DE10232695A1

DE10232695A1 - Immobilisierungsschicht für Biosensoren

Info

Publication number: DE10232695A1
Application number: DE2002132695
Authority: DE
Inventors: Hans-Dieter Dr. Feucht; Manfred Dr. Stanzel; Jürgen STROPP; Heinz Dr. Zeininger
Original assignee: Siemens Corp
Current assignee: Siemens Corp
Priority date: 2002-07-18
Filing date: 2002-07-18
Publication date: 2004-02-05
Also published as: EP1525248A1; WO2004009677A1

Abstract

Immobilisierungsschicht für Biosensoren, hergestellt aus einem Polyorganosiloxan unter Zusatz von Reaktionsvernetzern/Reaktionsvermittlern auf einem Trägermaterial, wobei das Polyorganosiloxan der folgenden allgemeinen Struktur entspricht: DOLLAR F1 worin folgendes gilt: DOLLAR A E = epoxyfunktioneller Rest mit 4 bis 20 C-Atomen; DOLLAR A Z = (photo)polymerisierbarer Rest mit 8 bis 40 C-Atomen; DOLLAR A H = hydrophiler Rest; DOLLAR A R·1· = Niederalkylgruppe mit vorzugsweise 1 bis 4 C-Atomen; DOLLAR A R·2· = R·1· oder H und DOLLAR A m + n + o + p + r = 50 bis 200 = L.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Immobilisierungsschicht für Biosensoren sowie ihre Verwendung zur Erzeugung von biosensorischen Erkennungsschichten, insbesondere zur Erzeugung von sogenannten DNA-Chips.

In der modernen biologischen Analysentechnik, aber auch in der medizinischen Diagnostik, werden in zunehmendem Maße Biosensoren eingesetzt, bei denen ein biologisches Erkennungssystem mit einem physikalischen Transducer verknüpft ist. Unter Erkennungssystemen versteht man biologische Erkennungsmoleküle, wie Antikörper, Enzyme, Nucleinsäuren und dergleichen, welche über eine sogenannte Immobilisierungsschicht an einem Träger (Transducer) gebunden sind. Als Transducer werden hauptsächlich kalorimetrische, piezoelektrische, optische und elektrochemische Prinzipien verwendet.

Die Erkennungssysteme, respektive ursprünglich die Immobilisierungsschichten, werden dabei meist in annähernd zweidimensionalen Schichten auf den Transducersystemen immobilisiert. Die Immobilisierung kann durch kovalente Bindungen, durch Affinitätswechselwirkung aber auch durch hydrophil/hydrophobe Wechselwirkungen erfolgen. Aus Stabilitätsgründen werden kovalente Bindungen bevorzugt, jedoch kommt auch die Bildung stabiler Komplexe, wie zum Beispiel Biotin/Avidin, erfolgreich zum Einsatz. Einen guten Überblick über den Aufbau annähernd zwei-dimensionaler biologischer Erkennungsschichten geben I. Willner, E. Katz: "Redoxproteinschichten auf leitenden Trägern – Systeme für bioelektronische Anwendungen" in Angew. Chem. 2000, 112, 1230–69.

Bei Transducer-Oberflächen, welche NH- oder OH-Gruppen enthalten, werden die biologischen Funktionsträger, d.h. die Erkennungsmoleküle, häufig durch Alkoxysilane, welche sogenann te Linkergruppen enthalten, aber auch mit Hilfe von Cyanurchlorid oder Carbodiimid immobilisiert. Zur Ausrüstung goldhaltiger Transducer-Oberflächen werden mit Thioalkyl gelabelte Erkennungsmoleküle eingesetzt, die über Schwefel-Gold-Bindungen in Form von sogenannten Self-Assembly-Schichten auf der Transducer-Oberfläche immobilisiert werden. Ein interessanter Ansatz zur Immobilisierung von Nucleinsäuren auf Transducer-Oberflächen ist die photochemisch unterstützte Synthese von Affymetrix (Light-directed spatially addressable parallel chemical synthesis, S.P.A. Fodor et al., Science 251, 767–773 (1991)).

