CN104673804B - 一种调节蔗糖合成的水稻基因及其应用 - Google Patents
一种调节蔗糖合成的水稻基因及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种调节蔗糖合成的水稻基因Os‑ER‑ANT1，该基因缺失导致水稻Os‑ER‑ANT1基因失活，引起蔗糖合成受阻，造成突变体3叶期后迅速死亡，表明Os‑ER‑ANT1是具有重要功能的看家基因，对水稻蔗糖代谢具有重要的正向调节作用。本发明不仅为研究水稻蔗糖合成的机制奠定基础，而且为研究Os‑ER‑ANT1蛋白的生物学功能及应用水稻Os‑ER‑ANT1基因改良作物品种提供了基础。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种调节蔗糖合成的水稻基因Os-ER-ANT1及其编码的蛋白与应用。
背景技术
水稻是我国的重要粮食作物，中国水稻播种面占全国粮食作物的1/4，水稻的有效穗、结实率、千粒重和籽粒充实度是构成产量的重要因素，这些因素与糖代谢有着一定的关系。
蔗糖是光合作用的主要终产物之一，是多数植物体内长距离运输碳水化合物的主要形式，它不仅为库器官进行的各项生理活动提供能量，同时也是某些植物如甘蔗、甜菜、胡萝卜等贮藏的主要化合物。
植物中与蔗糖代谢有关的酶有三类，分别是转化酶或G-呋喃果糖苷酶(Inv)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、蔗糖合成酶(SUSy)，其中蔗糖合成酶是催化蔗糖代谢的关键酶之一。除此之外，寻找调节蔗糖合成相关基因，将为作物改良提供新的选择。
三磷酸腺苷(ATP)是生物体内主要的能源载体。ATP/ADP转运蛋白是真核生物的一种腺苷酸转运载体，是质体ATP浓度的主要调节者。发明人通过对编码水稻ATP/ADP转运蛋白的编码基因Os-ER-ANT1基因的研究，发现该基因能够调节植物的蔗糖合成，该基因与光合作用密切相关。
发明内容
为研究植物蔗糖合成的机理以及光合作用的机理，本发明目的是同一种调节蔗糖合成的基因Os-ER-ANT1及其编码蛋白与应用。
本发明提供了Os-ER-ANT1基因在调节植物蔗糖合成中的应用，所述Os-ER-ANT1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。Os-ER-ANT1基因为编码ATP/ADP转运蛋白的水稻基因。
优选地，所述的植物为水稻。
本发明提供了Os-ER-ANT1基因在植物育种中的应用。
本发明还提供了Os-ER-ANT1基因在培育转基因植物中的应用。
本发明还提供用于扩增Os-ER-ANT1编码区基因的引物对。
其中，该引物对其中的每一个引物的长度为15到25个碱基，例如：
上游引物：5’-GGATCCAAATCCGCCGTCGACGATGCCA-3’（如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列）
下游引物：
5’-ACTAGTTCATCTAGATTTCAATGCCCCTTTCATCTTG-3’（如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列）
本发明的有益效果在于：本发明的Os-ER-ANT1基因缺失，表现为水稻Os-ER-ANT1基因失活，直接引起蔗糖合成受阻，造成突变体3叶期后迅速死亡，通过本发明的实验，证实了Os-ER-ANT1是具有重要功能的看家基因，能够调节植物体内蔗糖合成，对植物体内蔗糖代谢具有重要的正向调节作用，为培育植物新品种提供了基因资源。
附图说明
图1为实施例1中Os-ER-ANT1突变体表型，图中分别为12天，15天以及25天时的水稻Os-ER-ANT1突变体表型，其中WT为中花11。
图2为实施例2中Os-ER-ANT1突变体Ds插入突变位点，其中A图为er-ant1突变体在基因组上的插入位点；B图为ER-ANT1基因的结构示意图。
图3为实施例3中RNAi株系的表型照片。A图为野生型和RNAi转基因植株的表型，B图为野生型和RNAi转基因株系中Os-ER-ANT1基因表达。
