mit einer G-150 (Pharmacia)-Säule und Edman-Abbau-Sequenzierung des Proteins bestätigte den offenen Leserahmen der TIGR-cDNA.
Untersuchungen des rekombinanten Proteins legten daher nahe, (1) daß das 55 kDa-Protein sowohl in Zellen als auch in dem Medium vorkam, (2) daß es einer Oligomerisierung, (3) einer Phosphorylierung, (4) einer Glykosylierung unterzogen wurde, (5) daß es für Metalloproteinasen anfällig ist, (6) daß es eine hochaffine Bindung an extrazelluläre Matrix und Zellen des humanen trabekulären Netzwerkes zeigte, (7) daß es mit der Zeit schrittweise Induzierungen sowohl in Zellkulturen aus auch Organkulturen zeigte, und (8) daß es hohe Expression in den HTN von glaukomatösen Patienten verglichen mit normalen Patienten zeigte. Bezeichnenderweise korrelierte die Induktion mit den topischen Wirkungen von Glukokortikoiden auf den Augeninnendruck in Patienten und unterschied sich von anderen bekannten Glukokortikoid-Induktionsmustern, die eine beinahe maximale Induzierung nach nur einem Tag Dexamethason-Behandlung zeigen.
BEISPIEL 3
STRUKTURELLE EIGENSCHAFTEN DES TIGR
Der TIGR-Klon wurde sequenziert und es zeigte sich, daß er ein cDNA-Molekül von 2,0 kBp (SEQ ID NO: 2) umfasst. Das Vollängen-Transkript war beinahe 2,5 kBp groß, wie durch Northern-Analysen bestimmt wurde. Die cDNA beinhaltete zwei ATG-Startstellen, die sowohl in HTN- als auch in Sf9-Zellen zwei Proteine von 55 kDa bildeten. Das größere Protein besaß 297 Aminosäuren und wird durch den offenen Leserahmen des TIGR (SEQ ID NO: 1) definiert. Das größere Protein geht auf die unprozessierte Form des TIGR zurück, das kleinere Protein gibt die proteolytische Spaltung des TIGR-Signalpeptids wieder. Die aminoterminale Sequenz dieser Proteine wurde durch Aminosäuresequenzierungsanalysen bestätigt. Die post-translationale Modifikation dieser Proteine ergab ebenfalls eine hochgradig glykosylierte TIGR-Form von ungefähr 66 kDa.
Strukturanalysen des Klons zeigten, daß er für ein neues extrazelluläres Protein von ungefähr 55 kD mit einer N-Glykosylierungsstelle bei den Resten 57–60 der SEQ ID NO: 1 und O-Glykosylierungsstellen bei den Resten 221–222, 222–223, 270–272, 305–306, 307–401, 453–457, 457–459 der SEQ ID NO: 1, Heparinsulfatbindung (Reste 110–113 und 146–150 der SEQ ID NO: 1) und Initiationsdomänen (Reste 223–224, 231–232 und 324-325 der SEQ ID NO: 1), sieben Konsensus-Leucin-Zipper-Einheiten, die zwei Stretche bilden, einer bei den Resten 85–92 und 92–99 der SEQ ID NO: 1 angeordnet, und fünf bei den Resten 121–128, 128–135, 135–142, 142–149 und 149–156 der SEQ ID NO: 1 angeordnet, und einer potentiellen GIP (Guanidylinositolphosphat)-Verknüpfung kodiert. Das rekombinante Protein von 55 kDa bildet in dem HTN-Medium Dimere oder Heteromere, wie durch Kreuzvernetzungsuntersuchungen gezeigt wurde, und es konnte mit sich selbst aggregieren. Das rekombinante Protein besaß eine spezifische Fähigkeit, Zellen des trabekulären Netzwerkes zu binden (4,3 × 10^–9 M und 2,3 × 10^–8 M), wie durch Skatchard-Analysen gezeigt wurde. Demgegenüber zeigte das Protein eine nicht sättigbares und niederaffines Bindungsvermögen für Fibroblasten. Es wurde gezeigt, daß das rekombinante Protein ein Substrat für die 72 kDa-Metalloproteinase ist.
