DE102004021904B4

DE102004021904B4 - Verfahren und Vorrichtung zur Erzeugung einer Analyseanordnung mit diskreten, separaten Messbereichen zur biologischen, biochemischen oder chemischen Analyse

Info

Publication number: DE102004021904B4
Application number: DE200410021904
Authority: DE
Inventors: Karin Dr. 82327 Schütze; Raimund 82327 Schütze; Yilmaz Dr. 86159 Niyaz; Markus Dr. Ehrat; Michael Dr. 72147 Pawlak; Peter Dr. Oroszlan
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH; Carl Zeiss MicroImaging GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2004-05-04
Filing date: 2004-05-04
Publication date: 2011-08-18
Anticipated expiration: 2024-05-05
Also published as: DE102004021904A1; WO2005107949A1

Abstract

Verfahren zur Erzeugung einer Analyseanordnung (3) mit einer Vielzahl von diskreten, separaten Messbereichen (16), welche zum Nachweis mindestens eines Analyten in einem biologischen, biochemischen oder chemischen Nachweisverfahren in mit den Messbereichen (16) in Kontakt zu bringenden Proben ausgestaltet ist, umfassend die Schritte
a) Bereitstellen mindestens eines Trägers (4),
b) Bereitstellen eines Vorrats einer Reagenzlösung, und
c) berührungslose Übertragung mindestens einer bestimmten Menge der Reagenzlösung auf den Träger zur Erzeugung mindestens eines der Vielzahl von diskreten, separaten Messbereichen (16) oder auf einen vorher ausgewiesenen Bereich des Trägers (4) für den mindestens einen diskreten, separaten Messbereich (16) oder auf einen zuvor auf dem Träger (4) erzeugten diskreten Messbereich (16) durch Bestrahlen des Vorrats der Reagenzlösung mit einem elektromagnetischen Energiestrahl.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Erzeugung einer Analyseanordnung mit einer Vielzahl von diskreten und separaten Messbereichen, welche geeignet und ausgestaltet sind, um einen Nachweis einer oder mehrerer Verbindungen als Analyten in einer oder mehreren Proben, nach deren Aufbringung in besagten Messbereichen oder Kontaktierung mit in besagten Messbereichen zuvor immobilisierten biologischen, biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen, in einem biologischen, biochemischen oder chemischen (sowie gegebenenfalls auch physikalischen) Nachweisverfahren zu ermöglichen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein derartiges in Form eines ”Spotting”-Verfahrens ausgestaltetes Verfahren, bei dem mit Hilfe einer ”Spotting”-Technologie die zu analysierenden Proben auf die einzelnen Messbereiche der Analyseanordnung oder zur Erzeugung der einzelnen Messbereiche auf die Analysenanordnung aufgebracht werden, sowie eine entsprechende Vorrichtung, welche auch als ”Spotter” bezeichnet werden kann.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen diskrete, separate Messbereiche durch zwei- oder dreidimensionale Regionen auf einem Träger definiert werden, die dort immobilisierte Bindungspartner, zum Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer oder mehreren Proben in einem Bindungs- oder Affinitätsassay, einnehmen. Die diskreten, separaten Messbereiche können, aber müssen nicht vor der Aufbringung der Bindungspartner auf besagtem Träger ausgewiesen sein, beispielsweise in Form einer Unterteilung des Trägers in der Geometrie der Messbereiche entsprechende diskrete, separate Bereiche. Bevorzugt werden die diskreten, separaten Messbereiche mit dem Schritt der Aufbringung der zu immobilisierenden Bindungspartner auf dem Träger erzeugt.
Zueinander komplementäre Bindungspartner sind dadurch charakterisiert, dass zwischen ihnen eine gewisse Affinität besteht. Bindungen zwischen komplementären Bindungspartnern (wie beispielsweise Analyten und ihren biologischen, biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen) können reversibel oder irreversibel sein.
Unterschiedliche derartige Messbereiche können beispielsweise biologische, biochemische oder synthetische Erkennungselemente einer einzigen Art oder Form oder mehrerer unterschiedlicher Arten oder Formen als immobilisierte Bindungspartner enthalten, mit denen dann in einem nachfolgenden Schritt des Nachweisverfahrens eine oder mehrere auf die entsprechenden Analyten (welche spezifisch von den entsprechenden Erkennungselementen erkannt und gebunden werden) zu untersuchende Proben in Kontakt gebracht werden. Ein- oder zweidimensionale Anordnungen einer Vielzahl solcher Arrays von Messbereichen dieser ersten Form werden auch als ”Capture”-Arrays bezeichnet. Die in den Messbereichen immobilisierten biologischen, biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente liegen dabei vorzugsweise in einer angereicherten, aufgereinigten Form, d. h. in einer im Vergleich zu ihrem ursprünglichen Vorkommen in ihrem Erzeugungsmedium erhöhten Konzentration, vor.
Die diskreten, separaten Messbereiche können auch durch Aufbringung der auf ihre Inhaltsstoffe zu untersuchenden Proben selbst, ohne oder nach Durchführung eines oder mehrerer Aufreinigungsschritte wie beispielsweise Fraktionierung des zugrunde liegenden Probenmaterials, erzeugt sein. In diesem Falle sind in den aufgebrachten Proben enthaltene Analyten als immobilisierte Bindungspartner anzusehen. Das Probenmaterial kann beispielsweise ganze oder aufgeschlossene Zellen, Zellbestandteile, Gewebeausschnitte, andere biologische Materialien oder chemische Materialien umfassen. Im Falle von Lysaten als aufgebrachte Proben werden ein- oder zweidimensionale Anordnungen derartiger Messbereiche dieser zweiten Form als ”Lysat”-Arrays bezeichnet, deren enthaltene Analyten dann typischerweise nach Kontaktierung mit dafür spezifischen biologischen, biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen in einem Schritt eines Assays mit so genannter ”invertierter Assay-Architektur” bestimmt werden.
Zur Erzeugung von Arrays der ersten und der zweiten Form sind eine Vielzahl von Verfahren und Vorrichtungen bekannt.
Zu den bekannten Aufbringungsverfahren zählen das so genannte „Ink Jet Spotting”, bei dem ein piezoelektrischer Effekt ähnlich wie bei der Funktionsweise eines Tintenstrahldruckers ausgenutzt wird, um die Proben auf einen Träger zur Erzeugung der gewünschten Messbereiche aufzubringen.
Darüber hinaus sind mechanische „Spotting”-Verfahren (beispielsweise mittels Feder, Stift oder Kapillare) bekannt, bei denen ein mechanischer Kontakt zwischen einem Flüssigkeitsvorratsgerät (z. B. Stiften oder Kapillaren), welches die auf dem Träger abzuscheidenden Flüssigkeiten mit darin enthaltenen, auf dem Träger zu immobilisierenden Verbindungen beinhaltet, und der Oberfläche des Trägers erfolgt. Derartige mechanische „Spotting”-Verfahren sind mit mehreren prinzipiellen Nachteilen behaftet. Im Falle von festen Trägern mit druck- oder kratzempfindlichen Oberflächen, bei denen eine geringe Oberflächenrauhigkeit und Freiheit der Oberfläche von mechanischen Beschädigungen von entscheidender Bedeutung für die Qualität und Durchführbarkeit eines damit durchzuführenden Nachweisverfahrens ist (wie z. B. bei optischen Wellenleitern, Glas- oder Kunststoffplättchen oder Membranen als Trägern), besteht eine hohe Gefahr der Qualitätsminderung. Des Weiteren besteht die Gefahr einer kontinuierlichen Veränderung der mit der Trägeroberfläche in Kontakt gebrachten Anordnungen (z. B. Kapillarspitzen oder Stiftspitzen), ähnlich einem Abnutzungsprozess, was zu einer entsprechenden kontinuierlichen Änderung der Geometrie der Messbereiche („Spots”) und der darin aufgebrachten Flüssigkeitsmengen führen kann. Diesem Trend kann versuchsweise durch kontinuierliche Anpassung der Aufbringungsbedingungen auf die Oberfläche des Trägers begegnet werden (z. B. durch Anpassung der Andruckkraft), was aber einen erheblichen zusätzlichen Aufwand bedeutet.
