DE10049267B4 - Verfahren zur Erzeugung oder Erhöhung einer Resistenz in Organismen gegenüber biotischen Streßfaktoren - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Erzeugung oder Erhöhung einer Resistenz in einem Organismus gegenüber biotischen Streßfaktoren, wobei eine Veränderung der Verteilung von ATP und/oder ADP in Zellen des Organismus durchgeführt wird.

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung oder Erhöhung einer Resistenz in Organismen, insbesondere Pflanzen, gegen biotischen Streß. Das Verfahren basiert auf einer über verschiedene Methoden durchführbaren Veränderung der Verteilung von ATP und/oder ADP in den Zellen des Organismus.
• Pflanzen sind einer Vielzahl von biotischen Streßfaktoren ausgesetzt. Zu den biotischen Streßfaktoren gehören vor allem Krankheitserreger, beispielsweise phytopathogene Pilze, Bakterien und Viren. Durch diese Streßfaktoren wird der Ertrag beim landwirtschaftlichen oder gartenbaulichen Anbau der Kulturpflanzen erheblich beeinträchtigt oder es werden sogar ganze Ernten vernichtet. Die klassische Pflanzenzüchtung versucht deshalb seit langem, Resistenzen gegen biotische Streßfaktoren, insbesondere gegen Krankheitserreger, in die aktuellen Pflanzensorten zu integrieren. Bei bekannten wirksamen Resistenzen, insbesondere bei Krankheitsresistenzen, handelt es sich aber meist um Resistenzmechanismen, die auf dem Zusammenspiel einer Vielzahl beteiligter Gene beruhen, die oft auch auf mehreren Chromosomen verteilt sind, wodurch die Entwicklung effizient resistenter Sorten sehr schwierig ist. Hinzu kommt, daß in vielen Fällen keine natürlich vorkommenden Resistenzmechanismen in dem zur Verfügung stehenden Genpool vorhanden sind. Andere Resistenzmerkmale sind wiederum so uneffektiv, daß kein ausreichender oder dauerhafter Schutz erreicht werden kann.
• Daher wird seit vielen Jahren versucht, diese Lücke in der Pflanzenzüchtung durch Einsatz von chemischen Pflanzenschutzmitteln zu schließen. Dies bedingt aber den Einsatz von zumeist umweltunfreundlichen Chemikalien im Großmaßstab auf dem Feld. Auch der Einsatz der Gentechnik, mittels derer versucht wird, neue Resistenzgene einzuführen bzw. bekannte Resistenzmechanismen zu verbessern, hat vielfach noch nicht den erhofften Erfolg gebracht.
• WO 00/46347 beschreibt ein Verfahren zur Erhöhung bzw. Erniedrigung der Drogen-Resistenz in einer Zielzelle, bei dem der ATP-Gradient der biologischen Membran der Zielzelle verändert wird. Mit Drogen-Resistenz ist eine solche gegenüber chemischen Verbindungen, z. B. Herbiziden, Antibiotika und Chemotherapeutika, gemeint. Das Verfahren von WO 00/46347 betrifft jedoch nicht die Beeinflussung einer Resistenz gegenüber biotischen Streßfaktoren.
• Der vorliegenden Erfindung liegt somit das technische Problem zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem in Organismen, insbesondere Pflanzen, eine breite, allgemeine Resistenz gegen biotischen Streß erzeugt werden kann.
• Dieses technische Problem wird durch die Gegenstände in den Patentansprüchen gelöst. Die vorliegende Erfindung umfaßt einen neuen Resistenzmechanismus gegen biotische Streßfaktoren in Organismen, wie Pflanzen, der auf der Stärkung der allgemeinen Resistenz beruht. Überraschenderweise wurde gefunden, daß es möglich ist, durch die Veränderung der Verteilung von ATP oder ADP in der Zelle eine derartige physiologische Änderung hervorzurufen, daß eine signifikant höhere Resistenz, beispielsweise gegenüber Pflanzenschädlingen, erreicht werden kann.
