DE10006147A1 - Verfahren zur Herstellung von monoglycosidierten Flavonoiden - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoglycosidierten Flavonoiden durch enzymatische Hydrolyse von Rutinosiden, wobei für die enzymatische Hydrolyse ein Enzym, das auf einem Träger immobilisiert ist, verwendet wird. Durch dieses Verfahren können hohe Enzymkosten vermieden werden, und es wird gleichzeitig ein hoher Automatisierungsgrad verbunden mit einer hohen Raum/Zeitausbeute erreicht.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoglycosidierten Flavonoiden durch enzymatische Hydrolyse von Rutinosiden. Dabei wird der Rhamno­ serest der Rutinoside enzymatisch abgespalten.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden als Rutinoside solche Verbindungen bezeichnet, die einen zuckerfreien Bestandteil enthalten, an welchen ein Rest der For­ mel (I)

über eine glycosidische Bindung gebunden ist. Beispielsweise handelt es sich bei den Rutinosiden um Flavonoide mit der in Formel (I) dargestellten bisglycosidischen Einheit. Rhamnose und/oder die entsprechenden Glucopyranoside können aus den Rutinosiden gewonnen werden. Die Glucopyranoside leiten sich von den Rutinosiden dadurch ab, daß sie anstelle des Rests der Formel (I) einen Rest der Formel (I*)

enthalten, der an den zuckerfreien Bestandteil gebunden ist. Beispielsweise können aus Rutin sowohl Rhamnose als auch Isoquercetin gewonnen werden.

Rhamnose ist ein Monosaccharid, welches in der Natur weit verbreitet, allerdings zu­ meist nur in geringen Mengen vorkommt. Eine wichtige Quelle für Rhamnose sind z. B. die glycosidischen Reste natürlicher Flavonoide, wie Rutin, aus welchen die Rhamnose durch Glycosidspaltung gewonnen werden kann. Rhamnose spielt beispielsweise eine wichtige Rolle als Ausgangsstoff für die Darstellung von künstlichen Aromastoffen, wie Furaneol.

Isoquercetin ist ein monoglycosidiertes Flavonoid der folgenden Strukturformel (II)

Als Flavonoide (lat. flavu = gelb), die in Pflanzen weit verbreitete Farbstoffe sind, werden z. B. Glycoside von Flavonen, denen das Grundgerüst des Flavons (2-Phenyl-4H-1- benzopyran-4-on) gemeinsam ist, bezeichnet.

Der zuckerfreie Bestandteil der Flavonoide ist das sogenannte Aglykon. Isoquercetin ist beispielsweise ein Glycosid des Aglykons Quercetin (2-(3,4-Dihydrophenyl)-3,5,7- trihydroxy-4H-1-benzopyran-4-on), welches sich von Flavon durch das Vorhandensein von fünf Hydroxylgruppen unterscheidet. Im Isoquercetin ist der Kohlenhydratrest Glucose an die Hydroxylgruppe in Position 3 des Quercetins gebunden. Isoquercetin wird z. B. als Quercetin-3-O-β-D-glucopyranosid oder 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-(β-D- glucopyranosyloxy)-5,7-dihydroxy-4H-1-benzopyran-4-on bezeichnet. Es ist aber bei­ spielsweise auch unter dem Namen Hirsutrin bekannt.

Flavonoide bzw. Flavonoidgemische werden beispielsweise in der Lebensmittel- und Kosmetikindustrie verwendet und gewinnen dort zunehmend an Bedeutung. Besonders monoglycosidierte Flavonoide, wie z. B. Isoquercetin, zeichnen sich durch eine gute Aufnahmefähigkeit im menschlichen Körper aus.

Ein Beispiel für ein natürlich vorkommendes Flavonoid mit bisglycosidischer Einheit ist Rutin, welches folgende Strukturformel (III) besitzt:

Rutin ist wie Isoquercetin ebenfalls ein Glycosid des Aglykons Quercetin, wobei der Kohlenhydratrest Rutinose an die Hydroxylgruppe in Position 3 des Quercetins gebun­ den ist. Der Kohlenhydratrest im Rutin besteht aus einer in 1- und 6-Stellung verknüpf­ ten Glucose- und einer teminal gebundenen Rhamnose- bzw. 6-Deoxymannose-Einheit. Rutin wird z. B. als Quercetin-3-O-β-D-rutinosid oder 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-{[6-O- (6-deoxy-α-mannopyranosol)-β-D-glucopyranosyl]oxy}-5,7-dihydroxy-4H-1-benzopyran- 4-on bezeichnet. Es ist jedoch beispielsweise auch unter den Namen Sophorin, Birutan, Rutabion, Taurutin, Phytomelin, Melin oder Rutosid bekannt.