Diese Risiken in Folge eines mechanischen Kontakts können zumindest teilweise vermieden werden, wenn die Abgabe eines Flüssigkeitsvolumens aus einer Kapillare durch Brechen des Meniskus einer darin enthaltenen Flüssigkeit beim Kontakt zwischen der Kapillare und der Trägeroberfläche erfolgt. Ein entsprechendes Verfahren zur Herstellung einer Mikroanordnung von Analyt-spezifischen Testbereichen auf einem festen Träger ist beispielsweise in der EP 0 804 731 B1 beschrieben. Gemäß dieser Druckschrift wird vorgeschlagen, die Kapillare mit der darin enthaltenen Flüssigkeit an einer definierten Stelle auf dem festen Träger mit einer derartigen Kraft aufzudrücken, dass der Meniskus im Kapillarkanal gebrochen und ein ausgewähltes Volumen der im Kapillarkanal befindlichen Flüssigkeit (z. B. einer Reagenzlösung) auf den festen Träger aufgetragen wird. Diese Vorgehensweise erfordert jedoch nachteilig eine äußerst genaue Einstellung des Abstands zwischen dem festen Träger und der Kapillare.
Dem zuvor beschriebenen Verfahren gegenüber von Vorteil sind tröpfchenweise Aufbringungsverfahren, bei denen Tröpfchen der aufzubringenden Flüssigkeit einen gewissen freien Weg durch die Luft zurücklegen und kein Kontakt zwischen der Trägeroberfläche und dem die Flüssigkeit vor dem Depositionsschritt enthaltenden Behälter (oder dessen Enden) erforderlich ist. Ein Beispiel hierfür ist in US-Patent Nr. 5,763,170 beschrieben, wobei zur Ausbildung eines Arrays von unterschiedlichen biologischen Molekülen auf einer Trägeroberfläche vorgeschlagen wird, in einer Gasumgebung einzelne Tröpfchen einer eine Vielzahl von unterschiedlichen biologischen Molekülen beinhaltenden Flüssigkeit auszubilden, wobei jedes Flüssigkeitströpfchen im Durchschnitt mindestens ein biologisches Molekül aufweist, und wobei die Flüssigkeitströpfchen zur Erzeugung der gewünschten Messbereiche in Form eines Arrays auf einem festen Träger unter sterilen Bedingungen aufgebracht werden.
Ein entscheidendes Problem aller zuvor beschriebenen Aufbringungsverfahren ist, dass diese zwar geeignet sind, diskrete Messbereiche relativ geringen Durchmessers (beispielsweise von weniger als 100 μm, minimal gegenwärtig ca. 80 μm) unter Aufbringung einzelner, relativ kleiner Flüssigkeitsmengen (beispielsweise in der Größenordnung von Pikolitern bis Nanolitern Volumen pro Messbereich) zu erzeugen, wobei jedoch alle hierzu benutzten Vorrichtungen relativ komplexe Anordnungen von Führungsleitungen für die aufzubringenden Flüssigkeiten erfordern und die erforderlichen Vorratsvolumina der jeweils aufzubringenden Flüssigkeiten relativ groß sind (typischerweise in der Größenordnung von Mikrolitern bis Millilitern). Bei den aus dem Stand der Technik bekannten Vorrichtungen und Verfahren können zusätzlich nachteilig eine Vielzahl von Verlusten an in den zu übertragenden Flüssigkeitsmengen enthaltenen, einem analytischen Nachweis zu unterziehenden Stoffen sowie systembedingte Verfälschungen der nachfolgenden Analysenresultate auftreten: In den Vorratsgefäßen und Führungsleitungen kann es zum Substanzverlust durch Adsorption an deren Oberflächen kommen. Sofern unterschiedliche, in einer Probe enthaltene Stoffe in einem unterschiedlichen Maße adsorbiert werden, kann es auch, neben einer Verfälschung der zu bestimmenden enthaltenen absoluten Mengen zu einer Verfälschung der Konzentrationsverhältnisse unterschiedlicher Stoffe kommen. Im Falle der Entnahme der zu übertragenden Proben oder Reagenzienmengen aus kleinen Vorratsgefäßen kann es zu Trocknungsverlusten an Lösungsflüssigkeit mit dem nachteiligen Ergebnis einer falschen Bestimmung überhöhter Konzentrationen kommen. Zusätzlich ist typischerweise, im Falle von Zellen als zu übertragendem Probenmaterial, eine Lyse dieser Zellen erforderlich, was ebenfalls mit einem potenziellen Verlust an Zellmaterial verbunden ist. Diese Nachteile der herkömmlichen Anordnungen und Verfahren führen dazu, dass typischer Weise die Übertragungseffizienz auf einen Träger zur Erzeugung eines Arrays mit diskreten, separaten Messbereichen weniger als 1% beträgt.
Darüber hinaus sind die herkömmlichen Vorrichtungen und Verfahren mit einer Reihe weiterer systembedingter Beschränkungen und Nachteile behaftet: Ein Transfer von nicht gelöstem oder festem Material aus einem Probenmaterial ist typischerweise nicht möglich, sondern es können nur Flüssigkeiten bzw. darin gelöste Stoffe transferiert werden. Außerdem sind für den Transfer aus dem Vorrat (an Reagenzlösung oder Probenmaterial) relativ große Vorratsmengen (ausgedrückt in Volumina in der Größenordnung von Mikrolitern bis Millilitern) notwendig, so dass keine Informationen über die unterschiedlichen Inhaltsstoffe und deren (Konzentrations-)Verhältnis beispielsweise in einzelnen Zellen gewonnen werden können. Mit den herkömmlichen Aufbringungsverfahren erzeugte Arrays von diskreten, separaten Messbereichen können daher typischerweise nur eine über eine relativ große Ursprungsmenge, beispielsweise über eine Vielzahl von Zellen, gemittelte Information enthalten und keine Information über die Zusammensetzung individueller Zellen oder aus wenigen Zellen bestehender Bereiche eines Zellverbands (z. B. Gewebes) liefern. Damit kann die hohe Nachweisempfindlichkeit neuartiger Analyseanordnungen, wie sie beispielsweise durch Mikro-Arrays, insbesondere auf planaren Dünnschichtwellenleitern als Trägern, gegeben ist, in keiner adäquaten Weise ausgenutzt werden, sondern es geht ein Großteil der ortsaufgelösten, ursprungsbezogenen Information des zu untersuchenden Materials, welche mit Hilfe der genannten Analyseanordnungen prinzipiell gewonnen bzw. weiterverarbeitet werden könnte, verloren aufgrund der inadäquat großen notwendigen Ausgangsmengen für die genannten herkömmlichen ”Spotting”-Verfahren und ”Spotting”-Anordnungen.
Außerdem ist die mit den herkömmlichen ”Spotting”-Verfahren und ”Spotting”-Anordnungen übertragene Probenmenge im Allgemeinen nur schwer quantifizierbar, und der durch die Limitierung auf flüssige Proben verbundene Trocknungsprozess, nach deren Übertragung in diskrete Messbereiche auf einem Träger, kann zu Qualitätsstreuungen der erzeugten Messbereiche, beispielsweise zu Schwankungen oder inhomogener Verteilung der aufgebrachten Bindungspartner in den Messbereichen oder zu unterschiedlich großen, schwer kontrollierbaren Abmessungen der Messbereiche, d. h. Schwankungen der ”Spot-Morphologie” oder des ”Spot-Durchmessers”, führen.
Für die Aufbringung von Proben aus einem sehr kleinen Vorratsvolumen, beispielsweise in der Größenordnung einzelner Zellen oder von nur sehr wenigen Zellen (beispielsweise < 1000 Zellen), sind die zuvor beschriebenen bekannten Aufbringungsverfahren aus den vielen genannten Gründen nicht geeignet.
