DE3789186T2

DE3789186T2 - Methode zur Isolierung und Reinigung von Amylasen und Adsorbentien, sowie Vorrichtungen zur Isolierung und Reinigung.

Info

Publication number: DE3789186T2
Application number: DE3789186T
Authority: DE
Inventors: Ryoichi Haga; Masahiko Ishida; Yuusaku Nishimura; Masami Satoh
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1986-10-06
Filing date: 1987-10-06
Publication date: 1994-09-29
Anticipated expiration: 2007-10-07
Also published as: EP0263484A2; KR880005260A; CN87106754A; JPS63226284A; US5202250A; JPH0648982B2; EP0263484B1; DE3789186D1; EP0263484A3; CN1026014C

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Amylasen und für dieses Verfahren verwendete Adsorbentien sowie Vorrichtungen für die Isolierung und Reinigung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung vernetzte Polyglucane oder vernetzte Glucose-Homooligomere, die sich für die Adsorption von Glucoamylasen und β-Amylase mit hoher Selektivität eignen, und ein Verfahren für die Isolierung und Reinigung der Amylasen unter Verwendung der Adsorbentien sowie Vorrichtungen für das Verfahren.

2. Stand der Technik

Glucose, isomerisierte Glucose und Maltose werden gegenwärtig großtechnisch durch Hydrolyse von Stärken unter Verwendung von α-Amylase, Glucoamylase oder β-Amylase hergestellt.
Glucoamylase und β-Amylase sind als solche überaus nützlich für die großtechnische Herstellung von niedermolekularen Süßstoffen aus Stärken.
Im allgemeinen werden Enzyme durch Flüssigkultur von Mikroorganismen hergestellt, die imstande sind, die Enzyme zu bilden, nämlich von enzymbildenden Bakterien. Enzyme als Reagentien für die Forschung werden nach einer teilweisen Reinigung oder einer Reinigung bis zu einem hohen Grad nach komplizierten Verfahren für die Isolierung und Reinigung in Kombination mit Aussalzen, Ionenaustauschchromatographie, Elektrophorese und dergl. verwendet.
Andererseits werden Zubereitungen von Enzymen für die großtechnische Verwendung als Konzentrate von Kulturfiltraten erhalten, die direkt konzentriert werden, oder als trockene Pulver oder als Konzentrate, die durch Isolierung und Reinigung von Filtraten erhalten werden, oder als trockene Pulver dieser Konzentrate.
Die Konzentrate von Kulturfiltraten oder rohe trockene Produkte enthalten jedoch große Mengen an Komponenten mit unangenehmem Geruch oder an gefärbten Komponenten, die in den Kulturfiltraten enthalten sind. Daher ist es bei der Isolierung und Reinigung des gewünschten Reaktionsprodukts erforderlich, diese Komponenten schließlich zu entfernen. Ferner enthalten in vielen Fällen die Kulturfiltrate auch Proteasen. In Rohenzym-Lösungen, wie Kulturfiltraten oder dergl., die Proteasen zusätzlich zu Amylasen enthalten, werden die Amylasen durch die Einwirkung der Proteasen im Verlauf der Reinigung oder beim Ablauf der gewünschten Reaktion oftmals abgebaut und inaktiviert. Aus diesem Grund ist es erforderlich, diese ungünstigen Verunreinigungen bei der Herstellung nützlicher Materialien unter Anwendung von Reaktionen von Enzymen, wie Amylasen, zu entfernen.
Es besteht also eine hohe Belastung bei den Stufen der Isolierung und Reinigung von Produkten in nachfolgenden Reaktionen.
Andererseits weisen Aussalzen und Flüssigkeitschromatographie, die als herkömmliche Reinigungsverfahren bekannt sind, eine Grenze auf, die in der partiellen Konzentration besteht. Um den Grad der Isolierung zu erhöhen, müssen die Bedingungen bei diesen Schritten, z. B. die Art des Fällungsmittels, die Konzentration, der pH-Wert, die Art des Füllstoffs, die Art des Adsorbens und des Desorbens und dergl., verändert werden, und es müssen komplizierte Verfahren in Kombination mit diesen Bedingungen angewandt werden.
Ferner beinhalten diese Schritte die Zugabe von Salz in großen Mengen als Fällungsmittel oder Elutionsmittel, was ein Entsalzen bei der Durchführung einer nachfolgenden Stufe erforderlich macht. Ferner ist es im Hinblick auf den BOS-Wert nicht einfach, Abwässer, die eine Salzkonzentration von bis zu mehreren 10% zeigen, wie sie im Verlauf der Reinigungsstufen anfallen, zu behandeln.
JP-A-55 137 766 betrifft ein Amylopectin in Form eines hydratisierten Gels, das durch intermolekulare und/oder intramolekulare Vernetzung des Amylopectins erhalten werden kann. Der Verzweigungsgrad wird so gewählt, daß die Glucosereste, die Verzweigungspunkten im Gerüst entsprechen, mindestens 5% der Gesamtzahl der Glucosereste im Molekül des Amylopectins ausmachen. Das beschriebene vernetzte Amylopectin kann in geeigneter Weise als Gelfiltrationsmittel verwendet werden.
Nach den vorstehenden Ausführungen sind bekannte Reinigungsverfahren, die diese komplizierten Stufen umfassen, hauptsächlich auf die Reinigung von Reagentien oder dergl. für die Verwendung in der Forschung beschränkt.
Wenn ein Adsorbens entwickelt wird, das imstande ist, selektiv Glucoamylase und β-Amylase, von denen bekannt ist, daß sie besonders schwierig zu reinigen sind, unabhängig von Unterschieden in den Strukturen der Enzymmoleküle aufgrund von Unterschieden in der Herkunft der Enzyme zu adsorbieren, können beide Enzyme aus Kulturlösungen in einer Stufe in hoher Reinheit konzentriert und isoliert werden.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben, wobei sie dem Adsorptionsverfahren unter Verwendung von Amylose (ein lineares Polymeres von Glucose; Molekulargewicht von 100 000 bis 400 000; Zahl der polymerisierten Glucoseeinheiten: 5 · 10² bis 2 · 10³) als Adsorbens Aufmerksamkeit geschenkt haben, wobei es sich um ein bekanntes Verfahren für die Reinigung von α-Amylase handelt, versucht, das Adsorptionsverfahren auf Glucoamylase und β-Amylase anzuwenden. Sein Adsorptionsvermögen ist jedoch überaus gering, nämlich 1/10³ oder weniger, im Vergleich zum Fall von α-Amylase. Es ist daher verständlich, daß das bekannte Verfahren unter Verwendung von Amylose als Adsorbens für die Reinigung von Glucoamylase und β-Amylase nicht zweckmäßig ist.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Amylasen bereitzustellen, bei dem eine Rohenzym enthaltende Flüssigkeit in Kontakt mit Adsorbentien gebracht wird, die selektiv die eine oder beide von einem Mikroorganismus abgeleitete Glucoamylase oder von einem Mikroorganismus abgeleitete β-Amylase (nachstehend oftmals als "Glucoamylase und β-Amylase" bezeichnet) adsorbieren können, um dabei eines oder beide der Enzyme zu adsorbieren und zu isolieren.
In dieses Verfahren ist eine Stufe der ohne weiteres erfolgenden Desorption von Glucoamylase und β-Amylase, die an Adsorbentien adsorbiert sind, eingeschlossen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung zur Isolierung und Reinigung von Amylasen bereitzustellen, die in wirksamer Weise Glucoamylase und β-Amylase hochgradig selektiv adsorbieren und isolieren kann.
Diese und weitere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachstehenden Beschreibung deutlich.
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Amylasen, das folgende Stufen umfaßt:
Kontaktieren einer wäßrigen Rohenzym-Lösung, die eine oder beide von einem Mikroorganismus abgeleitete Glucoamylase oder von einem Mikroorganismus abgeleitete β-Amylase enthält, mit einer dreidimensionalen, vernetzten, hochmolekularen Substanz, welche erhalten wird durch intermolekulares Vernetzen eines α-1,4-verknüpften Glucose-Homooligomers; durch intermolekulares und/oder intramolekulares Vernetzen von Glycogen oder Amylopectin; durch intermolekulares und/oder intramolekulares Vernetzen von Glycogen oder Amylopectin, das verzweigte Ketten, die zuvor zum Verkürzen der verzweigten Ketten mit einer Amylase behandelt wurden, aufweist; um dadurch eine oder beide der von einem Mikroorganismus abgeleiteten Glucoamylase und von einem Mikroorganismus abgeleiteten β-Amylase zu adsorbieren;
Abtrennen eines hydratisierten Gels der dreidimensionalen, vernetzten, hochmolekularen Substanz, an die eine oder beide der von einem Mikroorganismus abgeleiteten Glucoamylase und von einem Mikroorganismus abgeleiteten β-Amylase adsorbiert wurden, aus der Lösung;
Kontaktieren des hydratisierten Gels mit einer schwach alkalischen, wäßrigen, wenigstens 0,5 m Salzlösung, um die adsorbierte Amylase zu desorbieren; und
Gewinnung einer oder beider der von einem Mikroorganismus abgeleiteten Glucoamylase und von einem Mikroorganismus abgeleiteten β-Amylase.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Vorrichtungen zur Isolierung und Reinigung von Amylasen, die folgende Bestandteile umfassen:
einen zellfreien Kulturlösungs-Vorratsbehälter zum Aufbewahren einer wäßrigen Rohenzym-Lösung, die eine oder beide von einem Mikroorganismus abgeleitete Glucoamylase und von einem Mikroorganismus abgeleitete β-Amylase enthält; und
einen mit dem Vorratsbehälter verbundenen Amylase-Adsorptions-Behälter, um die wäßrige Rohenzym-Lösung mit einer vernetzten, hochmolekularen Substanz gemäß der vorstehenden Definition unter dem ersten Aspekt der Erfindung in Kontakt zu bringen.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 zeigt ein repräsentatives Beispiel für eine Struktureinheit eines vernetzten Polyglucans, das unter Verwendung eines Epihalogenhydrins als Vernetzungsmittel erhalten wurde und beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird.
Fig. 2 und 3 zeigen repräsentative Beispiele für Struktureinheiten vernetzter Homooligomere, die unter Verwendung von Epihalogenhydrinen als Vernetzungsmittel erhalten wurden und beim Verfahren verwendet werden.
Fig. 4 zeigt eine Vorrichtung zur Isolierung und Reinigung von Glucoamylase oder β-Amylase, die zum Kontaktieren eines Adsorbens mit einer zellfreien Kulturlösung durch Suspensions-Mischen verwendet wird.
Fig. 5 zeigt eine Vorrichtung zur Isolierung und Reinigung von Amylasen, bei denen ein Kontakt eines Adsorbens mit einer zellfreien Kulturlösung unter Verwendung einer gepackten Säule durchgeführt wird.
Fig. 6 zeigt eine Vorrichtung zur Isolierung und Reinigung von Amylasen, in der ein Kontakt eines Adsorbens mit einer zellfreien Kulturlösung unter Verwendung eines Flüssigbetts durchgeführt wird.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Adsorbentien, die erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden, sind nachstehend angegeben.
(a) Dreidimensional vernetzte hochmolekulare Substanzen (vernetzte Polyglucane), die durch intermolekulare und/oder intramolekulare Vernetzung verzweigter Polyglucane erhalten werden, die verzweigte Ketten mit nicht-reduzierenden endständigen Glucoseresten als offene Enden aufweisen, die über α-1,4-Verknüpfungen von Glucose polymerisiert sind und die über α-1,6-Verknüpfungen in einem solchen Verzweigungsgrad verzweigt sind, daß die Glucosereste, die Verzweigungspunkten im Gerüst entsprechen, mindestens 5% der Gesamtzahl der Glucosereste im Molekül des verzweigten Polyglucans ausmachen.
Der mittlere Polymerisationsgrad der verzweigten Kette beträgt 2 bis 50 und vorzugsweise 2 bis 20.
Ein repräsentatives Beispiel für eine Struktureinheit der Substanzen, die unter Verwendung eines Epihalogenhydrins als Vernetzungsmittel erhalten werden, ist in Fig. 1 gezeigt.
(3) Dreidimensional vernetzte hochmolekulare Substanzen (vernetzte Polyglucane), die durch Einwirkung von Amylasen, insbesondere Glucoamylase, β-Amylase oder α-Amylase, auf verzweigte Polyglucane vor der Vernetzung, die unter (a) beschrieben wurde, um dadurch die Polymerisationszahl der Glucose in den verzweigten Ketten auf 2 bis 6 zu verringern, und Vernetzen der auf diese Weise erhaltenen verzweigten Polyglucane erhalten werden.
Derartige vernetzte Polyglucane entsprechen den in Fig. 1 gezeigten, worin e und f 0 bis 4 sind.
(c) Dreidimensional vernetzte hochmolekulare Substanzen (vernetzte Homooligomere), die durch intermolekulare Vernetzung von Homooligomeren erhalten werden, in denen 2 bis 50 Glucosemoleküle linear durch α-1,4-Verknüpfungen polymerisiert sind.
Repräsentative Beispiele für Struktureinheiten der Substanzen, die unter Verwendung von Epihalogenhydrinen als Vernetzungsmittel erhalten werden, sind in Fig. 2 und 3 gezeigt.