Rutin bildet mit drei Molekülen Kristallwasser blaßgelbe bis grünliche Nadeln. Wasser­ freies Rutin hat die Eigenschaft einer schwachen Säure, wird bei 125°C braun und zersetzt sich bei 214-215°C. Rutin, das in vielen Pflanzenarten - häufig als Begleiter des Vitamins C - vorkommt, z. B. in Zitrusarten, in gelben Stiefmütterchen, Forsythien-, Aka­ zienarten, verschiedene Solanum- und Nicotiana-Arten, Kapern, Lindenblüten, Johanniskraut, Tee usw., wurde 1842 aus der Gartenraute (Ruta graveolens) isoliert. Rutin kann auch den Blättern des Buchweizens und der ostasiatischen Färberdroge Wei-Fa (Sophora japonica, Fabaceae), die 13-27% Rutin enthält, gewonnen werden.

Es ist wünschenswert, sowohl Rhamnose als auch monoglycosidierte Flavonoid aus natürlichen Rohstoffen, beispielsweise aus Flavonoiden mit einer bisglycosidischen Ein­ heit, herzustellen. In diesem Zusammenhang ist z. B. die Spaltung von Rutinosiden zu Rhamnose und den entsprechenden Glucopyranosiden interessant.

Enzymatisch katalysierte Darstellungen von Rhamnose sind in der Literatur beschrie­ ben. Beispielsweise sind in der EP-A-0317033 ein Verfahren zur Herstellung von L-Rhamnose beschrieben, wobei die rhamnosidische Bindung von Glycosiden, die Rhamnose in terminaler Position gebunden halten, durch enzymatische Hydrolyse er­ reicht wird. Bei dieser Spaltung wird das Substrat üblicherweise als Suspension in einem wäßrigen Medium durchgeführt. Jedoch sind diese Reaktionen zumeist wenig selektiv. Beispielsweise entsteht aufgrund der bisglycosidischen Struktur des Kohlenhydratrestes im Rutin oft eine Mischung der beiden Monosaccharide Glucose und Rhamnose. Zudem entstehen zumeist hohe Anteile am Aglykon Quercetin sowie weitere unerwünschte Ne­ benprodukte.

Weiterhin werden enzymatisch katalysierte Spaltungen von Rutin auch in der JP-A-01213293 beschrieben. Allerdings verlaufen derartige in wäßrigen Medien durch­ geführte Reaktionen zumeist ebenfalls wenig selektiv.

Diese vorstehend beschriebenen Verfahren verwenden das Enzym in Lösung, d. h. na­ tiv. Dabei wird das Enzym direkt der Reaktionslösung zugegeben. Obwohl diese Verfah­ ren im Labormaßstab durchführbar sind, sind sie für eine technische Anwendung nicht praktikabel, da das Enzym aus der Reaktionslösung zur erneuten Verwendung nicht zurückgewonnen werden kann. Der einmalige Gebrauch dieser teuren Enzyme ist je­ doch bei einer technischen Anwendung nicht wirtschaftlich.

Es ist bekannt, daß Enzyme technisch einsetzbar sind, indem sie an einen Träger ge­ bunden werden. Dieses Verfahren wird als "Immobilisieren" bezeichnet. Unter dem Be­ griff "immobilisierte Enzyme" werden durch die European Federation of Biotechnology (1983) alle Enzyme zusammengefaßt, ". . . die sich in einem Zustand befinden, der ihre Wiederverwendung erlaubt" (Helmut Uhlig, Technische Enzyme und ihre Anwendung, Carl Hanser Verlag, München/Wien, 1991, S. 198). Trotz dieses Vorteils ist eine Immo­ bilisierung jedoch nicht für alle Enzymprozesse geeignet und hat sich bisher auch nur begrenzt durchgesetzt. Insbesondere finden nur zwei immobilisierte Enzyme großtech­ nisch Anwendung: Die Glucoseisomerisierung mit immobilisierter Glucoseisomerase und die Penicillin-G-Spaltung mit immobilisierter Penicillinamidase. Oft können immobili­ sierte Enzymverfahren nicht gegenüber den freien Enzymen oder chemischen Verfah­ ren bestehen. Oft sind auch die Enzyme oder die Reaktionsbedingungen für eine Im­ mobilisierung nicht geeignet. Es gibt also keine Universalmethode für das Immobili­ sieren, und jedes Enzym muß individuell betrachtet werden.

Beispielsweise kommt es in wäßrigen Systemen, wie sie für die Funktionstüchtigkeit von Enzymen wichtig sind, zu Löslichkeitsproblemen bei Rutinosiden, die bei der enzymati­ schen Hydrolyse als Substrat dienen. Diese Reaktion wird deshalb vorzugsweise mit einer übersättigten Substratlösung, d. h. als Rutinosidsuspension, durchgeführt. Bei ei­ ner übersättigten Lösung, in der das Substrat als Feststoff vorliegt, ist jedoch eine An­ wendung der Immobilisierungstechniken unmöglich. Es mangelt dabei an der Selektivität zwischen Rohstoff und Produktpartikeln und feststoffgebundenem Enzym.