• ATP stellt den universellen Energieträger aller lebenden Zellen dar. Für annähernd jeden anabolen Stoffwechselweg wird Energie in Form von ATP benötigt. In heterotrophen Pflanzenzellen wird ATP hauptsächlich mittels oxidativer Phosphorylierung in den Mitochondrien aus ADP und anorganischem Phosphat synthetisiert. Unter anaeroben Bedingungen geschieht dies mittels Substratkettenphosphorylierung im Zytosol. Der ATP-Export aus den Mitochondrien erfolgt über das mitochondriale ADP/ATP-Transportprotein, das eines der bestuntersuchten Membranproteine darstellt. Das mitochondriale ADP/ATP-Transportprotein katalysiert ausschließlich den Export von ATP im Gegenzug zum ADP-Import.
• Im Falle von heterotrophen pflanzlichen Speichergeweben wird ein vergleichsweise großer Anteil des ATP in die Speicherplastiden aufgenommen, um ausschließlich dort stattfindende Biosyntheseschritte, wie für die Stärke- oder Fettsäurebiosynthese, zu energetisieren. Diese Aufnahme wird durch ein plastidäres ATP/ADP-Transportprotein katalysiert, welches in der inneren Hüllmembran lokali siert ist und die ATP-Aufnahme im Gegenzug zur ADP-Abgabe ermöglicht.
• Zur Analyse der Wirkung veränderter piastidärer ATP/ADP-Transporteraktivitäten auf den Kohlenhydrathaushalt wurden in den zu der vorliegenden Erfindung führenden Experimenten transgene Kartoffelpflanzen mit erhöhter bzw. verringerter Aktivität des Transportes hergestellt.
• Es wurde die Menge des endogenen plastidären ATP/ADP-Transporters in Kartoffel (AATP1, Solanum tuberosum St) mittels einer Antisense-Inhibition verringert. Ein Teil der für AATP1,St-kodierenden cDNA wurde in "Antisense"-Orientierung in das Kartoffelgenom eingeführt, wobei verschiedene unabhängige Linien mit jeweils individuell verringter Aktivität des plastidären ATP/ADP-Transporters erhalten wurden. Diese cDNA stand unter der Kontrolle des konstitutiven Blumenkohlmosaikvirus 35S-Promotors. Die Aktivität des plastidären ATP/ADP-Transporters wurde dadurch auf 64% bis 79% im Vergleich zu derjenigen in nicht-transgenen Kontrollpflanzen reduziert. Die transgenen Kartoffelpflanzen zeigten keine phänotypischen Veränderungen im Bereich der oberirdischen grünen Gewebe. Im Gegensatz dazu war die Morphologie der Knollen deutlich verändert (verzweigte Knollen) und der Stärkegehalt sank bis auf ca. 50% im Vergleich zu den nicht-transgenen Kontrollpflanzen (Tjaden et al., Plant Journal 16 (1998), 531-540). Dieser physiologische Befund bedeutet demnach, daß aufgrund der verringerten ATP/ADP-Transporteraktivität vergleichsweise weniger ATP in die Plastiden aufgenommen wurde.
• Ferner wurden transgene Kartoffelpflanzen mit erhöhter Aktivität des plastidären ATP/ADP-Transporters erzeugt, indem die cDNA für den plastidären ATP/ADP-Transporter aus Arabidopsis thaliana (AATP1,At) in "Sense"-Orientierung unter der Kontrolle des 35S-Promotors in das Kartoffelgenom eingeführt wurde. Hierbei entstanden verschiedene unabhängige Linien mit jeweils individuell erhöhter Aktivität des plastidären ATP/ADP-Transporters. Die gemessene Aktivität des plastidären ATP/ADP-Transporters lag in den verschiedenen Linien zwischen 130 und 148% im Vergleich zu derjenigen in nicht-transgenen Kontrollpflanzen. Die transgenen Kartoffelpflanzen zeigten keine phänotypischen Veränderungen im Bereich der oberirdischen grünen Gewebe. Der Stärkegehalt war dagegen bis auf ca. 150% der nicht-transgenen Kontrollknollen erhöht (Tjaden et al., supra). Dieser physiologische Befund bedeutet demnach, daß aufgrund der erhöhten ATP/ADP-Transporteraktivität vergleichsweise mehr ATP in die Plastiden aufgenommen wurde.