Aus der US 2004/0053326 A1 ist ein Laser-unterstütztes Mikrodissektionsverfahren bekannt, wobei mit Hilfe eines Lasers Bereiche einer Nitrozellulose-Transferschicht über selektierten Zellen ablatiert werden, um anschließend einen Transfer dieser Zellen mittels Elektrophorese oder Kapillareffekt zu ermöglichen.
Gemäß der Druckschrift WO 00/23182 A2 erfolgt eine Laserbestrahlung zu dem Zweck, die Anhaftung einzelner Probenmoleküle an unterschiedlichen Messbereichen mit Hilfe eines Bindematerials zu verbessern, wobei mittels eines Laserstrahls eine photoleitende Schicht bestrahlt wird, um diese Schicht elektrisch leitfähig zu machen und anschließend mit Hilfe des somit geschlossenen Stromkreises einzelne Probenmoleküle in der Nähe von gewünschten Messbereichen anzusammeln.
In der US 6,139,831 A wird vorgeschlagen, ein Substrat mit Hilfe eines elektromagnetischen Energiestrahls zu bestrahlen, wobei durch die Energiebestrahlung eine Schicht geschmolzen und daraufhin eine Gasblase gebildet wird, welche bei Abschalten der Energiebestrahlung eine Übertragung der gewünschten Partikel ermöglicht.
Die Druckschrift DE 199 40 752 A1 schlägt das Aktivieren einer photoaktivierbaren Gruppe auf einer Trägeroberfläche mittels Belichtung vor, um anschließend biologische oder chemische Materialien oder Bausteine auf den entsprechenden Bereichen des Trägers, welcher in Form eines Chips ausgestaltet sein kann, ortsspezifisch zu binden.
In der Druckschrift JP 2002-125654 A , Patent Abstracts of Japan (2002), wird die Bestrahlung einer dünnen Schicht mit einem Lichtstrahl vorgeschlagen, um durch Verdampfen dieser Schicht einzelne Proben eines in einer darüber angeordneten dünnen Schicht enthaltenen Genmaterials auf ein Mikro-Array-Substrat zu übertragen, welches gegenüberliegend von einem die beiden Schichten aufweisenden Transfersubstrat angeordnet ist.
In der US 5,143,854 A ist eine Belichtung zur Aktivierung ausgewählter Bereiche eines Mikro-Arrays offenbart, um Polypeptide gewünschter Länge und Sequenz zu synthesieren.
Aus den Druckschriften WO 01/71311 A2 , US 4,322,449 A1 und DE 201 21 386 U1 ist jeweils eine berührungslose Übertragung von Reagenzlösungen auf ein Substrat bekannt. Gemäß der WO 01/71311 A2 erfolgt der berührungslose Transport der Reagenzlösung durch Anlegen einer elektrischen Spannung, während in der US 4,322,449 A1 der berührungslose Transport der Reagenzlösung mit Hilfe eine piezoelektrischen Oszillators erfolgt. In der DE 201 21 386 U1 wird für den Transport der Reagenzlösung ein Druckgas verwendet.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Erzeugung bzw. Herstellung einer Analyseanordnung mit einer Vielzahl von diskreten, separaten Messbereichen, welche zur biologischen, biochemischen oder chemischen Analyse von in oder auf den Messbereichen aufzubringenden Proben geeignet sind, vorzuschlagen, womit als Grundlage für eine später durchzuführende Analyse Proben oder Reagenzlösungen nicht nur auf einfache Art und Weise auf einen Träger zur Erzeugung einzelner Messbereiche aufgebracht werden können, sondern womit insbesondere auch äußerst geringe Flüssigkeits- oder Probenmengen (beispielsweise in der Größenordnung einzelner Zellen oder Zellbestandteile) auf oder in den Messbereichen aufgetragen werden können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Erzeugung einer Analyseanordnung mit einer Vielzahl von diskreten, separaten Messbereichen gemäß Patentanspruch 1 bzw. eine Vorrichtung zur Erzeugung einer derartigen Analyseanordnung gemäß Patentanspruch 24 gelöst. Die abhängigen Ansprüche definieren jeweils bevorzugte oder vorteilhafte Ausführungsformender vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, durch gezielte, gerichtete Einstrahlung von elektromagnetischer Energie in ein Vorratsvolumen einer Reagenzlösung eine bestimmte Menge besagter Reagenzlösung herauszulösen und berührungslos auf einen Träger zu übertragen, um dort diskrete Messbereiche mit darin enthaltenen Mengen der übertragenen Reagenzlösung zu erzeugen. Bevorzugt wird dabei Licht als eingestrahlte Energie, insbesondere Licht aus einer Laserlichtquelle, verwendet.
Die Erfindung erlaubt es, sehr hohe Dichten diskreter, separater Messbereiche auf einem Träger zu erzielen, da die Größe eines Messbereichs nicht notwendigerweise durch die Wechselwirkungen einer Flüssigkeit mit der Oberfläche des Trägers bestimmt wird (z. B. aufgrund der Benetzung der Oberfläche durch die Flüssigkeit). Dies gilt insbesondere für den erfindungsgemäßen Transfer nicht gelösten oder festen Materials von Proben aus einem Probenmaterial. Insbesondere in diesem Fall können gemäß der vorliegenden Erfindung wesentlich kleinere Mengen als mit den herkömmlichen Verfahren und Vorrichtungen übertragen werden. Daher ist es mit Hilfe der vorliegenden Erfindung möglich, Messbereiche auf einem Träger mit mehr als 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, oder 10⁸ Messbereichen pro Quadratzentimeter zu erzeugen.
Zur Erzeugung eines Arrays von diskreten Messbereichen mit in den Messbereichen zu immobilisierenden biologischen, biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Erzeugung einer Analyseanordnung mit einer Vielzahl von diskreten, separaten Messbereichen, welche zum Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einem biologischen, biochemischen oder chemischen Nachweisverfahren in mit den Messbereichen in Kontakt zu bringenden Proben ausgestaltet ist, umfassend die Schritte

a) Bereitstellen eines Trägers,
b) Bereitstellen eines Vorrats einer Reagenzlösung mit darin enthaltenen, auf dem Träger zu immobilisierenden Verbindungen als biologischen, biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen für die in besagten Proben nachzuweisenden Analyten, und
c) Übertragung mindestens einer bestimmten Menge der Reagenzlösung auf den Träger zur Erzeugung mindestens eines der Vielzahl von diskreten, separaten Messbereichen oder auf einen vorher ausgewiesenen Bereich des Trägers für einen diskreten, separaten Messbereich durch Bestrahlen des Vorrats der Reagenzlösung mit einem elektromagnetischen Energiestrahl, insbesondere einem Laserstrahl.

Entsprechend dem genannten erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung von Analyseanordnungen der genannten Art ist auch eine entsprechende Vorrichtungen zur Erzeugung derartiger Analyseanordnungen Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Vorrichtung zur Erzeugung einer Analyseanordnung mit einer Vielzahl von diskreten, separaten Messbereichen, welche zum Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einem biologischen, biochemischen oder chemischen Nachweisverfahren in mit den Messbereichen in Kontakt zu bringenden Proben ausgestaltet ist, umfassend
eine erste Anordnung zum Aufnehmen eines Flüssigkeitsvorrats mit einer Reagenzlösung mit darin enthaltenen, auf einem Träger zu immobilisierenden Verbindungen als biologischen, biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen für in zu untersuchenden Proben nachzuweisende Analyten,
eine zweite Anordnung zum Aufnehmen eines Trägers, auf welchem die Vielzahl von diskreten, separaten Messbereichen zu erzeugen ist, und eine Energiequelle, insbesondere eine Laserlichtquelle, zum gezielten Bestrahlen mindestens einer bestimmten Menge der Reagenzlösung in dem Flüssigkeitsvorrat mit einem elektromagnetischen Energiestrahl, insbesondere einem Laserstrahl, um dadurch die mindestens eine bestimmte Menge der Reagenzlösung von dem Flüssigkeitsvorrat auf den Träger zur Erzeugung mindestens eines der Vielzahl von diskreten Messbereichen oder auf einen vorher ausgewiesenen Bereich des Trägers für einen diskreten, separaten Messbereich zu übertragen.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung dieser Art ist, in allgemeinerer Form auch geeignet, kleinste Flüssigkeitsmengen aus einem Flüssigkeitsvorrat einer Reagenzlösung jeglicher Art auf einen Träger mit darauf zu erzeugenden diskreten, separaten Messbereiche oder auf bereits auf dem Träger erzeugte diskrete, separate Messbereiche zu übertragen.
