CN105779473A

CN105779473A - 鼠李糖异黄酮的合成基因簇及其应用

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Publication number: CN105779473A
Application number: CN201410808776.6A
Authority: CN
Inventors: 朱丽; 徐莉; 仲茜; 罗敏玉; 陈代杰; 钱秀萍; 戈梅
Original assignee: Shanghai Laiyi Biomedical Research And Development Center LLC; Shanghai Jiao Tong University
Current assignee: Shanghai Laiyi Biomedical Research And Development Center LLC; Shanghai Jiao Tong University
Priority date: 2014-12-19
Filing date: 2014-12-19
Publication date: 2016-07-20

Abstract

本发明涉及微生物基因工程领域，具体公开了一种鼠李糖异黄酮的合成基因簇及其应用。本发明的合成基因簇包含7个基因：AORI_0586基因编码葡萄糖1-磷酸胸腺嘧啶转移酶；AORI_0991基因编码脱氧胸苷二磷酸-葡萄糖-4,6-脱氢酶；AORI_3188基因编码脱氧胸苷二磷酸-葡萄糖-4,6-脱氢酶；AORI_0570基因编码脱氧胸苷二磷酸-4-脱氢鼠李糖-3,5-表异构酶；AORI_1501基因编码脱氧胸苷二磷酸-4-脱氢鼠李糖-3,5-表异构酶；AORI_6774基因编码脱氧胸苷二磷酸-4-脱氢鼠李糖-3,5-表异构酶；AORI_0992基因编码胸苷二磷酸-4-脱氢鼠李糖还原酶。本发明的基因簇可用于制备鼠李糖异黄酮类化合物。

Description

鼠李糖异黄酮的合成基因簇及其应用

技术领域

本发明涉及微生物基因工程领域，具体涉及鼠李糖异黄酮的合成基因簇及其应用。

背景技术

黄酮类化合物(fiavonoids)泛分布于植物体内的低分子多酚类物质，在植物体内多以游离态或与糖结合成苷的形式存在。此类化合物普遍具有抗氧化、抗肿瘤、抗癌、抗炎、镇痛、护肝、抗菌、抗病毒、防止动脉硬化等多种生物活性及药理作用。

鼠李糖，6-脱氧-L-甘露糖，广泛存在于植物的多糖、糖苷、植物胶和细菌多糖中。2000年，Marie-FranceGiraud和JamesHNaismith阐述了鼠李糖途径(GiraudMF,NaismithJH.Therhamnosepathway[J].Currentopinioninstructuralbiology,2000,10(6):687-696)。2006年，YoonTM等分离得到一种鼠李糖染料木黄酮苷，证明具有抗真菌活性(YoonTM,KimJW,KimJG,etal.TalosinsAandB:newisoflavonolglycosideswithpotentantifungalactivityfromKitasatosporakifunensisMJM341[J].JournalofAntibiotics,2006,59:633-639.)。而在1993年，KoyotoshiNishiyama等合成一系列的糖基取代的异黄酮苷，证明鼠李糖取代的异黄酮苷对β-半乳糖苷酶具有较强的竞争性抑制作用(KiyotoshiN,SachikoE,IkukoD,etal.Synthesesisoflavonesandisoflavoneglycosides,andtheirinhibitoryactivityagainstbovineliverβ-galactosidase[J].BiosciBiotechBiochem,1993,57(1):107-114.)。2009年，刘效稳等在东方拟无枝酸菌发酵液中分离得到了小组分鼠李糖大豆异黄酮，推测为发酵培养基中某些成分为东方拟无枝酸菌生物转化而来(刘效稳,李秋爽,阮林高,等。东方拟无枝酸菌发酵液小组分的分离鉴定[J].中国抗生素杂志，2009，34(11):654-658)

迄今为止，还没有关于鼠李糖异黄酮合成基因簇相关研究的报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种鼠李糖异黄酮的合成基因簇及其应用。

本发明采用如下技术方案：

本发明第一方面提供了一种鼠李糖异黄酮的合成基因簇，所述鼠李糖异黄酮的合成基因簇来自Amycolatopsisorientalis东方拟无枝酸菌CGMCCNo.6023，所述东方拟无枝酸菌，于2012年4月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCCNo.6023。

优选的，所述鼠李糖异黄酮的合成基因簇包含7个基因：

(1)AORI_0586基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，长度为882个碱基对，编码氨基酸序列如SEQIDNO.8所示的葡萄糖1-磷酸胸腺嘧啶转移酶(293个氨基酸)；