• Es ist zu vermuten, daß die Veränderung von ATP- oder ADP-Konzentrationen in bestimmten Teilen einer Pflanzenzelle erhebliche Auswirkungen auf den Zellstoffwechsel und die Regulierung von Genen hat. In den zu der vorliegenden Erfindung führenden Studien wurde daher untersucht, ob infolge einer solchen Veränderung auch die Resistenzeigenschaften der Pflanzen beeinflußt werden. Hierzu wurden z. B. mit den in Tjaden et al. (supra) beschriebenen Genkonstrukten zur "Antisense"-Erniedrigung oder "Sense"-Erhöhung der ATP-/ADP-Transporter-Aktivität transgene Kartoffelpflanzen der Sorte Désirée erzeugt. Diese wurden einer phytopathologischen Überprüfung der Resistenzeigenschaften unterzogen. Hierzu wurde insbesondere die Resistenz gegenüber dem phytopathogenen Bakterium Erwinia carotovora in Knollenscheibentests intensiv geprüft. Es zeigte sich, daß in den transgenen Pflanzen eine deutliche Verbesserung der Resistenzeigenschaften auftrat (vgl. das nachstehende Beispiel 1 und 1).
• Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung oder Erhöhung einer Resistenz von Organismen, vorzugsweise Pflanzen, gegenüber biotischen Streßfaktoren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Veränderung der Verteilung von ATP und/oder ADP in den Zellen des Organismus (gegenüber der ursprünglichen Situation) durchgeführt wird.
• Der hier verwendete Begriff "Resistenz gegenüber biotischen Streßfaktoren" betrifft eine Resistenz gegenüber einer Vielzahl von Faktoren die als biotische Streßfaktoren bezeichnet werden. Als biotische Streßfaktoren sind insbesondere phytopathogene Pilze, wie Phytophthora infestans, Botrytis cinerea, Alternaria alternata, Fusarium oxysporum, Ustilago maydis, und bakterielle Pathogene, wie Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris und Clavibacter michiganense, zu nennen.
• Vorzugsweise ist somit die durch das erfindungsgemäße Verfahren erzielte Resistenz eine Krankheitsresistenz oder Schädlingsresistenz.
• Bei den für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Organismen handelt es sich um Tiere, den Menschen und Pflanzen. Bei Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflanzen jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, d. h. sowohl um monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Der hier verwendete Begriff "Pflanze" umfaßt auch Gramineen, Chenopodien, Leguminosen, Brasicaceen, Solanaceen, Pilze, Moose und Algen. Bevorzugt handelt es sich um Nutzpflanzen, z. B. um Pflanzen, wie Weizen, Gerste, Reis, Mais, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Raps, Senf, Rübsen, Flachs, Erbse, Bohne Lupine, Tabak und Kartoffel.
• In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß in dem Organismus die Aktivität oder Konzentration eines Proteins erhöht oder verringert wird, das an der subzellulären Verteilung von ATP und ADP beteiligt ist, wobei es sich ein Protein handelt, das natürlicherweise in dem entsprechenden Organismus vorhanden ist, z. B. das mitochondriale ADP/ATP-Transportprotein, der plastidäre ATP/ADP-Transporter, oder der plastidäre Triosephosphat/Phosphat-Transporter. Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der die Expression eines für ein solches Protein kodierenden Gens erhöht oder verringert wird. Diese Modifikation der Genexpression kann mittels dem Fachmann bekannter Verfahren erfolgen. Beispielsweise kann dies durch die vorstehend und in Beispiel 1 beschriebene Veränderung der Proteinkonzentration mittels "Antisense" – oder "Sense"-Konstrukten erfolgen. Grundsätzlich kann die Veränderung der Proteinaktivität oder -konzentration sowohl auf der Ebene der Genexpression als auch über eine funktionelle Inhibierung der Proteinaktivität erfolgen, z. B. durch die Expression bindender, inhibierender, neutralisierender oder katalytischer Antikörper oder anderer spezifisch bindender und blockierender Proteine oder Peptide, durch Ribozyme, Einzel- oder Doppelstrang-Oligonukleotide, Aptamere, Lipide, natürliche Rezeptoren, Lektine, Kohlenhydrate etc..