Die erfindungsgemäß verwendeten Adsorbentien adsorbieren nicht wesentlich α-Amylase, so daß von Mikroorganismen abgeleitete Glucoamylase und/oder β-Amylase weitgehend von α-Amylase isoliert werden kann.
Durch Steuerung der Länge der verzweigten Ketten der vernetzten Polyglucane, bei denen es sich um erfindungsgemäß verwendete Adsorbentien handelt, oder durch Steuerung der Kettenlänge der Homooligomere, die für die Herstellung der vernetzten Oligomere verwendet werden, können Glucoamylase und β-Amylase voneinander getrennt werden. Glucoamylase kann nämlich an das Adsorbens selektiver als β-Amylase adsorbiert werden, indem die Länge der verzweigten Kette des Homooligomers verkürzt wird, d. h. durch Einstellen des mittleren Polymerisationsgrads von Glucose in den verzweigten Ketten der vernetzten Polyglucane auf 2 bis 6, vorzugsweise auf 2 bis weniger als 4; oder durch Einstellen eines mittleren Polymerisationsgrads von Glucose in Homooligomeren, die für die Herstellung vernetzter Homooligomere verwendet werden, auf 2 bis 6 und vorzugsweise auf 2 bis weniger als 4. Als die Adsorbentien, die beim vorstehenden Verfahren verwendet werden, werden ein vernetztes Polyglucan, das aus Glycogen oder Amylopectin, die mit Amylase behandelt werden, erhalten wird, oder ein vernetztes Homooligomeres aus Maltose oder Maltotriose bevorzugt.
Wenn ferner die Längen der verzweigten Ketten oder das Homooligomer länger gemacht werden, wenn nämlich vernetzte Polyglucane mit einem mittleren Polymerisationsgrad der verzweigten Kette von bis zu 50 und vorzugsweise von bis zu 20 oder vernetzte Homooligomere, die aus Homooligomeren mit einem mittleren Polymerisationsgrad von bis zu 50 und vorzugsweise von bis zu 20 erhalten werden, verwendet werden, dann können sowohl Glucoamylase als auch β-Amylase gleichzeitig adsorbiert werden. Als Adsorbentien, die für das vorstehende Verfahren verwendet werden, werden ein vernetztes Polyglucan, das aus Glycogen oder Amylopectin erhalten wird, und ein vernetztes Homooligomer aus Maltotetraose oder Maltohexose bevorzugt.
Die Glucoamylase und β-Amylase, die an die Adsorbentien adsorbiert sind, können leicht mit einer schwach alkalischen wäßrigen Lösung, einer wäßrigen Lösung eines Salzes mit einer Konzentration von mindestens 0,5 m oder einer wäßrigen Lösung, die schwach alkalisch ist und ein Salz enthält, desorbiert werden.
Bei der Adsorption und Desorption von Glucoamylase und β-Amylase wird es bevorzugt, daß dieser Schritt bei Temperaturen bei oder oberhalb des Gefrierpunktes und innerhalb eines solchen Bereiches, das die Hydrolyse nicht wesentlich auftritt, durchgeführt wird.
Der Grund besteht darin, daß die erfindungsgemäß verwendeten Adsorbentien auch solche einschließen, die eine Struktur aufweisen, die einer Hydrolyse durch Glucoamylase, β-Amylase oder andere Gluconasen, die in der Rohenzym-Lösung enthalten sind, unterliegen, und daß auch der Abbau des gewünschten Enzyms (Glucoamylase und β-Amylase) durch Proteasen, die in der Rohenzym-Lösung vorhanden sein können, und die Thermostabilität der gewünschten Enzyme in Betracht gezogen werden sollten.
Durch Verbinden der Adsorptions- und Desorptionsschritte der Amylasen enthaltenden Rohenzym-Lösung, die mit verschiedenen Arten von Adsorbentien durchgeführt werden, können die Amylasen, d. h. Glucoamylase und β-Amylase, isoliert werden.
Im Fall der Verwendung einer Rohenzym-Lösung mit einem Gehalt an α-Amylase, von einem Mikroorganismus abgeleiteter β-Amylase und Glucoamylase als Probelösung wird z. B. zuerst die Glucoamylase selektiv an das vernetzte Polyglucan, das verzweigte Ketten mit einem mittleren Polymerisationsgrad von 2 bis 6 und vorzugsweise von 2 bis weniger als 4 enthält, oder an das vernetzte Homooligomer, das aus einem Homooligomer mit einem Polymerisationsgrad von 2 bis 6 und vorzugsweise von 2 bis weniger als 4 erhalten wurde, als Adsorptionsmittel adsorbiert. Anschließend wird die restliche Lösung, die nicht-adsorbierte Komponenten enthält, in Kontakt mit dem vernetzten Homooligomer, das verzweigten Ketten mit einem mittleren Polymerisationsgrad von bis zu 50 und vorzugsweise von bis zu 20 enthält, oder mit dem vernetzten Homooligomer, das aus einem Homooligomer mit einem mittleren Polymerisationsgrad von bis zu 50 und vorzugsweise von bis zu 20 erhalten wird, als Adsorptionsmittel gebracht, um dabei die β-Amylase an das Adsorptionsmittel zu adsorbieren. Die schließlich verbleibende Lösung wird als α-Amylase enthaltende Lösung isoliert; alternativ kann die Lösung auch weiter mit Stärke nach dem herkömmlichen Stärke-Adsorptions-Verfahren in Kontakt gebracht werden, um α-Amylase aus der gleichen Lösung zu adsorbieren und zu isolieren. Die adsorbierten Enzyme werden von jeder der Säulen z. B. mit einer schwach alkalischen wäßrigen Lösung oder dergl. desorbiert, wobei drei Arten von Enzymen isoliert bzw. gereinigt werden können.
Alternativ werden unter Verwendung einer Rohenzym-Lösung mit einem Gehalt an α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase als Probelösung zuerst Glucoamylase und β-Amylase selektiv an das vernetzte Polyglucan, das verzweigte Ketten mit einem mittleren Polymerisationsgrad von bis zu 50 und vorzugsweise von bis zu 20 enthält, oder an das vernetzte Homooligomer, das einem Homooligomer mit einem mittleren Polymerisationsgrad von bis zu 50 und vorzugsweise von bis zu 20 erhalten wurde, als Adsorptionsmittel adsorbiert. Das auf diese Weise erhaltene System, das Glucoamylase und β-Amylase enthält, wird einer selektiven Adsorption unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Adsorptionsmittels, das selektiv Glucoamylase adsorbiert, unterworfen, wobei Glucoamylase und β-Amylase voneinander getrennt werden.
Alternativ wird ferner eine Probelösung mit einem Gehalt an Glucoamylase und anderen Amylasen mit dem vorstehend beschriebenen Adsorbens behandelt, das selektiv Glucoamylase adsorbiert, wobei Glucoamylase selektiv aus der Probelösung isoliert werden kann.
Alternativ wird ferner eine Probelösung mit einem Gehalt an Glucoamylase, β-Amylase und anderen Amylasen mit dem vorstehend beschriebenen Adsorbens behandelt, das selektiv Glucoamylase und β-Amylase adsorbiert, wobei Glucoamylase und β-Amylase selektiv aus der Probelösung isoliert werden können.
Der Kontakt des Adsorbens mit der Rohenzym-Lösung kann nach Verfahren und mit Vorrichtungen erfolgen, bei denen eine beliebige Art der Bildung eines Chargen-Mischbetts, eines Flüssigbetts oder einer gepackten Schicht angewandt wird.
Die erfindungsgemäß in Betracht gezogenen Enzyme umfassen von Mikroorganismen abgeleitete Glucoamylase und β-Amylase, d. h. β-Amylasen, die z. B. von Schimmelpilzen, die zur Gattung Aspergillus, zur Gattung Rhizopus oder dergl. gehören, von Hefen, die zur Gattung Saccharomyces gehören, und von Bakterien, die zur Gattung Bacillus oder dergl. gehören, abgeleitet sind, sind auch anwendbar. Ferner sind Glucoamylasen, die von Schimmelpilzen, die zur Gattung Aspergillus, zur Gattung Rhizopus oder dergl. gehören, von Hefen, die zur Gattung Saccharomyces gehören, und von Bakterien, die zur Gattung Bacillus, zur Gattung Clostridium oder dergl. gehören, abgeleitet sind, ebenfalls anwendbar.
Als Polyglucane (α-Glucane), die Rohmaterialien für die Herstellung der erfindungsgemäßen Adsorbentien sind, werden beim erfindungsgemäßen Verfahren hochgradig verzweigte Glucane eingesetzt. Im Hinblick auf den Verzweigungsgrad können diejenigen, bei denen Glucosereste, die den Verzweigungspunkten entsprechen, mindestens 5% der Gesamtzahl der Glucosereste im Molekül ausmachen, vorzugsweise verwendet werden. Insbesondere beträgt der Verzweigungsgrad 5 bis 35%. α-Glucane, die 15% oder mehr Verzweigungspunkte enthalten, sind wesentlich stärker bevorzugt. Dementsprechend umfassen Beispiele von natürlich auftretenden α-Glucanen Glycogen und hochgradig verzweigtes Amylopectin. Dieses Glycogen und hochgradig verzweigtes Amylopectin sind nicht auf besondere Quellen beschränkt. Zum Beispiel können sogar Glycogene, die von Tieren oder Mikroorganismen abgeleitet sind, verwendet werden.
Als diese α-Glucane können nicht nur α-Glucane, die aus den vorstehend genannten natürlich vorkommenden Rohmaterialien isoliert werden, sondern auch verarbeitete α-Glucane mit durch eine Enzymbehandlung verkürzten verzweigten Ketten verwendet werden. Für eine Behandlung zur Verkürzung der Ketten von α-Glucanen werden Glucoamylase, β-Amylase oder α-Amylase vorzugsweise verwendet. Diese Enzyme sind nicht auf eine bestimmte Art beschränkt. Die Reaktionsbedingungen bei der Behandlung können in geeigneter Weise, abhängig von der Art der Konzentration und dergl. des α-Glucans als Substrat gewählt werden, sie werden jedoch in geeigneter Weise so gesteuert, daß eine Glucosepolymerisationszahl der verzweigten Ketten von 2 bis 6 erhalten bleibt.
Wenn der Verzweigungsgrad der α-Glucane weniger als 5% beträgt, dann nimmt das Adsorptionsvermögen für Glucoamylase oder α-Amylase ab, was nicht zweckmäßig ist.
Als die Homooligomere (Oligosaccharide), die Rohmaterialien für die Herstellung der vernetzten Homooligomere, die erfindungsgemäß als Adsorbentien verwendet werden, sind, werden Oligosaccharide mit einer Polymerisationszahl von 2 bis 50, in denen Glucosemoleküle linear über α-1,4-Verknüpfungen polymerisiert sind, verwendet. Diese Oligosaccharide können aus einer einzigen Komponente bestehen, oder es kann sich um ein Gemisch handeln. Im Fall der vergleichsweise selektiven Adsorption entweder von Glucoamylase oder von Glucoamylase und β-Amylase werden jedoch Oligosaccharide mit unterschiedlichen Polymerisationsgraden in geeigneter Weise gewählt. Beispiele für diese Oligosaccharide umfassen Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltohexose und dergl.
Für das Verfahren der Vernetzung des vorstehend genannten Homooligomers (Oligosaccharids) oder Polyglucans (α-Glucans) gibt es keine besondere Beschränkung, die Vernetzung kann vielmehr intermolekular und/oder intramolekular in einer solchen Weise durchgeführt werden, daß die Löslichkeit des Adsorbens 0,01 g (d. h. 0,01%) oder weniger in 100 g Wasser bei Temperaturen zwischen dem Gefrierpunkt und 60ºC und vorzugsweise bei 60ºC beträgt, die bei der Adsorption von β-Amylase oder Glucoamylase angewandt werden.
Dementsprechend handelt es sich bei dem erfindungsgemäß verwendeten, durch die Vernetzungsbehandlung hergestellten Adsorbens um ein hydratisiertes Gel oder einen Feststoff. Bei dem hydratisierten Gel, das nach Eintauchen des durch die Vernetzungsbehandlung erhaltenen Adsorbens in Wasser bei 60º für 1 Tag gebildet wird, wird es bevorzugt, daß das Gewichtsverhältnis des hydratisierten Gels im Bereich vom 3 bis 50, bezogen auf das Adsorbens, beträgt.
Die Vernetzungsreaktion und die Bedingungen davon werden in geeigneter Weise abhängig von der Art oder Konzentration der α-Glucane oder Oligosaccharide und den Bedingungen für die Verwendung bei der Adsorption des Enzyms gewählt. Als ein Beispiel für die Reaktion kann die Vernetzung zwischen OH-Gruppen in den Glucoseresten in Gegenwart von Epihalogenhydrinen, wie Epichlorhydrin und dergl., genannt werden. Als Epihalogenhydrin ist Epichlorhydrin besonders zweckmäßig. Im Fall von Epihalogenhydrinen ist es zweckmäßig, wenn die zugegebene Menge dem 0,5 bis 3-fachen der rohen Lösung des α-Glucans oder Oligosaccharids entspricht. Es ist bevorzugt, daß die Konzentration an α-Glucan oder Oligosaccharid in der rohen Lösung 1% oder mehr beträgt. Die Vernetzungsreaktion wird in Gegenwart von Alkali durchgeführt. Als Alkali wird starkes Alkali, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder dergl., vorzugsweise verwendet; es wird bevorzugt, daß eine äquimolare Menge oder mehr an Alkali enthalten ist, bezogen auf das Halogen der Epihalogenhydrine mit einer Konzentration von 1 n oder mehr. Die Reaktion wird bei einer Temperatur oberhalb 30ºC durchgeführt. Eine Reaktionszeit kann in geeigneter Weise abhängig von der Temperatur und der Konzentration an Alkali gewählt werden, sie beträgt jedoch 30 Minuten oder mehr bei einer Reaktion bei 60ºC. Rühren ist wirksam für den Kontakt der Epihalogenhydrinphase mit der wäßrigen Phase und da ein Anstieg der Viskosität der Lösung die Gelbildung begleitet.