(2)AORI_0991基因，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，长度为984个碱基对，编码氨基酸序列如SEQIDNO.9所示的脱氧胸苷二磷酸-葡萄糖-4,6-脱氢酶(327个氨基酸)；

(3)AORI_3188基因，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，长度为960个碱基对，编码氨基酸序列如SEQIDNO.10所示的脱氧胸苷二磷酸-葡萄糖-4,6-脱氢酶(319个氨基酸)；

(4)AORI_0570基因，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，长度为549个碱基对，编码氨基酸序列如SEQIDNO.11所示的脱氧胸苷二磷酸-4-脱氢鼠李糖-3,5-表异构酶(182个氨基酸)；

(5)AORI_1501基因，核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，长度为618个碱基对，编码氨基酸序列如SEQIDNO.12所示的脱氧胸苷二磷酸-4-脱氢鼠李糖-3,5-表异构酶(205个氨基酸)；

(6)AORI_6774基因，核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，长度为606个碱基对，编码氨基酸序列如SEQIDNO.13所示的脱氧胸苷二磷酸-4-脱氢鼠李糖-3,5-表异构酶(201个氨基酸)；

(7)AORI_0992基因，核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，长度为891个碱基对，编码氨基酸序列如SEQIDNO.14所示的胸苷二磷酸-4-脱氢鼠李糖还原酶(296个氨基酸)。

本发明第二方面提供了本发明第一方面所述鼠李糖异黄酮的合成基因簇编码的蛋白。

本发明第三方面公开了含有本发明鼠李糖异黄酮的合成基因簇的表达载体或基因工程菌，均属于本发明的保护范围。

本发明第四方面公开了前述表达载体或染色体上整合有外源的前述鼠李糖异黄酮的合成基因簇的宿主细胞。

本发明第五方面公开了含有所述鼠李糖异黄酮的合成基因簇的工程菌的构建方法，就是将含有上述鼠李糖异黄酮的合成基因簇的重组表达载体导入宿主；或者直接将上述鼠李糖异黄酮的合成基因簇插入表达宿主的染色体即可。

优选地，所述的宿主选自大肠杆菌、红球菌、诺卡氏菌、枯草芽孢杆菌、乳酸棒杆菌或酵母菌中的任意一种；优选宿主为大肠杆菌或红球菌。

上述用于插入所述鼠李糖异黄酮的合成基因簇的表达载体是指能够在所述宿主中表达的质粒载体，例如可在大肠杆菌中表达的pET，或在红球菌中表达的穿梭质粒载体Pnv18，或可在毕赤酵母菌种表达的pPIC9K等。含有上述鼠李糖异黄酮的合成基因簇的重组表达载体可按现有技术中的常规方法构建。

含有上述鼠李糖异黄酮的合成基因簇的重组细胞可按现有技术中的常规同源重组方法构建。

本发明第六方面公开了一种东方拟无枝酸菌，含有前述的鼠李糖异黄酮的合成基因簇，其保藏编号为CGMCCNo.6023。

本发明第七方面公开了一种制备鼠李糖异黄酮及其类似物的方法，包括步骤：培养本发明第四方面所述的宿主细胞或权本发明第六方面所述的东方拟无枝酸菌，从而表达鼠李糖异黄酮及其类似物，以及从培养液中分离鼠李糖异黄酮及其类似物。

本发明第八方面公开了本发明第一方面所述鼠李糖异黄酮的合成基因簇、本发明第二方面所述的编码蛋白、本发明第三方面的表达载体活或本发明第六方面所述的东方拟无枝酸菌在制备鼠李糖异黄酮及其类似物中的应用。

本发明第九方面，提供了一种东方拟无枝酸菌，所述的东方拟无枝酸菌中前述的鼠李糖异黄酮的合成基因簇中一个或多个基因被失活，从而不产生鼠李糖异黄酮及其类似物。所述基因未失活的同种菌可产生鼠李糖异黄酮及其类似物。

优选地，所述鼠李糖异黄酮及其类似物具体是指：鼠李糖燃料木黄酮苷、鼠李糖大豆黄酮苷或鼠李糖黄豆黄酮苷。

本发明的有益效果为：

(1)本发明鼠李糖异黄酮的合成基因簇，所提供的核苷酸或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列的DNA作为探针进行Southern杂交的方法从其他微生物中得到鼠李糖异黄酮合成基因的同源基因；