• Aptamere, Lipide, natürliche Rezeptoren, Lektine, Kohlenhydrate etc..
• In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die ATP- oder ADP-Konzentration in Zellkompartimenten auch durch Einschleusung eines Proteins (Polypeptids) beeinfluß werden, das natürlicherweise in dem betreffenden Organismus nicht vorhanden ist. Zur Erzielung der Lokalisation des Proteins in dem gewünschten Zellkompartiment kann es günstig sein, wenn das Protein ein Signalpeptid aufweist, wodurch es in bestimmte Zellkompartimente einer Pflanzenzelle transportiert werden kann. Geeignete Signalpeptide und Verfahren zur Verknüpfung der Signalpeptide mit einem gewünschten Protein sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise wird auf das Signalpeptid der Amylase aus Gerste hinsichtlich des Apoplasten (Düring et al., Plant Journal 3 (1993), 587 598), auf ein Maus-Signalpeptid, auf die Kombination aus einem Maus-Signalpeptid und dem KDEL-ER-Retentionssignal hinsichtlich des ER (Artsaenko et al., Molecular Breeding 4 (1998), 313-319), auf das Targeting-Signal einer Säuger- -2,6-Sialyltransferase hinsichtlich des Golgi-Apparats (Wee et al., Plant Cell IV (1998), 1759-1768), auf das Vakuolen-Lokalisierungssignal einer vakuolären Chitinase aus Gurke hinsichtlich der Vakuolen (Neuhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 10362-10366), auf das Ferredoxin-Transitpeptid hinsichtlich der Chloroplasten und Plastiden, und auf das Transitpeptid von Tryptophanyl-t RNA-Snthetase aus Hefe hinsichtlich der Mitochondrien (Schmitz und Lonsdale, Plant Cell 1 (1989), 783-791) verwiesen. Grundsätzlich kann das Protein, das an der subzellulären Verteilung von ATP und ADP beteiligt ist, mittels verschiedener Verfahren, z. B. über Medien, wie Kulturmedien, einer Pflanze bzw. Teilen dieser, insbesondere Pflanzenzellen, verabreicht werden. Bevorzugt ist jedoch – wie bereits vorstehend ausgeführt – die Verabreichung des Proteins in Form einer es kodierenden Nukleinsäure, z. B. DNA oder RNA, an Pflanzen oder Teile dieser. Hierzu ist es notwendig, daß die Nukleinsäure in einem Expressionsvektor vorliegt bzw. mit Sequenzen eines solchen ligiert ist, wobei es günstig sein kann, wenn dieser bzw. diese eine Expression der Nukleinsäure in Zellkompartimenten ermöglichen. Solche Expressionsvektoren bzw. Sequenzen dieser sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise wird auf Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 8526-8530; Khan und Maliga, Nature Biotechnology 17 (1999), 910 – 915; und Sidorov et al., Plant Journal 19 ( 1999), 209-216 verwie sen.
• Verfahren zur Konstruktion der Expressionsvektoren, die das gewünschte Gen, z. B. für einen plastidären ATP/ADP-Transporter aus Arabidopsis thaliana (AATP1,At), in exprimierbarer Form enthalten, sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise auch in gängigen Standardwerken beschrieben (vgl. z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Die Expressionsvektoren können auf einem Plasmid, Cosmid, Virus, Bacteriophagen oder einem anderen in der Gentechnik üblichen Vektor basieren. Diese Vektoren können weitere Funktionseinheiten besitzen, die eine Stabilisierung des Vektors z. B. in der Pflanze bewirken. Für Pflanzen können sie ferner "left border"- und "right border"-Sequenzen agrobakterieller T-DNA enthalten, wodurch eine stabile Integration in das Erbgut von Pflanzen ermöglicht wird. Des weiteren kann eine Terminationssequenz vorhanden sein, die der korrekten Beendigung der Transkription sowie der Addition einer Poly-A-Sequenz an das Transkript dient. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) und beliebig austauschbar.