Der pH-Wert bei der Adsorption und Desorption der Amylasen an und von dem Adsorbens kann in geeigneter Weise abhängig von dem gewünschten Enzym, der Zusammensetzung von Verunreinigungen in der Rohenzym-Lösung und den Eigenschaften und dem Zweck des Adsorptionsmittels gewählt werden, Adsorption und Desorption können jedoch im allgemeinen unter folgenden Bedingungen durchgeführt werden.
Bei der Adsorption liegt der pH-Wert im Bereich von 3,0 bis 7,5. Es ist bevorzugt, daß der pH-Wert der Desorptionslösung 7,6 oder mehr beträgt; im Hinblick auf die Stabilität des Enzyms ist es jedoch allgemein bevorzugt, daß der pH-Wert 9,0 oder niedriger, also schwach alkalisch, ist. Ferner ist die Art der Salze in der Salzlösung, die für die Desorption verwendet wird, nicht besonders beschränkt. Die Salze, die in geeigneter Weise unter neutralen Salzen, schwach sauren Salzen und schwach basischen Salzen gewählt werden, werden für die Verwendung bereitgestellt. Die am einfachsten verwendeten Salze sind Natriumchlorid und Kaliumchlorid.
Die für die Desorption verwendete Salzlösung kann auch in Kombination mit einer schwach alkalischen Lösung verwendet werden. Die Salzkonzentration in der Salzlösung variiert abhängig von den Eigenschaften des zu isolierenden und zu reinigenden Enzyms, der Art des Salzes, dem pH-Wert der Lösung und dergl., im allgemeinen wird jedoch eine Salzlösung bei 0,5 m oder mehr verwendet. Eine Salzlösung von 3 m oder mehr ist nicht zweckmäßig, und zwar aufgrund einer nachfolgenden Entsalzung; es besteht die Gefahr, daß eine Inaktivierung oder Aussalzung des Enzyms hervorgerufen werden, und daher ist dies nicht zweckmäßig.
Nachstehend werden Ausführungsformen des Verfahrens und der Vorrichtung zur Isolierung und Reinigung gemäß der vorliegenden Erfindung mit Bezug auf die in den Fig. 4 bis 6 gezeigten Diagramme beschrieben.
In der in Fig. 4 gezeigten Vorrichtung werden enzymbildende Bakterien, die zur Bildung einer oder beider Glucoamylase und β-Amylase imstande sind, in einem Kulturbehälter 2 unter Bildung einer Kulturlösung 1 kultiviert. Die Bedingungen für die Kultur werden in geeigneter Weise abhängig von den Eigenschaften der Bakterien und dem Zweck der Enzymbildung gewählt. Nach dem Abschluß der Kultur wird die Kulturlösung 1 in einen Vorratsbehälter 4 über eine Übertragungsleitung 3 gefüllt. Anschließend wird die Kulturlösung in eine Zellaufschlämmung 10 und eine zellfreie Kulturlösung 12 durch eine Feststoff-Flüssigkeits-Trennvorrichtung, wie eine Zentrifugationstrennung oder dergl. getrennt. Die zellfreie Kulturlösung 12, die Amylasen enthält, wird in einem Vorratsbehälter 13 über eine Übertragungsleitung 8 gelagert. Die zellfreie Kulturlösung 12 wird in einen Amylase-Adsorptions-Behälter 16 eingeführt. Erfindungsgemäßes Adsorbens 18, das selektiv die zu isolierende Amylase unter den Amylasen adsorbiert, wird aus einem Vorratsbehälter 19 in den Adsorptionsbehälter 16 über eine Rohrleitung 17 geführt, wobei unter definierten Bedingungen ein Mischen erfolgt, um den Feststoff mit der Flüssigkeit in Kontakt zu bringen. Die Eigenschaften der Flüssigkeit beim Kontakt, z. B. der pH-Wert, die Temperatur und die Salzkonzentration, werden in geeigneter Weise gewählt, um die vorstehend angegebenen Bereiche abhängig von der Art der zu adsorbierenden Amylase zu erzielen. In dem in dieser Figur gezeigten Fall wird der Kontakt unter Rühren, z. B. durch mechanisches Rühren unter Verwendung eines Kreiselmischers, durchgeführt. Der Kontakt wird im Bereich einer niedrigen Behältertemperatur durchgeführt, in dem die enzymatische Hydrolyse der α-1,4-Verknüpfung der Glucose nicht wesentlich auftritt. Die Zeitspanne, die für die Adsorption erforderlich ist, wird ebenfalls in geeigneter Weise gewählt, wie vorstehend beschrieben wurde. Nach Abschluß der Adsorption wird Gemisch 15 aus dem Adsorbens für Amylase und zellfreier Kulturlösung in die Feststoff-Flüssigkeits-Trennvorrichtung 21 eingeführt. Hier wird das Amylase-adsorbierte Adsorbens von der Lösung isoliert, und anschließend wird die anhaftende Lösung abgespült und mit Spülwasser 23 entfernt. Das auf diese Weise erhaltene Amylase-adsorbierte und durch Spülen behandelte Adsorbens 25 wird in einen Desorptionsbehälter 30 überführt. Andererseits werden amylasefreie Kulturlösung und Spülabwasser 46 in einen Vorratsbehälter 45 über eine Rohrleitung 24 gefüllt. Das Amylase-adsorbierte und durch Spülen behandelte Adsorbens wird in Kontakt mit einer Desorptionslösung 26 gebracht, wobei die adsorbierte Amylase desorbiert wird. Das desorbierte Adsorbens-Desorptionslösungsgemisch 29 wird erneut einer Feststoff-Flüssigkeits- Trennung in einer Feststoff-Flüssigkeits-Trennvorrichtung 32 unterworfen. Das Adsorbens 36, von dem die isolierte Amylase desorbiert worden ist, wird von der Amylasedesorptionslösung 35 getrennt. Die Amylasedesorptionslösung wird in einem Vorratsbehälter 38 gelagert und, falls es erforderlich und gewünscht ist, in eine Entsalzungsvorrichtung 40 eingeführt, um Salze und Alkalikomponenten in der Desorptionslösung zu entfernen. Die amylasehaltige Lösung, die zur Entsalzung behandelt wurde, wird in geeigneter Weise mit einer Konzentrations-Trocknungs-Vorrichtung 43 als Konzentrat oder trockenes Pulver isoliert.
In Fig. 4 bezeichnet Bezugszeichen 5 einen Vorratsbehälter für Kulturlösung; 6 bezeichnet eine Übertragungsleitung für Kulturlösung; 7 bezeichnet eine Feststoff-Flüssigkeits- Trennvorrichtung; 9 bezeichnet eine Übertragungsleitung für eine Zellaufschlämmung; 11 bezeichnet einen Zellaufschlämmungs-Vorratsbehälter; 14 bezeichnet eine Übertragungsleitung für zellfreie Kulturlösung; 20 bezeichnet eine Übertragungsleitung für ein Gemisch aus Adsorbens für Amylase und zellfreier Kulturlösung 1; 23 bezeichnet Spülwasser; 27 bezeichnet einen Vorratsbehälter für Desorptionslösung; 28 bezeichnet eine Übertragungsleitung für Desorptionslösung; 31 bezeichnet eine Übertragungsleitung für ein Adsorbens-Desorptionslösungsgemisch; 33 bezeichnet eine Übertragungsleitung für Adsorbens, von dem Amylase desorbiert worden ist; 34 bezeichnet eine Übertragungsleitung für Amylasedesorptionslösung; 37 bezeichnet einen Vorratsbehälter für Adsorbens, von dem Amylase desorbiert worden ist; 39 bezeichnet eine Übertragungsleitung für Amylasedesorptionslösung; 41 bezeichnet einen Ionenaustauscher zur Entsalzung; 42 bezeichnet eine durch Entsalzung behandelte Amylaselösung; und 44 bezeichnet konzentrierte und getrocknete Amylase.
Alternativ kann, wie im Diagramm von Fig. 5 gezeigt ist, der Kontakt des Adsorbens mit der zellfreien Kulturlösung auch mit Hilfe einer gepackten Säule, die mit Adsorbens 115 gepackt ist, anstelle des Suspensionsmischens, wie es in Fig. 4 gezeigt ist, durchgeführt werden. Zuerst wird zellfreie Kulturlösung 112 zum Amylase-Adsorptions-Turm 116 über Übertragungsleitung 114 bewegt, wo die Amylase an Adsorbens 115, das in den Turm gepackt ist, adsorbiert wird. Anschließend wird Spülwasser 119 durch den Adsorptionsturm 116 über Rohrleitung 117 zum Spülen geleitet. Spülabwasser 126 wird in einem Vorratsbehälter 127 gelagert. Sodann wird Desorptionslösung 122 in den Adsorptionsturm 116 über Rohrleitung 123 eingeführt, wo die Amylase desorbiert wird. Die Amylasedesorptionslösung 130 mit einem Gehalt an Amylase wird, falls es erforderlich und gewünscht ist, entsalzt, konzentriert und getrocknet, wie in Fig. 4.
In Fig. 5 bezeichnet Bezugszeichen 118 einen Vorratsbehälter für Spülwasser; 120 bezeichnet eine Übertragungsleitung für amylasefreie Kulturlösung; 121 bezeichnet einen Vorratsbehälter für Desorptionslösung; 124 bezeichnet eine Übertragungsleitung für Spülabwasser; 125 bezeichnet eine Übertragungsleitung für Amylasedesorptionslösung; 128 bezeichnet eine amylasefreie Kulturlösung; 129 bezeichnet einen Vorratsbehälter für amylasefreie Kulturlösung; 131 bezeichnet einen Vorratsbehälter für Amylasedesorptionslösung; 132 bezeichnet eine Übertragungsleitung für Amylasedesorptionslösung; 133 bezeichnet einen Ionenaustauscher zum Entsalzen; 134 bezeichnet eine Entsalzungsvorrichtung; 135 bezeichnet eine Übertragungsleitung für durch Entsalzung behandelte Amylaselösung; 136 bezeichnet eine Konzentrations-Trocknungs-Vorrichtung; und 137 bezeichnet konzentrierte und getrocknete Amylase.
Fig. 6 zeigt eine Modifizierung des in Fig. 4 gezeigten Suspensionsmischens, wobei die Adsorption in einem Flüssigbett durchgeführt wird. Zellfreie Kulturlösung 12 wird in einen Amylase-Adsorptions-Behälter 217 vom Flüssigbett-Typ eingeführt, wo die Lösung in Kontakt mit Adsorbens 214 gebracht wird, während Kulturlösung mit Druckluft, die von einem Luftkompressor 221 bereitgestellt wird, aufgewirbelt wird. Der Fluß nach dem Kontakt entspricht dem in Fig. 4 gezeigten.
In Fig. 6 bezeichnet Bezugszeichen 215 einen Vorratsbehälter für Adsorbens für Amylase; 216 bezeichnet eine Übertragungsleitung für Adsorbens für Amylase; 218 bezeichnet ein Gemisch aus Adsorbens für Amylase und zellfreier Kulturlösung; 219 bezeichnet eine Übertragungsleitung für zellfreie Kulturlösung; 220 bezeichnet eine Übertragungsleitung für Luft; 222 bezeichnet einen Vorratsbehälter für Spülwasser; 223 bezeichnet Spülwasser; 224 bezeichnet eine Übertragungsleitung für Spülwasser; 225 bezeichnet eine Übertragungsleitung für ein Gemisch aus Adsorbens für Amylase und zellfreier Kulturlösung; 226 bezeichnet eine Feststoff-Flüssigkeits- Trennvorrichtung; 227 bezeichnet eine Übertragungsleitung für amylasefreie Kulturlösung und Spülabwasser; 228 bezeichnet eine Übertragungsleitung für Amylase-adsorbierte und durch Spülen behandelte Kulturlösung; 229 bezeichnet einen Vorratsbehälter für amylasefreie Kulturlösung und Spülwasser; 230 bezeichnet amylasefreie Kulturlösung und Spülwasser; 231 bezeichnet eine Adsorbenslösung; 232 bezeichnet einen Vorratsbehälter für Desorptionslösung; 233 bezeichnet ein Adsorbens- Desorptionslösungsgemisch; 234 bezeichnet einen Desorptionsbehälter; 235 bezeichnet eine Übertragungsleitung für ein Adsorbens-Desorptionslösungsgemisch; 236 bezeichnet eine Übertragungsleitung für Amylasedesorptionslösung; 237 bezeichnet eine Amylasedesorptionslösung; 238 bezeichnet einen Vorratsbehälter für Amylasedesorptionslösung; 239 bezeichnet eine Übertragungsleitung für Amylasedesorptionslösung; 240 bezeichnet eine Entsalzungsvorrichtung; 241 bezeichnet einen Ionenaustauscher zur Entsalzung; 242 bezeichnet eine Übertragungsleitung für durch Entsalzung behandelte Amylaselösung; 243 bezeichnet eine Konzentrations-Trocknungs-Vorrichtung; und 244 bezeichnet konzentrierte und getrocknete Amylase.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Amylasen und der Vorrichtung für das Verfahren werden als Adsorbentien vernetzte Polyglucane verwendet, bei denen eine Steuerung der Länge der verzweigten Ketten möglich ist, oder vernetzte Homooligomere, bei denen eine Steuerung der Länge der Hauptkette möglich ist, nämlich Adsorbentien, bei denen die Länge der verzweigten Kette oder der Hauptkette der Adsorbentien gesteuert werden kann, und zwar abhängig von der Amylase, die isoliert und gereinigt werden soll, und die durch dreidimensionale intermolekulare oder intramolekulare Vernetzung wasserunlöslich worden sind. Aus diesem Grund kann die gewünschte Amylase in einfacher Weise aus Lösungen, wie Rohenzym-Lösungen oder dergl., die viele oder verschiedene organische und anorganische Verunreinigungen und andere Enzyme enthalten, einfach durch Adsorption und Desorption der Amylase konzentriert und gereinigt werden. Daher kann erfindungsgemäß das Verfahren zur Reinigung von Amylasen wesentlich vereinfacht werden.
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung ausführlicher mit Bezug auf Beispiele für die vorliegende Erfindung erläutert.