Es ist deshalb die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von monoglycosidierten Enzymen zur Verfügung zu stellen, das im technischen Maß­ stab angewendet werden kann, wobei hohe Enzymkosten vermieden werden und gleichzeitig ein hoher Automatisierungsgrad verbunden mit einer hohen Raum/Zeit- Ausbeute und einer hohen Produktivität und Selektivität erreicht wird.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von monoglycosidierten Flavonoiden durch enzymatische Hydrolyse von Rutionosiden, worin für die enzymati­ sche Hydrolyse ein Enzym, das auf einem Träger immobilisiert ist, verwendet wird.

Überraschend wurde gefunden, daß trotz einer geringen Löslichkeit von Rutinosiden eine enzymatische Hydrolyse mit einem immobilisierten Enzym möglich ist. Durch die Immobilisierung kann das Verfahren kontinuierlich und mit einer hohen Effektivität im Vergleich zu der Reaktion mit dem nativen Enzym durchgeführt werden. Das erfin­ dungsgemäße Verfahren zeichnet sich insbesondere dadurch aus, daß eine hohe Au­ tomatisierung des gesamten Verfahrens einschließlich der Rückführung des Lösungs­ mitttels sowie der Überwachung der Enzymaktivität möglich ist.

In Abb. 1 wird als Beispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens die kontinuierliche Herstellung von Isoquercetin aus Rutin dargestellt.

Geeignete Rutinoside für das erfindungsgemäße Verfahren sind jene, die als zucker­ freien Bestandteil oder Aglykon einen 2-Phenyl-4H-1-benzopyran-4-on-Grundkörper enthalten, der in der Position 3 einen Rest der Formel (I) trägt und dessen Phenylgrup­ pen, abgesehen von der Position 3, auch ein- oder mehrfach durch -OH oder -O(CH₂)_n-H, wobei n 1 bis 8 bedeutet, substituiert sein können. n bedeutet vorzugs­ weise 1.

Die Substitution des 2-Phenyl-4H-1-benzopyran-on-Grundkörpers durch -OH und/oder -O(CH₂)_n-H tritt bevorzugt in den Positionen 5, 7, 3' und/oder 4' auf.

Besonders bevorzugt werden Rutinoside verwendet, die durch die Formel (A) dargestellt werden:

worin R H, OH oder OCH₃ darstellt.

Die Verbindung, worin R H darstellt, wird als Kämpferolrutinosid bezeichnet; das Ru­ tinosid, worin R OCH₃ darstellt, ist als Isorhamnetinrutinosid bekannt. Die Verbindung, worin R OH bedeutet, wird als Rutin bezeichnet. Demzufolge können gemäß dem erfin­ dungsgemäßen Verfahren aus Kämpferolrutinosid Rhamnose und Kämpferolglucosid, aus Rutin Rhamnose und Isoquercetin und aus Isorhamnetinrutinosid Rhamnose und Isorhamnetinglycosid erhalten werden.

Besonders bevorzugt wird das Rutinosid Rutin verwendet.

Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren können die Rutinoside in reiner Form oder auch als Gemische von Rutinosiden eingesetzt werden. Ebenfalls können die Rutinoside mit anderen Flavonoiden oder mit Rückständen aus der Rutino­ sidproduktion verunreinigt sein, ohne daß die Reaktion negativ beeinflußt wird.

Als Enzyme für die enzymatische Hydrolyse der Rutinoside können übliche Hydrolasen verwendet werden, die in der Lage sind, den Rhamnoserest der Rutinoside abzuspal­ ten. Vorzugsweise werden Hydrolasen, die aus dem Stamm Penicillium decumbens gewonnen werden, verwendet. Besonders bevorzugt werden als Enzyme α-L- Rhamnosidasen verwendet, da diese eine hohe Selektivität für die Hydrolyse des Rhamnoserestes besitzen. Geeignete α-L-Rhamnosidasen sind beispielsweise Hesperidinase, Naringinase, sowie jene, die in Kurosawa et al. (1973), J. Biochem., Bd. 73: 31-37 beschrieben werden. Es ist besonders bevorzugt, das Enzym Hesperidi­ nase zu verwenden.

Sowohl die Rutinoside als auch die Enzyme für das erfindungsgemäße Verfahren können als Handelsprodukte erworben werden. Ebenfalls ist es möglich, die Ausgangs­ stoffe und Enzyme nach allgemein bekannten Methoden zu gewinnen oder herzustellen.