Zur Steigerung der Empfindlichkeit von Biosensoren sowie zur Optimierung der Reproduzierbarkeit der damit erhaltenen Messergebnisse ist der Einsatz dreidimensionaler Immobilisierungsschichten für die biologischen Erkennungsmoleküle sinnvoll. Die Firma Schleicher & Schüll GmbH bietet unter dem Namen FAST^TM Slides DNA-Chips an, in welchen die Fänger-Oligos in einer drei-dimensionalen Nitrocellulose-Membran immobilisiert sind (BioMolecular Screening, Catalog 2001, intern. Edit. Fa. Schleicher & Schüll).

In der WO 00/43539 ist der Aufbau einer dreidimensionalen DNA-Erkennungsschicht durch Immobilisierung der DNA-Fänger-Sonden in Form von Polymer-Brushes beschrieben.

Von Timofeev et al. wird ein chemisch modifiziertes, radikalisch vernetztes Polyacrylamid beschrieben, das zum Beispiel für die Immobilisierung von Fänger-Oligos eingesetzt werden kann (E. N. Timofeev et al., Regioselective Immobilization of Short Oligonucleotides to Acrylic Copolymer Gels, Nucleic Acids Research, 1966, Vol.24, No. 16, 3142–3148). Hier werden als Kopplungsgruppen im Hydrogel Amino- oder Aldehydgruppen verwendet. Aldehyd- bzw. Amino-funktionalisierte Fänger-Oligos können an diese Kopplungsgruppen unter reduktiven Reaktionsbedingungen kovalent immobilisiert werden. Das bedeutet aber, dass neben der eigentlichen Kopplungsreaktion zwi schen Amino- und Aldehydgruppe, bzw. umgekehrt, ein zusätzlicher Reduktionsschritt unter Einsatz von Reduktionsmitteln erforderlich ist. Weitere von Timofeev et al. beschriebene Methoden zur chemischen Aktivierung des vernetzten Polyacrylamids erfordern ebenfalls zusätzliche Reaktionsschritte in der Polymermatrix.

Ein radikalisch vernetzbares Polyorganosiloxan, das zusätzlich Linkergruppen zur Ankopplung biologischer oder chemischer Funktionsträger enthält, ist durch die Anmelderin in der EP 0 562 369 B1 beschrieben. In der parallelen EP 0 562 372 B1 ist die Herstellung enzymhaltiger Erkennungsschichten für Biosensoren auf Basis der vorgenannten funktionellen Polyorganosiloxane beschrieben. Die Hydrophilie der damit erzeugten Immobilisierungsschichten wird in einem zusätzlichen Prozessschritt durch Umsetzung eines Teils der in der Matrix vorhandenen Linkergruppen mit zum Beispiel einer Aminosäure nachträglich so weit erhöht, dass zum Beispiel Enzyme, wie Glucoseoxidase, unter Erhalt ihrer Funktionsfähigkeit in der Schicht immobilisiert werden können. Diese nachträgliche Verbesserung der Hydrophilie der Immobilisierungsschicht ist aufwendig (Reaktionszeit mehrere Stunden bei 60°C, alkalisches Medium) und kommt somit insbesondere für die Massenherstellung von analytischen Biochips nicht in Frage.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Erzeugung einer radikalisch vernetzten, d.h. dreidimensionalen hydrophilen Immobilisierungsschicht für biosensorische Anwendungen, welche einfach und kostengünstig erzeugbar und daher auch zur Herstellung analytischer Biochips verwendbar sind.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demzufolge eine Immobilisierungsschicht für Bionsensoren, hergestellt aus einem Polyorganosiloxan, gegebenenfalls unter Zusatz von Reaktionsvernetzern/Reak-tionsvermittlern auf einem Trägermaterial, wobei das Polyorganosiloxan der folgenden allgemeinen Struktur entspricht:

worin folgendes gilt:
E = epoxyfunktioneller Rest mit 4 bis 20 C-Atomen;
Z = (photo)polymerisierbarer Rest mit 8 bis 40 C-Atomen;
H = hydrophiler Rest;
R¹= Niederalkylgruppe mit vorzugsweise 1 bis 4 C-Atomen;
R²= R¹ oder H und
m + n + o + p + r = 50 bis 200 = L