Es ist von Vorteil, wenn zusätzlich eine Anordnung zur Erleichterung der Erkennung und/oder Auswahl der bestimmten Menge einer Reagenzlösung, beispielsweise in Form eines Mikroskops und/oder Vorkehrungen zur Unterdrückung elektrostatischer Aufladung der zu übertragenden Flüssigkeitsmengen und/oder des Trägers für die Messbereiche vorgesehen sind.
Die vorliegende Erfindung umfasst zusätzlich weitere bevorzugte und vorteilhafte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Erzeugung von Analyseanordnungen.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, eine bestimmte Menge einer Reagenzlösung mittels elektromagnetischer Energie, insbesondere Laserenergie, direkt von einem entsprechenden Vorrat, beispielsweise von einem herkömmlichen Glas-Objektträger, einer Mikrotiterplatte, einer Petrischale etc. auf einen Träger zu übertragen, um auf besagtem Träger mehrere diskrete, separate Messbereiche für eine biologische, biochemische oder chemische Analyse in Form von Arrays von Messbereichen (auch bezeichnet als ”Mikro-Arrays”) zu erzeugen.
Der Träger der zu erzeugenden Messbereiche kann elastisch oder starr sein. Er kann in Form einer Membran, wie beispielsweise einer Nitrocellulose-Membran, vorliegen. Eine Membran als Träger kann beispielsweise in einen Rahmen oder eine Halterung gespannt sein oder auf einem zusätzlichen starren Trägersubstrat, wie beispielsweise einem Glasplättchen, aufgebracht, beispielsweise laminiert, sein. Die den zu erzeugenden Messbereichen zugewandte Oberfläche des Trägers kann flüssigkeitsfrei oder mit einer Flüssigkeit benetzt sein, insbesondere wenn dieses dem Haftungsvermögen der in den zu erzeugenden diskreten, separaten Messbereichen aufzubringenden Stoffe förderlich ist.
Die den zu erzeugenden Messbereichen zugewandte Oberfläche des Trägers kann glatt oder porös sein. Im Falle einer porösen Oberfläche wird bevorzugt, dass die Porengröße innerhalb einer begrenzten Verteilung, beispielsweise zwischen 3 nm und 10 nm, 10 nm und 30 nm, 30 nm und 100 nm, 100 nm und 1 μm, 1 μm und 30 μm liegt. Engere Begrenzungen der Porengröße eines porösen Materials als Träger sind in dieser beispielhaften Auflistung eingeschlossen.
Für eine Vielzahl von Anwendungen wird bevorzugt, dass die Oberfläche des Trägers im Wesentlichen porenfrei, d. h. glatt ist. Dabei ist der Träger vorzugsweise im Wesentlichen planar.
Für viele Anwendungen, insbesondere für den Nachweis von in oder an die diskreten, separaten Messbereiche gebundenen Analyten mittels optischer Detektionsmethoden, ist es von Vorteil, wenn das Material des Trägers gesamthaft oder eine oder mehrere, den Messbereichen zugewandte Schichten eines aus mehreren Schichten aufgebauten Trägers bei der Wellenlänge eines im Nachweisschritt eines biologischen, biochemischen oder chemischen Nachweisverfahrens eingestrahlten Anregungs- oder Messlichts im wesentlichen optisch transparent sind. Unter ”im Wesentlichen optischer Transparenz” bei einer bestimmten eingestrahlten Wellenlänge wird dabei verstanden, dass die Intensität des eingestrahlten Lichts beim Durchgang durch das betreffende Material bzw. die betreffende Schicht um weniger als 50% abgeschwächt wird.
Es wird bevorzugt, dass das Material des Trägers ein Material aus der Gruppe umfasst, welche form-, spritz- oder fräsbare Kunststoffe, Metalle, Metalloxide, Silikate, wie z. B. Glas, Quarz oder Keramiken, umfasst.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Träger als ein optischer Wellenleiter, besonders bevorzugt als ein planarer optischer Dünnschichtwellenleiter mit einer ersten hochbrechenden, wellenleitenden mindestens bei einer Wellenlänge eines einzustrahlenden Anregungs- oder Messlichts im Wesentlichen optisch transparenten Schicht, auf der, direkt oder vermittelt über eine Haftvermittlungsschicht, die diskreten und separaten Messbereiche anzuordnen sind, auf mindestens einer zweiten Schicht mit niedrigerem Brechungsindex als der erstgenannten Schicht ausgestaltet.
Dabei wird bevorzugt, dass der Brechungsindex der hochbrechenden, wellenleitenden Schicht größer als 1,8 ist. Außerdem wird bevorzugt, dass das Material der hochbrechenden, wellenleitenden Schicht Stoffe aus der Gruppe beinhaltet, welche TiO₂, ZnO, Nb₂O₅, Ta₂O₅, HfO₂ und ZrO₂ umfasst.
Die Technologie planarer Wellenleiter ist an sich bekannter Stand der Technik. Ausführungsformen planarer Wellenleiter, welche als Träger geeignet sind, sind beispielsweise in den internationalen Patentanmeldungen WO 95/33197 A1 , WO 95/33198 A1 und WO 96/35940 A beschrieben, so dass diesbezüglich auf diese Druckschriften Bezug genommen werden kann.
Die einfachste Form der Immobilisierung der in den diskreten, separaten Messbereichen auf dem Träger aufzubringenden biologischen, biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente besteht in physikalischer Adsorption, beispielsweise infolge hydrophober Wechselwirkungen zwischen den Erkennungselementen und dem Träger. Diese Wechselwirkungen können jedoch in einem nachfolgenden biologischen, biochemischen oder chemischen Nachweisverfahren durch die Zusammensetzung eines mit den Messbereichen in Kontakt gebrachten Mediums (Reagenz) und dessen physikalisch-chemische Eigenschaften, wie beispielsweise Polarität und Ionenstärke, in ihrem Ausmaß stark verändert werden. Insbesondere im Falle sequentieller Zugabe verschiedener Reagenzien in einem mehrstufigen Assay ist das Haftvermögen der Proben oder Erkennungselemente nach rein adsorptiver Immobilisierung auf der Oberfläche oft unzureichend. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Haftvermögen dadurch verbessert, dass zur Immobilisierung biologischer, biochemischer oder synthetischer Erkennungselemente auf dem Träger eine Haftvermittlungsschicht aufgebracht ist. Für die Herstellung der Haftvermittlungsschicht eignen sich eine Vielzahl von Materialien. Ohne jegliche Einschränkung wird bevorzugt, dass die Haftvermittlungsschicht Verbindungen aus den Gruppen von Silanen, funktionalisierten Silanen, Epoxiden, funktionalisierten, geladenen oder polaren Polymeren, ”selbstorganisierten funktionalisierten Mono- oder Mehrfachschichten”, Thiolen, Alkylphosphaten und -phosphonaten, multifunktionellen Block-Copolymeren, wie beispielsweise Poly(L)lysin/Polyethylenglycolen, umfasst.