Das Enzym wird auf einem geeigneten Träger immobilisiert. Dabei können übliche Trä­ ger, wie Kieselgel, beispielsweise handelsübliche sphärische oder handelsübliche ge­ brochene Kieselgele, z. B. Lichrosorb®, Lichroprep®, Lichrospher® und Trisoperl®, und handelsübliche polymere Träger, z. B. Eupergit®, Fractogel® und Fractoprep®, zum Ein­ satz kommen. Kieselgel gilt als bevorzugtes Trägermaterial. Der Enzymträger besitzt üblicherweise die folgenden Eigenschaften: Die Teilchengröße des Trägers beträgt vor­ zugsweise 0,005 bis 1 mm, noch bevorzugter 0,01 bis 0,5 mm. Der Porendurchmesser liegt üblicherweise im Bereich von 10 bis 4000 nm, wobei ein relativ großer Poren­ durchmesser von 2 bis 4 µm besonders bevorzugt ist. Durch eine ausreichend große Porengröße kann sichergestellt werden, daß das Enzym ohne Aktivitätsverlust auf dem Träger Platz findet. Die Partikeloberfläche beträgt vorteilhafterweise 40 bis 100 m²/g, und das Porenvolumen wird vorzugsweise aus einem Bereich von 0,5 bis 3 ml/g ausge­ wählt.

Das Enzym kann kovalent oder adsorptiv gekuppelt werden. Generell ist eine kovalente Kupplung vorzuziehen. Beispiele einer kovalenten Kupplung beinhalten eine Epoxidie­ rung, eine Carbodiimidmethode, Silanisierung, eine Bromcyanmethode, eine Glutardialdehydvernetzung oder eine Dicresylchloridmethode (siehe Biotransformations and Enzyme Reactions, Bommarius, A. S., Biotechnology (2. Aufl.), Bd. 3, S. 427-465, zusammengestellt von Stephanopoulos, G., VCH Weinheim, Deutschland, 1993, Walt, D. R. et al., trends in analytical chemistry, Bd. 13, Nr. 10, 1994, N. H. Park, H. N. Chang; J. Ferment. Technol., Bd. 57 (4), 310-316, 1979, M. Puri et al.; Enz. Microb. Technol., 18, 281-285, 1996 und H-Y. Tsen; J. Ferment. Technol., 62 (3), 263-267, 1984). Zur Durchführung dieser Verfahren ist es notwendig, daß der Träger mit entsprechenden funktionellen Gruppen oberflächenmodifiziert wird. Die funktionelle Gruppe kann am Träger entweder durch Copolymerisation mit funktionellen Monomeren oder durch Po­ lymeranalogumsetzung vollzogen werden. Besonders bevorzugt ist eine Oberflächen­ modifikation mit Aminoresten oder eine Diolmodifizierung.

Die enzymatische Hydrolyse findet in einem geeigneten Reaktor statt, der vorzugsweise zur kontinuierlichen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist. Es ist vorteilhaft, eine handelsübliche Säule zu verwenden. Im kleinen Maßstab kann bei­ spielsweise eine Säule, wie sie für die präparative HPLC verwendet wird, eingesetzt werden. Der Reaktor, insbesondere die Säule, sollte einen hohen hydraulischen Wir­ kungsgrad aufweisen. Dies kann durch die Zahl der theoretischen Böden quantifiziert werden. Deshalb ist es von Vorteil, daß es zu einem intensiven Kontakt der Rohstofflö­ sung mit der Oberfläche des Immobilisats kommt, um die wirksame Nutzung des En­ zyms zu gewährleisten und eine hohe Produktivität zu erreichen. Die erwähnte präpara­ tive HPLC-Säule erfüllt diese Anforderungen und ist ebenfalls mit der entsprechenden Technik mit Peripherie (Pumpen, Ventile, Steuerung) ausgestattet. Es ist ebenfalls von Vorteil, daß hierfür bereits Detektionstechniken, wie UV- oder RI-Detektionstechniken entwickelt wurden, so daß, wenn erwünscht, die Messung und Regelung des Umsatz­ grades der Reaktion automatisiert durchgeführt werden kann.

Das Immobilisat wird vor der Reaktion auf übliche Weise in den Reaktor gepackt.

Das umzusetzende Rutinosid wird in den Reaktor, vorzugsweise die Säule, üblicherwei­ se in Form einer Lösung gespeist. Dabei sollte die Rutinosidlösung vollkommen fest­ stofffrei sein. Es ist dabei von Vorteil, das Rutinosid mit dem Lösungsmittel in einem Tank, vorzugsweise unter Rühren und/oder Erwärmen, vorzulösen, um eine optimale Löslichkeit zu erreichen. Wenn notwendig, kann außerdem eine Vorfiltration der Lösung durchgeführt werden, um mögliche Feststoffe zu entfernen. Das Lösungsmittel ist vor­ zugsweise ein wäßriges System, um die Enzymaktivität zu gewährleisten und mögliche Denaturierungen zu verhindern. Um die Lösung der Rutinoside zu gewährleisten, kön­ nen zusätzlich weitere Lösungsmittel zugegeben werden. Vorzugsweise wird das erfin­ dungsgemäße Verfahren in Gegenwart eines Lösungsmittelgemisches aus Wasser und mindestens einem organischen Lösungsmittel durchgeführt.

Das oder die zusätzlich vorhandenen organischen Lösungsmittel umfassen sowohl or­ ganische Lösungsmittel, die mit Wasser mischbar sind, als auch organische Lösungs­ mittel, die nicht mit Wasser mischbar sind.

