DE1029781B

DE1029781B - Verfahren zur Herstellung organischer Saeuren durch aerobe Gaerung

Info

Publication number: DE1029781B
Application number: DEU3939A
Authority: DE
Inventors: Rene Niquet; Paul Vergnaud
Original assignee: Usines de Melle SA
Current assignee: Usines de Melle SA
Priority date: 1955-07-11
Filing date: 1956-06-07
Publication date: 1958-05-14
Also published as: US2883329A; GB797390A

Description

DEUTSCHES

Verschiedene organische Säuren können durch aerobe Gärung von Zuckern mit Hilfe von Schimmelpilzen hergestellt werden. Zwecks Vereinfachung bezieht sich die folgende Darlegung vor allem auf die Zitronensäuregärung. .

Die Herstellung von Zitronensäure durch Schimmelpilze erfordert als wesentliche Bedingungen:

1. die Verwendung eines geeigneten Stammes,

2. einen verhältnismäßig niedrigen pjj-Wert, der im allgemeinen bei 3 oder darunter liegt,

3. einen ausreichenden. Sauerstoffzutritt zum Schimmelpilz,

4. die Beschränkung der Mengen gewisser Nährstoffe, insbesondere Phosphor und als Kation in der Flüssigkeit vorliegendes Eisen. ¹^

Unter »Nährstoffen« sollen hier alle nicht giftigen Substanzen verstanden werden, die die biochemische Aktivität des Organismus beeinflussen,. Das sind insbesondere assimilierbarer Stickstoff, Phosphor, Magnesium und Kalium, Wuchsstoffe, Schwermetalle, wie Zink, Eisen, Kupfer, Vitamine usw., Substanzen, die die Bildung des Myzels oder die positive oder negative Katalyse der biochemischen. Reaktionen beeinflussen.

Es ist bekannt, daß gewisse dieser Elemente, die »Spurenelemente« genannt werden, in Mengen, die erheblich unter 1 mg pro Liter Flüssigkeit liegen, wirksam sein können.

Bei der Gärung können zwei aufeinanderfolgende Stufen unterschieden werden. Im Verlauf einer ersten Stufe entwickelt sich das Myzel auf Kosten eines Teils des Zuckers, wobei verhältnismäßig wenig Säuren gebildet werden. Im Verlauf der zweiten Stufe geht diese Entwicklung mehr oder weniger schnell weiter, aber zugleich wird ein sehr erheblicher Teil des restlichen Zuckers in Säuren, umgewandelt. Wenn der p£-Wert in, der Nähe des Neutralitätspunktes gehalten wird, bildet sich vor allem Gluconsäure, bei p_H-Werten zwischen 6,0 und 3,0 bildet sich Vorzugsweise Oxalsäure.

Die Menge des entwickelten Myzels hängt hauptsächlich von dem Gehalt der Flüssigkeit an aufbauenden Nährstoffen und von dem p_H ab; daher kann nach Shu und Johnson (Ind. Eng. Chem., 1948, S. 1202) unabhängig voneinander entweder die Menge des kationischen Eisens oder die Menge des assimilierbaren Phosphors geändert werden, um das Wachstum zu beschränken. Wenn diese Menge zu gering ist, ist die Gärgeschwindigkeit unzureichend; wenn sie zu groß ist, wird verhältnismäßig viel Zucker für die Myzelbildung verbraucht, und dieser Zucker kann nicht in Zitronensäure übergeführt werden. Außerdem wird durch eine zu beträchtliche Verfahren zur Herstellung
organischer Säuren durch aerobe Gärung

Anmelder:

Les Us ines de Meile S. A.,

Saint-Leger-les-Melle, Deux-Sevres

(Frankreich)

Vertreter: E. Maemecke, Berlin-Lichterfelde West,

und Dr. W. Kühl, Hamburg 36, Esplanade 36 a,

Patentanwälte

Beanspruchte Priorität:
Frankreich vom 11. Juli 1965

Paul Vergnaud und Rene Niquet,
Meile, Deux-Sevres (Frankreich),
sind als Erfinder genannt worden

Menge an Myzel bei der submersen Gärung die Gärflüssigkeit viskos und der Zutritt von Sauerstoff zum Organismus sehr erschwert, wenn nicht Rührvorrichtungen verwendet werden, die wegen ihrer Betriebskosten sehr nachteilig sind. Die angegebenen Mengen an Myzel, bezogen auf das trockene Produkt, liegen im allgemeinen zwischen 5 und 25 g pro Liter Flüssigkeit.