(2)包含本发明所提供的基因簇核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可以用于从东方拟无枝酸菌Amycolatopsisorientalis基因组文库中定位更多的文库质粒，这些文库质粒至少包含本发明中的部分核苷酸序列，也包含有Amycolatopsisorientalis基因组中以前邻近区域未克隆的DNA；

(3)本发明所提供的核苷酸序列和部分核苷酸序列的克隆基因或DNA片段可以通过中断鼠李糖异黄酮生物合成的一个或几个步骤或者引物其他同源基因而得到新的鼠李糖异黄酮的前体或衍生物；

(4)本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性或产量；

(5)本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径；

(6)本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化，或通过紫外线或化学试剂诱变等；

(7)本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以用来调节鼠李糖异黄酮或其衍生物的产量；

(8)本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢中的功能；

(9)本发明所提供的核苷酸序列或多个序列可以与载体序列融合而得到重组序列和相应的DNA分子。

总之，本发明所提供的鼠李糖异黄酮合成相关的所有基因信息有助于阐明和理解鼠李糖异黄酮生物合成的分子机理，从而为进一步利用基因工程手段改造提供理论基础与材料。本发明所提供的基因也可以用来寻找和发明可以用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

本发明菌株保藏信息如下：

菌株名称：东方拟无枝酸菌Amycolatopsisorientalis；

保藏号为：CGMCCNo.6023。

保藏日期：2012年4月20日；

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：CGMCC；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为空白培养基和CGMCCNo.6023发酵液的UPLC-MS离子流图。

图2为鼠李糖染料木黄酮苷、鼠李糖大豆异黄酮苷和鼠李糖黄豆黄酮苷的质谱图。

图3为鼠李糖异黄酮生物合成的示意图。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。

实施例1鼠李糖异黄酮类化合物的发现

菌株：AmycolatopsisorientalisCGMCCNO.6023

斜面培养基：高氏一号培养基。

种子培养基(g/L)：

发酵培养基(g/L)：

发酵过程与条件:

从新鲜的斜面中铲刮取一定量的孢子，接入种子培养基中，置于220rpm旋转摇床上振荡培养44～48h，培养温度28℃，相对湿度40％～60％。

在无菌条件下，将培养好的种子液转入发酵摇瓶中，接种量为8％，置于220rpm旋转摇床上振荡培养120h，培养温度28℃。

将发酵液加入等体积的甲醇，浸泡1小时，于8000rpm下离心20分钟，取上清液。进行UPLC-MS分析。UPLC-MS分析条件如下：

UPLC-MS:色谱柱：AcquityUPLCBEHC18column，1.7μm，100mm×2.1mm(Waters,Milford,USA),柱温：45℃；

流动相：A相为0.05％甲酸水，B相为0.05％甲酸-乙腈；

流速：0.4ml/min

洗脱流程：

在发酵液中发现了m/z401.12[M+H]⁺、417.12[M+H]⁺、431.13[M+H]⁺的化合物，结合文献，推测这三个化合物分子式分别为C₂₁H₂₀O₈、C₂₁H₂₀O₉、C₂₂H₂₂O₉，为鼠李糖异黄酮类物质，其苷元分别为大豆苷元、染料木素以及黄豆苷元。

实施例2AmycolatopsisorientalisCGMCCNo.6023总DNA的提取

1)取新鲜斜面孢子接种于装有20mlYMB液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养36hr。

2)离心(3000g，15min)收集菌丝体，用无菌水洗涤一次。

3)菌丝体重悬于3mlTE，经漩涡振散。

4)加入300ul溶菌酶(10mg/ml)和30ulRNase(10mg/ml)，37℃水浴90min，期间不断振荡。

5)加入210ul20％SDS和30ul蛋白酶K(10mg/ml)，55℃水浴2hr。

6)加入600ul5MNaCl和480ul10％CTAB，65℃水浴30min。

7)冷却到室温后，加入等体积氯仿:苯酚:异戊醇(25:24:1)，混匀，离心(8900g，15min)。

8)取上清，加入等体积氯仿，混匀，离心(8900g，15min)。

9)取上层相，贴壁缓慢加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，至絮状物析出。

10)用封口的玻璃棒缓缓搅动，将DNA缠绕其上，用70％乙醇洗涤两次，室温干燥，溶于100ulTE缓冲液中，4℃保存

实施例3高通量测序

1)将实施例2所得的DNA片段化，构建测序文库；

2)运用罗氏454公司的GSFLX测序仪进行高通量测序：获得了561423条读序(reads)，用454公司自带的拼装软件拼接后，contig数目为56条(>500bp)，覆盖度为全基因组的25.6倍。

