CN102206652B

CN102206652B - 稻米胶稠度控制基因gc6及其应用

Info

Publication number: CN102206652B
Application number: CN 201110111154
Authority: CN
Inventors: 曾大力; 钱前; 郭龙彪; 苏岩; 饶玉春; 胡江; 张光恒; 高振宇; 董国军; 朱丽; 刘坚; 颜美仙
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: China National Rice Research Institute
Priority date: 2011-04-30
Filing date: 2011-04-30
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2031-04-30
Also published as: CN102206652A

Abstract

本发明公开了一种稻米胶稠度控制基因GC6，该基因GC6为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。本发明还同时公开了如上述水稻胶稠度控制基因GC6编码的蛋白质，其具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了含有上述基因的植物表达载体和宿主细胞。本发明还同时公开了一种控制稻米胶稠度高低构成的方法：包括用本发明所述载体转化植物细胞；再将转化的植物细胞培育成植株。发明还同时公开了一种改良稻米胶稠度高低的方法，包括用本发明所述载体转化植物细胞；再将转化的植物细胞培育成植株。

Description

稻米胶稠度控制基因GC6及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体地说，本发明涉及一种稻米胶稠度控制基因GC6；另外，本发明还涉及控制稻米胶稠度育种的方法。

背景技术

随着水稻产量的逐渐提高，人们对水稻的品质要求越来越高，稻米品质是一个复杂的性状，主要包括蒸煮食味品质、营养品质和外观品质等^[1]。而蒸煮食味品质是稻米品质中最重要指标，主要受直链淀粉含量(AC)、胶稠度(GC)和糊化温度(GT)的影响^[2]。

胶稠度是稻米食用品质的重要指标。低胶稠的米饭干燥蓬松，冷却后硬而粗糙，食味不佳；高胶稠的米饭湿润光滑而有弹性，冷却后仍保持柔软而深受欢迎。通常粳稻的胶稠度较高，而籼稻则低、中、高品种均有，且以高胶品种居多。胶稠度既是食用稻米的品质指标，同时也是影响稻米制品加工和酿酒业的重要特性。

另外，由于胶稠度是一个受胚乳三倍体细胞控制的性状，同一植株上所结的不同种子的胶稠度存在着遗传分离与基因剂量效应，并易受其它性状和环境因素的影响，采用常规育种方法来改良胶稠度就较为困难，周期长，效率低，还受品种资源的制约。而基于基因克隆基础上的生物工程手段则是人工调控稻米胶稠度的最简便又有效的方法之一。

参考文献如下：

1.Liu QQ，Wang ZY and Gu MH et al..Stable inheritance of the antisense Waxy gene intransgenic rice with reduced amylose level and improved quality.Transgenic Res，2003，12：71-82(刘巧泉，王宗阳，顾铭洪等.稳定遗传的蜡质基因反义转基因技术可以降低稻米直链淀粉含量和改善品质.转基因研究，2003，12：71-82.)；

2.Fan CC，Yu XQ and Zhang QF et al..The main effects，epistatic effects andenvironmental interactions of QTLs on the cooking and eating quality of rice in adoubled-haploid line population.Theor Appl Genet，2005，110：1445-1452(Fan CC、余新桥，张启发等.稻米蒸煮食用品质主要效应、上位性效应及环境互作的QTL的分析.理论和应用遗传学，2005，110：1445-1452)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种稻米胶稠度制基因GC6以及植物改造方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种稻米胶稠度控制基因GC6，该基因GC6为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明还同时提供了一种载体，为含有上述基因的植物表达载体。

作为本发明的载体的改进：植物表达载体为pCAMGC6。

本发明还同时提供了一种宿主细胞，为含有上述载体的细胞。

作为本发明的宿主细胞的改进：细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞和或植物细胞。

本发明还同时提供了一种控制稻米胶稠度高低构成的方法：包括用上述载体转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成植株。可将上述载体通过农杆菌介导法或基因枪法转化植物细胞，该植株优选水稻。

本发明还同时提供了一种改良稻米胶稠度高低的方法：包括用上述载体转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成植株。可将上述载体通过农杆菌介导法或基因枪法转化植物细胞，该植株优选水稻。