Die anti-TIGR-Antikörper erkennen ein Protein von 66 kDa in DEX-behandeltem HTN-Medium. Es wurde gezeigt, daß dieses Protein eine hochgradig glykosylierte Form des TIGR-Proteins von 55 kDa ist. Diese Schlussfolgerung wurde durch die Beobachtung gestützt, daß eine Expression, die in Gegenwart von Tunicarnycin durchgeführt wurde, die Erzeugung von 66 kDa zu 55 kDa verschob. Die glykosylierte TIGR-Form von 66 kDa scheint ein Hyaluronatbindeprotein zu sein, da gefunden wurde, daß sie in der Lage ist, an Hyaluronsäurekügelchen zu binden. Derartige Bindeproteine werden durch ihre Fähigkeit definiert, an solche Kügelchen zu binden, und von solchen Kügelchen im Beisein von 4 M Guanidin nach Waschungen mit 0,15 und 1,5 M NaCl eluiert zu werden.
SEQUENZLISTE

Claims

Nukleinsäuremolekül, welches ein Fragment von 15 bis 250 Nukleotiden eines Polynukleotids mit der Sequenz der SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 umfaßt.
Nukleinsäuremolekül, welches das Komplement eines Moleküls gemäß Anspruch 1 umfaßt.
Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Nukleinsäuremolekül 250 Nukleotide umfaßt.
Gereinigtes TIGR-Protein, welches die Sequenz der SEQ ID NO: 1 aufweist und durch eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 kodiert wird.
Protein, das ein Polypeptid mit der Sequenz der SEQ ID NO: 1 umfaßt, welche durch eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 kodiert wird.
Anti-TIGR Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment davon oder Einzelketten Antigen-bindendes Molekül oder Antigenbindendes Fragment davon, das in der Lage ist, spezifisch an ein gereinigtes TIGR-Protein zu binden, das die Sequenz der SEQ ID NO: 1 aufweist.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment davon oder Einzelketten Antigen-bindendes Molekül oder Fragment davon gemäß Anspruch 5, das nachweisbar markiert ist.
Verfahren zur Diagnose eines Glaukoms, Schritte umfassend bei denen man: ein Marker-Nukleinsäuremolekül, das ein TIGR Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 umfaßt, und ein komplementäres Nukleinsäuremolekül, das von einer Zelle oder einer Körperflüssigkeit eines Patienten erhalten wurde, unter Bedingungen inkubiert, die eine Nukleinsäurehybridisierung ermöglichen, wobei die Nukleinsäurehybridisierung zwischen dem Marker-Nukleinsäuremolekül und dem komplementären Nukleinsäuremolekül, das von dem Patienten erhalten wurde, den Nachweis eines Polymorphismus ermöglicht, dessen Gegenwart auf eine Mutation hinweist, welche die Sekretion eines TIGR-Proteins gemäß einem der Ansprüche 3–5 in dem Patienten beeinflußt; die Hybridisierung zwischen dem für TIGR kodierenden Marker-Nukleinsäuremolekül und dem komplementären Nukleinsäuremolekül, das von dem Patienten erhalten wurde, ermöglicht; und die Gegenwart des Polymorphismus nachweist, wobei der Nachweis des Polymorphismus eine Diagnose auf Glaukom umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem die Mutation, welche die Sekretion des TIGR-Proteins beeinflußt, die Menge des TIGR-Proteins beeinflußt.
Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem die Mutation, welche die Sekretion des TIGR-Proteins beeinflußt, das Muster der TIGR-Proteinexpression beeinflußt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8–10, bei dem die Körperflüssigkeit aus der Gruppe bestehend aus Glaukom-Zellextrakt, Flüssigkeit von der vorderen Augenkammer, Blut, Lymphe und Serum umfaßt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8–11, bei dem das komplementäre Nukleinsäuremolekül, das von einer Zelle oder Körperflüssigkeit eines Patienten erhalten wurde, von mit Steroiden behandelten Zellen exprimiert wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 12, bei dem die Körperflüssigkeit Tränenflüssigkeit und die Zellen HTN-Zellen sind.
Verfahren gemäß Anspruch 9, bei dem das komplementäre Nukleinsäuremolekül, das von einer Zelle oder einer Körperflüssigkeit des Patienten erhalten wurde, mittels eines Nukleinsäureamplifikationsverfahrens vermehrt wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem das Nukleinsäureamplifikationsverfahren die Polymerase-Kettenreaktion ist.
Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem das Nukleinsäureamplifikationsverfahren eine Ligase-Kettenreaktion ist.
Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem das Nukleinsäureamplifikationsverfahren einen Oligonukleotid-Ligationsassay umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem das Nukleinsäureamplifikationsverfahren die Verwendung allel-spezifische Oligomere umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem das Nukleinsäureamplifikationsverfahren die Verwendung der branched DNA Technologie umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem das Nukleinsäureamplifikationsverfahren eine auf Transkription basierende Vermehrung ist.
Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem das Nukleinsäureamplifikationsverfahren eine isothermische Amplifikation ist.