图4为实施例4中回复突变体的表型照片。A图为缺失突变体以及回复突变测序结果，B图为回复突变的表型，C图为回复突变体中OsER-ANT1基因的表达丰度。
图5为实施例5中WT和突变体中在播种第10天、13天以及16天不同时间点可溶性糖含量分析。图5A为果糖的变化曲线，图5B为葡萄糖的变化曲线，图5C为蔗糖的变化曲线。
图6为实施例6中突变体在无蔗糖和有蔗糖的条件下的表型。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
实施例中pCUbi1390载体为常用的载体，pEasy-T1可市购；水稻品种为粳稻中花11；农杆菌GV3101和EHA105菌株常用的菌株，多数分子生物学实验室均有保存。
实施例中的主要试剂为：限制性内切酶、Taq酶、T4连接酶、Pyrobest Taq酶、KOD、RNase A、M-MLV反转录酶等购自于TAKARA(大连)、Promega、NEB、Toyobo等生物公司；dNTPs购自于Genestar公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自于上海捷瑞生物工程公司；TRLzol RNA提取试剂盒购自于Invitrogen公司；MS培养基，琼脂粉，琼脂糖，氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、硫酸庆大霉素(Gen)、利福平(Rif)等抗生素以及DEPC、Galactose、Glucose、BSA、尼龙膜、硝酸纤维素膜、LBMedium等购自Sigma，硝酸纤维素膜购自Amersham、Bio-Rad等公司；实施例中所使用的其它化学试剂均为进口或国产分析纯。
实施例中所使用的引物由Invitrogen公司合成，并进行测序。
实施例1Os-ER-ANT1突变体表型分析
WT和Os-er-ant1突变体植株在稻田中生长，12天，15天以及25天时，取材，洗净，拍照。突变表型见图1。er-ant1突变体2叶期前叶色与野生型无明显差异（图1中12天图）,三叶期后突变体变为淡绿色（图1中15天图），并迅速焦枯(图1中25天图)。
实施例2Os-ER-ANT1突变位点分析
提取突变体叶片中的基因组DNA，利用TAIL-PCR的方法扩增Ds插入突变的5’和3’末端，Ds插入位点位于11号染色体上的编码OsER-ANT1的基因上，详见图2。
采用TAIL-PCR的方法Liu等(1995)【Liu Y G,Mitsukawa N,Oosumi T etal.Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insertjunctions by thermal asymmetric interlaced PCR.Plant Journal,1995,8(3):457-463】来扩增Ds插入子两侧的序列，具体操作如下：
左右边界的特异引物设计采用Primer Premier5。反应条件参照Liu等(1995)的方法进行（表1），反应所用引物见表2，特异扩增得到的第三轮PCR产物用来测序。
突变体的Ds3′端TAIL-PCR扩增。Ds插入位点的旁侧序列扩增采用TAIL-PCR，3轮特异引物依次为Ds3′-1a、Ds3′-2a、Ds3′-3a，随机引物用AD3。第3轮PCR产物电泳检测后送公司测序，测序所用的引物为TAIL-PCR第3轮引物。
突变体的Ds5′端TAIL-PCR扩增。Ds插入位点的旁侧序列扩增采用TAIL-PCR，扩增的条件见表1，3轮特异引物依次为Ds5′-1a、Ds5′-2a、Ds5′-3a，随机引物用AD1。第3轮PCR产物电泳检测后送公司测序，测序所用的引物为Ds5′-3a。
表1TAIL-PCR循环条件
表2TAIL-PCR所用引物
L-Primer和R-Primer分别表示Ds元件5′末端和3′末端特异的嵌套引物，ADPrimer表示熔解温度较低的随机简并引物。
通过TAIL-PCR获得突变体的Ds旁邻序列后,利用NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库，采用BLASTn程序搜素数据库，以便获得Ds插入位点及相应基因。分析结果表明目的基因位于水稻第11染色体的BAC克隆AC146592上（图2中A图）。该克隆全长19234bp，从第11876-14462为目的基因区段，对应于水稻基因组注释数据库RGAP（http://rice.plantbiology.msu.edu/）的LOC_Os11g43960基因位点，此基因由3个外显子和两个内含子组成，Ds插入在第一内含子距下游外显子652bp处（图2中B图），将该基因命名为Os-ER-ANT1，其ORF(990bp)编码329个氨基酸。
实施例3Os-ER-ANT1RNAi载体构建和转基因植株表型分析
为了全面了解Os-ER-ANT1对植物蔗糖合成的影响，本发明从中花11水稻中克隆了编码植物ATP/ADP转运蛋白的基因Os-ER-ANT1。根据序列分析，设计引物将该基因的部分序列（306bp）扩增出来，连接到具有35S启动子的过表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS上，构建RNAi表达载体，Os-ER-ANT1RNAi。所用的引物为：
上游引物：5’-ACTAGTTTGGGCTGGGCAATAACTAC-3’（如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列）
下游引物：5’-CTCGAGATCCCCATTTGCACATCATT-3’（如SEQID No.4所示的核苷酸序列）
将Os-ER-ANT1RNAi后连接到具有35S启动子的载体pCAMBIA2300-35S-OCS上的具体方法为：首先以水稻cDNA为模板，利用上游引物和下游引物将Os-ER-ANT1编码区306bp的特异区段扩增出来（SEQ ID NO.3和4的引物），将PCR产物利用XhoI和SpeI酶切位点与pUCCRNAi中间载体连接，插入正向片段，鉴定后，命名为pUCCRNAi-Os-ER-ANT1-sense。将pUCCRNAi-Os-ER-ANT1-sense和PCR产物用XbaI和SalI酶切后，T4DNA酶连接，鉴定后命名为pUCCRNAi-Os-ER-ANT1RNAi。将pCAMBIA2300-35S-OCS和pUCCRNAi-Os-ER-ANT1RNAi分别用XhoI和SpeI酶切后，将长度为821bp的目的片段构建到pCAMBIA2300-35S-OCS载体上，连接产物命名为pCAMBIA2300-35S-OCS-Os-ER-ANT1RNAi。
将pCAMBIA2300-35S-OCS-Os-ER-ANT1RNAi利用农杆菌介导法导入野生型水稻中花11中，获得转基因植株。其转录水平相比中花11明显下调，表明其为Os-ER-ANT1下调的突变体，该基因受到抑制。表型分析表明，该转基因植株三叶期后叶色变黄，并迅速焦枯，与DS插入突变体类似。
实施例4Os-ER-ANT1回复突变体的获得及表型分析
由于突变体表型与Ds因子是紧密连锁的，如果将突变体与含Ac植株杂交，因为Ds因子在Ac转座酶存在时会发生再次转座，可能导致原来被破坏的基因回复功能，所以突变表型会产生变化，可能回复到野生。Ac/Ds转座子在插入基因组时往往会在插入位点处产生8bp左右的重复序列。当这些因子再次转座后，经常会有重复序列留下来（Mckenzie et al,TheorAppl Genet,2002,105:23-33）。为了证实得到的回复突变，对Ds因子插入位点进行测序，有可能找到Ds因子转座后留下的印迹（footprint）。在Ds插入位点两侧，依据水稻基因组测序数据设计特异引物，检测Ds因子及转座印迹。
以Ac纯合体作母本，突变杂合体作父本杂交，选留18个F1植株，以备筛选回复突变。种植F2，出苗2周后调查田间表型，随后喷洒Basta，移栽正常抗性植株，移栽3周后取样检测。用Dsyb(ATTGGTGTGAGGCCAACATT)、Dsyc(AGCGGGAGTACAACCACAAC)、Ds3′-1a(GGTTCCCGTCCGATTTCGACT)检测Ds是否存在，用Dsyb、Dsyc检测转座印迹。F2代种植18个株系，各株系检测20-80株，共提取DNA990株，其中14株Ds转座后留有印迹。