Die Mengen an assimilierbarem Phosphor, die als Monokaliumphosphat angegeben werden, liegen, im allgemeinen zwischen 0,02 und 2,5 g pro Liter Flüssigkeit. Diejenigen an kationischem Eisen sind im allgemeinen geringer als 4 oder sogar als 2 mg pro Liter Flüssigkeit.

Nach Shu und Johnson (loc. cit.) liegt für eine gleiche an aufbauenden Nährstoffen reiche Flüssigkeit die Menge des gebildeten Myzels zwischen 18 g pro Liter für ein anfängliches p_H von 4,9 und 7 g pro Liter für ein anfängliches p_H von 1,7.

Es ist vorgeschlagen worden (USA.-Patentschrift 2 353 771), das Wachstum in einer ersten assimilierbaren Phosphor enthaltenden Flüssigkeit zu bewirken, das Myzel abzutrennen, zu waschen und es dann in eine zweite Flüssigkeit, die sogenannte »Gärflüssigkeit«, zu bringen, die keinen assimilierbaren Phosphor enthält. In derselben Patentschrift ist ausgeführt,

809 510/143

daß dieselbe Flüssigkeit für beide Phasen verwendet werden kann, wenn die Menge an assimilierbarem Phosphor so gering ist, daß sie bei der Wachstumsphase ganz verbraucht wird.

In verschiedenen Patentschriften wird diese zweite Arbeitsweise vorgeschlagen: Die angegebenen Mengen an Monokaliumphosphat liegen in diesem Fall im allgemeinen unter 0,150 g pro Liter Flüssigkeit.

Die Flüssigkeiten werden im allgemeinen zuvor angesäuert, aber eine Wachstumsflüssigkeit mit anfangs niedrigem p_H ist nur geeignet, wenn sie reich an Nährstoffen ist.

Im allgemeinen muß ein verhältnismäßig hoher Verbrauch an Zucker für die Bildung des Myzels zugelassen werden. Nur nach dieser Bildung kann man J-5 erwarten, daß der Zucker in Zitronensäure umgewandelt wird. Die Verfahren, mit zwei aufeinanderfolgenden Stufen unter Abtrennung des Myzels können bei einer Gärflüssigkeit, die verhältnismäßig arm an Zucker ist, angewendet werden, da das Myzel ao während einer ersten Phase gebildet wird, aber die Gesamtausbeute ist dann gering. Außerdem sind diese Verfahren sehr schwierig durchzuführen; denn das Myzel muß aseptisch abgetrennt und gewaschen werden. Wenn in einer einzigen Phase gearbeitet werden soll, muß eine Flüssigkeit verwendet werden, die verhältnismäßig reich an Zucker ist, um eine annehmbare Ausbeute zu erhalten.

Wenn es verhältnismäßig leicht ist, diese Bedingungen bei Verwendung von Lösungen von reinem Handelszucker zu verwirklichen, so· ist dies verständlicherweise nicht der Fall, wenn Melasselösungen verwendet werden. In der Tat enthalten die Melassen die meisten Nährstoffe in Mengen, die weit über den oben angegebenen liegen.

Außerdem ist das Puffervermögen der Melasselösungen immer verhältnismäßig hoch; nach dem, was oben über die hohen Zuckergehalte der Lösungen und den Einfluß des p_H gesagt wurde, kann ein für die Bildung von Zitronensäure geeignetes p_H nur nach einem beträchtlichen Zuckerverbrauch, erhalten werden, sei es daß dieser von dem Myzel verbraucht wird, sei es daß dieser in andere Säuren als Zitronensäure umgesetzt wird.

Häufig wird eine vorherige Reinigung der Melassen durch Hindurchleiten durch Ionenaustauscher vorgeschlagen; eine solche Behandlung ist, wenn sie wirksam sein soll, empfindlich und lästig.

Es ist auch eine vorhergehende Behandlung der Melasselösungen mit Kalk vorgeschlagen worden, um die Phosphorsäure zu entfernen.

Schließlich werden im allgemeinen die Schwermetalle, insbesondere kationisches Eisen, zu passenden Mengen gebracht durch eine vorhergehende Behandlung der Melasselösungen mit einem löslichen Ferrocyanid oder irgendeinem anderen Reagens, das einen Niederschlag oder Komplex bildet, wobei der Niederschlag vor der Gärung durch Filtration abgetrennt werden kann oder nicht. Es kann dann, erforderlich sein, gewisse Aufbauelemente, wie kationisches Zink, wieder zuzufügen. Die Mengen der erforderlichen Reagenzien werden durch vorhergehende Versuche bestimmt.