• Für die Expression des für das gewünschte Protein kodierenden Gens geeignete Promotoren sind dem Fachmann bekannt und dazu zählen beispielsweise der Cauliflower Mosaic Virus 35S Promotor (Odell et al., Nature 313 (1995), 810-812), der Agrobacterium tumefaciens Nopalin Synthase Promotor und der Mannopin Synthase Promotor (Harpster et al., Molecular and General Genetics 212 (1988), 182-190).
• Die Erhöhung oder Erniedrigung der vorstehend beschriebenen Proteinaktivitäten kann konstitutiv oder zeitlich, lokal oder durch bestimmte Stimuli induzierbar erfolgen. Durch eine zeitlich oder lokal begrenzte oder induzierbare Erhöhung oder Erniedrigung der Proteinaktivitäten werden auch die bei Tjaden et al. (supra) beschriebenen Veränderungen in der Knollenmorphologie unterbunden.
• Somit ist eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des gewünschten Gens in sein, was z. B. die Steuerung der Synthese des gewünschten Proteins z. B. in einer Pflanze, zu einem gewünschten Zeitpunkt erlaubt. Geeignete Promotoren sind dem Fachmann bekannt und dazu zählen beispielsweise der anaerob induzierbare Gap C4 Promotor aus Mais (Bülow et al., Molecular Plant-Microbe Interactions 12 (1999), 182-188), PR-Promotoren, wie L-Phenylalanin Ammonium Lyase-, Chalcon Synthase- und "Hydroxyproline rich glycoprotein"-Promotoren, induzierbar durch Ethylen (Ecker and Davies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5202-5210) und ein durch Dexamethason induzierbares chimäres Transkriptions-Induktionssystem (Kunkel et al., Nature Biotechnology 17 (1990), 916 918), der IncW-Promotor aus Mais, induzierbar durch Saccharose oder D-Glucose (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999), 10512-10517. Ferner wird auf Datla et al., Biotechnology Annual Review 3 (1997), 269-290, und Gatz und Denk, Trends in Plant Science 3 (1998), 352 358 verwiesen. Desweiteren eignen sich Promotoren, die eine lokale Regulation der Expression, also nur in bestimmten Pflanzenteilen oder Organen, erlauben. Solche Promotoren sind z. B. der Patatin-Promotor aus Kartoffel (Liu et al., Molecular and General Genetics 223 (1990), 401-406) (knollenspezifisch), der Napin-Promotor aus Raps (Radke et al., Theoretical and Applied Genetics 75 (1988), 685-694) (im Samen embyosspezifisch), der RolC-Promotor aus Agrobacterium rhizogenes (Yokoyama et al., Molecular and General Genetics 244 (1994), 15-22) (Phloem-spezifisch), der TA29-Promotor aus Tabak (Kriete et al., Plant Journal 9 (1996), 809-818) (Tapetum-spezifisch), der LeB4-Promotor aus Vicia faba (Bäumlein et al., Molecular and General Genetics 225 (1991), 121-128) (samenspezifisch) und die rbcS- und cab-Promotoren aus Petunia (Jones et al., Molecular and General Genetics 212 (1988), 536-542) (blattspezifisch bzw. beschränkt auf photosynthetisch aktive Gewebe.
• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Expression des plastidären ATP/ADP-Transporters erhöht oder erniedrigt, wobei z. B. die Erniedrigung der Expression durch die Einschleusung eines "Antisense"-Konstruktes erfolgen kann, das die Expression des endogenen Gens hemmt, und die Erhöhung der Expression durch die Einschleusung eines "Sense"-Konstruktes, wobei es sich bei dem "Sense"-Konstrukt um ein auf einem Expressionsvektor vorliegendes Gen für den endogenen Transporter z. B. unter "Sense"-Konstruktes, wobei es sich bei dem "Sense"-Konstrukt um ein auf einem Expressionsvektor vorliegendes Gen für den endogenen Transporter z. B. unter Kontrolle eines starken Promotors handeln kann, aber auch um ein heterologes Gen, das für einen Transporter aus einem anderen Organismus, vorzugsweise einem nahe verwandten Organismus, kodiert.