Geeignete Lösungsmittel für das erfindungsgemäße Verfahren sind Nitrile, wie Acetoni­ tril, Amide, wie Dimethylformamid, Ester, wie Essigsäureester, insbesondere Essigsäu­ remethylester oder Essigsäureethylester, Alkohole, wie Methanol oder Ethanol, Ether, wie Tetrahydrofuran oder Methyl-tert-butylether und Kohlenwasserstoffe, wie Toluol. Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren in Gegenwart eines oder mehrerer der organischen Lösungsmittel Essigsäureester, Methanol, Ethanol, Methyl-tert-butylether oder Toluol durchgeführt. Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren in Gegenwart eines oder mehrerer Essigsäureester, insbesondere in Gegenwart von Essigsäuremethylester, zusätzlich zu Wasser durchgeführt.

Geeignete Volumenverhältnisse von Wasser zu organischem Lösungsmittel für das er­ findungsgemäße Verfahren sind Verhältnisse von 1 : 99 bis 99 : 1. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren mit Volumenverhältnissen von Wasser zu organischem Lösungsmittel von 20 : 80 bis 80 : 20, insbesondere mit Volumenverhältnissen von 50 : 50 bis 70 : 30 durchgeführt.

Die Menge an Rutinosid in dem Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemisch für das erfin­ dungsgemäße Verfahren ist abhängig von der Löslichkeit des Rutinosids in dem Lö­ sungsmittel bzw. Lösungsmittelgemisch. Zur optimalen Durchführung des erfindunsge­ mäßen Verfahrens sollte das Rutinosid gut löslich sein. Deshalb wird vorzugsweise mit einer untersättigten Lösung gearbeitet. Üblicherweise beträgt die Menge an Rutinosid im Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemisch 0,001 bis 5 g/l, vorzugsweise 0,05 bis 2 g/l, noch bevorzugter 0,1 bis 1,5 g/l.

Das Verhältnis von Rutinosid zu Immobilisat bzw. Enzym hängt von der Lebensdauer des Enzyms in der Säule und seiner Aktivität in immobilisierter Form ab.

Die Reaktion wird üblicherweise bei einer Temperatur von 15 bis 80°C durchgeführt. Bevorzugt ist eine Temperatur von 30 bis 60°C, insbesondere ist eine Temperatur von 40 bis 50°C von Vorteil, um einer möglichen Zerstörung des Enzyms entgegenzuwirken und gleichzeitig eine hohe Löslichkeit des Rutinosids zu gewährleisten.

Wenn die Reaktionstemperatur zu niedrig ist, läuft die Reaktion durch absinkende Enzymaktivität mit einer unangemessenen langsamen Reaktionsgeschwindigkeit ab. Außerdem verringert sich die Löslichkeit des Rutinosids derart, daß unnötig hohe Lö­ sungsmittelmengen notwendig werden. Wenn die Reaktionstemperatur dagegen zu hoch ist, wird das Enzym, welches ein Protein ist, denaturiert und somit deaktiviert.

Wenn das erfindungsgemäße Verfahren bei einer erhöhten Temperatur durchgeführt werden soll, kann der Reaktor mit einer Temperiereinrichtung versehen werden. Übliche Temperiereinrichtungen beinhalten ein Heizschlangensystem oder Doppelmantel. Es ist weiterhin von Vorteil, wenn das umzusetzende Rutinosid und insbesondere die Rutino­ sidlösung vor Eintritt in den Reaktor temperiert wird. Zu diesem Zweck ist es üblich, daß die Rutinosidlösung aus einem temperierten Tank, der auf die für die Reaktion ge­ wünschte Temperatur eingestellt ist, gespeist wird. Alternativ kann die einzuspeisende Lösung durch einen beheizbaren Schlauch geleitet werden, um die gewünschte Tempe­ ratur vor Eintritt in den Reaktor einzustellen. Durch die Temperierung können ebenfalls mögliche Auskristallisierungen des Rutinosids vermieden werden.

Geeignete pH-Werte für das erfindungsgemäße Verfahren sind pH-Werte zwischen 3 und 8. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren bei pH-Werten von 3 bis 7 durchgeführt, insbesondere bei pH-Werten von 3 bis 6. Weiterhin bevorzugte pH-Werte können jedoch je nach verwendetem Enzym innerhalb der gegebenen Gren­ zen variieren. Beispielsweise sind pH-Werte von 3,8 bis 4,3 bei Verwendung des En­ zyms Hesperidinase ganz außerordentlich bevorzugt.

Vorzugsweise wird das Verfahren derart ausgeführt, daß der pH-Wert mit Hilfe eines Puffersystems eingestellt wird. Prinzipiell können alle gängigen Puffersysteme, die zur Einstellung der obengenannten pH-Werte geeignet sind, verwendet werden. Bevorzugt wird jedoch wäßriger Citratpuffer verwendet.