Beispiel 1

Isolierung und Reinigung von β-Amylase und Glucoamylase unter Verwendung von vernetztem Glycogen

Zu 10 g trockenem Pulver von Glycogen (geschätztes Molekulargewicht: 4 · 10&sup5;; geschätzter Verzweigungsgrad: 25%), das von Escherichia coli-Zellen gebildet wurde, wurden 90 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wurde unter Rühren auf 70ºC erwärmt, um das Pulver zu lösen und eine viskose Lösung zu erhalten. Zu der Lösung wurden 33 ml 6 n Natriumhydroxid gegeben. Das Gemisch wurde in einen 500 ml fassenden Reaktionskolben, der mit einem Rührer und einem Rückflußkühler ausgestattet war, gegeben. Anschließend wurden 140 ml Epichlorhydrin zu dem Gemisch gegeben. Es erfolgte ein Erwärmen auf 50ºC für 5 Stunden unter Rühren bei 20 U/min.
Nach Abschluß der Reaktion wurde der Inhalt auf Raumtemperatur gekühlt, und das gelierte Produkt in der unteren wäßrigen Phase wurde abfiltriert. Zu dem gelatineartigen Produkt wurden 50 ml Ethanol gegeben. Nach Rühren wurde das gelatineartige Produkt abfiltriert und gewonnen. Das gewonnene Gel wurde erneut in 50 ml Ethanol suspendiert. Die Suspension wurde filtriert, um das gelatineartige Produkt zu gewinnen. Dieser Schritt wurde weitere 3 mal wiederholt. Sodann wurde das gelatineartige Produkt in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert und durch Filtration isoliert. Nach 3-maliger Wiederholung dieses Schritts wurde der Stoff erneut in 50 ml Ethanol dispergiert. Die Dispersion wurde filtriert. Nach Trocknen wurde das gelatineartige Produkt zu einem Pulver gemahlen, wobei man 9,2 g eines weißen Pulvers erhielt.
Die Löslichkeit des Pulvers in Wasser bei 60ºC betrug 0,002 g oder weniger, bezogen auf 100 g Wasser. Nach Eintauchen des Pulvers in Wasser bei 60ºC für einen Tag betrug das Gewichtsverhältnis des hydratisierten Gels zum Pulver 11,5.
Andererseits wurden 40 ml eines Kulturfiltrats (mit einem Gehalt an 0,50 Einheiten/ml α-Amylase, 0,98 Einheiten/ml β-Amylase und 1,30 Einheiten/ml Glucoamylase) von Aspergillus oryzae IFO-4176 auf 6ºC gekühlt, und 0,2 g des vorstehend beschriebenen Adsorbenspulvers wurden zugegeben. Sie wurden miteinander durch Mischen für 2 Minuten bei 5 U/min in Kontakt gebracht. Das Gemisch wurde filtriert, und α-Amylase- Aktivität, β-Amylase-Aktivität und Glucoamylase-Aktivität im Filtrat wurden gemessen.
a-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase im Überstand betrugen 0,50 Einheiten/ml, 0,02 Einheiten/ml bzw. 0,01 Einheiten/ml.
Die Menge der einzelnen Enzyme, die an das vorstehend beschriebene Adsorbens adsorbiert waren, wurde als ein Wert berechnet, der durch Abziehen einer Enzymkonzentration nach dem Kontakt mit dem Adsorbens von einer Enzymkonzentration vor dem Kontakt erhalten wurde. Als Ergebnis wurde im Kulturfiltrat enthaltene α-Amylase nicht wesentlich adsorbiert, es wurden jedoch 98% (38,4 Einheiten) β-Amylase und 99% (51,6 Einheiten) Glucoamylase an das Adsorptionsmittel adsorbiert.
Sodann wurde das Adsorbens, an das die vorstehend genannten Enzyme adsorbiert waren, in einen Behälter von 20 ml gegeben, und 4 ml einer Lösung, die mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 8 eingestellt worden war, wurden zu dem Adsorbens gegeben. Das Gemisch wurde 2 Minuten bei 5 U/min gerührt, um sie miteinander in Kontakt zu bringen. Nach Zentrifugation bei 3000 U/min für 5 Minuten wurde das Gemisch in Adsorptionsmittel und Überstand getrennt. Weitere 2 ml Wasser wurden zu dem Adsorbens gegeben, um es zu suspendieren. Die Suspension wurde erneut bei 3000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert, um sie in die Spüllösung und das Adsorbens durch Feststoff-Flüssigkeits-Trennung zu trennen. Der Überstand und die vorstehend erhaltene Spüllösung wurden vereinigt, wobei man 6 ml Enzymdesorptionslösung erhielt.
Die Enzymkonzentration in der vorstehend beschriebenen Enzymdesorptionslösung wurde gemessen. Als Ergebnis wurde keine α-Amylase nachgewiesen, β-Amylase und Glucoamylase betrugen jedoch 6,40 Einheiten/ml bzw. 8,60 Einheiten/ml. Durch Multiplikation der Konzentrationen der entsprechenden Enzyme in der Desorptionslösung mit 6 ml als der Menge der Lösung wurden die entsprechend gewonnenen Mengen zu 0 Einheiten α-Amylase, 38,4 Einheiten β-Amylase und 51,6 Einheiten Glucoamylase bestimmt. In der rohen Lösung vorhandene Enzyme konnten also mit 0% α-Amylase, 98% β-Amylase und 99% Glucoamylase durch Adsorption und Desorption in diesem Beispiel gewonnen werden. Ferner wurde in der Lösung keine Protease- Aktivität nachgewiesen, und es wurde weder eine Verfärbung noch ein Geruch festgestellt. Außerdem wurden die Mengen an organischen und anorganischen Materialien in der Lösung auf 1,1% bzw. 1,0%, bezogen auf die Gehalte in der rohen Lösung, verringert.
Nach den vorstehenden Ausführungen konnten β-Amylase und Glucoamylase in der rohen Lösung auf etwa das 5-fache konzentriert und gereinigt werden.