• Zur Herstellung der Expressionsvektoren zur Einführung in Pflanzen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pA-CYC184, etc.. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Der erhaltene Vektor wird für die Transformation von E.coli-Zellen verwendet. Transformierte E.coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Der Vektor wird dann wiedergewonnen. Als Analysemethoden zur Charakterisierung der gewonnenen Vektor-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Vektor-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente können mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Vektor-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder in andere Vektoren kloniert werden.
• Für die Einführung der vorstehenden Expressionsvektoren in eine Pflanzenzelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation von Pflanzenzellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.
• Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Vektoren gestellt. Es können einfache Plasmide, wie z. B. pUC-Derivate, verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, sollte ein selektierbarer Marker vorhanden sein. Geeignete selektierbare Marker sind dem Fachmann bekannt und dazu zählen beispielsweise das Neomycinphosphotransferase II-Gen aus E. coli (Beck et al., Gene 19 (1982), 327 336), das Sulfonamid-Resistenzgen (EP-369637) und das Hygromycin-Resistenzgen (EP-186425). Je nach Einführungsmethode für die gewünschten Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Wird z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch müssen die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.
• Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Vektoren kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor (vgl. das nachstehende Beispiel 1). Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden. Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium sollte ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.
• Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobakterium rhizogenes cokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regene riert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes, die elektrisch oder chemisch induzierte DNA-Aufnahme in Protoplasten, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die Makroinjektion von DNA in Blütenstände, die Mikroinjektion von DNA in Mikrosporen und Pro-Embryonen, die DNA-Aufnahme durch keimende Pollen und die DNA-Aufnahme in Embryonen durch Quellung (zur Übersicht: Potrykus, Biotechnologie 8 (1990), 535-542). Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plasmid-Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels auf Agrobacterium basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind.
• In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäß verwendeten Expressionsvektoren Lokalisierungssignale für die Lokalisierung in Zellkompartimenten, insbesondere endoplasmatischem Retikulum (ER), Apoplasten, Golgi-Apparat, Plastiden, Peroxisomen, Mitochondrien und/oder Vakuolen. Es wird auf vorstehende Ausführungen hinsichtlich der Signalpeptide verwiesen. Besonders bevorzugt sind als Lokalisierungssignale das KDEL-ER-Targeting-Peptid, das Golgi-Lokalisierungssignal der β-1,2-N-Acetylglucosamintransferase (GnTI), das Transitpeptid aus der kleinen Untereinheit der Ribulose-Biphosphat-Carboxylase und/oder das vakuoläre Targeting-Signal SKNPIN.
• Die für die Expression des Proteins gewünschten Pflanzenteile betreffen im Prinzip jedes beliebige Pflanzenteil, jedenfalls Vermehrungsmaterial dieser Pflanzen, beispielsweise Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge etc.
• Mit der vorliegenden Erfindung ist es prinzipiell auch möglich, eine Resistenz gegen biotischen Streß in Tieren und dem Menschen zu erzeugen bzw. zu erhöhen. Hierfür kann das vorstehende Protein als solches oder in Kombination mit einem Signalpeptid an Tiere, den Menschen oder Zellen dieser verabreicht werden. Ein solches Signalpeptid kann z. B. ein Maus-Signalpeptid, eine Kombination aus einem Maus-Signalpeptid und dem KDEL-ER-Retentionssignal oder das Targeting-Signal einer Säuger-alpha-2,6- Sialyltransferase hinsichtlich des Golgi-Apparats sein. Ferner kann das Protein in Form einer es kodierenden Nukleinsäure, z.B. DNA oder RNA, an Tiere, den Menschen oder Zellen dieser verabreicht werden. Für die Verabreichung in Form einer Nukleinsäure ist es notwendig, daß diese in einem Expressionsvektor vorliegt bzw. mit Sequenzen eines solchen ligiert ist. Es wird auf die vorstehenden allgemeinen Ausführungen hinsichtlich Expressionsvektoren und ihre Herstellung verwiesen. Ergänzend wird auf Vektoren verwiesen, die sich für die Gentherapie bei Tieren eignen. In diesen kann die Nukleinsäure unter der Kontrolle eines induzierbaren oder gewebespezifischen Promotors, wie Metallothionein I- oder Polyhedrin-Promotors, stehen. Bevorzugte Vektoren sind z. B. Viren, wie Retroviren, Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren oder Vaccinia-Viren. Beispiele von Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MUMTV, RSV oder GaLV. Des weiteren kann die für das Polypeptid kodierende Nukleinsäure in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Hierzu zählen z. B. Liposomen und Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682).