Die Rutinosidlösung wird in den Reaktor, der das Immobilisat enthält, gegeben, um die enzymatische Hydrolyse durchzuführen. Diese Reaktion kann batchweise, d. h. diskonti­ nuierlich, oder kontinuierlich durchgeführt werden.

Es ist jedoch bevorzugt, die Reaktion kontinuierlich durchzuführen. Dabei wird die Ru­ tinosidlösung üblicherweise permanent und kontinuierlich mit einer geeigneten Pumpe durch den Reaktor, vorzugsweise eine Säule, gefördert. Durch die entsprechende Ein­ stellung der Fließgeschwindigkeit kann ein beliebig hoher Umsatzgrad erreicht werden. Normalerweise wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,001 bis 1 mm/s, bezogen auf den leeren Rohrquerschnitt der Säule, gearbeitet.

Die Aktivität des Enzyms in dem System nimmt erfahrungsgemäß mit der Zeit ab. Es ist deshalb notwendig, daß das Immobilisat in regelmäßigen Abständen ganz oder teilweise erneuert wird. Um einen Aktivitätsverlust der Enzyme auszugleichen, ist es vorteilhaft, den Umsatzgrad durch UV- oder RI-Detektion auszuwerten, so daß bei einer Änderung der Zusammensetzung eine Steuerung über die Pumpenleistung der Änderung entge­ gensteuert.

Nach Austritt der Reaktionslösung kann das erhaltene Produkt getrennt werden. Nach beendeter Reaktion besteht das Reaktionsgemisch hauptsächlich aus Lösungsmittel, nichtumgesetztem Rutinosid, Rhamnose, dem gewünschten monoglycosidierten Flavo­ noid und möglicherweise weiteren Zusätzen, wie Puffer. Die Isolierung des gewünschten Reaktionsprodukts erfolgt nach gängigen Methoden bei üblicher Aufarbeitung.

Vorzugsweise wird das Produkt bei Aufkonzentrierung ausgefällt. Wenn das Lösungs­ mittel ein Lösungsmittelgemisch, enthaltend mindestens ein organisches Lösungsmittel, enthält, ist es bevorzugt, daß das organische Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert wird. Das auskristallisierende monoglycosidierte Flavonoid wird üblicherwei­ se vom restlichen Reaktionsgemisch durch eine Fest/Flüssigtrennung, wie Absaugen bzw. Filtration unter vermindertem Druck oder durch Abschleudern der ausgefallenen Kristalle, getrennt. Anschließend wird der Feststoff gewaschen, vorzugsweise mit Was­ ser und danach getrocknet. Die Reinheit des erhaltenen monoglycosidierten Flavonoids bei Einsatz von reinem Rutinosid ist normalerweise größer als 94%. Zur weiteren Reini­ gung kann das Endprodukt beispielsweise aus geeigneten Lösungsmitteln umkristalli­ siert werden, z. B. aus Wasser oder aus Lösungsmittelgemischen, bestehend aus Toluol und Methanol oder Wasser und Essigsäuremethylester.

Die anfallende Menge an Lösungsmittel nach der Reaktion wird vorzugsweise zurück­ gewonnen, um die Wirtschaftlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zu gewährlei­ sten. Diese Rezirkulation erfolgt üblicherweise kontinuierlich und automatisiert. Hierfür bieten sich handelsübliche Verdampferanlagen mit entsprechender Steuerung an. Han­ delt es sich bei dem einzusetzenden Lösungsmittel um ein Lösungsmittelgemisch aus Wasser und mindestens einem organischen Lösungsmittel, ist es in der Regel nicht möglich, das Destillat sofort wieder für das Verfahren einzusetzen, da sich die Lö­ sungsmittelverhältnisse durch das Abdestillieren des organischen Lösungsmittels ver­ ändert haben. Durch automatische Qualitätsmessung und Korrektur kann das ge­ wünschte Lösungsmittelverhältnis dabei wiederhergestellt werden und das Lösungsmit­ tel somit rückgeführt werden.

Weiterhin können bei der Aufkonzentrierung Membranprozesse oder Nanofiltration durchgeführt werden. Bei diesen Verfahren wird das Lösungsmittelgemisch ahne Ände­ rung der Zusammensetzung abgetrennt.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung verdeutlichen. Sie sind jedoch keinesfalls als beschränkend zu betrachten.

Beispiel 1 Immobilisierung des Enzyms Hesperidinase auf einem Kieselgelträger 1) Trägeroberflächenkonditionierung zur Immobilisierung 1.1) Eigenschaften des Trägermaterials

Kieselgel LiChrospher SI500-SI1000
Durchmesser = 15-40 µm
Porendurchmesser = 300 Å
Partikeloberfläche = 80 m²

/g
Porenvolumen = 0,73 ml/g
Dichte = 2 g/ml

1.2) Kieselgel-Aktivierung

250 g Kieselgel werden mit genügend HCl (7%) in einer 1 L-Flasche vermengt und über Nacht stehen gelassen, um das Kieselgel zu befeuchten.