Beispiel 2

Es wurden 5 g des in Beispiel 1 hergestellten vernetzten Glycogens genommen und in eine Säule mit 10 Φ · 70 mm gepackt.
Durch die Säule wurden 80 ml eines Kulturfiltrats von Aspergillus oryzae IFO-4176 aus der gleichen Charge wie in Beispiel 1 bei einer Temperatur von 6ºC mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 3 ml/min geleitet. Die Säulenfiltrate wurden gesammelt, und die Enzymkonzentrationen in der Lösung wurden gemessen.
Als Ergebnis betrugen α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase 0,5 Einheiten/ml, 0,03 Einheiten/ml bzw. 0,01 Einheiten/ml.
Die Menge der einzelnen Enzyme, die an das vorstehend beschriebene Adsorbens adsorbiert war, wurde als ein Wert berechnet, der durch Abziehen einer Enzymkonzentration nach dem Kontakt mit dem Adsorbens von einer Enzymkonzentration vor dem Kontakt erhalten wurde. Als Ergebnis wurden α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase mit 9 Einheiten, 76 Einheiten bzw. 103,2 Einheiten adsorbiert. Dementsprechend wurde im Kulturfiltrat enthaltene α-Amylase nicht adsorbiert, es wurden jedoch 97% β-Amylase und 99% Glucoamylase an das Adsorbens adsorbiert.
Sodann wurden 4 ml Wasser durch die vorstehend beschriebene Säule geleitet, um sie zu waschen. Durch die gewaschene Säule wurden 15 ml einer Lösung, deren pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 8,0 eingestellt worden war, bei 6ºC mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,5 ml/min geleitet. Anschließend wurden 5 ml Wasser durchgeleitet, und die Spüllösung wurde aufgefangen. Das ausströmende Medium und die vorstehend beschriebene Spüllösung wurden vereinigt, wobei man 20 ml Enzymdesorptionslösung erhielt.
Die Enzymkonzentrationen in der Enzymdesorptionslösung wurde gemessen. Als Ergebnis wurde keine α-Amylase nachgewiesen, β-Amylase und Glucoamylase betrugen jedoch 12,5 Einheiten/ml bzw. 16,9 Einheiten/ml. Durch Multiplikation der Konzentrationen der entsprechenden Enzyme in der Desorptionslösung mit 20 ml als der Menge der Lösung wurden die entsprechenden gewonnenen Mengen bestimmt. So betrugen α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase 0 Einheiten, 76 Einheiten bzw. 10 Einheiten. Unter den in der rohen Lösung vorhandenen Enzymen konnten nämlich 0% α-Amylase, 97% β-Amylase und 96% Glucoamylase gewonnen werden.
Ferner wurde in der Lösung keine Protease-Aktivität nachgewiesen, und es wurde weder eine Verfärbung noch ein Geruch festgestellt. Außerdem wurden die Mengen an organischen und anorganischen Materialien in der Lösung auf 1,1% bzw. 1,0%, bezogen auf die Gehalte in der rohen Lösung, verringert.
Nach den vorstehenden Angaben konnten β-Amylase und Glucoamylase in der rohen Lösung auf etwa das 4-fache konzentriert und gereinigt werden.

Beispiel 3

Zu 10 g trockenem Pulver von Glycogen (geschätztes Molekulargewicht: 4 · 10&sup5;; geschätzter Verzweigungsgrad: 27%) aus Rinderleber wurden 90 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wurde auf 70ºC unter Rühren erwärmt, um das Pulver zu lösen und eine viskose Lösung herzustellen. Zu der Lösung wurden 33 ml 4 n Natriumhydroxid gegeben. Die Lösung wurde in einen 500 ml fassenden Reaktionskolben, der mit einem Rührer und einem Rückflußkühler ausgestattet war, gegeben. Anschließend wurden 140 ml Epichlorhydrin zu dem Gemisch gegeben. Dann wurde 5 Stunden auf 50ºC unter Rühren bei 20 U/min erwärmt.
Nach Abschluß der Reaktion wurde der Inhalt auf Raumtemperatur gekühlt, und das gelatineartige Produkt in der unteren wäßrigen Phase wurde abfiltriert. Zu dem gelatineartigen Produkt wurden 50 ml Ethanol gegeben. Nach Rühren wurde das gelatineartige Produkt abfiltriert und gewonnen. Das gewonnene Gel wurde erneut in 50 ml Ethanol suspendiert. Die Suspension wurde filtriert, um das gelatineartige Produkt zu gewinnen. Dieser Schritt wurde weitere 3 mal wiederholt. Sodann wurde das gelatineartige Produkt in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert und durch Filtration isoliert. Nach 3-maliger Wiederholung dieses Schritts wurde der Stoff erneut in 50 ml Ethanol dispergiert. Die Dispersion wurde filtriert. Nach Trocknen wurde das gelatineartige Produkt zu einem Pulver gemahlen, wobei man 9,3 g eines weißen Pulvers erhielt.
Die Löslichkeit des Pulvers in Wasser bei 60ºC betrug 0,003 g oder weniger, bezogen auf 100 g Wasser. Nach weiterem Eintauchen des Pulvers in Wasser bei 60ºC für 1 Tag, betrug das Gewichtsverhältnis des hydratisierten Gels zum Pulver 12,3.
Sodann wurde folgender Versuch durchgeführt, um die Adsorptionseigenschaften von Glucoamylase an das Pulver zu untersuchen.
40 ml eines Kulturfiltrats (mit einem Gehalt an 0,50 Einheiten/ml α-Amylase, 0,98 Einheiten/ml β-Amylase und 1,30 Einheiten/ml Glucoamylase) von Aspergillus oryzae IFO-4176 wurden auf 6ºC gekühlt, und 0,2 g des vorstehend beschriebenen Adsorbenspulvers wurden zugegeben. Sie wurden miteinander durch Mischen für 2 Minuten bei 5 U/min in Kontakt gebracht. Das Gemisch wurde über eine Säule (10 Φ · 50 mm), die mit einem Filter am Boden ausgestattet war, filtriert, und α- Amylase-Aktivität, β-Amylase-Aktivität und Glucoamylase-Aktivität im Filtrat wurden gemessen.
Im Überstand betrugen α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase 0,50 Einheiten/ml, 0,03 Einheiten/ml bzw. 0,02 Einheiten/ml.
Die Menge der einzelnen Enzyme, die an das vorstehend beschriebene Adsorbens adsorbiert worden war, wurde als ein Wert berechnet, der durch Abziehen einer Enzymkonzentration nach dem Kontakt mit dem Adsorbens von einer Enzymkonzentration vor dem Kontakt erhalten wurde. Als Ergebnis wurde im Kulturfiltrat enthaltene α-Amylase nicht wesentlich adsorbiert, es wurden jedoch 97% (0,95 Einheiten) β-Amylase und 98% (1,28 Einheiten) Glucoamylase an das Adsorbens adsorbiert.
Sodann wurde eine wäßrige 0,5 m Natriumchloridlösung (pH-Wert: 7,0) durch die Säule geleitet, an die die vorstehend genannten Enzyme adsorbiert worden waren, und das ausströmende Medium wurde aufgefangen. Anschließend wurden 2 ml Wasser durchgeleitet, um die Säule zu spülen. Die Spülflüssigkeit und das vorstehend beschriebene ausströmende Medium wurden vereinigt, wobei man 6 ml Enzymdesorptionslösung erhielt.
Die Enzymkonzentrationen in der vorstehend beschriebenen Enzymdesorptionslösung wurden gemessen. Als Ergebnis wurde keine α-Amylase nachgewiesen, β-Amylase und Glucoamylase betrugen jedoch 6,2 Einheiten/ml bzw. 8,6 Einheiten/ml. Durch Multiplikation der Konzentrationen der entsprechenden Enzyme in der Desorptionslösung mit 6 ml als der Menge der Lösung wurden die entsprechenden gewonnenen Mengen zu 0 Einheiten α-Amylase, 37,2 Einheiten β-Amylase und 51,2 Einheiten Glucoamylase bestimmt. Unter den in der rohen Lösung vorhandenen Enzyme konnten also 0% α-Amylase, 95% β-Amylase und 96% Glucoamylase durch Adsorption und Desorption in diesem Beispiel gewonnen werden. Ferner wurde in der Lösung keine Protease-Aktivität nachgewiesen, und weder eine Verfärbung noch ein Geruch wurden festgestellt. Außerdem wurden die Mengen an organischen und anorganischen Materialien in der Lösung auf 1,1% bzw. 1,0%, bezogen auf die Gehalte der rohen Lösung, verringert.
Nach den vorstehenden Ausführungen konnten β-Amylase und Glucoamylase in der rohen Lösung auf etwa das 5-fache konzentriert und gereinigt werden.

Beispiel 4

Zu 10 g trockenem Pulver aus Glycogen (geschätztes Molekulargewicht: 4 · 10&sup5;, geschätzter Verzweigungsgrad: 25%), das aus Austern hergestellt wurde, wurden 90 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wurde auf 70ºC unter Rühren erwärmt, um das Pulver zu lösen und eine viskose Lösung herzustellen.
Zu der Lösung wurden 33 ml 6 n Natriumhydroxid gegeben. Das Gemisch wurde in einen 500 ml fassenden Reaktionskolben gegeben, der mit einem Rührer und einem Rückflußkühler ausgestattet war. Anschließend wurden 140 ml Epichlorhydrin zu dem Gemisch gegeben. Dann wurde 5 Stunden auf 50ºC unter Rühren bei 15 U/min erwärmt.
Nach Abschluß der Reaktion wurde der Inhalt auf Raumtemperatur gekühlt, und das gelierte Produkt in der unteren wäßrigen Phase wurde abfiltriert. Zu dem gelatineartigen Produkt wurden 50 ml Ethanol gegeben. Nach Rühren wurde das gelatineartige Produkt abfiltriert und gewonnen. Das gewonnene Gel wurde erneut in 50 ml Ethanol suspendiert. Die Suspension wurde filtriert, um das gelatineartige Produkt zu gewinnen.
Dieser Schritt wurde weitere 3 mal wiederholt. Sodann wurde das gelatineartige Produkt in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert und durch Filtration isoliert. Dieser Schritt wurde weitere 3 mal wiederholt. Sodann wurde der Stoff erneut in destilliertem Wasser dispergiert und anschließend abfiltriert. Nach 3 maliger Wiederholung dieses Schritts wurde der Stoff erneut in 50 ml Ethanol dispergiert.
Die Dispersion wurde filtriert. Nach Trocknen wurde das gelatineartige Produkt zu einem Pulver gemahlen, wobei man 9,1 g eines weißen Pulvers erhielt.
Die Löslichkeit des Pulvers in Wasser bei 60ºC betrug 0,001 g oder weniger, bezogen auf 100 g Wasser. Nach weiterem Eintauchen des Pulvers in Wasser bei 60ºC für 1 Tag betrug das Gewichtsverhältnis von hydratisiertem Gel zu Pulver 10,8.
Sodann wurde der folgende Versuch durchgeführt, um die Adsorptionseigenschaften von Glucoamylase an das Pulver zu untersuchen.
40 ml eines Kulturfiltrats (mit einem Gehalt an 0,50 Einheiten/ml α-Amylase, 0,98 Einheiten/ml β-Amylase und 1,30 Einheiten/ml Glucoamylase) von Aspergillus oryzae IFO-4176 wurden auf 6ºC gekühlt und in einen Adsorptionsbehälter vom Fluidphasentyp gegeben. Der Behälter wies eine Struktur auf, die einen Außenzylinder (28 mm Φ · 100 mm) mit einem Luftströmungsrohr (15 mm Φ · 70 mm) darin umfaßte, in dem sich eine Luftblas-Einzelporendüse (Innendurchmesser von 1 mm) befand, um die Lösung aufzuwirbeln. Anschließend wurden 0,2 g des vorstehend beschriebenen Adsorbenspulvers zugegeben, und Luft wurde mit einer Geschwindigkeit im leeren Turm von 0,5 cm/sec einzublasen, um dabei die Lösung im Behälter auf zuwirbeln und 2 Minuten mit dem Pulver in Kontakt zu bringen. Die Lösung wurde durch eine Säule (10 Φ · 50 mm), die mit einem Filter am Boden ausgestattet war, filtriert, und die α-Amylase-Aktivität, die β-Amylase-Aktivität und die Glucoamylase-Aktivität im Filtrat wurden gemessen.
Im Überstand betrugen α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase 0,5 Einheiten/ml, 0,04 Einheiten/ml bzw. 0,03 Einheiten/ml. Die Menge der einzelnen Enzyme, die an das vorstehend beschriebene Adsorbens adsorbiert waren, wurde als ein Wert berechnet, der durch Abziehen einer Enzymkonzentration nach dem Kontakt mit dem Adsorbens von einer Enzymkonzentration vor dem Kontakt erhalten wurde. Als Ergebnis wurde im Kulturfiltrat enthaltene α-Amylase im wesentlichen nicht adsorbiert, jedoch 96% (0,94 Einheiten/ml) β-Amylase und 98% (1,27 Einheiten/ml) Glucoamylase wurden an das Adsorbens adsorbiert.
Sodann wurde eine wäßrige 0,5 m Natriumchloridlösung (pH-Wert: 7,0) durch die Säule geleitet, an die die vorstehend genannten Enzyme adsorbiert waren, und das ausströmende Medium wurde aufgefangen. Anschließend wurden 2 ml Wasser durchgeleitet, um die Säule zu spülen. Die Spülflüssigkeit und das vorstehend beschriebene ausströmende Medium wurden vereinigt, wobei man 6 ml einer Enzymdesorptionslösung erhielt.
Die Enzymkonzentrationen in der vorstehend beschriebenen Enzymdesorptionslösung wurden gemessen. Als Ergebnis wurde keine α-Amylase nachgewiesen, β-Amylase und Glucoamylase betrugen jedoch 6,2 Einheiten/ml bzw. 8,4 Einheiten/ml. Durch Multiplikation der Konzentrationen der entsprechenden Enzyme in der Desorptionslösung mit 6 ml als der Menge der Lösung wurden die entsprechenden gewonnenen Mengen zu 0 Einheiten α-Amylase, 37,4 Einheiten β-Amylase und 50,1 Einheiten Glucoamylase bestimmt. Von den vorhandenen Enzymen konnten also 0% α-Amylase, 95% β-Amylase und 96% Glucoamylase durch Adsorption und Desorption in diesem Beispiel gewonnen werden. Ferner wurde in der Lösung keine Protease-Aktivität nachgewiesen, und es wurde weder eine Verfärbung noch ein Geruch festgestellt. Außerdem wurden die Mengen an organischen und anorganischen Stoffen in der Lösung auf 1,2% bzw. 1,1%, bezogen auf die Gehalte in der rohen Lösung, verringert.
Nach den vorstehenden Ausführungen konnten β-Amylase und Glucoamylase in der rohen Lösung auf etwa das 5-fache konzentriert und gereinigt werden.

Beispiel 5

Isolierung und Reinigung von β-Amylase und Glucoamylase unter Verwendung von vernetztem Glycogen, das mit Glucoamylase behandelt wurde

Zu 10 g trockenem Pulver von Glycogen (geschätztes Molekulargewicht: 4 · 10&sup5;; geschätzter Verzweigungsgrad: 25%) von aus Escherichia coli wurden 95 ml eines 0,05 m Natriumacetat-Puffers (pH-Wert: 5,0) gegeben. Das Gemisch wurde unter Rühren auf 70ºC erwärmt, um das Pulver zu lösen. Die Lösung wurde auf 50ºC gekühlt. 30 ml der Lösung wurden entnommen, und 2 ml Glucoamylase-Lösung, in der 10 Einheiten Glucoamylase, die von Aspergillus oryzae IFO-4176 abgeleitet war, gelöst waren, wurden zugegeben. Das Gemisch wurde bei 40ºC gehalten.
Die Menge an Glucose, die 2 Stunden später gebildet wurde, wurde gemessen, und als Ergebnis erreichte sie ungefähr 30%, bezogen auf die Anzahl der Glucosereste in dem untersuchten Glycogenmolekül. An diesem Punkt betrug das Molekulargewicht 6 · 10&sup4;.
Die Lösung wurde in ein Cellophanröhrchen zur Dialyse gegeben und 10 Stunden bei 10ºC gegen 5 l Wasser dialysiert. Der Inhalt wurde gefriergetrocknet, wobei man 0,9 g eines weißen Pulvers erhielt.
Zu dem Pulver wurden 10 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wurde auf 70ºC unter Rühren erwärmt, um das Pulver zu lösen und eine viskose Lösung herzustellen. Zu der Lösung wurden 33 ml 6 n Natriumhydroxid gegeben. Das Gemisch wurde in einen 200 ml fassenden Reaktionskolben, der mit einem Rührer und einem Rückflußkühler ausgestattet war, gegeben. Anschließend wurden 100 ml Epichlorhydrin zu dem Gemisch gegeben. Danach wurde 5 Stunden auf 70ºC unter Rühren bei 20 U/min erwärmt.
Nach Abschluß der Reaktion wurde der Inhalt auf Raumtemperatur gekühlt, und das gelierte Produkt in der unteren wäßrigen Phase wurde abfiltriert. Zu den gelatineartigen Produkt wurden 50 ml Ethanol gegeben. Nach Rühren wurde das gelatineartige Produkt abfiltriert und gewonnen. Das gewonnene Gel wurde erneut in 50 ml Ethanol suspendiert. Die Suspension wurde filtriert, um das gelatineartige Produkt zu gewinnen. Dieser Schritt wurde weitere 3 mal wiederholt. Sodann wurde das gelatineartige Produkt in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert und durch Filtration isoliert. Nach 3-maliger Wiederholung dieses Schritts wurde der Stoff erneut in 50 ml Ethanol dispergiert. Die Dispersion wurde filtriert. Nach Trocknen wurde das gelatineartige Produkt zu einem Pulver gemahlen, wobei man 0,7 g eines weißen Pulvers erhielt.
Die Löslichkeit des Pulvers in Wasser bei 60ºC betrug 0,001 g oder weniger, bezogen auf 100 g Wasser. Nach weiterem Eintauchen des Pulvers in Wasser bei 60ºC für 1 Tag betrug das Gewichtsverhältnis von hydratisiertem Gel zu Pulver 13,2. Durch Messung der nicht-reduzierenden endständigen Glucosereste des Pulvers wurde der mittlere Polymerisationsgrad der verzweigten Ketten zu 4,2 bestimmt. Sodann wurde der folgende Versuch durchgeführt, um die Adsorptionseigenschaften von Glucoamylase an das Pulver zu untersuchen.
40 ml eines Kulturfiltrats (mit einem Gehalt an 0,50 Einheiten/ml α-Amylase 0,98 Einheiten/ml, β-Amylase und 1,30 Einheiten/ml Glucoamylase) von Aspergillus oryzae IFO-4176 wurden auf 6ºC gekühlt, und 0,2 g des vorstehend beschriebenen Adsorbenspulvers wurden zugegeben. Sie wurden miteinander durch Mischen für 2 Minuten bei 5 U/min in Kontakt gebracht. Der Inhalt wurde durch eine Säule (10 (Φ) · 50 mm), die mit einem Filter am Boden ausgestattet war, filtriert, und die α-Amylase-Aktivität, die β-Amylase-Aktivität und die Glucoamylase-Aktivität im Filtrat wurden gemessen.
Im Überstand betrugen α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase 0,50 Einheiten/ml, 0,50 Einheiten/ml bzw. 0,01 Einheiten/ml. Die Menge der einzelnen Enzyme, die an das vorstehend beschriebene Adsorbens adsorbiert war, wurde als ein Wert berechnet, der durch Abziehen einer Enzymkonzentration nach dem Kontakt mit dem Adsorbens von einer Enzymkonzentration vor dem Kontakt erhalten wurde. Als Ergebnis wurde im Kulturfiltrat enthaltene α-Amylase nicht wesentlich adsorbiert, es wurden jedoch 51% (0,48 Einheiten/ml) β-Amylase und 99% (1,29 Einheiten/ml) Glucoamylase an das Adsorbens adsorbiert.
Sodann wurde eine wäßrige 0,5 m Natriumchloridlösung (pH-Wert: 7,0), die mit Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt worden war, durch die Säule geleitet, an die die vorstehend genannten Enzyme adsorbiert worden waren, und das ausströmende Medium wurde aufgefangen. Anschließend wurden 2 ml Wasser durchgeleitet, um die Säule zu spülen. Die Spülflüssigkeit und das vorstehend beschriebene ausströmende Medium wurden vereinigt, wobei man 6 ml Enzymdesorptionslösung erhielt.
Die Enzymkonzentrationen in der vorstehend beschriebenen Enzymdesorptionslösung wurden gemessen. Als Ergebnis wurde keine α-Amylase nachgewiesen, β-Amylase und Glucoamylase betrugen jedoch 3,1 Einheiten/ml bzw. 8,5 Einheiten/ml. Durch Multiplikation der Konzentrationen der entsprechenden Enzyme in der Desorptionslösung mit 6 ml als der Menge der Lösung wurden die entsprechenden gewonnenen Mengen zu 0 Einheiten α-Amylase, 20 Einheiten β-Amylase und 51,0 Einheiten Glucoamylase bestimmt. Unter den in der rohen Lösung vorhandenen Enzymen konnten also 0% α-Amylase, 51,0% β-Amylase und 98% Glucoamylase durch Adsorption und Desorption in diesem Beispiel gewonnen werden. Ferner wurde in der Lösung keine Protease-Aktivität nachgewiesen, und es wurde weder eine Verfärbung noch ein Geruch festgestellt. Außerdem wurden die Mengen an organischen und anorganischen Materialien in der Lösung auf 0,9% bzw. 1,1%, bezogen auf die Gehalte der rohen Lösung, verringert.
Nach den vorstehenden Ausführungen konnten β-Amylase und Glucoamylase in der rohen Lösung auf etwa das 3,4-fache bzw. auf etwa das 5-fache konzentriert und gereinigt werden.

Beispiel 6

Isolierung und Reinigung von Glucoamylase unter Verwendung von vernetzter Maltose

Zu 10 g trockenem Pulver aus Maltose wurden 90 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wurde auf 50ºC unter Rühren erwärmt, um das Pulver zu lösen. Zu der Lösung wurden 33 ml 3 n Natriumhydroxid gegeben. Das Gemisch wurde in einen 500 ml fassenden Reaktionskolben, der mit einem Rührer und einem Rückflußkühler ausgestattet war, gegeben. Anschließend wurden 140 ml Epichlorhydrin zu dem Gemisch gegeben. Dann wurde 15 Stunden auf 70ºC unter Rühren bei 20 U/min erwärmt.
Nach Abschluß der Reaktion wurde der Inhalt auf Raumtemperatur gekühlt, und das gelierte Produkt in der unteren wäßrigen Phase wurde abfiltriert. Zu dem gelatineartigen Produkt wurden 50 ml Ethanol gegeben. Nach Rühren wurde das gelatineartige Produkt abfiltriert und gewonnen. Das gewonnene Gel wurde erneut in 50 ml Ethanol suspendiert. Die Suspension wurde filtriert, um das gelatineartige Produkt zu gewinnen. Dieser Schritt wurde 3 mal wiederholt. Sodann wurde das gelatineartige Produkt in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert und durch Filtration gewonnen. Nach 3-maliger Wiederholung dieses Schritts wurde der Stoff erneut in 50 ml Ethanol dispergiert. Die Dispersion wurde filtriert. Nach Trocknen wurde das gelatineartige Produkt zu einem Pulver gemahlen, wobei man 9,4 g eines weißen Pulvers erhielt.
Die Löslichkeit des Pulvers in Wasser bei 60ºC betrug 0,002 g oder weniger, bezogen auf 100 g Wasser. Nach weiterem Eintauchen des Pulvers in Wasser bei 60ºC für 1 Tag betrug das Gewichtsverhältnis des hydratisierten Gels zum Pulver 14,0.
Andererseits wurden 20 ml eines Kulturfiltrats (mit einem Gehalt an 0,50 Einheiten/ml α-Amylase, 0,98 Einheiten/ml β-Amylase und 1,30 Einheiten/ml Glucoamylase) von Aspergillus oryzae IFO-4176 auf 6ºC gekühlt, und 0,2 g des vorstehend beschriebenen Adsorbenspulvers wurden zugegeben. Das Gemisch wurde bei 5 U/min für 2 Minuten gerührt. Das Gemisch wurde filtriert, wobei man 20 ml Filtrat erhielt. Die α-Amylase-Aktivität, die β-Amylase-Aktivität und die Glucoamylase-Aktivität im Filtrat wurden gemessen.
Im Überstand betrugen α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase 0,50 Einheiten/ml, 0,97 Einheiten/ml bzw. 0,01 Einheiten/ml.
Die Menge der einzelnen Enzyme, die an das vorstehend beschriebene Adsorbens adsorbiert waren, wurde als ein Wert berechnet, der durch Abziehen einer Enzymkonzentration nach dem Kontakt mit dem Adsorbens von einer Enzymkonzentration vor dem Kontakt erhalten wurde. Als Ergebnis wurden α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase an das Adsorbens mit 0 Einheiten/ml, 0,015 Einheiten/ml und 1,29 Einheiten/ml des Kulturfiltrats adsorbiert. Dementsprechend wurden 0% α-Amylase, 1% β-Amylase und 99% Glucoamylase an das Adsorbens adsorbiert.
Sodann wurde das Adsorbens, an das die vorstehend genannten Enzyme adsorbiert worden waren, in einen Behälter von 20 ml gegeben, und 4 ml einer Lösung, die mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 8 eingestellt worden war, wurden zu dem Adsorbens gegeben. Das Gemisch wurde bei 5 U/min für 2 Minuten gerührt, um die Bestandteile miteinander in Kontakt zu bringen. Nach Zentrifugation bei 3000 U/min für 5 Minuten wurde das Gemisch in das Adsorbens und den Überstand getrennt. Weitere 2 ml Wasser wurden zu dem Adsorbens gegeben, um es zu suspendieren. Die Suspension wurde erneut bei 3000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert, um sie in die Spüllösung und das Adsorbens durch eine Feststoff-Flüssigkeits-Trennung zu trennen. Der Überstand und die vorstehend erhaltene Spüllösung wurden vereinigt, wobei man 6 ml einer Enzymdesorptionslösung erhielt.
Die Enzymkonzentration in der vorstehend beschriebenen Enzymdesorptionslösung wurde gemessen. Als Ergebnis betrugen α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase 0 Einheiten/ml, 0,65 Einheiten/ml bzw. 4,25 Einheiten/ml. Es konnten also 0 Einheiten (Gewinnungsgrad: 0%) α-Amylase, 3,9 Einheiten (2%) β-Amylase und 25,5 Einheiten (98%) Glucoamylase gewonnen werden.
Ferner wurde in der Lösung keine Protease-Aktivität nachgewiesen, und es wurde weder eine Verfärbung noch ein Geruch festgestellt. Außerdem wurden die Mengen an organischen und anorganischen Materialien in der Lösung auf 1,5% bzw. 1,4%, bezogen auf die Gehalte in der rohen Lösung, verringert. Nach den vorstehenden Ausführungen konnte Glucoamylase in der rohen Lösung selektiv auf etwa das 3-fache konzentriert und gereinigt werden.