Durch alle diese Verfahren wird die Fähigkeit der Melassen zur Zitronensäuregärung verbessert, aber dadurch werden nicht alle bei der Gärung gewisser Melassen auftretenden Schwierigkeiten beseitigt.

Die Schwierigkeit, mit gewissen Melassen zu annehmbaren Ergebnissen zu kommen, ist in den Arbeiten von Martins und W at er s (Ind. Eng. Chem., 1952, S. 2229) dargelegt. Diese Verfasser erhalten mit Melassen der gleichen geographischen Herkunft, aber aus verschiedenen Jahren durch die gleiche Behandlung (Ferrocyanid in vorher bestimmter Menge) und das gleiche Gärverfahren Ausbeuten an Zitronensäure von 9,9 bis 70,7% des verwendeten Zuckers.

Es wurde gefunden, daß diese Schwierigkeiten immer sehr stark verringert werden, wenn ganz zuerst das Wachstum des Myzels in einer Lösung erfolgt, die verhältnismäßig arm an Melasse ist (erste Stufe), daß das so erhaltene »Myzelsubstrat« dann ohne Abtrennung des Myzels fortlaufend im passenden Augenblick und auf jeden Fall dann, wenn, ihr p_H bei 3,0 oder darunter liegt, mit verhältnismäßig reichlichen, ungefähr 15 bis 30% Zucker enthaltenden Melasselösungen versetzt wird, so daß das p_H bei 3,0 oder darunter bleibt (zweite Stufe). Dieser Zusatz kann kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen. Es ist dann leicht, bei der ersten Stufe die Menge der verschiedenen Nährstoffe einzustellen, indem unabhängig voneinander der Gehalt des Myzelsubstrates an Melasse und die Menge der zugeführten Nährstoffe geändert wird. Außerdem sinkt das p_H der Lösung infolge der Bildung verschiedener Säuren schnell, da das Puffervermögen der schwachen Lösung verhältnismäßig gering ist. Wenn dann das Myzel·- substrat mit an Melasse reichen Lösungen versetzt wird, wird der zugeführte Zucker mit hoher Ausbeute in Zitronensäure übergeführt. In der Tat ist das nied^ri&^e Ph bei dieser Umsetzung günstig. Außerdem wird festgestellt, daß sich bei einem p_H in der Nähe von 3,0 oder darunter der Einfluß eines Überschusses an Nährstoffen auf die Ausbeute bei der Umwandlung von Zucker in. Zitronensäure viel weniger bemerkbar macht. Die Entwicklung des Myzels wird gehemmt, und es werden die Nachteile mechanischer Vorrichtungen, die bei einem Überschuß des Myzels , erforderlich sind, vermieden.

Eine gewisse Entwicklung des Myzels im Verlauf der zweiten Stufe wird nicht vermieden, und dadurch wird die mittlere Melassekonzentration, die am Schluß der Gärung erhalten werden kann, begrenzt. Die Grenze hängt also bei einem Myzelsubstrat gegebener Zusammensetzung hauptsächlich von dem Gehalt der zugeführten Melasse an Nährstoffen ab, aber bei einer Melasse gegebener Zusammensetzung und einer gegebenen mittleren Endkonzentration der Melasse sind die Ausbeuten an Zitronensäure bei dem erfindungsgemäßen Verfahren immer viel höher, als wenn die Gärung in einer Flüssigkeit ohne Zusatz ausgeführt wird.

Die beiden unten beschriebenen Versuche beweisen diese Tatsache.

Es wird eine Melasselösung aus Zuckerrüben mit

390 g/l, die nahe beim Aufkochen mit 2,8 g/l Kalium=

ferrocyanid versetzt und dann filtriert wird, hergestellt. Diese Mutterlösung wird verdünnt, wenn es für die unten angegebenen Versuche erforderlich ist.

Erster Versuch

9,6 1 Lösung mit 180 g/l Melasse mit 9% Zucker, die mit Kaliumferrocyanid behandelt wurden, werden proLiter mit 0, 030 g Kaliummonophosphat und 0,3 g Magnesiumsulfatheptahydrat versetzt, das Ganze wird sterilisiert und in einen mit mechanischer Rührvorrichtung und Belüftungsaufsatz versehenen Bottich gebracht. Alle mit der Flüssigkeit in Berührung": kommenden Materialteile dürfen von den bei den* %,, Gärung gebildeten Säuren nicht angegriffen werden.:'«.