Anschließend wird die Kieselgelsuspension mit VE-Wasser chloridfrei gewaschen. Dazu muß man nach jeder Waschung den Überstand mit Salpetersäure und Silbernitrat te­ sten. Die Waschung wird wegen der Eigenschaften der Kieselgelpartikel auf einem ca. 24 cm-Durchmesser-Keramiktrichter durchgeführt.

1.3) Oberflächenmodifiaktion mit Aminogruppen

Das säurebehandelte Kieselgel wird in einem 2 L-Dreihalskolben, der mit einem Rück­ flußkühler sowie einem Tropftrichter ausgestattet ist, zusammen mit genügend Wasser gemischt, so daß es rührfähig wird. Bei Raumtemperatur und guter Durchmischung tropft man 1 mmol/g Träger des 3-Aminopropyltrimethoxysilans (für 250 g Kieselgel braucht man 135 ml Lösung) mit einer Geschwindigkeit von ca. 5 Tropfen/s zu der Kie­ selgelsuspension zu. Anschließend wird die Suspension 2 Stunden bei 90°C gerührt. Danach wird die Suspension mit Eis gekühlt.

Der Überstand muß mittels pH-Wert Messung auf mögliche Reste von 3-Amino­ propyltrimethoxysilan überprüft werden. Die Beadsuspension wird mit VE-Wasser so lange gewaschen, bis der pH-Wert konstant bleibt.

1.4) Glutardialdehydbelegung

Zu der erhaltenen Kieselgelsuspension wird Glutardialdehyd (GDA) in einer Konzentra­ tion von 1 mmol/g Träger (für 250 g Träger braucht man 13 ml 50%-ige GDA-Lösung) zugegeben. Die Suspension (plus etwas Wasser) wird 2 Stunden bei Raumtemperatur in einer 1 L-Flasche gerollt. Am Anfang ist die Suspension gelb gefärbt, und am Ende wird sie dunkelrot.

Anschließend wird der Überstand von jedem Waschen durch eine Fällungsreaktion mit Dinitrophenylhydrazin auf Glutardialdehydreste überprüft. Die Suspension wird sorgfältig gewaschen, bis der Test negativ ist.

2) Immobilisierung 2.1) Hesperidinase Erste Proteinzugabe

3,8 g Hesperidinase werden in 500 ml Citrat/Phosphatpuffer (pH = 6,0) gerührt. Zum besseren Lösen werden 300 µl Tenside (Tween 20) zugegeben. Anschließend wird die Enzymlösung filtriert.

In einer 1 L-Flasche werden ca. 230 g der unter 1.4) erhaltenen Kieselgelsuspension mit der Enzymlösung vermengt. Anschließend wird die Enzym-Trägersuspension ca. 40 Stunden bei Raumtemperatur gerollt.

Zweite Proteinzugabe

ca. 0,76 g Hesperidinase (Amano) werden in 120 ml Citrat/Phosphatpuffer (pH = 6,0) mit 60 µl Tensiden gerührt und später filtriert.

Die Enzymlösung wird in die vorstehend genannte 1 L-Flasche gegossen, und die En­ zymlösung wird bei Raumtemperatur gerollt.

2.2) BSA (für den Trennungstest)

0,3 Biomex BSA (Rinderserumalbumin-Pulver) werden in 100 ml Citrat/Phosphatpuffer (pH = 6,0) gerührt. In einer 0,5 L-Flasche werden ca. 20 g der unter 1.4) erhaltenen Kieselgelsuspension mit der Proteinlösung vermengt, und 60 µl ProClin300 werden zu­ gegeben.

3) Proteinmengen- und Aktivitätsbestimmung 3.1) Proteinmenge (mg Protein/ml)

Der Proteingehalt einer Lösung wird mittels Bradford-Test bestimmt. Es wird das Stan­ dard-Assay durchgeführt. Dabei werden 20 µl Probe in 1 ml Bradford-Farbstoff-Reagenz (1 : 5 verdünnt) gemischt und nach 15 min im Photometer bei 595 nm gemessen.

Bei sehr geringen Proteinkonzentrationen muß das Microassay durchgeführt werden. Dabei werden 0,8 ml Probe in 0,2 ml Bradford-Farbstoff-Reagenz (konzentriert) gemischt und nach 15 min im Photometer bei 595 nm gemessen.

3.2) Aktivität

Die Aktivität einer Lösung wird durch die Reaktion mit einem Ersatzsubstrat gemessen. Für jede Probe nimmt man:
88 µl Citrat/Phosphatpuffer (pH = 4,0)
100 µl Probe
20 µl Probe
20 µl Ersatzsubstrat: p-Nitrophenyl-α-L-Rhamnosid (Rhamnosidase-Aktivität)
p-Nitrophenyl-α-L-Glucosid (Glucosidase-Akivität)

Diese 1 ml Lösung wird in einem Eppendorfreaktionsgefäß vermengt. Nach einer Inku­ bationszeit von je 2 und 5 min bei 40°C im Schüttler, werden je 100 µl des Reaktions­ gemisches mit 1 ml 1 M-Sodalösung vermengt. Dann wird die Konzentration von p-Nitrophenol im Photometer bei 400 nm gemessen. Die Aktivität errechnet sich durch Konzentrationsänderung von p-Nitrophenol pro Zeit.