Als in den Messbereichen aufzubringende biologische, biochemische oder synthetische Erkennungselemente, d. h. insbesondere zur Herstellung sogenannter ”Capture”-Arrays, können beispielsweise Komponenten aus der Gruppe aufgebracht werden, welche Nukleinsäuren (DNA, RNA) oder Nukleinsäure-Analoge (z. B. PNA), Antikörper, Aptamere, membrangebundene und isolierte Rezeptoren, deren Liganden, Antigene für Antikörper, durch chemische Synthese erzeugte Kavitäten zur Aufnahme molekularer Imprints, chemische Bindungsmoleküle, Erkennungssequenzen für „Protein-Tags”, wie beispielsweise ”His-Tags” umfasst. Es kann auch vorgesehen sein, dass als biologische, biochemische oder synthetische Erkennungselemente ganze Zellen oder Zellfragmente aufgebracht werden.
Als biologische, biochemische oder chemische Nachweisverfahren für in den zu untersuchenden Proben nachzuweisende Analyten eignen sich insbesondere biologische, biochemische oder chemische Verfahren, welche einen massenspektrometrischen oder optischen Nachweis umfassen. Der Nachweis eines oder mehrerer Analyten in oder auf einem diskreten Messbereich kann beispielsweise mithilfe eines Massenspektrometers, insbesondere eines MALDI-TOF-Gerätes (”Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight”) erfolgen, oder mit Hilfe von Anordnungen zur Messung einer oder mehrerer Lumineszenzen bzw. Fluoreszenzen, insbesondere im evaneszenten Feld eines Wellenleiters, sowie Messungen des effektiven Brechungsindexes (z. B. Gitterkoppler-, Oberflächenplasmonen- oder Interferenz-Messysteme) oder von Änderungen dieser Messgrößen. Derartige Anordnungen sind bekannter Stand der Technik.
Der Transfer der bestimmten Mengen einer Reagenzlösung erfolgt erfindungsgemäß berührungslos und erfordert vorzugsweise lediglich einen Laserschuss, wobei der Transfer über Phasengrenzen hinweg, d. h. aus dem Vorrat (Probenmaterial oder Reagenzlösung) heraus durch Luft auf den Träger, erfolgt.
Die Erfindung stellt somit eine hochsensitive Technologie zum Transfer auch kleinster Mengen zur Verfügung, so dass entsprechend auch die Analyse einzelner Zellen oder einzelner Zellbestandteile auf deren Inhaltsstoffe, beispielsweise Nukleinsäuren wie DNA oder RNA, oder Proteine, ermöglicht wird.
Die Erfindung wird nachfolgend näher erläutert unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen.
1 zeigt schematisch eine Vorrichtung zur Erzeugung bzw. Herstellung einer Analyseanordnung mit einer Vielzahl von diskreten, separaten Messbereichen gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt einen beispielhaften Aufbau einer Analyseanordnung, wie sie in 1 zum Einsatz kommen kann, und
3A und 3B zeigen Beispiele für das Übertragen einzelner Proben auf die Analyseanordnung gemäß der vorliegenden Erfindung.
1 zeigt eine Vorrichtung zur Herstellung bzw. Erzeugung einer Analyseanordnung mit einer Vielzahl von diskreten, separaten Messbereichen, in oder auf denen jeweils Proben, zum Nachweis eines oder mehrerer darin enthaltener Analyten in einem biologischen, biochemischen oder chemischen Nachweisverfahren, aufzubringen sind. Bei dem dargestellten Beispiel handelt es sich um einen Halter 3 mit einer Vielzahl von Trägern 4, auf denen jeweils ein oder mehrere Mikro-Arrays 5 von den zuvor beschriebenen diskreten, separaten Messbereichen 16 angeordnet sind bzw. anzuordnen sind, wobei in 1 lediglich beispielhaft vier derartige Träger dargestellt sind. Dieses soll nachfolgend näher anhand 2 erläutert werden.
Wie in 2 in Form einer Aufsicht auf die Analyseanordnung gezeigt, umfasst die Analyseanordnung in dieser beispielhaften Ausführungsform einen Rahmen bzw. Halter 3, wobei gemäß 2 sechs nebeneinander angeordnete Träger bzw. Trägeranordnungen 4 von dem Halter 3 gehalten werden. Auf jedem Träger 4 sind sechs individuell adressierbare Mikro-Arrays 5 mit einer matrixartigen Anordnung von diskreten und separaten Messbereichen 16 angeordnet, wobei beispielsweise bis zu 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, oder 10⁸ derartige Messbereiche 16 pro Mikro-Array vorgesehen sein können, in oder auf denen jeweils einzelne Proben oder zu immobilisierende biologische, biochemische oder synthetische Erkennungselemente für eine nachfolgende biologische, biochemische oder chemische Analyse aufzubringen sind. Die Anzahl der in einem Array, insbesondere pro Flächeneinheit auf dem Träger, erzeugbaren Messbereiche wird im Wesentlichen bestimmt durch den Durchmesser des für den Transfer eingesetzten Laserstrahls sowie durch die Positionierauflösung und Positioniergenauigkeit der Verstelleinrichtungen 7 und 8. Bei dem Träger 4 kann es sich bevorzugt um einen festen Träger, besonders bevorzugt um einen festen Träger mit einer planaren, glatten oder porösen Oberfläche handeln. In einer speziellen, besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um einen planaren Wellenleiter, insbesondere um einen planaren Dünnschichtwellenleiter mit einer ersten hochbrechenden, mindestens bei einer Wellenlänge eines einzustrahlenden Anregungs- oder Messlichts im Wesentlichen optisch transparenten Schicht, auf der, direkt oder vermittelt über eine Haftvermittlungsschicht, die diskreten Messbereiche anzuordnen sind, auf mindestens einer zweiten Schicht mit niedrigerem Brechungsindex als der erstgenannten Schicht. Mit Hilfe der Anregung und Detektion von Lumineszenz von Iumineszenzfähigen Molekülen oder molekularen Komponenten im evaneszenten Feld des in einem Dünnschichtwellenleiter geführten Lichts für den Schritt des Analytnachweises kann eine beispielsweise fünfzig- bis hundertfach höhere Empfindlichkeit beim Auslesen der Signale aus den diskreten, separaten Messbereichen eines Mikro-Arrays auf einem planaren Dünnschichtwellenleiter erreicht werden als mit herkömmlichen Trägern, wie beispielsweise Glas- oder Mikroskop-Plättchen, beim Auslesen der Signale mit Hilfe herkömmlicher Laser-Scanner.
Dabei können die zum Zweck des Analytnachweises eingesetzten lumineszenzfähigen Moleküle oder molekulare Komponenten beispielsweise als Label an die Analyten oder Analyt-Analoge (den Analyten gleichartige Moleküle) in einem kompetitiven Assay oder an einen der Bindungspartner der Analyten in einem mehrstufigen Assay gebunden sein. Im Falle von Nukleinsäure-Hybridisierungsassays kann es sich beispielsweise auch um so genannte Interkalatoren handeln, welche sich in doppelsträngige Nukleinsäure-Stränge einlagern und dort beispielsweise zu einer verstärkten Lumineszenz (im Vergleich zum Abstrahlungsverhalten in homogener Lösung) angeregt werden können.
Das Aufbringen der zu analysierenden Proben bzw. der bestimmten Mengen von Reagenzlösungen auf einen Träger 4 zur Erzeugung von Mikro-Arrays 5 von einzelnen diskreten und voneinander beabstandeten Messbereichen 16 wird als ”Spotting” bezeichnet. Die in 1 dargestellte Vorrichtung ist derart ausgestaltet, dass das ”Spotting” einen Transfer der entsprechenden Proben bzw. Mengen von Reagenzlösungen auf den Träger, zur Erzeugung der gewünschten Messbereiche, mittels Laserenergie ermöglicht, wobei der Transfer berührungslos durch Bestrahlung des jeweiligen Flüssigkeitsvorrats an Reagenzlösung bzw. des Vorrats an Probenmaterial mit einem Laserstrahl erfolgt. Durch die Bestrahlung der einzelnen Objekte bzw. Proben bzw. bestimmten Bereiche in einer Reagenzlösung (allgemein bezeichnet als Regionen) mit dem Laserstrahl erfolgt eine Impulsübertragung von dem Laserstrahl auf die damit bestrahlten Regionen, wobei die genaue Ursache für diese Impulsübertragung derzeit noch nicht vollständig geklärt ist. Es wird jedoch vermutet, dass die Impulsübertragung und die dadurch hervorgerufene Beschleunigung des mit dem Laserstrahl bestrahlten Objekts (bzw. Region nach vorangehender Definition) auf eine Plasmabildung im Bereich der Oberfläche des jeweiligen Objekts (bzw. Region) zurückgeht. Durch die Bestrahlung der ausgewählten Regionen, bei denen es sich um einzelne Zellen oder einzelne Zellbestandteile oder auch kleinste Tröpfchen einer Reagenzlösung etc. handeln kann, erfolgt demzufolge eine Beschleunigung in Richtung der Ausbreitungsrichtung des Laserstrahls, so dass ein berührungsloser Transfer über Phasengrenzen hinweg zu der Analyseanordnung 3 hin möglich ist.