Es wird mit Sporen von Aspergillus niger geimpft, die sich von einer auf Gelose gewachsenen Kultur eines guten an Zitronensäure ergiebigen Stamms ableiten, und es wird mit 10001/Std. steriler Luft belüftet, die bei einer Temperatur von 32° C mit Feuchtigkeit gesättigt ist, wobei das Rühren fortgesetzt und die Temperatur bei 32° C gehalten wird. Das p_H fällt von anfangs 6,05 auf 3,05 am vierten Tag. In diesem Zeitpunkt werden 31,5 g freie Säure, berechnet als Zitronensäuremonohydrat, pro Liter Flüssigkeit titriert, aber die besondere Bestimmung dieser Säure ergibt zu vernachlässigende Mengen. Am sechsten Tag ist kein Zucker mehr vorhanden, und der Säuregehalt ist konstant bei 46,2 g/l. Die besondere Bestimmung der Zitronensäure ergibt 13,1 g/l, das sind 28% der Gesamtsäure. Es wurden also 7,3 kg Zitronensäure aus 100 kg Melasse gebildet, was einer Ausbeute von 14,6%, bezogen auf den verwendeten Zucker, entspricht.

20 Zweiter Versuch

In die gleiche Vorrichtung werden 6 1 einer ersten sterilisierten Lösung, die pro Liter 50 g mit Kaliutnferrocyanid behandelter Melasse mit 2,5% Zucker, 0,050 g Monokaliumphosphat und 0,5 g Magnesiumsulfatheptahydrat enthält, gebracht. Es wird mit der gleichen Menge an Sporen, die aus demselben Röhrchen stammen, geimpft, mit derselben Menge steriler Luft, die bei der Temperatur von 32° C mit Feuchtigkeit gesättigt ist, in derselben Weise wie bei dem ersten Versuch belüftet, wobei 32° C aufrechterhalten werden.

Nach 36 Stunden, wenn die freie Säure 9,1 g/l, angegeben als Zitronensäuremonohydrat, und das pg gleich 2,9 ist, wird eine sterilisierte Lösung, die 390 g/l mit Kaliumferrocyanid ohne Nährsalze behandelte Melasse mit 19,5% Zucker enthält, zugegeben, wobei die Zugabe mit solcher Geschwindigkeit erfolgt, daß das p_H zwischen 2,5 und 2,9 bleibt. So werden 3,6 1 Lösung in 4 Tagen zugegeben. Am neunten Tag ist kein Zucker mehr vorhanden, die Acidität ist konstant. Es werden 78 g/l Säure, angegeben als Zitronensäuremonohydrat, titriert, und die besondere Bestimmung dieser Säure ergibt 69,2 g, das sind 88,5% der Gesamtsäure. Es wurden also 38,9 kg Säure aus 100 kg Melasse oder 77,7 kg aus lOO kg verwendeten Zuckers gebildet.

Dieser zweite Versuch ist ein Beispiel dafür, wie das Verfahren nach der Erfindung am einfachsten ausgeführt werden kann, es wird aber darauf hingewiesen, daß die dem Myzelisubstrat und den Zusatzlösungen zugesetzten Nährstoffe geändert oder fortfallen können, daß die Melassen jeder Behandlung zur Verbesserung (mit Ionenaustauschern, Kalk, Eisen(II)-cyanid oder jedes andere Reagens, das einen Niederschlag oder Komplex bildet, wie Phytat) unterworfen werden können und daß zwei oder mehr als zwei verschiedene oder verschieden behandelte Melassen für die Herstellung des Myzelsubstrats und der Zusatzlösungen verwendet werden können.

Ebenso kann ein anderer Stamm von Schimmelpilzen als Aspergillus niger verwendet werden., beispielsweise ein Stamm von ausgewähltem Aspergillus Wentiii. Schließlich können Rohrmelassen, die als »black strap« oder »high test« bezeichnet werden, an Stelle von Runkelrübenmelassen verwendet werden.

Nach einem wesentlichen Merkmal der Erfindung wird die Wachstums- oder Entwicklungsstufe in einer Flüssigkeit mit geringem »Pufferindex« ausgeführt. Dieser »Pufferindex« wird hier definiert als die Menge in g reiner Chlorwasserstoffsäure (HCl), die erforderlich ist, um das p_H eines Liters Flüssigkeit von 6,0 auf 3,0 zu erniedrigen. Bei dem zweiten oben angeführten Versuch ist dieser Pufferindeix gleich 1,53. Er kann zwischen 0,07 und 6,0 schwanken, soll aber vorzugsweise unter 3,0 liegen.