• Erfindungsgemäß wird das vorstehende Protein an Tiere, den Menschen und Zellen dieser verabreicht. Dabei kann es sich prinzipiell um Tiere jeder beliebigen Tierspezies handeln. Vorzugsweise handelt es sich um Nutz- und Haustiere, z. B. Rinder, Pferde, Schafe, Schweine, Ziegen, Hunde, Katzen, etc.
• Beispiele für biotischen Streß bei Tieren bzw. dem Menschen stellen insbesondere tierpathogene Pilze dar, die Erkrankungen, wie Candidamycosen, Cryptococcosen, Aspergillosen, Dermatomycosen, Hystopolasmosen, Coccidiomycosen und Blastomycosen erzeugen, und bakterielle Pathogene, wie Micrococcaceae (z. B. Staphylococci), Lactobacteriaceae (z. B. Streptococci), Neisseriaceae (z. B. Neisseriae), Corynebacteriaceae, Spirillaceae, Listeria bacteriae, Mycobacteriaceae, Enterobacteriaceae (z. B. Escherichia bacteriae), Salmonellae, Brucellaceae (z. B. Pasteurella bacteriae), anaerobe and aerobe Sporenbildner (e.g. Bacillaceae, Clostridia) und Rickettsiales. Insgesamt gesehen eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren bestens, um in der Pflanzen- und Tierzüchtung sowie in der Humanmedizin eingesetzt zu werden.
• Kurze Beschreibung der Figuren:
• 1 zeigt verbleibendes intaktes Kartoffelknollengewebe (in %) nach Inokulation von Knollenscheiben mit 2000 Erwinia carotovora ssp. atroseptica Bakterien in 2 μl und Inkubation für drei Tage nach Düring et al., supra. Linien MPB/aATPT enthalten das "Antisense"-Genkonstrukt, Linien MPB/sATPT enthalten das "Sense"-Genkonstrukt für den plastidären ATP/ADP-Transporter aus Arabidopsis thaliana in transgenen Kartoffelpflanzen der Sorte Désirée. Désirée: nicht-transgene Ausgangssorte als Kontrolle.
• Die Erfindung wird durch das nachstehene Beispiel erläutert.
• Beispiel 1: Erhöhung der Resistenz von transgenen Kartoffelknollen gegen Erwinia carotovora
• Die in Tjaden et al. (supra) beschriebenen Genkonstrukte zur "Antisense"-Erniedrigung ("MPB/aATPT") oder "Sense"-Erhöhung ("MPB/sATPT") der plastidären ATP/ADP-Transporter-Aktivität in Kartoffelknollen wurden jeweils "blunt-end" in die geöffnete und aufgefüllte singuläre Hindlll-Schnittstelle des binären Vektors pSR 8-30 (vgl. Düring et al., supra; Porsch et al., Plant Molecular Biology (1998) 37, 581-585) ligiert. Man erhielt die beiden Transformationsvektoren pSR 8-30/aATPT und pSR 8-30/sATPT. Diese beiden Expressionsvektoren wurden einzeln zur Transformation von E.coli SM10 verwendet. Transformanten wurden mit Agrobacterium GV 3101 gemischt und über Nacht bei 28°C inkubiert. (Koncz und Schell, Mol.Gen.Genet. (1986) 204, 383-396; Koncz. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1987) 84, 131-135). Es wurde auf Carbenicillin selektioniert, wobei das hierfür notwendige bla-Gen in den vorstehenden Expressionsvektoren vorlag. Selektionsklone von Agrobacterium tumefaciens wurden auf abgeschnittenen und mehrfach an der Mittelrippe eingeritzten Blättern der Kartoffelpflanze cv. Désirée aufgebracht und die Blätter wurden 2 Tage bei 20°C im Dunkeln inkubiert. Danach wurden die Agrobakterien abgewaschen und den Kartoffelblättern Pflanzenwuchststoffe zugesetzt, so daß bevorzugt Sprosse regenerierten. Ferner wurden durch die Zugabe von Kanamycin in das Pflanzenmedium nicht-transformierte Zellen in den Kartoffelblättern abgetötet. Heranwachsende