Die Aktivität eines Enzyms wird in Units (U) (= µmol umgesetztes Substrat je Minute) angegeben.

4) Ergebnisse

PROTEINGEHALT und AKTIVITÄTSWERTE (FREIE HESPERIDINASE)

PROTEINGEHALT und AKTIVITÄTSWERTE (IMMOBILISIERTE HESPERIDINASE)

• - Proteingehalt des Trägers ≅ 1,045 g gebundenes Protein
• - Auf den Träger sind 4,7 mg Protein/g Träger
• - 2% des zugegebenen Proteins wurden nicht gebunden

Beispiel 2

Herstellung von Isoquercetin aus Rutin durch enzymatische Hydrolyse unter Verwendung eines Immobilisats.

In einem heizbaren 4,5 m³-Rührkessel (1) werden 3200 l VE-Wasser und 800 l 1-Propanol vorgelegt. Über die Dampfzufuhr (2) wird das Gemisch auf ca. 50-60°C er­ wärmt. Unter starkem Rühren wird der Lösung 8000 g Rutin, DAB zugegeben. Die Mi­ schung wird solange gerührt, bis sich das Rutin vollständig gelöst hat. Über eine Kreis­ laufpumpe und ein in die Leitung montiertes pH-Meter (3a) wird anschließend der pH- Wert kontrolliert und ggf. auf pH 4,0-4,5 eingestellt (mit H₃PO₄ und NaOH). Über das manuelle Ventil (4) kann auch zur Kontrolle und Konzentrationsbestimmung eine Probe entnommen werden.

Zum Start der Reaktion wird die Lösung über einen Beutelfilter (5) und einen Kerzenfilter (6) der Kolbendosierpumpe (7) zugeführt. Der Beutelfilter hat dabei die Aufgabe, die größere Menge an ungelösten Bestandteilen aufzuhalten, während der Kerzenfilter die Lösung mit einer Feinheit von 0,2 µm reinigt.

Die Kolbendosierpumpe (7) fördert die Lösung durch einen heizbaren Schlauch, welcher die Lösung über ein Thermometer auf eine Temperatur von 40°C am Eingang der Säule einstellt, mit einem Fluß von 1 l/min in die Säule (9) (100 × 400 mm). Die Säule enthält 1,5 kg Immobilisat. Da der elektrisch beheizte Schlauch die Lösung nicht kühlen kann, ist die Temperatur im Rührkessel (1) so zu wählen, daß die Abkühlung auf dem Weg bis zur Pumpe bei maximalem Pumpfenfluß bis 40°C führt.

Über ein manuelles Ventil (10) kann der Lösung nach Durchlaufen der Säule eine Probe entnommen werden, womit nochmals die Temperatur und der Umsatzgrad der Reaktion off-line gemessen werden können. Ist der gemessene Umsatzgrad geringer als gefor­ dert, wird die Flußrate der Pumpe entsprechend verringert.

Nach Durchlaufen der Säule ist die Reaktion vollständig abgelaufen, so daß die Lösung in das Auffanggefäß (11) geführt werden kann. Dort wird der Lösung über einen Kon­ densator (12) ca. 10-20% des Volumens entzogen. Dadurch wird der Gehalt an Pro­ panol deutlich gesenkt, wodurch die Löslichkeit des Isoquercetins stark sinkt. Durch nachträgliche Abkühlung sinkt die Löslichkeit weiter, so daß das Produkt ausfällt und im Beutefilter (13) abgetrennt werden kann. Von dort wird es zur weiteren Trocknung in einen Trockenschrank (14) überführt. Die Mutterlauge und das abdestillierte Kondensat werden gemeinsam zum erneuten Ansatz in den Rührkessel (1) zurückgeführt.

Claims (9)

1. Verfahren zur Herstellung von monoglycosidierten Flavonoiden durch enzymatische Hydrolyse von Rutinosiden, dadurch gekennzeichnet, daß für die enzymatische Hy­ drolyse ein Enzym, das auf einem Träger immobilisiert ist, verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Rutinosid ein Ru­ tinosid der Formel (A)
worin R H, OH oder OCH₃ bedeutet,
verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Rutinosid Ru­ tin verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym eine α-L-Rhamnosidase verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym Hesperidinase verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym auf Kieselgel immobilisiert ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Hydrolyse in Gegenwart eines Lösungsmittelgemisches aus Wasser und mindestens einem organischen Lösungsmittel durchgeführt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einer Reaktionstemperatur von 15 bis 80°C durchgeführt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einem pH-Wert von 3 bis 8 durchgeführt wird.