DE10061347A1 - Verfahren zur elektrophysiologischen Messung von Ionenströmen an einer einzelnen Zelle unter Bedingungen der Ischämie und/oder der autokrinen bzw. parakrinen Stimulation - Google Patents
Verfahren zur elektrophysiologischen Messung von Ionenströmen an einer einzelnen Zelle unter Bedingungen der Ischämie und/oder der autokrinen bzw. parakrinen StimulationInfo
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Abstract
Es war Aufgabe der Erfindung, die Ionenströme an einer einzelnen Zelle entsprechend ihren physiologischen bzw. pathophysiologischen sowie gewebetypischen Zellbedingungen zu messen, wobei die Messung insbesondere unter Bedingungen der Ischämie und/oder der autokrinen bzw. parakrinen Stimulation möglich sein soll. DOLLAR A Erfindungsgemäß wird die Messung in einer Mikromesskammer (1) durchgeführt, deren Größe und vorzugsweise Form im Wesentlichen den Ausmaßen der zu untersuchenden Zelle angepasst ist und deren Wand als Ag/AgCl-Referenzdiode dient. Die Ionenstrommessung erfolgt dabei unter einer konstantgehaltenen Chloridionenkonzentration der Extrazellulärlösung (2) in der Mikromesskammer (1). DOLLAR A Die vorgeschlagene Messung der Ionenströme findet Anwendung bei der elektrophysiologischen Untersuchung von Zellen.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur elektrophysiologischen Messung von
Ionenströmen an einer einzelnen Zelle unter Bedingungen der Ischämie und/oder der
autokrinen bzw. parakrinen Stimulation.
Elektrophysiologisch werden isolierte Zellen untersucht, indem sich diese Zellen in einem
relativ großen Volumen an extrazellulärem Medium befinden und die Ionenströme mittels
der Patch-Clamp-Technik gemessen werden (O. P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann
und F. J. Sigworth: Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording
from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. 391, 1981, 85-100). Zu diesem
Zweck wird eine spitz ausgezogene Glaspipette auf die Zelle aufgesetzt. Es können die
Ströme entweder in dem Stück Membran unter der Pipettenspitze oder nach Eröffnung der
Zelle durch die gesamte Zellmembran gemessen werden. Die Badlösung stellt in jedem
Falle ein praktisch unendlich großes Reservoir dar, in dem Stoffe, die aus der Zelle
austreten, sich auch nahezu unendlich verdünnen. Unter diesen Voraussetzungen können
bei der Messung physiologische bzw. pathophysiologische Zellbedingungen nur relativ
begrenzt simuliert werden, so dass die Messergebnisse oft nicht aussagefähig sind für
Zellfunktionen unter Bedingungen der Ischämie und/oder der autokrinen bzw. parakrinen
Stimulation.
Es ist deshalb Aufgabe der Erfindung, die Ionenströme an einer einzelnen Zelle
entsprechend ihren physiologischen bzw. pathophysiologischen sowie gewebetypischen
Zellbedingungen zu messen, wobei die Messung insbesondere unter Bedingungen der
Ischämie und/oder der autokrinen bzw. parakrinen Stimulation möglich sein soll.
Erfindungsgemäß wird der über die Zellmembran fließende Ionenstrom in einer
Mikromesskammer gemessen, deren Größe und vorzugsweise Form im wesentlichen den
Ausmaßen der Zelle angepasst ist. Auf diese Weise wird die Zelle nicht wie bisher in
einem nahezu unendlich großen Reservoir an extrazellulärem Medium untersucht, in
welchem sich die aus der Zelle austretenden Stoffe in entsprechender Weise verdünnen.
Infolge der an die Zelle angepassten speziellen Mikromesskammer umgibt die darin
befindliche Extrazellulärlösung die zu untersuchende Zelle als vergleichsweise sehr kleines
Flüssigkeitsvolumen. In diesem verändert sich die Konzentration der besagten aus der Zelle
austretenden Stoffe nicht wesentlich, so dass sie für die Ionenstrommessung an der Zelle
erhalten bleiben. Auf diese Weise gelingt es, die Zelle nach der gestellten Aufgabe unter
ihren physiologischen bzw. pathophysiologischen sowie gewebetypischen Zellbedingungen
zu untersuchen, wodurch die Messergebnisse nunmehr auch aussagefähig sind für
Zeltfunktionen unter Bedingungen der Ischämie und/oder der autokrinen bzw. parakrinen
Stimulation.