Beispiel 7

Zu 10 g trockenem Pulver aus Maltose wurden 80 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wurde auf 50ºC unter Rühren erwärmt, um das Pulver zu lösen. Zu der Lösung wurden 33 ml 4 n Natriumhydroxid gegeben. Das Gemisch wurde in einen 500 ml fassenden Reaktionskolben, der mit einem Rührer und einem Rückflußkühler ausgestattet war, gegeben.
Anschließend wurden 140 ml Epichlorhydrin zu dem Gemisch gegeben. Dann wurde 6 Stunden auf 80ºC unter Rühren bei 20 U/min erwärmt.
Nach Abschluß der Reaktion wurde der Inhalt auf Raumtemperatur gekühlt und das gelierte Produkt in der unteren wäßrigen Phase wurde abfiltriert. Zu dem gelatineartigen Produkt wurden 50 ml Ethanol gegeben. Nach Rühren wurde das gelatineartige Produkt abfiltriert und gewonnen.
Das gewonnene Gel wurde erneut in 50 ml Ethanol suspendiert. Die Suspension wurde filtriert, um das gelatineartige Produkt zu gewinnen. Dieser Schritt wurde weitere 3 mal wiederholt. Sodann wurde das gelatineartige Produkt in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert und durch Filtration isoliert.
Nach 3-maliger Wiederholung dieses Schritts wurde der Stoff erneut in 50 ml Ethanol dispergiert. Die Dispersion wurde filtriert. Nach Trocknen wurde das gelatineartige Produkt zu einem Pulver gemahlen, wobei man 18,1 g eines weißen Pulvers erhielt.
Die Löslichkeit des Pulvers in Wasser bei 60ºC betrug 0,003 g oder weniger, bezogen auf 100 g Wasser. Nach weiterem Eintauchen des Pulvers in Wasser bei 60ºC für 1 Tag betrug das Gewichtsverhältnis von hydratisiertem Gel zu Pulver 15,2.
Andererseits wurden 20 ml eines Kulturfiltrats (mit einem Gehalt an 0,50 Einheiten/ml α-Amylase, 0,98 Einheiten/ml β-Amylase und 1,30 Einheiten/ml Glucoamylase) von Aspergillus oryzae IFO-4176 auf 6ºC gekühlt, und 0,2 g des vorstehend beschriebenen Adsorbenspulvers wurden zugegeben. Das Gemisch wurde bei 5 U/min für 2 Minuten gerührt. Das Gemisch wurde filtriert, und die α-Amylase-Aktivität, die β-Amylase- Aktivität und die Glucoamylase-Aktivität im Filtrat wurden gemessen.
Die entsprechenden Enzymaktivitäten im Überstand wurden gemessen. Im Überstand betrugen α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase 0,50 Einheiten/ml, 0,88 Einheiten/ml bzw. 0,01 Einheiten/ml.
Die Menge der einzelnen Enzyme, die an das vorstehend beschriebene Adsorbens adsorbiert wurden, wurde als ein Wert berechnet, der durch Abziehen einer Enzymkonzentration nach dem Kontakt mit den Adsorbens von einer Enzymkonzentration vor dem Kontakt erhalten wurde. Als Ergebnis wurden α- Amylase, β-Amylase und Glucoamylase an das Adsorbens mit 0 Einheiten/ml, 0,12 Einheiten/ml bzw. 1,29 Einheiten/ml des Kulturfiltrats adsorbiert.
Dementsprechend wurde die im Kulturfiltrat enthaltenen α-Amylase überhaupt nicht adsorbiert, es wurden jedoch 12,0% β-Amylase und 99% Glucoamylase an das Adsorbens adsorbiert.
Sodann wurde das Adsorbens, an das die vorstehend genannten Enzyme adsorbiert worden waren, in einem Behälter von 20 ml gegeben, und 4 ml einer Lösung, deren pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 8 eingestellt worden war, wurden zu dem Adsorbens gegeben. Das Gemisch wurde bei 5 U/min für 2 Minuten gerührt, um die Bestandteile miteinander in Kontakt zu bringen. Nach Zentrifugation bei 3000 U/min für 5 Minuten wurde das Gemisch in das Adsorbens und den Überstand getrennt. Weitere 2 ml Wasser wurden zu dem Adsorbens gegeben, um es zu suspendieren. Die Suspension wurde erneut bei 3000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert, um sie in die Spüllösung und das Adsorbens durch eine Feststoff-Flüssigkeits-Trennung zu trennen. Der Überstand und die vorstehend erhaltene Spüllösung wurden vereinigt, wobei man 6 ml einer Enzymdesorptionslösung erhielt.
Die Enzymkonzentrationen in der vorstehend beschriebenen Enzymdesorptionslösung wurden gemessen. Als Ergebnis betrugen α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase 0 Einheiten/ml, 0,35 Einheiten/ml bzw. 4,14 Einheiten/ml. Es konnten also 0 Einheiten (Gewinnungsgrad: 0%) α-Amylase, 2,1 Einheiten (10,7%) β-Amylase und 24,8 Einheiten (95%) Glucoamylase gewonnen werden.
Ferner wurde in der Lösung keine Protease-Aktivität nachgewiesen, und es wurde weder eine Verfärbung noch ein Geruch festgestellt. Außerdem wurden die Mengen an organischen und anorganischen Materialien in der Lösung auf 1,4% bzw. 1,2%, bezogen auf die Gehalte in der rohen Lösung, verringert. Nach den vorstehenden Angaben konnte Glucoamylase in der rohen Lösung selektiv auf etwa das 3,2-fache konzentriert und gereinigt werden.

Beispiel 8

Isolierung und Reinigung von Glucoamylase unter Verwendung von vernetzter Maltotriose

Zu 10 g trockenem Pulver aus Maltotriose wurden 80 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wurde auf 50ºC unter Rühren erwärmt, um das Pulver zu lösen. Zu der Lösung wurden 33 ml 4 n Natriumhydroxid gegeben. Das Gemisch wurde in einen 500 ml fassenden Reaktionskolben, der mit einem Rührer und einem Rückflußkühler ausgestattet war, gegeben.
Anschließend wurden 140 ml Epichlorhydrin zu dem Gemisch gegeben. Dann wurde 6 Stunden auf 80ºC unter Rühren bei 20 U/min erwärmt.
Nach Abschluß der Reaktion wurde der Inhalt auf Raumtemperatur gekühlt. Das gelierte Produkt in der unteren wäßrigen Phase wurde abfiltriert. Zu dem gelatineartigen Produkt wurden 50 ml Ethanol gegeben. Nach Rühren wurde das gelatineartige Produkt abfiltriert und gewonnen.
Das gewonnene Gel wurde erneut in 50 ml Ethanol suspendiert. Die Suspension wurde filtriert, um das gelatineartige Produkt zu gewinnen. Dieser Schritt wurde weitere 3 mal wiederholt. Sodann wurde das gelatineartige Produkt in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert und durch Filtration isoliert.
Nach 3-maliger Wiederholung dieses Schritts wurde der Stoff erneut in 50 ml Ethanol dispergiert. Die Dispersion wurde filtriert. Nach Trocknen wurde das gelatineartige Produkt zu einem Pulver gemahlen, wobei man 9,7 g eines weißen Pulvers erhielt.
Die Löslichkeit des Pulvers in Wasser bei 60ºC betrug 0,002 g oder weniger, bezogen auf 100 g Wasser. Nach weiterem Eintauchen des Pulvers in Wasser bei 60ºC für 1 Tag betrug das Gewichtsverhältnis des hydratisierten Gels zum Pulver 14,8.
Andererseits wurden 20 ml eines Kulturfiltrats (mit einem Gehalt an 0,50 Einheiten/ml α-Amylase, 0,98 Einheiten/ml β-Amylase und 1,30 Einheiten/ml Glucoamylase) von Aspergillus oryzae IFO-4176 auf 6ºC gekühlt, und 0,2 g des vorstehend beschriebenen Adsorbenspulvers wurden zugegeben. Das Gemisch wurde bei 5 U/min für 2 Minuten gerührt. Das Gemisch wurde filtriert, und die α-Amylase-Aktivität, die β-Amylase- Aktivität und die Glucoamylase-Aktivität im Filtrat wurden gemessen.
Die entsprechenden Enzymaktivitäten im Überstand wurden gemessen. Im Überstand betrugen α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase 0,50 Einheiten/ml, 0,64 Einheiten/ml bzw. 0,03 Einheiten/ml.
Die Menge der einzelnen Enzyme, die an das vorstehend beschriebene Adsorbens adsorbiert worden waren, wurde als ein Wert berechnet, der durch Abziehen einer Enzymkonzentration nach dem Kontakt mit dem Adsorbens mit einer Enzymkonzentration vor dem Kontakt mit dem Adsorbens erhalten wurde.
Als ein Ergebnis waren α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase an das Adsorbens mit 0 Einheiten/ml, 0,34 Einheiten/ml bzw. 1,27 Einheiten/ml des Kulturfiltrats adsorbiert.
Dementsprechend wurde die im Kulturfiltrat enthaltene α-Amylase überhaupt nicht adsorbiert, es wurden jedoch 35% β-Amylase und 98% Glucoamylase an das Adsorbens adsorbiert.
Sodann wurde das Adsorbens, an das die vorstehend genannten Enzyme adsorbiert worden waren, in einen Behälter von 20 ml gegeben, und 4 ml einer Lösung, deren pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 8,2 eingestellt worden war, wurden zu dem Adsorbens gegeben. Das Gemisch wurde bei 5 U/min für 2 Minuten gerührt, um die Bestandteile miteinander in Kontakt zu bringen. Nach Zentrifugation bei 3000 U/min für 5 Minuten wurde das Gemisch in das Adsorbens und den Überstand getrennt. Weitere 2 ml Wasser wurden zu dem Adsorbens gegeben, um es zu suspendieren. Die Suspension wurde erneut bei 3000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert, um sie in die Spüllösung und das Adsorbens durch eine Feststoff-Flüssigkeits-Trennung zu trennen. Der Überstand und die vorstehend erhaltene Spüllösung wurden vereinigt, wobei man 6 ml einer Enzymdesorptionslösung erhielt.
Die Enzymkonzentrationen in der vorstehend beschriebenen Enzymdesorptionslösung wurden gemessen. Als Ergebnis betrugen α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase 0 Einheiten/ml, 1,05 Einheiten/ml bzw. 4,16 Einheiten/ml. Es konnten also 0 Einheiten (Gewinnungsgrad: 0%) α-Amylase, 6,27 Einheiten (32%) β-Amylase und 25,0 Einheiten (96%) Glucoamylase gewonnen werden.
Ferner wurde in der Lösung keine Protease-Aktivität nachgewiesen, und es wurde weder eine Verfärbung noch ein Geruch festgestellt. Außerdem wurden die Mengen an organischen und anorganischen Materialien in der Lösung auf 1,7% bzw. 1,2%, bezogen auf die Gehalte in der rohen Lösung, verringert. Nach den vorstehenden Ausführungen konnte Glucoamylase in der rohen Lösung selektiv auf etwa das 3,2-fache konzentriert und gereinigt werden.