Es kann also im Rahmen der Erfindung das Myzelsubstrat mit einem Gemisch von Melasse und gereinigtem Zucker des Handels hergestellt werden, wodurch der Pufferindex erniedrigt wird, oder sogar aus Zucker allein.

Es kann auch im Rahmen, der Erfindung bei der ersten Stufe Säure zugesetzt werden, wenn sie den biochemischen Vorgang nicht stört. Die Zitronensäure ist für diesen Zweck besonders geeignet, und im allgemeinen verfügt man in den, Zitronensäurefabriken über nicht kristallisierbare Mutterlösungen, die mit Vorteil in dieser Weise verwendet werden.

Wenn am Ende der zweiten Stufe die gewünschte mittlere Konzentration an Melasse erreicht ist und wenn die Gärung beendet oder nahezu beendet ist, kann ein Teil des vergorenen Substrates abgezogen und in einer dritten Gärungsstufe durch ein gleiches Volumen von Melasselösung mit derselben mittleren Konzentration ersetzt werden, wobei stets ein p_H bei 3,0 oder darunter aufrechterhalten wird. Diese Verfahrensstufen können kontinuierlich oder diskontinuierlich während einer Zeit, die von der Natur der Melasse abhängt, durchgeführt werden. Diese Zeit hängt wesentlich von dem Gehalt der Melasse an Nährstoffen und von der Rührwirkung ab. Tatsächlich wird durch diesen Gehalt die Menge des erhaltenen Myzels bestimmt, wenn der Gleichgewichtszustand erreicht ist; bei gewissen Melassen, die arm an Nährstoffen sind, kann es erforderlich sein, diese zuzusetzen.

Umgekehrt kann es vorteilhaft sein, bei der dritten Stufe ein Gemisch von Melasse und gereinigtem Handelszucker zuzusetzen.

Bei dieser dritten Gärstufe wird der ganze zugesetzte Zucker mit hoher Ausbeute in Zitronensäure übergeführt, wodurch in beträchtlichem Maße die mittlere Ausbeute der drei Stufen verbessert und eine bessere Ausnutzung des Gärungsmaterials ermöglicht wird.

Das Verfahren kann in gleicher Weise zur Herstellung anderer organischer Säuren, deren Bildung vorzugsweise in einer Flüssigkeit mit verhältnismäßig niedrigem p_H erfolgt, insbesondere Itakonsäure, verwendet werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung organischer Säuren, insbesondere Zitronensäure, ausgehend von Melasse, durch aerobe Gärung bei einem p_H nicht über 3,O¹ mittels Schimmelpilzen, dadurch gekennzeichnet, daß Schimmelpilze in einer Zucker enthaltenden Flüssigkeit gezüchtet werden, die einen Pufferindex unter 6,0 hat und die gegebenenfalls Nährsalze enthält, und daß dann in einer zweiten Stufe, nachdem das p_H der Flüssigkeit infolge der mikrobiellen Säurebildung auf etwa 3,0 oder darunter gesunken ist, ohne Abtrennung des gebildeten Myzels zu dem so gebildeten Myzelsubstrat eine Melasse enthaltende Flüssigkeit, die einen Zuckergehalt von ungefähr 15 bis 30% hat, in solchem Maße zugesetzt wird, daß das p_H in der Nähe von 3,0 oder darunter bleibt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Melasse enthaltenden Flüssigkeit noch Zucker und Nährsalze zugesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Wachstum in einer sterilisierten Flüssigkeit erfolgt, bei der der Zucker aus Melasse stammt und/oder aus gereinigtem Zucker des Handels besteht, wobei der Pufferindex dieser Flüssigkeit zwischen 0,07 und 3,0 gehalten wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Flüssigkeit, in der das Wachstum stattfindet, eine den biochemischen Vorgang nicht störende Säure, insbesondere Zitronensäure, zugesetzt wird, vorzugsweise in

Form nicht kristallisierbarer Mutterlösungen, dfe aus· einer Zitronensäurefabrik stammen.

5. Verfahren, nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß am oder nahe am Ende der Gärung ein Teil der Gärflüssigkeit abgezogen und durch ein gleiches Volumen verdünnter Melasse, dem möglicherweise Zucker zugesetzt ist, ergänzt wird, wobei die Zuführung in der Weise erfolgt, daß das p_H bei 3,0 oder darunter bleibt.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Referat im Chemischen Zentralblatt 1950, I, S. 808, über die französische Patentschrift Nr. 942 811 und 1954, S. 5418", über die kanadische Patentschrift Nr. 495 249.