Bei dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel sollen die zu analysierenden Proben von einem auf einem Träger 1 befindlichen Probenmaterial (nachfolgend auch bezeichnet als ”Präparat”) 2 auf die einzelnen Messbereiche der Analyseanordnung 3 transferiert werden. Bei dem Träger 1 kann es sich beispielsweise um einen herkömmlichen Glas-Objektträger, um einen Membran-Träger mit einer auf einen Rahmen gespannten Membran, eine Mikrotiterplatte, eine Petrischale oder dergleichen handeln. Die Art und Ausgestaltung des Trägers 1 ist für das hierin beschriebene und vorgeschlagene „Spotting”-Verfahren ohne Bedeutung.
Darüber hinaus ist in 1 angedeutet, dass der Träger 1 über eine Verstelleinrichtung 7 mit einem Computersystem 11 gekoppelt ist, welches die Funktion einer automatischen Steuerung für den Ablauf des „Spotting”-Verfahrens übernimmt und als Ausgabemittel beispielsweise einen handelsüblichen Monitor 12 und als Eingabemittel eine graphische Benutzeroberfläche in Verbindung mit einer Tastatur 13 und einer Computermaus 14 umfasst. Über die graphische Benutzeroberfläche kann ein Benutzer beispielsweise einzelne gewünschte Zellen eines Zellverbands (wie z. B. eines Gewebestücks) oder Zellbestandteile einzelner Zellen des Präparats 2 für die einzelnen „Spotting”-Vorgänge auswählen, wobei zu diesem Zweck der Bereich des Trägers 1 mit dem darauf befindlichen Präparat 2 von einem Mikroskop mit darin integrierter CCD-Kamera 10 aufgenommen wird, so dass ein dem (nicht gezeigten) Objektiv des Mikroskops entsprechend vergrößertes Bild des Präparats 2 auf dem Monitor 12 darstellbar ist. Über die Verstelleinrichtung 7 kann der Träger 1 mit dem Präparat 2 sowohl zweidimensional in x- und y-Richtung als auch vertikal in z-Richtung verfahren werden, so dass der gesamte Bereich des Präparats 2 über das Objektiv des Mikroskops bewegt und somit der gesamte Bereich des Präparats 2 abgefahren werden kann, um beispielsweise die interessierenden Zellen bzw. Zellbestandteile auffinden und selektieren zu können.
Die für die einzelnen „Spotting”-Vorgänge ausgewählten Proben bzw. bestimmten Mengen einer Reagenzlösung (gemeinsam nachfolgend bezeichnet als ”Objekte”) können anschließend von dem Benutzer über eine entsprechende Benutzereingabe graphisch auf dem auf dem Monitor 12 dargestellten vergrößerten Bild markiert und somit selektiert werden. Ebenso kann auf diese Weise von dem Benutzer festgelegt werden, welche zuvor ausgewählten Proben bzw. bestimmten Mengen einer Reagenzlösung auf welches Mikro-Array 5 der Analyseanordnung 3 und insbesondere zur Erzeugung welchen Messbereichs 16 des gewünschten Mikro-Arrays 5 transferiert werden sollen. Hierzu kann von dem Benutzer eine Abbildungsmatrix angelegt werden, welche eindeutig die Zuordnung der ausgewählten Proben bzw. bestimmten Mengen einer Reagenzlösung zu den einzelnen Messbereichen 16 der einzelnen Mikro-Arrays 5 der Analyseanordnung 3 festlegt, was nachfolgend näher anhand der Darstellungen von 3A und 3B verdeutlicht werden soll.
Bei der Darstellung von 3A wird davon ausgegangen, dass von dem Benutzer vier Objekte des Präparats 2 für den nachfolgenden „Spotting”-Vorgang markiert und selektiert worden sind, wobei anschließend die selektierten Objekte 15 im Wesentlichen unter Beibehaltung der ursprünglichen Topographie in dem Präparat 2 auf den Träger 4 zur Erzeugung entsprechend angeordneter Messbereiche 16 eines beliebigen Mikro-Arrays 5 der Analyseanordnung 3 übertragen werden sollen.
Bei dem in 3B dargestellten Beispiel wird hingegen davon ausgegangen, dass bei dem Transfer der selektierten Objekte 15 die ursprüngliche Topographie in dem Präparat 2 nicht mehr beibehalten wird, wobei die Objekte 15 auf den Träger 4 zur Erzeugung von Messbereichen 16 in einer gemeinsamen Spalte eines Mikro-Arrays 5 übertragen werden. Für das auf Grundlage der auf die Messbereiche 16 übertragenen Proben nachfolgend durchzuführende biologische, biochemische oder chemische Analyseverfahren ist jedoch erforderlich, dass bekannt ist, welche Probe bzw. welches Objekt 15 sich in oder auf welchem Messbereich 16 des Mikro-Arrays 5 befindet. Diese Information kann durch die zuvor beschriebene Abbildungsmatrix festgehalten werden, wobei in der Abbildungsmatrix in dem in 1 gezeigten Computersystem eindeutig gespeichert wird, welche Probe bzw. welches Objekt des Präparats 2 in oder auf welchen Messbereich 16 der einzelnen Mikro-Arrays 5 der Analyseanordnung 3 übertragen worden ist. Im Prinzip reicht hierzu das Anlegen und Abspeichern einer einfachen zweidimensionalen Tabelle aus.
Ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht jedoch darin, dass nicht nur ein zweidimensionales „Spotting” möglich ist, sondern dass einzelne Zellen bzw. Zellbestandteile des Präparats 2 auch, wie vorangehend beschrieben, dreidimensional gespottet werden können, so dass übereinander liegende Areale oder ganze Schichten des Präparats nacheinander mittels Laserbestrahlung abgetragen und in oder auf die einzelnen Messbereiche 16 der unterschiedlichen Mikro-Arrays 5 der Analyseanordnung 3 übertragen, d. h. gespottet, werden können. In diesem Fall muss entsprechend von dem Benutzer zur eindeutigen Zuordnung der Messbereiche 16 zu den selektierten Objekten bzw. Proben 15 eine dreidimensionale Abbildungsmatrix verwaltet werden.
Selbstverständlich ist es entgegen den Darstellungen von 3A und 3B nicht erforderlich, dass die für das Präparat 2 ausgewählten Messbereiche allesamt einem gemeinsamen Mikro-Array 5 zugeordnet sind. Vielmehr können die für das „Spotting”-Verfahren ausgewählten Proben beliebig in oder auf die Messbereiche 16 aller Mikro-Arrays 5 der Analyseanordnung 3 verteilt werden. Darüber hinaus ist es auch möglich, dass unterschiedliche biologische Objekte 15 des Präparats 2 auf ein und denselben Messbereich 16 übertragen werden.
Die Zuordnung der selektierten Proben zu den gewünschten Messbereichen 16 der einzelnen Mikro-Arrays 5 kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass von dem Computersystem auf den Monitor 12 auch ein digitales Bild der einzelnen Mikro-Arrays 5 mit den entsprechenden Messbereichen 16 der Analyseanordnung 3 dargestellt wird, so dass von dem Benutzer die selektierten Proben 15 des Präparats 2 einfach den gewünschten Messbereichen 16 der einzelnen Mikro-Arrays 5 graphisch zugeordnet werden können. Selbstverständlich sind auch andere Möglichkeiten der Zuordnung denkbar.