3)进行进一步拼接组装，完成补洞工作(gapclosing)：共通过设计548个特异PCR和2个fosmid克隆shotgun测序，最终拼装得到东方拟无枝酸菌CGMCCNo.6023的完整基因组序列。其中，每100,000个碱基错误率小于0.5，超过国际要求每100,000个碱基错误率小于1的水平。全基因组拼装采用的是phred/phrap/consed数据包。

实施例4基因组功能注释

1)开放阅读框(ORF)的确定：先用Glimmer3.02预测，然后用Genemark和Z-curve进行校正。

2)蛋白功能注释：对预测到的CDSs，通过BLASTP比对KEGG和NR数据库进行初步基因注释，所有注释结果均通过人工最后手动修正；而直系同源基因(clustersoforthologousgroups，COGs)及蛋白保守结构域的预测则通过比对NCBI的CDD数据库获得，COGs的确认参数为identity≥30％,lengthdiversity≤20％。

表1、鼠李糖异黄酮生物合成基因簇生物信息学分析

实施例5鼠李糖异黄酮的合成基因簇功能验证

从东方拟无枝酸菌CGMCCNo.6023中克隆所述鼠李糖异黄酮的合成基因簇，将含有所述鼠李糖异黄酮的合成基因簇的重组载体pET28a质粒导入宿主大肠杆菌中，然后培养含目标质粒的大肠杆菌，验证所得工程菌是否能够表达鼠李糖异黄酮类化合物。

将工程菌发酵液加入等体积的甲醇，浸泡1小时，于8000rpm下离心20分钟，取上清液。进行UPLC-MS分析。UPLC-MS分析条件如下：

流动相：A相为0.05％甲酸水，B相为0.05％甲酸-乙腈；

流速：0.4ml/min

洗脱流程：

在发酵液中发现了m/z401.12[M+H]⁺、417.12[M+H]⁺、431.13[M+H]⁺的化合物，结合文献，推测这三个化合物分子式分别为C₂₁H₂₀O₈、C₂₁H₂₀O₉、C₂₂H₂₂O₉，为鼠李糖异黄酮类物质，其苷元分别为大豆苷元、染料木素以及黄豆苷元。表明该工程菌菌产生了鼠李糖异黄酮类化合物。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种鼠李糖异黄酮的合成基因簇，其特征在于，所述鼠李糖异黄酮的合成基因簇包含7个基因：

2.根据权利要求1所述鼠李糖异黄酮的合成基因簇编码的蛋白。

3.含有权利要求1所述鼠李糖异黄酮的合成基因簇的表达载体。

4.含有权利要求3所述表达载体或染色体上整合有外源的权利要求1所述的鼠李糖异黄酮的合成基因簇的宿主细胞。

5.含有权利要求1所述鼠李糖异黄酮的合成基因簇的基因工程菌的构建方法，其特征在于，将含有权利要求1所述的鼠李糖异黄酮的合成基因簇的重组表达载体导入宿主。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主选自大肠杆菌、红球菌、诺卡氏菌、枯草芽孢杆菌、乳酸棒杆菌或酵母菌中的任意一种。

7.一种东方拟无枝酸菌，其特征在于，含有权利要求1所述的鼠李糖异黄酮的合成基因簇，其保藏编号为CGMCCNo.6023。

8.一种制备鼠李糖异黄酮类化合物的方法，其特征在于，包括步骤：培养权利要求4所述的宿主细胞或权利要求7所述的东方拟无枝酸菌，从而表达鼠李糖异黄酮及其类似物，以及从培养液中分离鼠李糖异黄酮及其类似物。

9.根据权利要求1所述的鼠李糖异黄酮的合成基因簇、权利要求2所述的编码蛋白、权利要求3所述的表达载体或权利要求7所述的东方拟无枝酸菌在制备鼠李糖异黄酮及其类似物中的应用。

10.一种东方拟无枝酸菌，其特征在于，所述的东方拟无枝酸菌中权利要求1所述的鼠李糖异黄酮的合成基因簇中一个或多个基因被失活，从而不产生鼠李糖异黄酮及其类似物。