Sprosse wurden abgeschnitten und auf dem Medium ohne Pflanzenwachstumsstoffe, aber mit Kanamycin, bewurzelt. Die weitere Kultivierung der Kartoffelpflanzen ertolgte in üblicher Weise. Man erhielt einerseits transgene Linien mit dem "Antisense"-Genkonstrukt und andererseits transgene Linien mit dem "Sense"-Genkonstrukt. Die regenerierten Kartoffellinien wurden in Erde ausgepflanzt und im Gewächshaus angezogen. Nach Abreifen der Kartoffelpflanzen wurden die Knollen geerntet und für die phytopathologische Prüfung gelagert.
• Die Resistenzeigenschaften der transgenen Kartoffelknollen gegenüber dem bakteriellen Pathogen Erwinia carotovora wurden in einem Knollenscheibentest geprüft. Dazu wurden Knollen geschält und 1 cm dicke Zylinder ausgestochen. Diese wurden wiederum in 3 mm dicke Scheiben geschnitten. Die grundsätzliche experimentelle Verfahrensweise ist in Düring et al., supra) beschrieben. Die auf einem nassen Filterpapier ausgelegten Knollenscheiben wurden in der Mitte frisch angestochen und eine Suspension von 2000 Erwinia carotovora ssp. atroseptica Bakterien wurde in 2 ml Volumen aufgetragen. Nach drei Tagen wurde das mazerierte Gewebe abgespült und das verbleibende feste Kartoffelgewebe nach Abtrocknen gewogen. Die Ergebnisse von 4 transgenen Linien der Serie MPB/aATPT und von 3 Linien der Serie MPB/sATPT sind in Figur. 1 dargestellt. Bei dem "Antisense"-Genkonstrukt (Linien MPB/aATPT) lag dabei der Anteil des verbliebenen intakten Gewebes bei ca. 15% bei der nicht-transgenen Kontrolle, während bei den transgenen Linien dieser Anteil bei annähernd 90% lag. Auch bei dem "Sense"-Genkonstrukt (Linien MPB/sATPT) lag der Anteil bei etwa 35%. Somit ist deutlich, daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine deutliche Steigerung der Resistenz, z.B. gegen Erwinia carotovora ssp. atroseptica, erzielt werden kann.

Claims (9)

1. Verfahren zur Erzeugung oder Erhöhung einer Resistenz in einem Organismus gegenüber biotischen Streßfaktoren, wobei eine Veränderung der Verteilung von ATP und/oder ADP in Zellen des Organismus durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Organismus eine Pflanze ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Pflanze Gramineen, Chenopodien, Leguminosen, Brasicaceen, Solanaceen, Pilze, Moose und Algen umfaßt.
4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Pflanze Weizen, Gerste, Reis, Mais, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Raps, Senf, Rüben, Flachs, Erbse, Bohne, Lupine, Tabak und Kartoffel umfaßt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Resistenz eine Krankheitsresistenz oder Schädlingsresistenz ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Organismus die Aktivität oder Konzentration eines Proteins erhöht oder verringert wird, das an der subzellulären Verteilung von ATP und ADP beteiligt ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Organismus die Expression eines Gens erhöht oder verringert wird, das für ein Protein kodiert, das an der subzellulären Verteilung von ATP und/oder ADP beteiligt ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression zeitlich, lokal oder induzierbar reguliert wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des plastidären ATP/ADP-Transporters erhöht oder erniedrigt wird.