Nachdem von dem Benutzer festgelegt worden ist, welche Objekte bzw. Proben auf den Träger zur Erzeugung welcher Messbereiche 16 der einzelnen Mikro-Arrays 5 gespottet werden sollen, kann von dem Benutzer ein von dem Computersystem automatisch gesteuerter „Spotting”-Vorgang gestartet werden, wobei von dem Computersystem automatisch die jeweils erforderliche Relativbewegung zwischen dem Träger 1 mit dem darauf befindlichen Präparat 2 und der Analyseanordnung 3 mit den darauf befindlichen Trägern 4 bzw. Mikro-Arrays 5 hervorgerufen wird.
Zu diesem Zweck ist – wie in 1 dargestellt ist – die Analyseanordnung 3 von einer Halterung 6 gehalten, welche wiederum über eine weitere Verstelleinrichtung 8 computergestützt in x- und y-Richtung sowie vorzugsweise auch in z-Richtung verfahren werden kann. Selbstverständlich kann unter Umständen auch auf die Halterung 6 verzichtet werden, sofern der Rahmen der Analyseanordnung 3 selbst derart ausgestaltet ist, dass er unmittelbar mit der Verstelleinrichtung 8 gekoppelt werden kann.
Während des „Spotting”-Vorgangs wird der Träger 1 mit dem darauf befindlichen Präparat 2 über die Verstelleinrichtung 7 durch das Computersystem derart verstellt, dass das jeweils gewünschte Objekt bzw. die jeweils gewünschte Probe 15 gegenüber dem Laserstrahl einer Laserlichtquelle 9, beispielsweise eines UV-Stickstofflasers, ausgerichtet ist. Die Anordnung und Ausrichtung der Laserlichtquelle 9 gegenüber dem Träger 1 und dem Träger 4 ist in 1 lediglich beispielhaft zu verstehen. Selbstverständlich ist es bei entsprechender Anordnung und Ausrichtung der Laserlichtquelle 9 auch möglich, einen Transfer von unten nach oben oder in einer horizontalen oder diagonalen Richtung etc. durchzuführen. Von dem Computersystem wird die Verstelleinrichtung 8 derart angesteuert, dass der auf dem Träger 4 vorgesehene Bereich zur Erzeugung des gewünschten Messbereichs 16 des gewünschten Mikro-Arrays 5 ebenfalls gegenüber dem Laserstrahl der Laserlichtquelle 9 und demzufolge gegenüber der zu transferierenden Probe ausgerichtet ist. Anschließend wird von dem Computersystem automatisch die Laserlichtquelle 9 aktiviert und ein Laserschuss auf die gewünschte Probe gesetzt, woraufhin aufgrund des erfolgten Impulsübertrags die damit bestrahlte Probe 15 aus dem Präparat 2 gelöst, auf den Träger 4 übertragen wird und dort den gewünschten Messbereich 16 erzeugt. Aufgrund der durch die Laserbestrahlung hervorgerufenen Beschleunigung der Probe 15 ist ein hochpräziser Transfer möglich. Darüber hinaus ist die Auflösung des „Spotting”-Vorgangs im Prinzip lediglich durch den Durchmesser des Laserstrahls beschränkt, wobei der Laserstrahldurchmesser im Bereich von wenigen μm liegen und bei entsprechender Fokussierung des Laserstrahls auf wenige 100 nm reduziert werden kann, sowie durch die Positionierauflösung und Positioniergenauigkeit der Verstellelemente 7 und 8, so dass hochpräzise beispielsweise einzelne Zellen bzw. Zellbestandteile bzw. äußerst kleine Zellareale gespottet werden können.
Der zuvor beschriebene Vorgang wird für jede zuvor selektierte Probe 15 des Präparats 2 und für jeden entsprechend zugeordneten Messbereich 16 der einzelnen Mikro-Arrays 5 der Analyseanordnung 3 wiederholt, so dass schließlich alle selektierten Proben 15 nacheinander auf den Träger 4 der Analyseanordnung 3 vollautomatisch und computergestützt durch entsprechende Ansteuerung der Verstelleinrichtungen 7, 8 und der Laserlichtquelle 9 gespottet werden und dort die gewünschten Messbereiche 16 erzeugen.
Es ist möglich, die einzelnen zu spottenden Proben bzw. Zellen vor dem Transfer aufzuschließen (beispielsweise in einem Lyse-Puffer). Es ist aber auch möglich, direkt, ohne vorherigen Aufschluss, eine oder mehrere Zellen oder Bestandteile davon in einem Zellverband (beispielsweise einem Gewebestück) oder in einer Zellkultur oder einzelne Regionen in einzelnen Zellen auszuwählen, mit dem beschriebenen Verfahren aus ihrer Umgebung zu lösen und auf den Träger 4 zu übertragen.
Die Träger 4 bzw. die darauf ausgebildeten Messbereiche 16 der Mikro-Arrays 5 sind derart präpariert bzw. ausgestaltet, dass unmittelbar eine biologische, biochemische oder chemische Analyse der darauf aufgebrachten Proben 15 möglich ist. Dabei kann im Prinzip jedes beliebige Analyseverfahren angewendet werden. Hierbei kann es sich insbesondere um qualitative und/oder quantitative Analyseverfahren handeln, um die einzelnen Proben bezüglich ihrer Bestandteile, wie beispielsweise Nukleinsäuren, wie DNA oder RNA, oder Proteine zu untersuchen, wobei es sich bei den Proben beispielsweise sowohl um lebende als auch nicht lebende Zellen/Zellbestandteile handeln kann. Allgemein können die Analyseverfahren derart ausgestaltet sein, dass das Vorhandensein bzw. die absolute oder relative Menge (im Vergleich unterschiedlicher Proben) und/oder die Identität eines oder mehrerer bestimmter Analyten, wie beispielsweise Biopolymeren, insbesondere Polynukleotiden oder Polypeptiden, in der jeweils gespotteten Probe bestimmt werden kann. Derartige bioanalytische Verfahren bzw. Vorrichtungen sind allgemeiner Stand der Technik, so dass an dieser Stelle nicht weiter darauf eingegangen werden muss.
Vorzugsweise handelt es sich bei der in 1 dargestellten Vorrichtung um eine Bioanalysevorrichtung, in welcher die in 1 dargestellte Anordnung zum computergestützten, Laser-induzierten Spotten in Form eines einzigen Geräts integriert ist.
Das zuvor beschriebene Laser-induzierte Spotten kann im Prinzip nicht nur auf das Spotten von biologischen Proben wie Zellen, wie vorangehend ausführlich beschrieben, angewendet werden, sondern es ist beispielsweise insbesondere auch geeignet, um aus einem Flüssigkeitsvorrat, beispielsweise einem Vorrat einer Reagenzlösung, kleinste Mengen dieser Reagenzlösung in oder auf diskrete, separate Messbereiche 16 auf einem Träger 4 oder auf vorher ausgewiesene Bereiche des Trägers 4 für diskrete, separate Messbereiche oder auf zuvor auf dem Träger 4 erzeugte diskrete Messbereiche durch Bestrahlen der entsprechenden Menge der Reagenzlösung mit einem Laserstrahl zu transferieren. Bei besagter Reagenzlösung kann es sich insbesondere um eine Analyt-spezifische Reagenzlösung mit darin enthaltenen biologischen, biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen handeln. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es daher, aus einem Flüssigkeitsvorrat mit einer Analyt-spezifischen Reagenzlösung, d. h. darin enthaltenen biologischen, biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen, kleinste Mengen dieser Reagenzlösung durch Energiebestrahlung, insbesondere durch Laserbestrahlung, in oder auf die Messbereiche 16 der Analyseanordnung 3 zu transferieren, um somit Mikro-Arrays mit Analyt-spezifischen Messbereichen (sogenannte ”Capture”-Arrays) auf der Analyseanordnung 3 herzustellen. Hierzu wird anstelle des in 1 dargestellten Probenmaterials 2 der entsprechende Flüssigkeitsvorrat mit dem Laserstrahl der Laserlichtquelle 9 bestrahlt, wobei die jeweils mit dem Laserstrahl bestrahlten Flüssigkeitströpfchen der Reagenzlösung transferiert werden. Die generelle Funktionsweise und der generelle Ablauf des „Spotting”-Verfahrens bleibt jedoch gleich, so dass auf die vorhergehenden Erläuterungen bezüglich der Übertragung beispielsweise biologischer Proben verwiesen werden kann. Bei den Reagenzlösungen kann es sich insbesondere um Analyt-spezifische Reagenzlösungen der in der eingangs beschriebenen Druckschrift EP 0 804 731 B1 offenbarten Art handeln.