Die Wand der Mikromesskammer ist vorzugsweise selbst die Ag/AgCl-Referenzelektrode
für die elektrophysiologischen Untersuchungen. Die Chlorierung der Silberwand erfolgt
vor den Messungen.
Bei der vorbeschriebenen Messung von Ganzzell-Ionenströmen, die zelltypisch im
Nanoampere-Bereich auftreten, würde sich in dem kleinen Volumen der in der
Mikromesskammer befindlichen Extrazellulärlösung die Konzentration der Chloridionen,
je nach Stromrichtung, ändern. Bisher war dieser Aspekt infolge des vergleichsweise
großen Reservoirs an Zellsuspension gegenstandslos und ohne Einfluss auf das Messergeb
nis. Um zu gewährleisten, dass sich in diesem sehr kleinen Flüssigkeitsvolumen die
Chloridionenkonzentration in der Extrazellulärlösung während der Messwerterfassung
nicht verändert, wird initial die Spannung ermittelt, bei welcher der Strom über die
Zellmembran null beträgt. Zu diesem Zweck wird die Spannung an der Zelle vor jeder
durchzuführenden Patch-Clamp-Messung iterativ verändert, bis der Strom über die
Zellmembran null ist (Nullstrom).
Nach der Messung von Jonenströmen ist es für die besagten zelltypischen Ionenstrom
größen wesentlich, die Chloridionenkonzentration in der Extrazellulärlösung wiederher
zustellen und die elektrische Stabilität der Ag/AgCl-Referenzelektrode zu gewährleisten.
Dies wird erreicht, indem jeweils ein Strom kleiner Amplitude solange appliziert wird, bis
die in der Messperiode bewegte Nettoladung wieder zurückgeflossen ist.
Bei zyklischen Verfahren zur Ionenstrommessung ist es möglich, nach Wiederherstellung
der ursprünglichen Chloridionenkonzentration jeweils nochmals iterativ den Nullstrom zu
ermitteln. Damit können für jede Patch-Clamp-Messung eventuelle geringfügige
Abweichungen des Nullstromes korrigiert werden.
In den Unteransprüchen sind weitere Ausgestaltungsmerkmale zur Anwendung des
erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere zur Begasung der Mikromesskammer
während der Patch-Clamp-Messung mit wasserdampfgesättigten Gasen, aufgeführt. Mit
dieser Begasung, die ein Austrocknen des sehr kleinen extrazellulären Flüssigkeits
volumens verhindert, wird dafür gesorgt, dass die Atmosphäre über der Mikromesskammer
wasserdampfangereichert ist.
Zur Untersuchung autokrin vermittelter Aktivierung von Ionenkanälen oder parakriner
Stimulation unter Verwendung von jeweils zwei Zellen kann wasserdampfgesättigte Luft
bzw. wasserdampfgesättigter Sauerstoff eingesetzt werden.
Zur Messung unter Bedingungen der Ischämie ist auch eine Begasung mit
wasserdampfgesättigtem reinen Argon als laminarer Strom durch die Messkammer
möglich.
Die Ionenstrommessung an der erfindungsgemäß im kleinen extrazellulären Flüssigkeits
volumen der Mikromesskammer befindlichen Zelle gestattet ferner gleichzeitig zu dieser
Auswertung die Anwendung anderer Verfahren zur Zelluntersuchung, beispielsweise an
sich bekannte Fluoreszenzverfahren für eine optische Erfassung von Flüssigkeits
bewegungen und Ionenflüssen über die Zellmembran.
Die Erfindung soll nachstehend anhand einer schematisch in der Zeichnung dargestellten
Mikromesskammer als Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.