Die für den Aufbau der Immobilisierungsschicht verwendeten Polyorganosiloxane sind in der parallelen deutschen Patentanmeldung (Nummer noch nicht bekannt) beschrieben und tragen alle für das Funktionieren eines Biochips wesentlichen Funktionen an dem Polysiloxangerüst, nämlich Vernetzergruppen zur Ausbildung der dreidimensionalen Schicht, Linkergruppen zur Anbindung der Erkennungsmoleküle und hydrophile Gruppen, um das Eindringen der Erkennungsmoleküle, deren Anbindung sowie das Eindringen der zu erkennenden Moleküle und damit die Auslösung einer positiven Erkennungsreaktion zu erleichtern. Durch gezielte Planung des Aufbaues der vernetzbaren, hydrophilen Immobilisierungsschicht auf Basis dieser Polyorganosiloxane lassen sich in einem weiten Bereich Hydrophilie und auch Vernetzungsdichte der Immobilisierungsschicht steuern. Diese Steuerbarkeit lässt sich durch den Zusatz sogenannter Vernetzermoleküle bzw. Reaktionsvermittler weiter optimieren.

Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen 2 bis 10.

Danach wird der epoxyfunktionelle Rest in dem zur Ausbildung der Immobilisierungsschicht verwendeten Polyorganosiloxan vorzugsweise aus den folgenden Gruppen ausgewählt:

wobei die Erstere ganz besonders bevorzugt wird.

Der photopolymerisierbare Rest Z wird vorzugsweise durch Addition einer photopolymerisierbaren Verbindung an einen an der Siloxankette befindlichen epoxyfunktionellen Rest E eingeführt. Die photopolymerisierbare Verbindung ist vorzugsweise eine Acryl- oder Methacrylsäure.

Der hydrophile Rest H ist vorzugsweise ein Polyalkylenglycolether-, insbesondere eine Polyethylenglycoletherverbindung.

Insbesondere wird das zur Erzeugung der Immobilisierungsschicht verwendete Polyorganosiloxan aus der folgenden Gruppe ausgewählt:

mit
m + n + o + p + r = 150 = L
m = 90–120
o = 20–30
p = 5–20
q = 1–2
r = 5–20,

mit
m + n + o + p + r = 150 = L
m = 90–100
n = 20–30
o = 5
p = 5–20
q = 3–4
r = 15–20
s = 1–9, vorzugsweise 9
R = H, CH₃
oder

mit
m + n + o + p + r = 150 = L
m = 90–100
n = 30
o = 5
p = 10–25
q = 1–10, vorzugsweise 1–4
r = 0–5.

Wie bereits erwähnt, können zur Steigerung der Steuerbarkeit der Hydrophilie und/oder Vernetzungsdichte zusätzliche Reaktionsvermittler verwendet werden, wie Tri-(meth)-acrylate, di- und monofunktionelle Polyethylenglycol(meth)acrylate. Zum Starten der Vernetzungsreaktion werden Radikalinitiatoren eingesetzt.

Nach Applikation der Polyorganosiloxan-Mischung auf ein Transducersystem und anschließende thermische bzw. Photovernetzung oder Photostrukturierung wird eine mit Wasser quellbare, funktionelle Polyorganosiloxanschicht erhalten, in die unter Verwendung der vorhandenen Linkergruppen biologische oder chemische Erkennungsmoleküle für analytische oder diagnostische Anwendungen unter Erhalt ihrer Funktionsfähigkeit eingekuppelt werden. Grundsätzlich können die Mischungen mit allen modernen Beschichtungstechnologien appliziert werden. Bevorzugt werden jedoch Spin-Coating sowie Dispensieren. Hierbei werden die Polyorganosiloxane bzw. deren Mischung mit Vernetzermolekülen und Reaktionsvermittlern an das Beschichtungsverfahren angepasst.

Für Spin-Coating kann die zusätzliche Verwendung eines polymeren Filmbildners in der Mischung in Betracht gezogen werden. Zur Erzeugung von Submikrometer-Schichten sind keine weiteren Zusätze erforderlich. Auch ist ein Zusatz von Weichmachern nicht erforderlich. Zur Einstellung der Verarbeitungsviskosität der Polyorganosiloxan-Mischung kann ein Lösemittel, wie zum Beispiel Dimethylformamid oder Methylethylketon, zugesetzt werden.

Bei der Schichtbildung durch Dispensieren wird die Polyorganosiloxan-Mischung in Lösung je nach Transducerabmessung in Tropfen in einer Größe von einigen μl bis zu 1 nl und weniger aufgebracht. Für das Dispensieren werden hochsiedende Lösemittel, die ausreichend lange Lebensdauer des Tropfens an der Spitze der Dispensierkanüle aufweisen, verwendet, um ein reproduzierbares Dosieren und Absetzen des Tropfens zu ermöglichen. Andererseits darf der Siedepunkt des Lösemittels nicht zu hoch sein, um ein ausreichend rasches Abdampfen des Lösungsmittels aus dem abgesetzten Tropfen zu ermöglichen. Ge gebenenfalls ist hier ein Temperschritt zur Steuerung des Gehaltes an Restlösemittel erforderlich. Erfindungsgemäß kommt für das Dispensieren der Mischung vorzugsweise Dimethylformamid oder 2,3-Butandiol oder Mischungen daraus zum Einsatz.

Erfindungsgemäß werden die Polyorganosiloxan-Mischungen in Schicht- oder Spotform auf Transducer- oder Trägeroberflächen aus Metall, Glas, Silicium, Siliciumdioxid, Siliciumnitrid oder Kunststoff aufgebracht. Es können auch Oberflächen mit Topographie, die aus unterschiedlichen Materialen bestehen, wie zum Beispiel Interdigitalelektrodenarrays auf Siliciumnitrid, als Passivierung beschichtet werden. Die Beschichtung von Flächen schließt auch die Beschichtung innerer Oberflächen von Mikrokanälen oder Nanotubes ein. Die zu beschichtenden Oberflächen sind gegebenenfalls mit einem Haftvermittler zu beschichten.

Die Polymerisation und Vernetzung der Polyorganosiloxan-Mischung erfolgt durch thermische oder UV-Initiierung. Bei UV-Initiierung kann auch eine Strukturierung der Schicht durch Kontakt- bzw. Proximity-Belichtung durch eine Maske erfolgen. Die Polyorganosiloxan-Mischung arbeitet hier wie ein Negativresist, d.h. im bestrahlten Bereich wird polymerisiert und vernetzt. In den abgedunkelten Bereichen findet keine Reaktion statt. Die hier befindliche Mischung wird in einem Entwicklungsschritt wieder vom Substrat abgelöst.

Hilfskomponenten, wie polymere Filmbildner sowie nicht vernetzte Mischungsanteile werden durch Extraktion aus der vernetzten Schicht entfernt. Das kann unter Umständen zeitgleich mit dem eigentlichen Ausrüstungsschritt erfolgen.

Die biologischen oder chemischen Erkennungsmoleküle werden vorzugsweise aus wässriger Lösung, aus wässriger Pufferlösung oder aus Gemischen polarer Lösungsmittel mit Wasser auf die Immobilisierungsschicht aufgebracht. Das Aufbringen erfolgt durch Auftropfen oder Aufspoten bzw. Auf dispensieren. In Na notubes oder Mikrokanälen kann das Heranbringen der Lösung mit den biologischen oder chemischen Erkennungsmolekülen an die vernetzte Schicht auch durch den Transport durch das fluidische System selbst erfolgen. Für die zielgenaue Beladung von Messspots werden vorteilhafterweise vernetzte Spots verwendet, die von einem Schutzring umgeben sind.

Für das kovalente Ankoppeln der biologischen oder chemischen Erkennungsmoleküle, die mit einer zur in der vernetzten Schicht vorhandenen Linkergruppe passenden Kopplungsgruppe versehen sind, kann, je nach Reaktivität, ein Temperschritt erforderlich sein. Um das Austrocknen der Polyorganosiloxanschicht während der Kopplungsreaktion zu verhindern, wird in einer Klimakammer gearbeitet. Besonders geeignet für die Ankopplung an die Epoxidlinkergruppen sind Aminoalkylgruppen.

Das erfindungsgemäße System ermöglicht den Aufbau von Sensorarrays mit biologischen Erkennungsmolekülen in einer dreidimensionalen Matrix in hoher Integrationsdichte.

Claims

Immobilisierungsschicht für Biosensoren, hergestellt aus einem Polyorganosiloxan, gegebenenfalls unter Zusatz von Reaktionsver-netzern/Reaktionsvermittlern, auf einem Trägermaterial, wobei das Polyorganosiloxan der folgenden allgemeinen Struktur entspricht:
worin folgendes gilt: E = epoxyfunktioneller Rest mit 4 bis 20 C-Atomen; Z = (photo)polymerisierbarer Rest mit 8 bis 40 C-Atomen; H = hydrophiler Rest; R¹= Niederalkylgruppe mit vorzugsweise 1 bis 4 C-Atomen; R²= R¹ oder H und m + n + o + p + r = 50 bis 200 = L
Immobilisierungsschicht nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der epoxyfunktionelle Rest aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
Immobilisierungsschicht nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der epoxyfunktionelle Rest E
ist.
Immobilisierungsschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der (foto)polymerisierbare Rest Z durch Addition einer (foto)polymerisierbaren Verbindung an wenigstens einen an der Siloxankette befindlichen Rest E erhältlich ist.
Immobilisierungsschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die (foto)polymerisierbare Verbindung eine Acryl- oder Methacrylsäure ist.
Immobilisierungsschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der hydrophile Rest H eine Polyalkylenglycolether-, insbesondere eine Polyethy-lenglycoletherverbindung, ist.
Immobilisierungsschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyorganosiloxan aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
mit m + n + o + p + r = 150 = L m = 90–120 n = 20–30 o = 5 p = 5–20 q = 1–2 r = 5–20,
mit m + n + o + p + r = 150 = L m = 90–100 n = 20–30 o = 5 p = 5–20 q = 3–4 r = 15–20 s = 1–9, vorzugsweise 9 R = H, CH₃ oder
mit m + n + o + p + r = 150 = L m = 90–100 n = 30 o = 5 p = 10–25 q = 1–10, vorzugsweise 1–4 r = 0–5.
Immobilisierungsschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsvernetzer unter den Tri(meth)-acrylaten und den di- und monofunktionalen Polyalkylenglycol(meth)-acrylaten ausgewählt sind.
Immobilisierungsschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass zu deren Aufbau Radikalinitiatoren verwendet werden.
Immobilisierungsschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie auf Transducer- oder Trägeroberflächen aus Metall, Glas, Silicium, Siliciumdioxid, Siliciumnitrid, Kunststoff oder auf Oberflächen mit Topographie durch thermische Vernetzung, fotochemische Vernetzung bzw. Strukturierung hergestellt ist.
Verwendung der Immobilisierungsschicht nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung von biosensorischen Erkennungsschichten durch (kovalentes) Einkuppeln bzw. Immobilisieren von chemischen oder biologischen Erkennungsmolekülen.
Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungsmoleküle Fänger-Oligonucleotide sind.