本发明的水稻胶稠度控制基因GC6编码的蛋白质，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明人通过深入研究，利用粳稻品种春江6号(CJ06)和正常籼稻品种台中本地1号(TN1)构建的DH群体进行相关QTL定位，并运用图位克隆技术首先克隆了GC6基因。

本发明的优选实施方式包含以下步骤：

一、水稻胶稠度控制基因的遗传分析

本发明所采用的水稻品种为高胶稠度的粳稻品种春江06(CJ06)和低胶稠度的籼稻品种台中本地1号(TN1)，二品种杂交得F1代，对F₁代进行花药离体培养，再经自然加倍或用秋水仙素处理，随机选取其中的120个株系组成DH群体用于分子连锁图谱的构建。

二、图位克隆控制水稻胶稠度的GC6基因

(一)、GC6基因的精细定位及物理定位

为了分离GC6基因，剔除GC2和GC3对GC6的干扰，本发明首先建立了一个仅带有GC6座位的染色体片断置换系(图2)，其由TN1(籼稻)与CJ06品种(粳稻)杂交之后，以CJ06为轮回亲本不断回交而成，该染色体片断置换系和CJ06杂交获得的F1代经自交形成的BC4F2精细定位群体(图3)。然后根据已有的QTL分析结果，利用分子标记筛选交换单株，并结合这些交换单株的胶稠度分析，借助图位克隆的方法进行GC6基因的精细定位及物理定位。

通过已测序的GC6位点区域的BAC序列，建立BAC克隆重叠群。发展新标记进行精细定位，最终将GC6定位于BAC克隆P0679C08上的标记S28和CAPS6之间11kb的范围之内(图4)。通过分析此区段的开放阅读框(ORF)推测候选基因，结果发现该区间内只包含一个基因，对该候选基因进行序列分析，发现其在CJ06和TN1之间存在巨大差异(图5)。

(二)、GC6基因的鉴定和功能分析

进行功能互补的转基因研究。将低胶稠度品种TN1的GC6基因构建到常规植物表达载体并转化到高胶稠度品种CJ06中(图6)，结果表明本发明获得了使高胶度的粳稻品种CJ06的胶稠度降低的转基因水稻，证明了本发明正确克隆了GC6基因(图7)。

随着人民生活水平的提高和市场经济的发展，对农作物品质的要求越来越高，农作物品质的改进无疑在农业发展中日益受到重视。GC6基因的发现与克隆，使得应用基因工程技术调控水稻稻米胶稠度成为可能，在改善稻米蒸煮和食味品质方面；同时也在稻米加工、食品添加剂生产方面发挥重要的作用。而在相关领域，如工业原料供应等方面势必也将起到一定的作用。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是DH群体及其双亲的胶稠度分布图；

图2是GC6主效QTL座位的染色体片断置换系图；

图2中，白色区域代表来自CJ06的基因组DNA，黑色区域代表来自TN1的基因组DNA图；1～12指水稻的12条染色体；

图3是染色体片断置换系的构建图；

图4是GC6在水稻第6染色体上的精细定位图；

图4中，白色区域代表来自CJ06的基因组DNA，黑色区域代表来自TN1的基因组DNA，灰色区域代表杂合型的基因组DNA；L1～L12是指经筛选获得的、用于基因图位克隆的12个重要的水稻植株；

图5是CJ06和TN1基因组DNA差异的比较图；

图6是载体pCAMGC6质粒图谱；

图7是GC6基因转化高胶稠度水稻恢复低胶稠度的表型图；T2-17是指转基因互补实验中获得的一个植株；

图8是载体pTCKGC6质粒图谱；

图9是通过转基因技术可以高胶稠度稻米图；

图9中，A代表转空载体pTCK303后对照表型，B代表干涉gel基因后表现巨胚表型。

具体实施方式

下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明作限定。

实施例1、水稻稻米胶稠度控制基因GC6的克隆

1、水稻材料

水稻(Oryza sativa ssp.)高胶稠度粳稻品种春江06(CJ06)和低胶稠度籼稻品种台中本地1号(TN1)。

2、分析和定位群体

移种大田或使用浓度2％的秋水仙素点滴水稻幼苗心叶。

为了分离GC6基因，剔除GC2和GC3对GC6的干扰，本发明首先建立了一个仅带有GC6座位的染色体片断置换系(图2)，其由TN1(籼稻)与CJ06品种(粳稻)杂交之后，以CJ06为轮回亲本不断回交而成(例如回交4次)；该染色体片断置换系和CJ06杂交获得的F1代经自交形成的BC4F2精细定位群体(图3)。