In der Zeichnung ist eine Mikromesskammer 1 dargestellt, in der sich eine Extrazellulär
lösung 2 befindet. Mittels einer Patch-Pipette 3, die vorzugsweise mit einem aus
Übersichtsgründen nicht dargestellten Mikromanipulator in Verbindung steht, wird eine
Zelle 4, die nach dem an sich bekannten Patch-Clamp-Verfahren zu untersuchen ist,
ausgewählt und in der Mikromesskammer I mit der Extrazellulärlösung 2 platziert. Das
Aufnahmevolumen der Mikromesskammer 1 ist dabei der Größe der zu untersuchenden
Zelle 4 angepasst und beträgt ungefähr das Zweifache des Zellvolumens. Kleinere
Kammervolumen, beispielsweise das 1,5-fache gegenüber dem Zellvolumen, sind möglich.
Damit ist auch die Menge der Extrazellulärlösung 2 festgelegt und stellt in Relation zu
vergleichbaren Messkammern des Standes der Technik ein sehr geringes Reservoir dar, in
welchem sich aus der Zelle austretende Stoffe nicht wesentlich verdünnen können, so dass
die Effekte von diesen durch die Zelle 4 sezernierten Stoffen auf die Zelle 4 selbst
berücksichtigt werden.
Der Ionenstrom in der Zelle 4 wird über die Patch-Pipette 3 mit dem Patch-Clamp-
Verfahren bei konstanter Spannung gemessen. Die Referenzelektrode wird durch die aus
Silber bestehende Wandung der Mikromesskammer 1 selbst gebildet. Auf diese Wandung
wird vor der Messung eine AgCl-Schicht aufgebracht.
Um zu vermeiden, dass sich bei der Messung von Ganzzell-Ionenströmen, die zelltypisch
im Nanoampere-Bereich auftreten, während des erfindungsgemäßen Messfahrens in der
kleinvolumigen Mikromesskammer 1 die Konzentration der Chloridionen in der Extrazel
lulärlösung 2 je nach Stromrichtung ändert, wird deshalb in einem ersten Schritt vor jeder
Patch-Clamp-Messung in einem iterativen Prozess die Spannung ermittelt, bei welcher der
Strom über die Zellmembran null beträgt (Nullstrom). Über rechnergestützte Verfahren
kann dieser Prozess, in weniger als einer Sekunde erledigt werden. Mit dieser Spannung,
die für die nachfolgende Ionenstrommessung an der Zelle 4 konstantgehalten wird, ist die
Stabilität der durch die Wandung der Mikromesskammer 1 gebildeten Ag/AgCl-
Referenzelektrode gewährleistet und bleibt auch die Chloridionenkonzentration in der
Extrazellulärlösung 2 durch Elektrodenreaktionen unverändert, so dass das Ergebnis der
nachfolgenden Messung und Auswertung nicht durch solche Elektrodenreaktionen
beeinträchtigt wird.
In einem zweiten Schritt erfolgt die an sich bekannte Messung des Ionenstromes (Patch-
Clamp-Messung) über die Zelle 4. Je nach Fragestellung werden die entsprechenden
Spannungsprotokolle appliziert und die entsprechenden Membranströme gemessen bzw.
aufgezeichnet. Am Ende der Applikation der Spannungsprotokolle wird berechnet, welche
Nettoladung in der Messperiode geflossen ist. Je nach Vorzeichen dieser Nettoladung hat
sich die Konzentration der Chloridionen in der Extrazellulärlösung 2 erhöht bzw.
erniedrigt.
Um die ursprüngliche Chloridionenkonzentration vor der Patch-Clamp-Messung wieder
herzustellen, wird in einem dritten Schritt ein Strom kleiner Amplitude und entsprechender
Stromrichtung solange appliziert, bis die in der Messperiode bewegte Nettoladung wieder
zurückgeflossen ist. Dieser Vorgang wird rechentechnisch kontrolliert. Im Ergebnis stellt
sich die Chloridionenkonzentration in der Extrazellulärlösung 2 wieder weitgehend auf den
Ausgangswert ein, wobei geringe Abweichungen von dem Nullstrom über der Zelle 4
durch nochmalige Ausführung von Schritt 1 korrigiert werden können. Nach Ermittlung
und Einstellung der Spannung, die den Nullstrom hervorruft, kann beliebig lange Zeit
vergehen, da die Zelle 4 bei ihrem normalen Ruhepotential gehalten wird. Infolge des
Nullstroms über die Zelle 4 bleibt auch die Chloridionenkonzentration in der Extrazellulär
lösung 2 konstant.