Claims

Verfahren zur Erzeugung einer Analyseanordnung (3) mit einer Vielzahl von diskreten, separaten Messbereichen (16), welche zum Nachweis mindestens eines Analyten in einem biologischen, biochemischen oder chemischen Nachweisverfahren in mit den Messbereichen (16) in Kontakt zu bringenden Proben ausgestaltet ist, umfassend die Schritte a) Bereitstellen mindestens eines Trägers (4), b) Bereitstellen eines Vorrats einer Reagenzlösung, und c) berührungslose Übertragung mindestens einer bestimmten Menge der Reagenzlösung auf den Träger zur Erzeugung mindestens eines der Vielzahl von diskreten, separaten Messbereichen (16) oder auf einen vorher ausgewiesenen Bereich des Trägers (4) für den mindestens einen diskreten, separaten Messbereich (16) oder auf einen zuvor auf dem Träger (4) erzeugten diskreten Messbereich (16) durch Bestrahlen des Vorrats der Reagenzlösung mit einem elektromagnetischen Energiestrahl.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der elektromagnetische Energiestrahl ein Lichtstrahl ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der elektromagnetische Energiestrahl ein Laserstrahl ist.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass zum Übertragen der Menge der Reagenzlösung auf den Träger (4) zur Erzeugung des mindestens einen Messbereichs (16) ein Laserschuss auf die Probe gesetzt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Bereiche des Trägers (4) zur Erzeugung von diskreten Messbereichen (16) ausgewählt werden, und dass anschließend mehrere Mengen der Reagenzlösung nacheinander mittels des elektromagnetischen Energiestrahls auf den Träger (4) zur Erzeugung der entsprechenden Messbereiche (16) übertragen werden.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswahl der Bereiche auf dem Träger (4) für die Messbereiche (16) sowie die anschließende Übertragung der Mengen der Reagenzlösung auf den Träger (4) zur Erzeugung der entsprechenden Messbereiche (16) computergestützt erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Übertragung der Mengen der Reagenzlösung auf den Träger (4) zur Erzeugung der entsprechenden Messbereiche (16) durch Herbeiführen entsprechender Relativbewegungen zwischen der Reagenzlösung und dem elektromagnetischen Energiestrahl einerseits sowie zwischen der Reagenzlösung und dem Träger (4) andererseits erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Messbereiche (16) in Form mindestens eines Mikro-Arrays (5) auf dem mindestens einen Träger (4) ausgebildet werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Träger (4) starr ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–8, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Träger (4) elastisch ist.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Träger (4) in Form einer Membran vorliegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine den Messbereichen (16) zugewandte Oberfläche des mindestens einen Trägers (4) glatt oder porös ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Träger (4) im Wesentlichen planar ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Material des mindestens einen Trägers (4) bei der Wellenlänge eines im Nachweisschritt des biologischen, biochemischen oder chemischen Nachweisverfahrens eingestrahlten Anregungs- oder Messlichts im Wesentlichen optisch transparent ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Material des mindestens einen Trägers (4) ein Material aus der Gruppe umfasst, welche form-, spritz- oder fräsbare Kunststoffe, Metalle, Metalloxide und Silikate umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (4) als ein planarer optischer Dünnschichtwellenleiter mit einer ersten mindestens bei einer Wellenlänge eines einzustrahlenden Anregungs- oder Messlichts im Wesentlichen optisch transparenten Schicht auf mindestens einer zweiten Schicht mit einem niedrigeren Brechungsindex als die erste Schicht ausgestaltet ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Träger (4) eine Haftvermittlungsschicht aufgebracht ist.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Haftvermittlungsschicht mindestens eine Verbindung umfasst, welche ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend Silane, funktionalisierte Silane, Epoxide, funktionalisierte geladene oder polare Polymere, selbstorganisierte funktionalisierte Mono- oder Mehrfachschichten, Thiole, Alkylphosphate, Alkylphosphonate und multifunktionelle Block-Copolymere.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nacheinander mehrere Mengen der Reagenzlösung durch Bestrahlung mit dem elektromagnetischen Energiestrahl auf den Träger (4) zur Erzeugung unterschiedlicher Messbereiche (16) übertragen werden, wobei eine Abbildungsmatrix erstellt wird, in welcher festgehalten ist, welche Mengen der Reagenzlösung auf den Träger (4) zur Erzeugung welcher Messbereiche (16) zu übertragen sind.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Abbildungsmatrix für eine nachfolgende Verwendung gespeichert wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren computergestützt automatisch durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die im Schritt b) bereitgestellte Reagenzlösung Analyt-spezifisch ist und auf dem Träger (4) zu immobilisierende Verbindungen als biologische, biochemische oder synthetische Erkennungselemente für den mindestens einen in den Proben nachzuweisenden Analyten enthält.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen, biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente ausgewählt sind aus einer Gruppe umfassend Nukleinsäuren, Nukleinsäure-Analoge, Antikörper, Aptamere, membrangebundene und isolierte Rezeptoren, deren Liganden, Antigene für Antikörper, durch chemische Synthese erzeugte Kavitäten zur Aufnahme molekularer Imprints, chemische Bindungsmoleküle und Erkennungssequenzen für „Protein-Tags”.
Vorrichtung zur Erzeugung einer Analyseanordnung (3) mit einer Vielzahl von diskreten, separaten Messbereichen (16), welche zum Nachweis mindestens eines Analyten in einem biologischen, biochemischen oder. chemischen Nachweisverfahren in mit den Messbereichen (16) in Kontakt zu bringenden Proben (15) ausgestaltet ist, umfassend eine erste Anordnung (1) zum Aufnehmen eines Flüssigkeitsvorrats mit einer Reagenzlösung, eine zweite Anordnung (6) zum Aufnehmen mindestens eines Trägers (4) mit der Vielzahl von diskreten, separaten Messbereichen (16), eine Energiequelle (9) zum gezielten Bestrahlen der Reagenzlösung in dem Flüssigkeitsvorrat mit einem elektromagnetischen Energiestrahl, und Steuermittel (11) zur automatischen Steuerung der Bestrahlung der Reagenzlösung mit dem elektromagnetischen Energiestrahl der Energiequelle (9), um dadurch mindestens eine bestimmte Menge der Reagenzlösung von dem Flüssigkeitsvorrat berührungslos auf mindestens eine der Vielzahl von diskreten, separaten Messbereichen (16) des Trägers (4) oder auf einen vorher ausgewiesenen Bereich des Trägers (4) für den mindestens einen diskreten, separaten Messbereich (16) zu übertragen.
Vorrichtung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass Verstellmittel (7, 8) zum Herbeiführen einer Relativbewegung zwischen der ersten Anordnung (1) und der Energiequelle (9) einerseits und der ersten Anordnung (1) und der zweiten Anordnung (6) andererseits vorgesehen sind.
Vorrichtung nach Anspruch 24 oder Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Energiequelle (1) eine Laserlichtquelle zur Erzeugung eines Laserstrahls als elektromagnetischer Energiestrahl ist.