用分子标记RM540和RM587进行辅助选择，选择表现“TN1”基因型的单株用于进一步的回交和辅助选择，标记RM540和RM587的序列如下。

3、水稻胶稠度控制基因的遗传分析

在DH群体中，群体性状呈超亲分离，如图1所示。通过分析DH群体120个株系的胶稠度的表现，结合业已构建的遗传图谱，开展水稻胶稠度相关基因的遗传分析。QTL分析表明，在该DH群体中，共检测到3个与胶稠度有关的QTL座位，其中位于水稻第6染色体上的GC6为控制胶稠度的主效QTL，并将之定位于分子标记RM540和RM587之间(表1)。

RM540F：GCCTTCTGGCTCATTTATGC

RM540R：CTAGGCCTGCCAGATTGAAC

RM587F：ACGCGAACAAATTAACAGCC

RM587R：CTTTGCTACCAGTAGATCCAGC

表1、胶稠度相关性状的QTL分析

QTL	染色体	标记区间	LOD值	变异解释率％	加性效应
						GC2	2	RM3732-RM492	2.96	17.8	-16.76
GC3	3	RM514-RM85	3.05	14.6	-18.40
						GC6	6	RM540-RM587	12.17	52.4	-32.30

4、GC6基因的精细定位及物理定位

利用建立的染色体片断置换系的BC4F2定位群体，根据已有的QTL分析结果，利用分子标记RM540和RM8200对11,459个BC4F2个体进行交换单株的筛选，从中筛选获得423个交换单株。

RM540和RM8200为SSR分子标记，采用如下的SSR标记的反应体系和反应条件进行PCR扩增及电泳检测，并记录电泳检测结果。

对11，459个单株同时用RM540和RM8200进行分子标记检测，符合下列条件之一的植株确认为“交换单株”：

(1)分子标记RM540表现为杂合的基因型，而分子标记RM8200表现为纯合的基因型(TN1型或CJ06型)；

(2)分子标记RM8200表现为杂合的基因型，而分子标记RM540表现为纯合的基因型(TN1型或CJ06型)；

(3)分子标记RM540表现为TN1的基因型，而分子标记RM8200表现为CJ06的基因型；

(4)分子标记RM540表现为CJ06的基因型，而分子标记RM8200表现为TN1的基因型。

在苗期每株取0.1克左右的嫩叶，用来提取DNA，并保留备用。在收获期收获种子后，对上述423个交换单株的籽粒开展胶稠度的测定，其中110个单株的稻米胶稠度表现为高胶稠度而被进一步筛选出来作为精细定位及物理定位所用。

具体指对上述的11，459个单株进行DNA的提取，DNA的提取方法为：用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)法提取水稻亲本幼苗及杂交后代幼苗基因组DNA。

通过已测序的GC6位点区域的BAC序列，建立BAC克隆重叠群。发展新的STS和CAPS标记进行精细定位，最终将GC6定位于BAC克隆P0679C08上的标记S28和CAPS6之间11kb的范围之内(图4)。

SSR标记的反应体系和反应条件为：

在PTC-225PCR仪上进行SSR标记的PCR扩增，PCR反应体系为：1μl上述DNA溶液，10×PCR Buffer 2.0ul，25mM MgCl₂ 2.0ul，2mM dNTP 2.0ul，10uM引物2.0ul，5U/ulTaq DNA聚合酶0.2ul，ddH₂O 10.8ul，总体系20ul。上述引物分别为表2中的RM540和RM8200。

反应程序：95℃变性5分钟；94变性1分钟，55退火1分钟，72延伸1分钟，40个循环；72补齐10分钟；产物检测：在含有0.5％ug/ul EB的4.0％的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相记录结果，分析记录发生连锁交换的单株。

说明：RM540和RM8200为SSR标记，用CTAB法提取获得的DNA。

STS标记的反应体系和反应条件为：

在PTC-225PCR仪上进行STS标记PCR扩增，PCR反应体系为：1μl上述DNA溶液，10×PCR Buffer 2.0ul，25mM MgCl₂2.0ul，2mM dNTP 2.0ul，10uM引物2.0ul，5U/ul TaqDNA聚合酶0.2ul，ddH₂O 10.8ul，总体系20ul。上述引物分别为表3中的S13、S15、S18、S20、S22、S26、S27、P1和IndGC6。

反应程序：95℃变性5分钟；94变性1分钟，54退火1分钟，72延伸1分钟，40个循环；72补齐10分钟；产物检测：在含有0.5％ug/ul EB的4.0％的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相记录结果。如图4可见，将之定位于第6染色体分子标记P1和S27之间。

说明：S13、S15、S18、S20、S26、P1、IndGC6、S27、S22为STS标记。

CAPS标记的反应体系和反应条件为：

在PTC-225PCR仪上进行CAPS标记的PCR扩增，PCR反应体系为：1μl上述DNA溶液，10×PCR Buffer 2.0ul，25mM MgCl₂2.0ul，2mM dNTP 2.0ul，10uM引物2.0ul，5U/ulTaq DNA聚合酶0.2ul，ddH₂O 10.8ul，总体系20ul。上述引物分别为表3中的S28、CAPS6和CAPS3。

反应程序：95℃变性5分钟；94变性1分钟，55退火1分钟，72延伸1分钟，40个循环；72补齐10分钟。

在37℃恒温水浴槽中进行8小时的限制性内切酶(购自宝生物大连有限公司)的酶切反应，酶切体系为：5ul上述PCR扩增产物，10×对应的酶切Buffer(宝生物大连有限公司随所购买的酶附送)2ul于一新的PCR管，限制性内切酶5U单位，加ddH₂O至反应总体系为20ul。

说明：CAPS6、S28、CAPS3为CAPS标记。

如图4可见，将之定位于第6染色体分子标记S28和CAPS6之间，S28和CAPS6之间的物理距离为11kb。

表2、定位所用到的引物

5、GC6基因的获得

根据精细定位的结果，GC6基因被定位于分子标记S28和CAPS6之间，其物理距离为11kb，对11kb的全长基因组序列用HMM软件(http://www.softberry.com/berry.phtml)预测可能的编码区(ORF)，发现其间只有1个候选基因，经过ABI3730DNAanalyzers型测序仪测序分析GC6基因在CJ06和TN1间的基因组序列，发现其在CJ06和TN1之间存在巨大差异(图5)。

序列表SEQ ID NO：1中显示的即为TN1的GC6基因序列，如SEQ ID NO：1所述(其包含intron序列，下划线部分为intron)。

实施例2、水稻胶稠度控制主效基因GC6的功能互补及转基因研究

根据台中本地1号(TN1)GC6基因的序列设计引物，用引物GC6-1F，GC6-1R，

GC6-2F，GC6-2R，GC6-3F和GC6-3R，高保真PCR扩增。

GC6-1F：AGGTTTATGTCCTACGGAATGA

GC6-1R：ACACATCCATCCAATGCGAT

GC6-2F：GCTGACCGTCGTCGTCTT

GC6-2R：AAACCATATAACCAGCAACCAT

GC6-3F：ATGACACATTCTAATACCGATAAGT

GC6-3R：TCACTACATTCGTACATCACACTT

PCR反应体系为：1μl DNA溶液(TN1的DNA，制备方式等同于实施例1步骤4中的DNA溶液的制备方式)，10×PCR Buffer 2.0ul，25mM MgCl₂2.0ul，2mM dNTP 5.0ul，10uM引物2.0ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0.5ul，ddH₂O7.5ul，总体系20ul。反应程序：94℃预变性5min，94℃1min，55℃1min，72℃4min，35cycles，72℃延伸10mins。

并用ABI3730DNA analyzers型测序仪测序(ABI公司)，挑选序列完全正确的克隆并将它们连接成一个7,347bp片段，包含起始密码子ATG上游的2,294个碱基和终止密码子TGA后的1,577个碱基的全长序列，克隆到双元载体pCAMBIA1300中(购自CAMIA公司)中，获得了用于转化的质粒pCAMBIAGC6(图6)。质粒通过电击的方法转入农杆菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105(购自CAMIA公司)中用于转化水稻。

将春江06的幼胚脱壳灭菌，接种到诱导愈伤组织的MS培养基[可参考Linsmaier，E.Mand Skoog，F.，.Physiol.Plant.1965，18，100-127]中。在28℃的培养室中暗培养3周，从盾片处生长出愈伤组织，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用作转化的受体。用含有双元质粒载体的农杆菌EHA105菌株侵染水稻愈伤组织，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织和转基因植株。将潮霉素抗性植株(由于载体带有潮霉素抗性，因此只要转入该载体的植株均带有潮霉素抗性)在阴凉处练苗，几天后移栽到水田，结实后收种进行表型鉴定。共收获7个株系的T₀代种子，分析其胶稠度发现7个株系的胶稠度均比春江06明显下降，而与TN1的接近。说明GC6基因已经整合进受体基因组内并能够正确表达(见图7)。

实施例3、高胶稠度稻米的获得

根据台中本地1号(TN1)GC6基因的序列设计引物，用引物GCi-1F，GCi-1R，高保真PCR扩增。

GCi-1F：AGGATCCGAGCTCTCACCACGTCCCAGCT

GCi-1R：AACTAGTGGTACCGAGGACGTCACCGAG

PCR反应体系为：1μl DNA溶液(TN1的DNA)，10×PCR Buffer 2.0ul，25mM MgCl₂2.0ul，2mM dNTP 5.0ul，10uM引物2.0ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0.5ul，ddH₂O 7.5ul，总体系20ul。94℃预变性5min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，35cycles，72℃延伸10mins并用ABI3730DNA analyzers型测序仪测序(ABI公司)，挑选序列完全正确的克隆利用共有的SpeI、SacI、BamHI和KpnI位点将它们连接成一个311bp片段(如SEQ ID NO：3所示)，克隆到双元载体pTCK303(购自CAMIA公司)中，获得了用于转化的质粒pTCKGC6(图8)。质粒通过电击的方法转入农杆菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105(购自CAMIA公司)中用于转化水稻。

将台中本地1号的幼胚脱壳灭菌，接种到诱导愈伤组织的MS培养基[可参考Linsmaier，E.M.and Skoog，F.，.Physiol.Plant. 1965，18，100-127]中。在28℃的培养室中暗培养3周，从盾片处生长出愈伤组织，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用作转化的受体。用含有双元质粒载体的农杆菌EHA105菌株侵染水稻愈伤组织，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织和转基因植株。将潮霉素抗性植株在阴凉处练苗，几天后移栽到水田，结实后收种进行表型鉴定。共收获5个株系的T₀代种子，分析其胶稠度发现5个株系的胶稠度均比TN1明显增加，说明pTCKGCi-1的序列已经整合进受体基因组内并能够正确表达(见图9)。图9中，A代表转空载体pTCK303后对照胶稠度，B代表干涉GC6基因后的胶稠度表现。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种稻米胶稠度控制基因GC6，其特征是：该基因GC6为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的水稻胶稠度控制基因GC6编码的蛋白质，其特征是：为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

3.一种载体，其特征是：为含有权利要求1所述基因的植物表达载体。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征是：所述植物表达载体为pCAMGC6。

5.一种宿主细胞，其特征是：为含有权利要求3或权利要求4所述载体的细胞；所述细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

6.一种改良稻米胶稠度的方法，其特征是：包括用权利要求3或权利要求4所述载体转化植物细胞；再将转化的植物细胞培育成植株；所述植株为水稻。

7.根据权利要求6所述的改良稻米胶稠度的方法，其特征是：所述转化法为农杆菌介导法或基因枪法。