Bei zyklischen Ionenstrommessungen werden die vorgenannten Schritte in einem
entsprechenden Rhythmus ausgeführt.
1
Mikromesskammer
2
Extrazellulärlösung
3
Patch-Pipette
4
Zelle
Claims (9)
1. Verfahren zur elektrophysiologischen Messung von Ionenströmen an einer einzelnen
Zelle unter Bedingungen der Ischämie und/oder der autokrinen bzw. parakrinen
Stimulation, bei dem die Ionenströme über die Zellmembran, vorzugsweise in zyklischen
Messungen, mittels der Patch-Clamp-Technik in einer Messkammer gemessen werden,
worin sich die zu untersuchende Zelle in einer Extrazellulärlösung befindet, und bei dem
die Ionenströme mit einer Patch-Pipette gegen eine Ag/AgCl-Referenzelektrode außerhalb
der Zelle registriert werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung unter
Konstanthaltung der Chloridionenkonzentration der Extrazellulärlösung in einer
Mikromesskammer durchgeführt wird, deren Größe und vorzugsweise Form im
wesentlichen den Ausmaßen der zu untersuchenden Zelle angepasst ist.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung in einer
Mikromesskammer durchgeführt wird, deren Volumen im wesentlichen doppelt so groß ist
wie das Volumen der zu messenden Zelle und auf deren aus Silber bestehende Wandung
zur Ausbildung der Ag/AgCl-Referenzelektrode vor der Messung eine AgCl-Schicht
aufgebracht wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zum Zweck der Konstant
haltung der Chloridionenkonzentration in der Extrazellulärlösung für die Gewährleistung
der Stabilität der Ag/AgCl-Referenzelektrode vor jeder durchzuführenden Patch-Clamp-
Messung iterativ die Spannung ermittelt wird, bei welcher der Strom über die Zellmembran
null (Nullstrom) beträgt, und dass zur Wiederherstellung der ursprünglichen Chloridionen
konzentration in der Extrazellulärlösung nach jeder Patch-Clamp-Messung jeweils ein
Strom kleiner Amplitude solange appliziert wird, bis die in der Patch-Clamp-Messperiode
bewegte Nettoladung wieder zurückgeflossen ist.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass nach Wiederherstellung
der ursprünglichen Chloridionenkonzentration nochmals iterativ die Spannung ermittelt
wird, bei welcher der Strom über die Zellmembran null (Nullstrom) beträgt, um eventuelle
geringfügige Abweichungen des Nullstromes zu korrigieren.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikromesskammer
während der Patch-Clamp-Messung mit einem wasserdampfgesättigten Gas überströmt
wird.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikromesskammer zur
Messung unter aeroben Bedingungen, beispielsweise zur autokrin vermittelten Aktivierung
von Ionenkanälen, mit wasserdampfgesättigter Luft bzw. wasserdampfgesättigtem Sauer
stoff begast wird.
7. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikromesskammer
unter Begasung mit wasserdampfgesättigter Luft bzw. wasserdampfgesättigtem Sauerstoff
zum Zweck der Untersuchung parakriner Stimulation mit zwei Zellen belegt wird, wobei
eine Zelle zur Simulation und die andere Zelle zur Messung der Jonenströme verwendet
wird.
8. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikromesskammer zur
Messung unter Bedingungen der Ischämie an der Zelle mit wasserdampfgesättigtem reinen
Argon überströmt wird.
9. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass gleichzeitig zur Messung
der Ionenströme an sich bekannte Fluoreszenzverfahren für eine optische Erfassung von
Flüssigkeitsbewegungen und Ionenflüssen durch die Zellmembran eingesetzt werden.
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|---|---|---|---|
| 8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |