DE69510779T2

DE69510779T2 - Nematizide proteine

Info

Publication number: DE69510779T2
Application number: DE69510779T
Authority: DE
Inventors: Nicholas Birch; Angharad Gatehouse; Irene Geoghegan; Walter Robertson
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1994-03-30
Filing date: 1995-03-30
Publication date: 1999-12-02
Anticipated expiration: 2015-03-31
Also published as: DE69510779D1; AU698124B2; WO1995026634A1; ES2136282T3; ATE182050T1; EP0752816B1; CA2186737A1; GB9406371D0; DK0752816T3; AU2079895A; EP0752816A1; US6006470A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Bekämpfung von Nematodenschädlingen.
Es gibt Nematodenparasiten von Pflanzen und Tieren einschließlich Menschen. Die Pflanzenparasiten können signifikante ökonomische Verluste bei der subtropischen, tropischen und gemäßigten Landwirtschaft verursachen. Pflanzenparasitäre Nematoden sind kleine (im allgemeinen 100 bis 300 gm lang, aber bis zu 4 mm lang und 15 bis 35 um breit) wurmartige Tiere, die sich von Wurzeln, Stämmen oder Blattgeweben lebender Pflanzen ernähren. Nematoden sind immer dort vorhanden, wo Pflanzen gezüchtet werden. Ectoparasitäre Nematoden, wie die bohrenden (Xiphinema und Longiorus spp.), wurzelbefallenden (Trichodorus und Paratrichodorus spp.) und spiralförmigen (Scutellonema und Helicotylenchus spp.) Nematoden leben außerhalb der Pflanze und stechen die Pflanzenzellen mit ihrer Lanzette an, um sich zu ernähren. Migratorische endoparasitäre Nematoden, wie die verletzenden (Pratylenchus spp.), Stamm und Zwiebel befallenden Ditylenchus spp.) und grabenden (Radopholus spp.) Nematoden, leben und ernähren sich innerhalb der Pflanze, wobei sie durch die Pflanzengewebe wandern. Seßhafte endoparasitäre Nematoden, wie die Wurzelknöllchen- (Meloidogyne spp.), Cysten- (Globodera und Heterodera spp.), Citrus (Tylenchulus spp.) und nierenförmigen (Rotylenchulus spp.) Nematoden leben und ernähren sich innerhalb der Pflanze und induzieren in den empfänglichen Pflanzen spezialisierte, fixierte Futterstellen, die Riesenzellen, Syncytien oder Nahrungszellen genannt werden. Solche fixierten Futterstellen dienen als Nahrungstransferzellen für die verschiedenen Entwicklungsstadien der Nematoden.
Syncytien entstammen dem Pericyclus, der Endodermis oder dem benachbarten Cortex.
Verschiedene Methoden wurden verwendet, um pflanzenparasitäre Nematoden zu bekämpfen. Sie umfassen Quarantänemaßnahmen, Manipulation der Pflanz- und Erntedaten, verbesserte Düngungs- und Bewässerungsprogramme, die den Pflanzenstreß verringern, Fruchtwechsel und Brache, Verwendung von resistenten und toleranten Kulturrassen und Wurzelstöcken, Verbesserungen des organischen Bodens und physikalische (z. B. Bestrahlung), biologische und chemische Bekämpfung. Obwohl Quarantänebehandlungen nützlich sind, insbesondere, wenn ein Befall zuerst entdeckt wird, sind dies sehr teure Maßnahmen und können üblicherweise die Ausbreitung der Nematoden nicht verhindern. Ferner ist die biologische Bekämpfung schwierig zu handhaben, und große Mengen und wiederholte Zugaben der Mittel werden benötigt.
Heute beruht die Bekämpfung der pflanzenparasitären Nematoden hauptsächlich auf der chemischen Bekämpfung. Kommerziell verwendete Nematicide sind im allgemeinen entweder Räucherungsmittel (z. B. halogenierte aliphatische Kohlenwasserstoffe und Methylisothiocyanat-Vorläuferverbindungen) oder Nichträucherungsmittel (z. B. Organophosphate und Oximcarbamate). Jedoch ist die Verwendung chemischer Nematicide unerwünscht, weil diese Chemikalien stark toxisch sind und daher für den Anwender und für die Umwelt eine Gefahr darstellen.
Daher besteht heute eine echte Notwendigkeit, neue wirksamere und sichere Mittel zur Bekämpfung pflanzenparasitären Nematoden zu besitzen.
Unter Verwendung der modernen Techniken der rekombinanten DNA und der Pflanzengentechnik können Gene, die Nematodenkontrollproteine codieren, cloniert werden und in Zel len der geeigneten Nutzpflanze eingeschleust werden, worin ihre Expression die Pflanze inhärent resistent gegenüber einem Nematodenangriff macht. Die Gentechnik überwindet das Problem der reproduktiven Barrieren für genetische Rekombination.
Die WO 93/06710(North Carolina State University) beschreibt ein Verfahren zur Verleihung von Nematodenresistenz an Pflanzen, wobei die Pflanzen mit einem heterologen DNA- Konstrukt, bestehend aus einem Pflanzenpromotor, der durch eine Nematode, die die Pflanze angreift, aktiviert wird, und einem Strukturgen, das ein Produkt codiert, das für die Pflanzenzellen toxisch ist, die die Futterstelle der Nematode bilden, codiert, umfaßt, transformiert werden. Beispiele für Produkte, die für Pflanzenzellen toxisch sind, die offenbart sind, sind Nucleasen, Proteinasen, Toxine von pflanzenpathogenen Bakterien, Lipasen, Membrankanalproteine und Antikörper, die an die Pflanzenzellkomponenten binden. Der Nachteil dieser Variante ist, daß die Expression des Toxingens auf die Nematodenfutterstelle begrenzt werden muß, um den Tod von Pflanzenzellen in benachbarten Geweben zu verhindern. In der Praxis ist dies schwierig zu erreichen.
Die WO 92/04453 (The University of Leeds) offenbart ein Verfahren zur Verleihung von Nematodenresistenz an Pflanzen durch Transformieren von Pflanzen mit einem heterologen DNA- Konstrukt, das einen Pflanzenpromotor, der durch die Nematodeninfektion induziert wird und ein Strukturgen, das ein Produkt codiert, das für die Pflanzenzellen, die die Futtestelle der Nematode bilden oder die Nematode selbst toxisch ist, codiert, umfaßt. Beispiele für toxische Produkte, die offenbart sind, sind Enzyme, wie DNase, RNase oder eine Proteinase, Antisense-RNA, Bacillus thuringiensis- Proteine mit Anti-Nematodenaktivität oder ein Antikörper, der die Aufnahme oder Verdauung von Futter durch die Nematode unterbricht. Eine solche Variante besitzt den Nachteil, daß sie gegen pflanzenparasitäre Nematoden, die die Bildung spezialisierter Futterstellen nicht induzieren, ineffektiv ist.
Die WO 92/21757 (Plant Genetic Systems N. V.) offenbart ein Verfahren zur Verleihung von Nematodenresistenz an Pflanzen, wobei Pflanzen mit zwei chimären Genen transformiert werden. Das erste chimäre Gen umfaßt einen nematodeninduzierten Promotor und ein Strukturgen, das ein toxisches Produkt codiert, das die Pflanzenzellen der Nematodenfutterstellen oder die Nematode selbst tötet. Das zweite chimäre Gen umfaßt einen nematodenreprimierten Promotor und ein Strukturgen, das ein Produkt codiert, das bei Expression in Zellen der Pflanze das toxische Produkt des ersten chimären Gens hemmt oder inaktiviert. Beispiele für Typen von Genprodukten, die Pflanzenzellen oder Nematoden töten, umfassen Nucleasen, Proteasen, Antisense-RNA, B. thuringiensis-Toxine, Collagenasen, Chitinasen, Glucanasen, Peroxidasen, Superoxiddismutasen, Lectine, Glycosidasen, antibakterielle Peptide, Gelatinasen, Enzyminhibitoren oder Neurotoxine. Spezifische Beispiele für Genprodukte, die Nematoden töten oder unfähig machen können, werden nicht offenbart. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, daß es die Transformation von Pflanzen mit zwei chimären Genen benötigt, von denen jedes nur in spezifischen Geweben exprimiert werden darf. In der Praxis ist dies schwierig zu erreichen.
Die WO 92/15690 (Nickerson Biocem Ltd) offenbart Proteinaseinhibitoren, die Anti-Nematodenaktivität besitzen und daher zum Schutz von Pflanzen gegen Nematoden entweder durch Abgabe des Proteinaseinhibitors an die Nematoden oder Transformation von Pflanzen mit einem Gen, das einen Proteinaseinhibitor codiert, verwendet werden können. Tests an Kartoffelpflanzen, die mit einem Langbohnen-Trypsininhibitor- (CpTi)-Gen transformiert wurden und in denen nachweisbare Mengen an CpTi gemessen werden konnten, zeigten quantifi zierbare Wirkungen auf die Wachstumsrate und das Geschlechtsverhältnis von Cysten-Nematoden und auf die Eizahlen von Wurzelknöllchen-Nematoden, aber es wurde nicht gezeigt, ob diese Wirkungen ausreichend waren, um Ernteverluste infolge von Nematoden zu verringern.
Die WO 92/15690 beschreibt auch Tests an Kartoffelpflanzen, die mit einem Erbsenlectingen transformiert wurden. Solche transformierte Pflanzen hatten eine geringe oder keine signifikante Wirkung auf die Etablierung von Cystnematoden und deren Reifung, verglichen mit nichttransformierten Pflanzen.
So codieren die bekannten Nematodenkontrollgene für Produkte, die entweder nur teilweise effektiv oder nichtselektiv sind und daher benötigt ihre Verwendung die Verwendung zusätzlicher Gene, um die Pflanzenzellen, die nicht Ziel sind, zu schützen.
Lectine sind eine heterogene Klasse von (Glyco)-Proteinen, die aufgrund ihrer Fähigkeit, Kohlenhydratanteile von Glycokonjugaten zu erkennen und zu binden, zusammen gruppiert werden. Chitin, das Hauptstruktur-Kohlenhydrat für Insekten, ist ein Polymer aus N-Acetylglucosamin (GluNAc) und verschiedene Lectine mit zuckerbindenden Eigenschaften für GluNAc wurden mit insecticider Aktivität gegen bestimmte landwirtschaftliche Schädlinge beschrieben.
Die EP-A-0351924 (Shell Internationale Research Maatschappij B. V.) betrifft eine transgene Pflanze, umfassend ein Lectingen, das ein Lectin in der Pflanze, das für die Pflanze fremd ist, wie es in der Natur vorkommt, exprimiert. Insbesondere wird offenbart, daß Erbsenlectin in Tabak insertiert wurde, und die transgene Pflanze einen gewissen Grad an Insektenresistenz besitzt. Die EP-A-0427529 (Pioneer Hi-Bred International, Inc) offenbart, daß gefunden wurde, daß ausgewählte Pflanzenlectine larvicid gegen eine Anzahl von üblichen Insektenschädlingen oder landwirtschaftlichen Nutzpflanzen sind.
Es ist bekannt, daß viele Lectine für Säuger und Vögel toxisch sind. Beispielsweise werden die Lectine von Phaseolus vulgaris von Ratten schlecht verdaut und können daher mit Darmzellen reagieren, was ein Aufbrechen des Bürstensaums der Zwölffingerdarm- und Leerdarmenterocyten verursacht. Als Ergebnis tritt eine abnormale Absorption potentiell schädlicher Substanzen auf, was zu schweren toxischen Wirkungen führt. Es besteht daher eine Notwendigkeit, Lectine zu identifizieren, die für Nematoden toxisch sind, aber gleichzeitig keine Toxizität gegenüber Säugern oder Vögeln entfalten. Diese würden bei der Anwendung zum Schutz von Nutzpflanzen unbeschränkt für die nahrungsmittelmäßige Verwendung des Materials, in dem das Fremdlectin präsentiert werden soll, nützlich sein. Die WO 92/02139 (Agricultural Genetics Company Ltd) offenbart, daß eine Gruppe von Lectinen, die durch eine spezifische mannosebindende Fähigkeit gekennzeichnet ist, die insbesondere von Amaryllidaceae und Alliaceae abgeleitet ist, für die Bekämpfung von Insektenschädlingen effektiv ist, aber für Säuger und Vögel nicht toxisch ist. Die WO 91/06311 (Scottish Crop Research Institute) offenbart, daß mannosespezifische Lectine, die von Amaryllidaceae erhalten wurden, eine antivirale Aktivität gegen RNA-Viren, wie das menschliche Immunschwächevirus, besitzen.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß zwei Gruppen von Lectinen für die Bekämpfung von Nematodenschädlingen nützlich sind, aber für Säuger und Vögel nicht toxisch sind, wobei eine Gruppe durch die spezifische mannosebindende Fähigkeit gekennzeichnet ist und insbesondere von Amaryllidaceae oder Alliaceae abgeleitet ist, und die zweite Gruppe durch die Fähigkeit, Mannose sowie andere Zucker zu binden, gekennzeichnet ist und insbesondere von Vicieae abgeleitet ist.
In ihrem breitesten Umfang betrifft die Erfindung die Verwendung von Lectinen mit einer spezifischen mannosebindenden Fähigkeit und/oder abgeleitet von Amaryllidaceae oder Alliaceae oder mit mannosebindender Fähigkeit und abgeleitet von Vicieae zur Bekämpfung von Nematodenschädlingen. Genauer werden derartige Lectine den Nematoden in Mengen präsentiert, die wahrscheinlich Mortalität, ein verringertes Larvengewicht und/oder eine verzögerte Entwicklung hervorrufen. Als Ergebnis der Präsentation solcher Lectine an Nematodenschädlinge von Pflanzen können Pflanzen vor Schädigung an Wurzeln, Stämmen, Brutbechern und anderen nützlichen Teilen geschützt werden. Solche Lectine sind andererseits für Säuger nichttoxisch und stellen eine sichere Alternative zur Verwendung chemischer Nematicide dar.
Die erfindungsgemäß verwendeten Lectine zeigen mannosebindende Eigenschaften. Lectine aus Alliaceae ähneln stark denjenigen von Amaryllidaceae bezüglich ihrer Molekularstruktur, Kohlenhydratbindungsspezifität, Aminosäurezusammensetzung und serologischen Eigenschaften. Alle binden ausschließlich D-Mannose. Alle enthalten große Mengen an sauren und Hydroxylaminosäuren, Glycin und Leucin. Alle enthalten Untereinheiten mit einem MG von 11.500 bis 14.000, die durch Disulfidbindungen nicht verknüpft sind und die als Dimere (z. B. Knoblauch) oder Tetramere (z. B. Schneeglöckchen) vorkommen können. Im allgemeinen ist die Lectinkonzentration in den Zwiebeln von Amaryllidaceae höher als in den Zwiebeln von Alliaceae.
Eine bevorzugte Verwendung von Amaryllidaceae-, Alliaceae- und Vicieae-Lectine gemäß der Erfindung ist die Insertion der Gene, die diese Proteine codieren, in Pflanzen.
Verschiedene Methoden sind einem Fachmann auf dem Gebiet zur Einschleusung und Expression fremder Gene in transgenen Pflanzen verfügbar. Diese umfassen Agrobacterium vermittelten Gentransfer, Mikroinjektion von DNA in Zellen oder Protoplasten, DNA-Transfer über wachsende Pollenschläuche, DNA-Aufnahme durch Tränken von zygotischen Embryonen, siliciumkohlenstoff-faservermittelte Abgabe, Mikroprojektilbeschuß (biolistischer Transfer) und direkte DNA-Aufnahme durch Verwendung von Polyethylenglycol, Liposomen oder Elektroporation. Sobald eine Linie von transgenen Pflanzen etabliert ist, kann der Charakter auf andere Zuchtsorten durch herkömmliche Pflanzenzüchtung übertragen werden.
Pflanzen, die gemäß den Verfahren dieser Erfindung geschützt werden können, bevorzugt durch Transformation, umfassen ohne Beschränkung: Reis, Weizen, Mais, Baumwolle, Kartoffel, Zuckerrohr, Weintrauben, Cassava, Süßkartoffel, Tabak, Sojabohnen, Zuckerrübe, Bohnen, Bananen, Tomaten, Kopfsalat, Ölsaatraps und Sonnenblumen.
Lectine, die zur Nematodenbekämpfung nützlich sind, und die entsprechenden Gene können ohne Beschränkung erhalten werden von Allium sativum (Knoblauch), Allium vineale, Allium ursinum, Allium moly, Allium cepa, Allium porrum, Narcissus pseudonarcissus, Clivia miniata, Galanthus nivalis (Schneeglöckchen), Hippeastrum hybr, Cicer spp., Lens culinaris, Lathyrus odoratus und Pisum sativum (Erbse).
Alternativ können diese Proteine direkt an Pflanzen unter Verwendung einer agrochemischen Formulierung oder als Teil einer Pesticidformulierung verabreicht oder begleitend verabreicht werden, die auch Bacillus thuringiensis (Bt), Bt-Toxin oder andere nematicide Substanzen umfassen kann.
Die zu kontrollierenden Nematoden umfassen Pflanzenparasiten der Ordnungen Dorylaimida und Tylenchida. Nematoden der Ordnung Dorylaimida, die erfindungsgemäß kontrolliert werden können, umfassen ohne Beschränkung Nematoden, die Pflanzenviren als Vektor übertragen und der Familie Longidoridae angehören, beispielsweise Xiphinema spp. und Longidorus spp. oder der Familie Trichodoridae angehören, beispielsweise Trichodorus spp. und Paratrichodorus spp. Nematodenen der Ordnung Tylenchida, die erfindungsgemäß kontrolliert werden können, umfassen ohne Beschränkung migratorische Ectoparasiten der Familien Anguinidae, beispielsweise Ditylenchus spp., Dolichodoridae, beispielsweise Dolichodorus spp. und Belenolaimidae, beispielsweise Belenolaimus spp. und Trophaus spp.; obligate Parasiten der Familien Pratylenchidae, beispielsweise Pratylenchus spp., Radopholus spp. und Nacobbus spp, Hoplolaimidae, beispielsweise Helicotylenchus spp., Scutellonema spp. und Rotylenchulus spp., Heteroderidae, beispielsweise Heterodera spp., Globodera spp., Meloidogyne spp. und Meloinema spp., Criconematidae, beispielsweise Croconema spp. Hemicycliophora spp. und Tylenchulidae, beispielsweise Tylenchulus spp., Paratylenchulus spp. und Tylenchocriconema spp.; und Parasiten der Familien Aphelenchoididae, beispielsweise Aphelenchoides spp., Bursaphelenchus spp. und Rhadinaphelenchus spp. und Fergusobiidae, beispielsweise Fergusobia spp.

Extraktion von Lectinen aus Pflanzenmaterial

Für den Zweck der Extraktion von Lectinen aus Amaryllidaceae- und Alliaceaearten, wie Narcissus pseudonarcissus und Galanthus nivalis, kann das folgende Verfahren angewendt werden.
Die Zwiebeln oder Blätter werden mit einem Mischer unter Verwendung von 50 ml 1 M Ammoniumsulfat pro g Frischgewebe homogenisiert. Anschließend wird der Extrakt durch Käseleinen filtriert und mit 4000 g 10 min zentrifugiert. Der so erhaltene Überstand wird über Nacht bei -20ºC eingefroren. Nach Auftauen wird das Präzipitat durch eine zweite Zentrifugation entfernt. Der geklärte Überstand wird auf eine Säule aus Mannosesepharose (50 ml Bettvolumen), die mit 1 M Ammoniumsulfat äquilibriert worden ist, aufgebracht. Nichtgebundene Proteine werden abgewaschen, und das Lectin wird unter Verwendung von nichtgepufferten 20 mM 1,3-Diaminopropan desorbiert.
Um alle phenolischen Verbindungen zu entfernen, wird das affinitätsgereinigte Lectin auf 1 M Ammoniumsulfat durch Zugabe des festen Salzes gebracht und auf eine Säule aus Phenylsepharose (Warenzeichen) (15 · 3 cm), die mit 1 M Ammoniumsulfat äquilibriert worden war, aufgebracht. Nach Waschen der Säule werden die Lectine unter Verwendung von destilliertem Wasser oder 1,3-Diaminopropan (20 mM, nichtgepufferte Lösung) eluiert.
Die Lectine der Erbse können nach einem Saccharidaffinitätsverfahren, basierend auf dem von Blobbel und Dobberstein [J. Cell Biology (1975) 67, 835-851] zur Herstellung von Concanavalin A, präpariert werden. Reife Cotyledonen von Pisum sativum cv "Feltham First" wurden in einem Nahrungsmittelprozessor in 20 mM N-Tris[hydroxymethyl]methyl-2- aminoethansulfonsäure, 0,5 M NaCl, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, pH 7,5, vermischt. Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugation mit 10.000 g für 30 min gewonnen. Der Überstand wurde bezüglich Ammoniumsulfat 30%ig Gew./Vol. gemacht, indem das feste Salz zugegeben wurde und durch Zentrifugation, wie vorstehend, geklärt. Der Überstand wurde 80%ig Gew./Vol., bezogen auf Ammoniumsulfat durch Zugabe des festen Salzes und des durch Zentrifugation ausgefällten Materials gemacht, in destilliertem Wasser aufgelöst und zuerst gegen Wasser und dann gegen 1 M NaCl dialysiert. Das Dialysat wurde mit SephadexTM G-50 vermischt, das zuvor mit 1 M NaCl äquilibriert worden war. Die Aufschlämmung wurde in eine Säule gegeben und mit 1 M NaCl 48 h durchgewaschen. Das Lectin wurde von der Säule mit 0,2 M D-Glucose in 1 M NaCl verdrängt.

Clonierung des Lectingens zur Insertion in Pflanzen

Die Clonierung der Gene für Amaryllidaceae- und Alliaceaelectine wirft spezielle Probleme auf. Die Extraktion der RNA aus Zwiebelgeweben ist besonders schwierig. Es wurde gefunden, daß Ovargewebe, in dem gefunden wurde, daß Lectine reichlich vorkommen, sich zur Extraktion für mRNA eignet.
Nachstehend ist ein Verfahren zum Erhalt von Lectingenen aus Schneeglöckchen (Galanthus nivalis) beschrieben. Ein Fachmann würde erkennen, daß dieses Protokoll leicht für andere Mitglieder der Amaryllidaceae oder Alliaceae angepaßt werden kann.
Blühende Pflanzen von Schneeglöckchen werden gewonnen, und die Ovarien werden aus den Blumen ausgeschnitten, in flüssigem Stickstoff gefroren und bei -80ºC gelagert. Gesamtzell-RNA wird aus Ovargewebe im wesentlichen wie von Finkelstein und Crouch [Plant Physiology (1986) 81, 907-912] beschrieben, hergestellt. polyA-reiche RNA wird chromatographisch über Oligodesoxythymidincellulose wie von Siflow et al [Biochemistry (1979) 18, 2725-2731] beschrieben, gereinigt, ausgenommen, daß die polyA-reiche RNA bei Raumtemperatur eluiert wird.
Eine cDNA-Bank kann unter Verwendung der polyA-angereicherten isolierten RNA unter Verwendung eines cDNA-Synthese-Kits hergestellt werden und in die EcoRI-Spaltstelle eines multifunktionellen Phagemids pT7T3 I8U insertiert werden. Die Bank wird in E. coliXL1 Blue propagiert.
Um Clone auszuwählen, die für das Lectingen rekombinant sind, werden die Kolonien unter Verwendung einer mit ³²P endmarkierten teildegenerierten Oligonucleotidsonde, die von der Aminosäuresequenz des Lectins für die Reste 41 bis 45 abgeleitet ist, durchgemustert:
5' TGT GTT TGT TGC CCA 3'
5' TGT GTT TGT AGC CCA 3'
5' TGT GTT TGT GGC CCA 3'
Die Hybridisierung wird 12 h bei 38ºC in 0,9 M Natriumchlorid, das 90 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6 mM EDTA, 10 · Denhardts, 0,1% SDS, 180 mg/ml hydrolysierte Hefe-RNA und 2 x 10&sup6; cpm/ml ³²P-markierte Sonde enthält, durchgeführt. Nach der Hybridisierung werden die Filter viermal in 6 · SSC (1 · SSC = 0,9 M Natriumchlorid und 0,09 M Natriumcitrat, pH 7,0) bei Raumtemperatur für 15 min gewaschen und anschließend 5 min bei Hybridisierungstemperatur in 6 · SSC gewaschen. Die Filter werden trocken geblottet, in Saran-Wrap eingepackt und einem Kodak-X-Omat-Film bei -80ºC exponiert. Kolonien, die positive Signale produzieren, werden unter Verwendung der gleichen Sonde unter den gleichen Bedingungen erneut durchgemustert. Die Plasmide werden aus den gereinigten Kolonien unter Verwendung des alkalischen Lyseverfahrens, wie von Birnboim und Doly [Nucleic Acids Research (1979) 7, 1513-1522] beschrieben, isoliert und sequenziert, um das Lectingen zu identifizieren, wobei das von Sanger et al. beschriebene Didesoxyverfahren verwendet wird [Proc. Natl. Acad. Sci. (1977) 74, 5463-5467].
Die vollständigen Nucleotidsequenzen für cDNAs entsprechend mehreren Isoformen des Schneeglöckenlectins sind in dem beigefügten Sequenzprotokoll gezeigt. Die Lectin-cDNA LECGNA2 enthält ein offenes Leseraster von 570 Nucleotiden mit einem wahrscheinlichen Initiationscodon in Position 18. Die Translation, die mit diesem Codon beginnt, erzeugt ein 157 Aminosäure langes Polypeptid mit einem berechneten Molekulargewicht von 16.917 Dalton, das einem in vitro Translationsprodukt für Schneeglöckchenlectin entspricht. Die 3'- nichttranslatierte Region enthält sechs Terminationscodons im Leseraster und ein mögliches Polyadenylierungssignal in Position 532. Der Vergleich der aminoterminalen Seguenz für das Lectin und die abgeleitete Aminosäuresequenz für den Lectinclon zeigt, daß das Lectin mit einer Leader(Signal)Sequenz von 23 Aminosäureen (2315 Dalton) synthetisiert wird. Es ist auch wahrscheinlich, daß 22 Aminosäuren (2278 Dalton) posttranslationell von dem C-terminalen Ende des Proteins entfernt werden.
Das Erbsenlectin A-Präproproteingen (LecA), das die Sequenz in einer Form, die zur Expression von LecA in transgenen Pflanzen nützlich ist, codiert, kann von dem die genomische DNA von Erbsen enthaltenen rekombinanten Bakteriophagen λLecA [Gatehouse et al., Nucleic Acids Research (1987) 18, 7642] abgeleitet werden.
Das benötigte Fragment wurde durch Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion von λLecA-DNA unter Verwendung des synthetischen Oligonucleotids
5'-GACTCTAGAATGGCTTCTCTTCAAACC
als N-terminalem Primer; und
5'-GACGGTACCCTATGCATCTGCAGCTTG
als C-terminalem Primer isoliert. Diese 27-meren enthalten zusätzlich Sequenzen an ihren 5'-Enden, um eine Restriktionsendonuclease Xbal-Erkennungssequenz am 5'-Ende und eine Kpnl-Erkennungssequenz am 3'-Ende der amplifizierten Erbsensequenz einzuschleusen. Dieses Fragment wurde glattendig in die HincII-Spaltstelle des Plasmids pUC18 ligiert, wodurch das Plasmid pVINp1 erhalten wurde. Die den Lectinvorläufer codierende Sequenz wurde von Kpnl + Xba1 gespaltener pVINp1- DNA hergestellt und in den Kpnl + Xba1-gespaltenen binären Vektor pRok2 ligiert, wodurch das Plasmid pRokVINp1 erhalten wurde. Das Plasmid pRokVINp1 wird verwendet, um transgene Pflanzen zu produzieren, die das Erbsenlectin A durch herkömmliche agrobacteriumvermittelte Pflanzentransformation exprimieren
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

Wirkung von Lectinen auf die in vitro Mobilität von Cystennematoden

Cysten der Kartoffelcystennematode (PCN) Globodera rostochiensis wurden zur Vermehrung unter Verwendung eines Kartoffelwurzeldiffusats stimuliert und frisch geschlüpften J2-Juveniltieren wurden mit Hand für Studienzwecke entnommen. Gruppen von 10 J2 wurden in Beobachtungsgläser, die 1 ml Wasser als Bekämpfung oder wäßrige Lösung von Phosphatpuffer, pH 6,4, oder Lectin in Phosphatpuffer enthielten, überführt. Die aus Galanthus nivalis (GNA), Narcissus pseudonarcissus (NPA) und Pisum sativum (Plec) extrahierten Lectine wurden getestet. Jede Behandlung wurde fünfmal wiederholt Die J2-Mobilität wurde alle 12 h für drei Tage in einem Raum mit kontrollierter Umgebung bei 12ºC überwacht. J2 galten als iminobil, wenn sie nicht auf die Stimulierung mit einem Bürstchen antworteten [Alphey, Robertson & Lyon (1988) Revue de Nematalogie 11 (4), 399- 404].
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Es ist klar, daß bei allen getesteten Konzentrationen alle drei Lectine eine negative Wirkung auf die PCN-Mobilität haben.

Beispiel 2

Wirkung einer Tränkungsanwendung von Lectinen auf die Entwicklung von Gallen durch Wurzelknöllchennematoden an Tomatenpflanzen

Glasröhrchen (7,5 · 2,5 cm) wurden jeweils mit 24,5 g gesiebtem, trockenem Sand, 1 ml Wasser, enthaltend 350 Meloidogyne incognita J2-Juveniltiere und 5 ml Wasser oder Phosphatpuffer, pH 6,4, oder Lösung in Phosphatpuffer, pH 6,4, von Lectinen für eine Endkonzentration von 0,1 bis 100 ug m11 gefüllt. Jede Behandlung wurde 10mal wiederholt. Ein zwei Wochen alter Tomatensämling (cv Moneymaker) wurde in jedes Röhrchen gepflanzt und nach 14 Tagen im Treibhaus bei 22 bis 27ºC wurden die Wurzeln gewaschen, und die Anzahl der durch Nematodenernährung induzierten Gallen wurde aufgezeigt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Alle drei Lectine führen zu einer Reduktion der Anzahl der Nematodengallen, die an Tomatensämlingen gebildet wurden.

Beispiel 3

Konstruktion und Transformation von Schneeglöckenlectinclonen

Der LECGNA2-Clon enthielt eine durch ein 570 Basen EcoR1-Linker verknüpfte Schneeglöckenlectin-(GNA)-Gen-cDNA, cloniert in den Phagemid pT7T3 18U. Die N-terminalen und Cterminalen Peptide, die während der Verarbeitung zur Bildung des reifen Proteins gespalten worden waren, sind auf den Sequenzdaten markiert.
Die codierende Region des Lectingens wurde in pUC19 unter Verwendung einer Standard-Polymerasekettenreaktions- (PCR)-Technologie [Innis, M. A. et al., Hrg. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press, San Diego, 1990] subcloniert. Oligonucleotidprimer wurden hergestellt, die die N-terminalen und C-terminalen Regionen bedeckten, die Restriktionsspaltstellen beherbergten, so daß die so erhaltenen amplifizierten Fragmente unter Verwendung eines BamHI/Kpnl-Doppelspaltansatzes subcloniert werden konnten. Diese Primer umfassen die Sequenzen:
N-Terminus: 5'-CGGATCCATGGCTAAGGCAAGT
C-Terminus: 5'-CGGTACCTCATTACTTTGCCGT
Die Fragmente wurden unter Verwendung von PCR und der LECGNA2-DNA als Matrize amplifiziert. Die amplifizierten Fragmente wurden in pUC19 cloniert, der mit BamHI + Kpnl linearisiert worden war. Die rekombinanten Plasmide wurden bezüglich der korrekten Insertionsgröße mit BamHI/Knpl abgesucht. Die so erhaltenen Konstrukte (p1GNA2) wurden sequenziert, um zu gewährleisten, daß keine unerwünschten Mutationen als Artefakte der PCR-Reaktion erzeugt worden waren.
Das GNA-codierende Fragment wurde durch Spaltung des p1GNA2-Konstrukts mit BamHI/KpnI isoliert, in mit BamHI/KpnI gespaltenen rROK2 ligiert und zur Transformation des E. coli-Stamms MC1022 verwendet. Diese Rekombinanten ergaben die binären Agrobacterium-Vektorkonstrukte, die für die konstitutive Expression von GNA in transgenen Pflanzen nützlich sind, wie in Fig. 1 erläutert. Die Kolonien wurden durch Restriktionsspaltung unter Verwendung von BamHI/KpnI, SphI und HincIII durchgemustert und das korrekte p15GNA1- Konstrukt wurde in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 durch triparentale Paarung mit HB101(pRK2013) gemäß etablierten Methoden [Bevan, M. (1984) Nucleic Acids Research, 12, 103-110] mobilisiert. Einzelkolonien, die die p15-GNA1-Plasmide enthielten, wurden durch Spaltung mit BamHI/KpnI erneut durchgemustert, um die korrekte Größe der Insertion zu überprüfen.

Beispiel 4

Konstruktion der Plasmide pGNA2 und pGNA3

Das Plasmid p1GNA2 wurde mit BamHI und KpnI gespalten und in KpnI-gespaltenen pAPT9 in Gegenwart eines 8 Basenpaar großen Oligonucleotids (5'-GATCGTAC-3') ligiert, das zur Verknüpfung der KpnI-Spaltstelle und der BamHI-Spaltstelle an dem 5'-Ende des insertierten Fragments verwendet wurde. Nach der Transformation von E. coli MC 1002 bezüglich Ampi cillinresistenz wurden Restriktionsanalysen und Sequenzierung verwendet, um zu bestätigen, daß das Fragment in der Sense-Orientierung insertiert war, und um die korrekte Anwesenheit des Oligolinkers zu bestätigen. Das so erhaltene Plasmid, das als pGNA1 bezeichnet wurde, trägt eine Pflanzenexpressionskassette, die den CaMV35S-Promotor, die GNA-codierende Region und den NOS-Terminator umfaßt. Dieses Plasmid wurde mit BamHI gespalten, mit BamHIgespaltenem pAPT5 ligiert und zur Transformation von MC1022 für Tetracyclinresistenz verwendet. Die Restriktionsanalyse und die auf PCR basierende Analyse der so erhaltenen Konstrukte zeigten an, daß die CaMV35S-GNA-NOS-Kassette in pAPT5 in beiden Orientierungen, bezogen auf die T-DNA insertiert waren, so daß das GNA-Gen in linker Richtung in dem Plasmid pGNA2 und in rechter Richtung in dem Plasmid pGNA3 transkribiert wurde. Das Plasmid pAPTS ist ein binärer Vektor auf der Basis von pRK290, der Tetracyclinresistenz codiert und eine T-DNA-Region enthält, die zwei Gene für die Pflanzenselektion umfaßt: TR 2'-Promotor-β-glucuronidase (uidA) codierende Sequenz-NOS-Terminator und CaMV-35S- Promotor-Neomycinphosphotransferase-(aph3'II)-codierende Sequenz-Octopinsynthaseterminator. Diese Gene sind so positioniert, daß die Promotorseguenzen benachbart sind, und daß das uidA-Gen der Sequenz der linken Grenze der T-DNA benachbart ist. Einzigartige Spaltstellen für Hindil, PacI und BamHI sind ebenfalls in der T-DNA-Region lokalisiert und proximal der Sequenz der rechten Grenze. Die Plasmide pGNA2 und pGNA3 wurden in Agrobacterium tumefaciens LBA4404 durch triparentale Paarungen mit E. coli-HB101(pRK2013) gemäß etablierten Methoden mobilisiert, auf Minimalagar, der Tetracyclin (1 mg/l) enthielt, selektiert, und so erhaltenen Einzelkolonien wurden bis zur Reinheit auf den gleichen Medien ausgestrichen. Die Anwesenheit des korrekten Plasmids pGNA2 oder pGNA3 in den so erhaltenen Agrobacterium tumefaciens LBA4404-Stämmen wurde durch Restriktionsanalysen und Analysen auf PCR-Basis bestätigt.

Beispiel 5

Konstruktion des Plasmids pPCG6

Das Plasmid pPCG6 enthält zwei Insektenresistenzgene: das GNA-Gen, das ein mannosespezifisches Lectin aus Schneeglöcken (Galanthus nivalis, L) codiert, und das Langbohnentrypsininhibitor-(CpTi)-Gen, isoliert aus Langbohnen (Vigna unguiculata Walp). Das verwendete CpTi-Gen war am 5'-Ende verkürzt, so daß es die Nucleotide +153 bis +476 der ursprünglichen CpTi-Sequenz [Hilder, V. et al. (1989) Plant Molecular Biology 13, 701-710] und die codierende Region, beginnend am zweiten Initiationscodon im Leseraster enthält. Standard-PCR-Techniken wurden verwendet, um BamHI und KpnI- Restriktionsspaltstellen an dem 5'- bzw. 3'-Ende der codierenden Region hinzuzufügen, was die Clonierung des Fragments in pUC19 zwischen den gleichen Stellen erlaubt. Diese verkürzte CpTi-codierende Region wurde anschließend unter Verwendung von BamHI und SstI herausgeschnitten und in die BglII- und SstI-Spaltstellen, die zwischen dem CaMV35S- Promotor (-420 Basenpaare) und NOS-Terminator lokalisiert waren, cloniert. Die so erhaltene CaMV35S-CpTi-Kassette ist auf einem 1,1 kb großen BamHI-Fragment enthalten. Wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde die codierende Region des GNA- Gens aus LECGNA2 in pGNA1 subcloniert, wobei die so erhaltene CaMV35S-GNA-NOS-Kassette auf einem 1, 2 kb großen BamHI- Fragment enthalten ist. Um pPCG6 zu erzeugen, wurde ein speziell entwickelter Polylinker verwendet, der eine 150 bp große Spacer-Region, die von einer stromaufwärtigen Region (-433 bis -583) des CaMV35S-Promotors, gebunden durch BamHI- BglII und BclI-BamHI-Spaltstellen, abgeleitet ist, enthielt. Die BamHI-Fragmente, die die CpTi- und GNA-Gene enthielten, wurden zwischen die BamHI-BglII-Spaltstellen bzw. BclI- BamHI-Spaltstellen cloniert, so daß die zwei Gene als ein umgekehrtes "Kopf-an-Kopf"-Repeat orientiert waren. Diese Konformation von Genen beschränkt die Möglichkeit von Deletionen, die auftreten, sofern irgendeine Rekombination zwischen den ähnlichen Sequenzen der zwei Kassetten stattfindet und sollte eine doppelte Verstärkung der CaMV35S-Promotoren infolge der engen Nachbarschaft der zwei Sequenzen erlauben. Schließlich wurde das 2, 3 kb große BamHI-Fragment, das beide Expressionskassetten enthielt, in die BamHT- Spaltstelle von pAPTS cloniert, so daß das GNA-Gen proximal zur Sequenz der rechten Grenze war. Andere Einzelheiten von pAPT5 sind, wie in Beispiel 4 beschrieben.

Beispiel 6

Transformation von Tabak

Die Transformation von Tabak Nicotiana tabacum var Samsun mit Agrobacterium tumefaciens LBA4404, das die p15GNA1-Plasmide enthielt, wurde unter Verwendung des Standard-Blattscheibenverfahrens [Horsch, R. B. et al. (1985) Science 227, 1229-1231] durchgeführt. Blattscheiben wurden auf Selektivmedien, die Kanamycin in einer Konzentration von 100 mg/l enthielten, gezüchtet, um transformierte Schößlinge zu selektieren. Die Schößlinge wurden auf Kanamycin bewurzelt, um nichttransformierte Ausläufer zu beseitigen. Die transformierten Pflänzchen wurden auf Schneeglöckchen- Lectinexpression nach Standard-ELISA-Verfahren [Engvall, E. (1990) Meths. Enzymol. 70, 419] getestet. Transgene Pflanzen von den Linien 15GNA33, 15GNA35 und 15GNA79 exprimieren hohe Gehalte an GNA-Antigen, die äquivalent zu 40,2, 26,6 bzw. 47,3 ug/g Frischgewicht sind. Die biologische Aktivität des Lectins in diesen Pflanzen kann durch Standard-Hämagglutinations-Assay-Verfahren unter Verwendung von trypsinisierten Kaninchen-Erythrocyten [Liss, H. & Sharon, N. (1973) Ann. Rev. Biochem. 42, 541-574] auf phosphatgepufferten Kochsalzextrakten von freigetrocknetem Blattgewebe nachgewiesen werden.

Beispiel 7

Transformation von Kartoffeln

Die Transformation von Kartoffel Solanum tuberosum cv. Desiree mit Agrobacterium tumefaciens LBA4404, das pGNA2- Plasmide enthielt, wurde unter Verwendung des Stammsektionstransformationsverfahrens [Newell, C. A. et al. (1991) Plant Cell Rep. 10, 30-34] durchgeführt. Stammsektionen wurden auf Selektivmedien, die 100 mg/l Kanamycin enthielten, gezüchtet, um transformierte Schößlinge zu selektieren. Die Schößlinge wurden auf Kanamycin bewurzelt und auf β-Glucuronidaseenzymaktivität getestet, um transgene Schößlinge von nichttransformierten Ausläufern zu identifizieren. Die transformierten Pflänzchen wurden durch verstärkte Chemilumineszenz bezüglich Schneeglöckchen-Lectinexpression getestet.

Beispiel 8

Transformation von Tomaten

Die Transformation von Tomate Lycopersicon esculentum cv. Ailsa Craig mit Agrobacterium tumefaciens LBA4404, das pGNA2-Plasmide enthielt, wurde unter Verwendung von Stammsektionen von in vitro gezüchteten Pflänzchen [Bird, C. R. et al. (1988) Plant Mol. Biol. 11, 651-662] durchgeführt. Die Explantate wurden auf Medien, die 50 mg/l Kanamycin enthielten, gezüchtet, um nach transformierten Schößlingen zu selektieren. Die Schößlinge wurden auf Kanamycin bewurzelt, das effektiv nichttransgene Ausläufer eliminiert. Die transformierten Pflänzchen wurden auf Schneeglöckchen-Lectinexpression nach Standard-Immundetektionstechniken unter Verwendung verstärkter Chemilumineszenz getestet. Die transgenen Pflanzen exprimierten das GNA-Protein bis zu einem Spiegel von 0,4% Gesamtprotein.

Beispiel 9

Transformation von Ölsaatraps

Die Transformation mehrerer Linien von Ölsaatraps Brassica napus mit Agrobacterium tumefaciens LBA4404, das die Plasmide pGNA2, pGNA3 oder pPCG6 enthielt, wurde unter Verwendung eines Sämling-Hypocotylverfahrens [de Block, M. et al. (1989) Plant Physiol. 91, 694-701] durchgeführt. Hypocotylexplantate wurden in Gegenwart von 20 mg/l Kanamycin gezüchtet, um nach transformierten Schößlingen zu selektieren; die Schößlinge wurden in einem Medium, das Kanamycin in der gleichen Menge enthielt, die effektiv nichttransgene Ausläufer ausmusterten, bewurzelt. Die Pflänzchen wurden auf Schneeglöckchen-Lectinexpression nach Standard-Immundetektionstechniken unter Verwendung verstärkter Chemilumineszenz getestet. Die transgenen Linien exprimierten Gehalte an GNA-Protein bis zu 1% des Gesamtproteins.

Beispiel 10

Transformation von Kopfsalat

Die Transformation von Kopfsalat mit Agrobacterium tumefaciens LBA4404, das p15GNA1-Plasmide enthielt, wurde unter Verwendung von Keimblättern von Sämlingen als Ausgangsmaterial [Michelmore, C. et al. (1987) Plant Cell Rep. 6, 439-442] durchgeführt. Cotyledonstücke wurden in Gegenwart von 50 mg/l Kanamycin gezüchtet, um nach transformiertem Gewebe zu selektieren. Die Schößlinge wurden in Medium, das den gleichen Gehalt an Kanamycin enthielt, um nichttransgene Ausläufer auszumustern, bewurzelt. Die transformierten Pflänzchen wurden auf Schneeglöckchen-Lectinexpression nach Standard-Immundetektionstechniken unter Verwendung verstärkter Chemilumineszenz getestet. Die transgenen Linien exprimierten Gehalte an GNA-Protein bis zu etwa 2% des Gesamtproteins.

Beispiel 11

Transformation von Reis

Die Tranformation von Reis (Oryza sativa) wurde nach Mikroprojektilbeschuß unter Verwendung einer embryogenen Suspension von gezüchteten Zellen als Ausgangsmaterial [Cao, J. et al. (1992) Plant Cell Reports 11 : 586-591] durchgeführt. Wolframmikroprojektile wurden mit 5 ug Plasmid-DNA, die die GNA-codierende Region, exprimiert von einem geeigneten Promotor, beispielsweise dem Blumenkohlmosaikvirus 35S-Promotor oder dem Mais-adh-1-Promotor mit der 5'-Intronsequenz, enthielt, beschichtet. Die beschossenen Zellen wurden selektiert, wobei ein geeignetes Mittel verwendet wurde, beispielsweise Zellen, die mit Konstrukten bombardiert wurden, die die Expression von Streptomyces hygroscopicus- Phospinothricinacetyl-Transferasegen (bar) exprimieren, werden in Gegenwart von 4 mg/l Ammoniumglufosinat selektiert oder Zellen, die das Hygromycin-Phosphotransferasegen (hpt) exprimieren, können unter Verwendung von Hygromycin B in einer Konzentration von 25 bis 50 mg/l exprimiert werden. Die transformierten Pflanzen wurden aus den embryogenen Calli regeneriert, und die Expression des Schneeglöckchen- Lectingens wurde unter Verwendung von Standard-Immundetektionstechniken unter Verwendung verstärkter Chemilumineszenz getestet.

Beispiel 12

Wirkung von transgenem Ölsaatraps, der Lectin und Proteaseinhibitorgene exprimiert, auf eine Cystennematode, Heterodera schachtii

Die Linien von transgenem Ölsaatraps wurden erzeugt, die das Galanthus nivalis-Lectingen allein (GNA2) oder in Kombination mit dem Trypsininhibitorgen von Vigna unguiculata (PCG6), wie in Beispiel 9 beschrieben, exprimieren. Beide transgenen Pflanzen wurden aus dem Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotor exprimiert. In allen Linien enthielt die T-DNA auch das Markergen, das β- Glucuronidase codiert. Für jede transgene oder nichttransformierte Kontrollinie wurden mehrere replikate Töpfe von zwei Samen jeweils in Bodenerde gepflanzt und unter kontrollierten Umgebungsbedingungen im Treibhaus gezüchtet. Wenn beide Samen in einem Topf keimten, wurde einer entfernt. Als die Pflanzen etwa 10 cm groß waren, wurde ein Blattscheibchen von jeder Pflanze zur Bewertung der 53-Glucuronidaseaktivität entnommen; Pflanzen, die keine Aktivität zeigten, wurden verworfen. Für jede Linie wurden sechs transgene und sechs Kontrollpflanzen etwa der gleichen Größe durch Pipettieren einer Suspension, die 1000 bis 1500 Heterodera schachtii-Eier und infektiöse Juveniltiere in ein 2 bis 3 cm Loch im Boden, benachbart zu dem sich entwickelnden Wurzelsystem, inokuliert. Die Pflanzen wurden 40 Tage wachsengelassen, bevor das Wurzelsystem jeder Pflanze zur Analyse geerntet wurde. Die weiblichen Nematoden wurden von dem Wurzelsystem abgewaschen und gezählt. Die Anfärbung des Wurzelsystems ergab, daß der Hauptteil der weiblichen sowohl in der Bekämpfung als auch in den transgenen Linien zum Zeitpunkt des Erntens geschlechtsreif waren.
Die mittlere Anzahl der Weibchen pro Wurzelsystem ist in Tabelle 3 zusammengefaßt. Es ist klar, daß für beide verwendete Konstrukte die Expression der Transgene nicht nur die Anzahl der Nematoden pro Wurzelsystem verringerte, sondern auch den Prozentsatz der reifen weiblichen Nematoden in der Population verringerte.
PCG6: Transgene Pflanzen, die Lectin- und Proteaseinhibitorgene exprimieren
GNA2: Transgene Pflanzen, die Lectingen exprimieren.

Beispiel 13

Wirkung von transgenem Ölsaatraps, der Lectin- und Proteaseinhibitorgene exprimiert, auf eine migratorische endoparasitäre Nematode, Pratylenchus neglectus

Die verwendeten Linien von transgenem Ölsaatraps waren wie in Beispiel 12 beschrieben. Die Samen wurden oberflächensterilisiert, keimten unter sterilen Bedingungen auf Agar enthaltenden Medien und wurden 10 Tage lang wachsengelassen. Eine Probe des Pflanzenmaterials wurde auf β-Glucuronidaseaktivität getestet, und alle Pflanzen, die keine Aktivität zeigten, wurden verworfen. Für jede getestete Linie wurden zwischen vier und sieben transgenen und Kontrollpflanzen mit 122 ± 11 aktiven Pratylenchus neglectus-Nematoden inokuliert, die direkt auf die Agaroberfläche aufgebracht wurden. Nach drei Monaten wurde die Anzahl von Nematoden pro Pflanze gezählt.
Die in Tabelle 4 zusammengefaßten Daten zeigen klar, daß für beide transgenen Linien PCG6 und GNA2 die Anzahl an Nematoden pro Wurzel deutlich reduziert ist.

Beispiel 14

Wirkung von transgenen Kartoffeln, die ein Lectingen exprimieren, auf die Cystennematode Globodera pallida

Linien der transgenen Kartoffel wurden erzeugt, die das Galanthus nivalis-Lectingen (GNA2), wie in Beispiel 7 beschrieben, exprimieren. Das Transgen wurde von dem Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotor exprimiert. Für jede transgene und nichttransformierte Kontrollinie wurden mehrere 60 ml Replikatkanister, die Bodenerde enthielten, mit einer Kartoffelknolle bepflanzt und mit 1500 Globodera pallida-Eiern und infektiösen Juveniltieren inokuliert. Die Kanister wurden mit einem Verschluß versehen und im Dunkeln vier Wochen bei 18ºC inkubiert. Das Wurzelsystem jeder Kartoffelpflanze wurde geerntet, und die Anzahl der Nematodencysten wurde gezählt. Die mittlere Anzahl der Cysten pro Pflanzenwurzelsystem ist in Tabelle 5 zusammengefaßt. Es ist klar, daß die transgenen Linien, die das Lectingen exprimieren, signifikant weniger Nematodencysten haben als die nichttransformierten Linien.

Sequenz ID No. LECGNA1

Art der Sequenz: Nucleotidsequenz mit entsprechendem Protein
Länge der Sequenz: 610 Basen
Strangform: Doppelsträngig
Topologie: Linear
Art des Moleküls: cDNA zu mRNA
Ursprüngliche Herkunft des Organismus: Galanthus nivalis
Experimentelle Quelle: Clone
Merkmale: von 1 bis 67 bp vermutliches Signalpeptid P von 68 bis 382 bp vermutliches reifes Protein P von 383 bis 487 bp vermutliches C- terminales Peptid P von 488 bis 610 bp nicht- translatierte 3'-Region P

Sequenz ID No. LECGNA2

Art der Sequenz: Nucleotidsequenz mit entsprechendem Protein
Länge der Sequenz: 570 Basen
Strangform: Doppelsträngig
Topologie: Linear
Art des Moleküls: cDNA zu mRNA
Ursprüngliche Herkunft des Organismus: Galanthus nivalis
Experimentelle Quelle: Clone
Merkmale: von 1 bis 17 bp nichttranslatierte 5'-Region E von 18 bis 86 bp Signalpeptid E von 87 bis 401 bp reifes Protein E von 402 bis 491 bp C-terminales Peptid E von 492 bis 570 bp nichttranslatierte 3'-Region

Sequenz ID No. LECGNA3

Art der Sequenz: Nucleotidsequenz mit entsprechendem Protein
Länge der Sequenz: 667 Basen
Strangform: Doppelsträngig
Topologie: Linear
Art des Moleküls: cDNA zu mRNA
Ursprüngliche Herkunft
des Organismus: Galanthus nivalis
Experimentelle Quelle: Clone
Merkmale: von 1 bis 62 bp vermutliches Signalpeptid P von 63 bis 377 bp vermutliches reifes Protein P von 378 bis 467 bp vermutliches C- terminales Peptid P von 468 bis 667 bp nichttranslatierte 3'-Region P
TTGCATGCAT GTGAGAAGAG TAATATAATA TATGTGCATT TTACATCAAT GCACACCGTG 547
TTTCTTTCTC ACAAATAAAT AACTAGGTTG TACTGGACGT AAATAAAGTC CCGCCTCCTA 607
GTTTCGTGCC TTCTACGCAT CTTGTACGCA TCTTGTATGC ATGCATTTTG GAAAGGAGGC 667

Sequenz ID No. LECGNA5

Art der Sequenz: Nucleotidsequenz mit entsprechendem Protein
Länge der Sequenz: 650 Basen
Strangform: Doppelsträngig
Topologie: Linear
Art des Moleküls: cDNA zu mRNA
Ursprüngliche Herkunft
des Organismus: Galanthus nivalis
Experimentelle Quelle: Clone
Merkmale: von 1 bis 63 bp vermutliches Signalpeptid P von 64 bis 378 bp vermutliches reifes Protein P von 379 bis 468 bp vermutliches C- terminales Peptid P von 469 bis 650 bp nichttranslatierte 3'-Region P
TGATCTATGA ACCTTGCATG CATGTGAGAA GAGTAATAAA ATATCTGCAT TTTAGATCAA 538
TGCACACGCT GTTTGTTTGT CACAAATAAA TAACTAGGTT GTACTGGACA TAAATATAGT 598
CCCGCCTCCT GGTTTCATCC CTTGTACCCA TCTTCTATGC ATGCATTTTG GA 650

Sequenz ID No. LECGNA8

Art der Sequenz: Nucleotidsequenz mit entsprechendem Protein
Länge der Sequenz: 597 Basen
Strangform: Doppelsträngig
Topologie: Linear
Art des Moleküls: cDNA zu mRNA
Ursprüngliche Herkunft
des Organismus: Galanthus nivalis
Experimentelle Quelle: Clone
Merkmale: von 1 bis 61 bp vermutliches Signalpeptid P von 62 bis 376 bp vermutliches reifes Protein P von 377 bis 481 bp vermutliches C- terminales Peptid P von 482 bis 597 bp nichttranslatierte 3'-Region P
TTATGACCCG TGAGCTCCGG GCTGCATGTG TGTGAGAATG AGGAATAAAA GTAAAACCAT 541
GTGGTGGACG TGCTGAAAAT AAATAACTGC TATGTATGAT GTAATGGAGA CTTATC 597

Claims

1. Verwendung von Lectinen, die von Amaryllidaceae, Alliaceae oder Vicieae abgeleitet sind, zur Bekämpfung von Nematoden.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Lectine von Allium sativum (Knoblauch), Allium vineale, Allium ursinum, Allium moly, Allium cepa, Allium porrum, Narcissus pseudonarcissus, Clivia miniata, Glanthus nivalis (Schneeglöckchen), Hippeastrum hybr, Cicer spp., Lens culinaris, Lathyrus odoratus und Pisum sativum (Erbse) abgeleitet sind.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Lectin aus der Expression des Lectingens in einer transgenen Pflanze stammt.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Lectingen eine Sequenz besitzt, die mit einer der Sequenzprotokolle LECGNA1, LECGNA2, LECGNA3, LECGNA5 und LECGNA8 identisch ist oder eine wesentliche funktionelle Homologie damit besitzt.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, zur Bekämpfung von Nematoden der Klasse, umfassend die Familien Longidoridae, Trichodoridae, Anguinidae, Dolichodoridae, Belenolaimidae, Pratylenchidae, Hoplolaimidae, Heteroderidae, Criconematidae, Tylenchulidae, Aphelenchoididae und Fergusobiidae.

6. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche zum Schutz von Reis, Weizen, Mais, Baumwolle, Kartoffeln, Zuckerrohr, Weintrauben, Cassava, Süßkartoffel, Tabak, Sojabohnen, Zuckerrüben, Bohnen, Bananen, Tomaten, Kopfsalat, Ölsaatraps und Sonnenblumen.

7. Verfahren zur Bekämpfung von Nematodenschädlingen in einem Wirt oder in einer Umgebung, die zu Nematodenbefall neigt, wobei man in dem Wirt oder in der Umgebung eine nematicide Menge eines Lectins, das von Amaryllidaceae, Alliaceae oder Vicieae abgeleitet ist, etabliert.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Wirt genetisch so modifiziert ist, daß er das Lectin an der Stelle des Nematodenangriffs präsentiert.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei der Wirt eine Pflanze ist.