用Dsyb、Dsyc扩增中花11、Ds供体、回复突变株，用Dsyc作测序引物，PCR产物直接测序，测序比对发现，Ds再次转座后，留下6个碱基的印迹(tgtggt)，与Ds插入时产生的8bp碱基重复(gttgtggt)序列相比少两个碱基（图4中A图）。表型观测表明，回复突变与野生型表型无异（图4中B图）,而RT-PCR分析表明回复突变目的基因表达得以恢复（图4中C图）。以上结果表明，Os-ER-ANT1是本研究的目的基因，Ds插入造成Os-ER-ANT1基因失活，是突变体os-er-ant1产生黄化表型的原因。
实施例5Os-ER-ANT1突变体中可溶性糖分析
水稻3叶期是植株由异养生长向自养生长转变的临界期。由于突变体在3叶期后迅速死亡，推测其可能由于能量缺乏所致。为此，本发明分析了突变体叶片可溶性糖份含量的变化。具体步骤如下：
为了全面分析植物叶片糖份，WT和Os-er-ant1突变体种植于稻田中，播种后10天、13天以及16天的上午7:00点和下午19:00点分别取样，利用高效液相色谱分析新鲜叶片可溶性糖的含量。
测定结果表明，野生型植株其果糖、葡萄糖和蔗糖的变化均呈现周期性变化，其下午可溶性糖份含量均高于上午（图5A、图5B、图5C）。在6次测定结果中播种后13天的下午（PM）测定值最大，每克叶片果糖、葡萄糖和蔗糖含量分别为6.67mg、8.39mg和17.23mg。突变体植株的果糖、葡萄糖含量虽然较野生型低，但同一天的可溶性糖份含量下午均高于上午仍呈现周期性变化，其最大值亦出现在播种后13天的下午，分别为2.83mg/g FW和3.44mg/gFW，这表明突变体中果糖、葡萄糖代谢依旧受昼夜节律调控，与光合作用密切相关。而突变体植株经过一天光合作用后蔗糖含量几乎无增加，甚至低于早晨的起始值，与野生型的最大值（17.23mg）相比较而言，突变体植株相应时期蔗糖含量（2.34mg）显著低于野生型，表明突变体蔗糖含量显著降低，而且其代谢模式也发生了变化。
综上所述，表明Os-ER-ANT1基因敲除后影响了水稻可溶性糖的代谢，而且对蔗糖代谢的影响最大。
实施例6Os-ER-ANT1有机物添加实验
蔗糖是植物光合作用同化产物最主要的转运形式，对于高等植物的生长发育至关重要。实施例5的结果表明，Os-ER-ANT1基因缺失造成了突变体叶片蔗糖含量显著降低。据此推测，补充蔗糖理应能够缓解突变体表型。为了分析蔗糖对突变体生长的影响，本发明依照如下所述步骤进行了相关实验，具体如下：
为了获得纯合的突变体种子，本发明通过以下2个步骤获得：
（1）将待检测的种子切取一半胚乳（不含胚），提取DNA，检测基因型；含胚部分保存备用。
（2）依据水稻基因组序列在Ds插入位点两侧设计一对引物（DsL:CCAATGTCATCCGATACTTCC,DsR:GCCATACAGATAACAAGGGTTC），它们的结合位点分别是转座子两侧的水稻基因组序列。另外在Ds转座子内部靠近末端处设计一条引物(Ds5′-1a:ACGGTCGGGAAACTAGCTCTAC)检测Ds是否存在。利用这三条引物同时扩增，能同时区分突变纯合体、突变杂合体和野生型三种类型的植株。
将上述检测确认的WT和Os-er-ant1突变体种子，播种于含有或不含有蔗糖的1/2MS培养基中，生长15天后观察表型。
结果表明，野生型幼苗在含有蔗糖的培养基（2%）与不含蔗糖的培养基生长情况无明显差异。但是，突变体在含有蔗糖的培养基生长明显好于无蔗糖培养基，表明补充蔗糖能够缓解突变体表型。
综上所述，本发明得出结论：Ds插入导致水稻Os-ER-ANT1基因失活，引起蔗糖合成受阻，造成突变体3叶期后迅速死亡，而添加蔗糖能显著缓解突变体表型。以上表明，Os-ER-ANT1是具有重要功能的看家基因，对水稻蔗糖代谢具有重要的正向调节作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.Os-ER-ANT1基因在调节水稻蔗糖合成中的应用，其特征在于，所述Os-ER-ANT1基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.Os-ER-ANT1基因在培育转基因水稻中的应用，所述Os-ER-ANT1基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
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