Beispiel 9

Isolierung und Reinigung von β-Amylase und Glucoamylase unter Verwendung von vernetzter Maltotetraose

Zu 1 g trockenem Pulver von Maltotetraose wurde 8 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wurde auf 50ºC unter Rühren erwärmt, um das Pulver zu lösen. Zu der Lösung wurden 33 ml 4 n Natriumhydroxid gegeben. Das Gemisch wurde in einen 200 ml fassenden Reaktionskolben, der mit einem Rührer und einem Rückflußkühler ausgestattet war, gegeben.
Anschließend wurde 15 ml Epichlorhydrin zu dem Gemisch gegeben. Dann wurde 6 Stunden auf 80ºC unter Rühren bei 20 U/min erwärmt.
Nach Abschluß der Reaktion wurde der Inhalt auf Raumtemperatur gekühlt, und das gelierte Produkt in der unteren wäßrigen Phase wurde abfiltriert. Zu dem gelatineartigen Produkt wurden 50 ml Ethanol gegeben. Nach Rühren wurde das gelatineartige Produkt abfiltriert und gewonnen.
Das gewonnene Gel wurde erneut in 50 ml Ethanol suspendiert. Die Suspension wurde filtriert, um das gelatineartige Produkt zu gewinnen. Dieser Schritt wurde weitere 3 mal wiederholt. Sodann wurde das gelatineartige Produkt mit 50 ml destilliertem Wasser suspendiert und durch Filtration isoliert.
Nach 3-maliger Wiederholung dieses Schrittes wurde der Stoff erneut in 50 ml Ethanol dispergiert. Die Dispersion wurde filtriert. Nach Trocknen wurde das gelatineartige Produkt zu einem Pulver gemahlen, wobei man 0,90 g eines weißen Pulvers erhielt.
Die Löslichkeit des Pulvers in Wasser bei 60ºC betrug 0,001 g oder weniger, bezogen auf 100 g Wasser. Nach weiterem Eintauchen des Pulvers in Wasser bei 60ºC für 1 Tag betrug das Gewichtsverhältnis von hydratisiertem Gel zu Pulver 13,4.
Andererseits wurden 20 ml eines Kulturfiltrats (mit einem Gehalt an 0,50 Einheiten/ml α-Amylase, 0,98 Einheiten/ml β-Amylase und 1,30 Einheiten/ml Glucoamylase) von Aspergillus oryzae IFO-4176 auf 6ºC gekühlt, und 0,2 g des vorstehend beschriebenen Adsorbens wurden zugegeben. Das Gemisch wurde bei 5 U/min für 2 Minuten gerührt.
Das Gemisch wurde filtriert, und die α-Amylase-Aktivität, die β-Amylase-Aktivität und die Glucoamylase-Aktivität im Filtrat wurden gemessen.
Im Überstand betrugen α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase 0,50 Einheiten/ml, 0,29 Einheiten/ml bzw. 0,03 Einheiten/ml Die Menge der einzelnen Enzyme, die an das vorstehend beschriebene Adsorbens adsorbiert worden waren, wurde als ein Wert berechnet, der durch Abziehen einer Enzymkonzentration nach dem Kontakt mit dem Adsorbens von einer Enzymkonzentration vor dem Kontakt erhalten wurde.
Als Ergebnis wurden α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase an das Adsorbens mit 0 Einheiten/ml, 0,69 Einheiten/ml bzw. 1,27 Einheiten/ml des Kulturfiltrats adsorbiert.
Dementsprechend wurde die in dem Kulturfiltrat enthaltene α-Amylase überhaupt nicht adsorbiert, es wurden jedoch 70% β-Amylase und 98% Glucoamylase an das Adsorbens adsorbiert.
Sodann wurde das Adsorbens, an das die vorstehend genannten Enzyme adsorbiert worden waren, in einen Behälter von 20 ml gegeben, und 4 ml einer Lösung, deren pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 8,2 eingestellt worden war, wurden zu dem Adsorbens gegeben. Das Gemisch wurde bei 5 U/min für 2 Minuten gerührt, um die Bestandteile miteinander in Kontakt zu bringen. Nach Zentrifugation bei 3000 U/min für 5 Minuten wurde das Gemisch in das Adsorbens und den Überstand getrennt. Weitere 2 ml Wasser wurden zu dem Adsorbens gegeben, um es zu suspendieren. Die Suspension wurde erneut bei 3000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert, um sie in die Spüllösung und das Adsorbens durch eine Feststoff-Flüssigkeits-Trennung zu trennen. Der Überstand und die vorstehend erhaltene Spüllösung wurden vereinigt, wobei man 6 ml einer Enzymdesorptionslösung erhielt.
Die Enzymkonzentrationen in der vorstehend beschriebenen Enzymdesorptionslösung wurden gemessen. Als Ergebnis betrugen α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase 0 Einheiten/ml, 1,31 Einheiten/ml bzw. 2,06 Einheiten/ml. Es konnten also 0 Einheiten (Gewinnungsgrad: 0%) α-Amylase, 7,84 Einheiten (40,0%) β-Amylase und 12,35 Einheiten (95%= Glucoamylase gewonnen werden.
Ferner konnte in der Lösung keine Protease-Aktivität nachgewiesen werden, und es wurde weder eine Verfärbung noch ein Geruch festgestellt. Außerdem wurden die Mengen an organischen und anorganischen Materialien in der Lösung auf 1,7% bzw. 1,3%, bezogen auf die Gehalte in der rohen Lösung, verringert. Nach den vorstehenden Ausführungen konnte Glucoamylase in der rohen Lösung selektiv auf etwa das 9,5-fache konzentriert und gereinigt werden.

Beispiel 10

Isolierung und Reinigung von β-Amylase und Glucoamylase unter Verwendung von vernetzter Maltohexose

Zu 10 g trockenem Pulver aus Maltohexose wurden 90 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wurde auf 50ºC unter Rühren erwärmt, um das Pulver zu lösen. Zu der Lösung wurden 33 ml 4 n Natriumhydroxid gegeben. Das Gemisch wurde in einen 200 ml fassenden Reaktionskolben, der mit einem Rührer und einem Rückflußkühler ausgestattet war, gegeben.
Anschließend wurden 150 ml Epichlorhydrin zu dem Gemisch gegeben. Dann wurde 6 Stunden auf 80ºC unter Rühren bei 20 U/min erwärmt.
Nach Abschluß der Reaktion wurde der Inhalt auf Raumtemperatur gekühlt, und das gelierte Produkt in der unteren wäßrigen Phase wurde abfiltriert. Zu dem gelatineartigen Produkt wurden 50 ml Ethanol gegeben. Nach Rühren wurde das gelatineartige Produkt abfiltriert und gewonnen.
Das gewonnene Gel wurde erneut in 50 ml Ethanol suspendiert. Die Suspension wurde filtriert, um das gelatineartige Produkt zu gewinnen. Dieser Schritt wurde weitere 3 mal wiederholt. Sodann wurde das gelatineartige Produkt in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert und durch Filtration isoliert.
Nach 3-maliger Wiederholung dieses Schritts wurde der Stoff erneut in 50 ml Ethanol dispergiert. Die Dispersion wurde filtriert. Nach Trocknen wurde das gelatineartige Produkt zu einem Pulver gemahlen, wobei man 9,7 g eines weißen Pulvers erhielt.
Die Löslichkeit des Pulvers in Wasser bei 60ºC betrug 0,002 g oder weniger, bezogen auf 100 g Wasser. Nach weiterem Eintauchen des Pulvers in Wasser bei 60ºC für 1 Tag betrug das Gewichtsverhältnis von hydratisiertem Gel zu Pulver 13,5.
Andererseits wurden 20 ml eines Kulturfiltrats (mit einem Gehalt an 0,50 Einheiten/ml α-Amylase, 0,98 Einheiten/ml β-Amylase und 1,30 Einheiten/ml Glucoamylase) von Aspergillus oryzae IFO-4176 auf 6ºC gekühlt, und 0,2 g des vorstehend beschriebenen Adsorbenspulvers wurden zugegeben. Das Gemisch wurde bei 5 U/min für 2 Minuten gerührt.
Das Gemisch wurde filtriert, und die α-Amylase-Aktivität, die β-Amylase-Aktivität und die Glucoamylase-Aktivität im Filtrat wurden gemessen.
Die entsprechenden Enzymaktivitäten im Überstand wurden gemessen. Im Überstand betrugen α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase 0,50 Einheiten/ml, 0,20 Einheiten/ml bzw. 0,03 Einheiten/ml.
Die Menge der einzelnen Enzyme, die an das vorstehend beschriebene Adsorbens adsorbiert worden waren, wurde als ein Wert berechnet, der durch Abziehen einer Enzymkonzentration nach dem Kontakt mit dem Adsorbens von einer Enzymkonzentration vor dem Kontakt erhalten wurde. Als Ergebnis wurden α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase an das Adsorbens mit 0 Einheiten/ml, 0,88 Einheiten/ml bzw. 1,27 Einheiten/ml des Kulturfiltrats adsorbiert.
Dementsprechend wurde die im Kulturfiltrat enthaltene α-Amylase überhaupt nicht adsorbiert, es wurden jedoch 90% β-Amylase und 98% Glucoamylase an das Adsorbens adsorbiert.
Sodann wurde das Adsorbens, an das die vorstehend genannten Enzyme adsorbiert worden waren, in einen Behälter von 20 ml gegeben, und 4 ml einer Lösung, deren pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 8,2 eingestellt worden war, wurden zu dem Adsorbens gegeben. Das Gemisch wurde bei 5 U/min für 2 Minuten gerührt, um die Bestandteile miteinander in Kontakt zu bringen. Nach Zentrifugation bei 3000 U/min für 5 Minuten wurde das Gemisch in das Adsorbens und den Überstand getrennt. Weitere 2 ml Wasser wurden zu dem Adsorbens gegeben, um es zu suspendieren. Die Suspension wurde erneut bei 3000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert, um sie in die Spüllösung und das Adsorbens durch eine Feststoff-Flüssigkeits-Trennung zu trennen. Der Überstand und die vorstehend erhaltene Spüllösung wurden vereinigt, wobei man 6 ml Enzymdesorptionslösung erhielt.
Die Enzymkonzentrationen in der vorstehend beschriebenen Enzymdesorptionslösung wurden gemessen. Als Ergebnis betrugen α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase 0 Einheiten/ml, 25,5 Einheiten/ml bzw. 41,7 Einheiten/ml. Es konnten also 0 Einheiten (Gewinnungsgrad: 0%) α-Amylase, 15,3 Einheiten (78,0%) β-Amylase und 25,0 Einheiten (96,0%) Glucoamylase gewonnen werden.
Ferner wurde in der Lösung keine Protease-Aktivität nachgewiesen, und es wurde weder eine Verfärbung noch ein Geruch festgestellt. Außerdem wurden die Mengen an organischen und anorganischen Materialien in der Lösung auf 1,8% bzw. 1,9%, bezogen auf die Gehalte der rohen Lösung, verringert. Nach den vorstehenden Ausführungen konnte also Glucoamylase in der rohen Lösung selektiv auf etwa das 19,2-fache konzentriert und gereinigt werden.

Beispiel 11

Isolierung und Reinigung von Glucoamylase unter Verwendung von vernetztem Glycogen, das mit Glucoamylase und α-Amylase behandelt wurde

Zu 5 g trockenem Pulver aus Glycogen (geschätztes Molekulargewicht: 4 · 10&sup5;; geschätzter Verzweigungsgrad: 25%), das aus Escherichia coli-Zellen hergestellt worden war, wurde 95 ml eines 0,05 m Natriumacetat-Puffers (pH-Wert: 5,0) gegeben. Das Gemisch wurde auf 70ºC unter Rühren erwärmt, um das Pulver zu lösen. Die Lösung wurde auf 50ºC gekühlt. 30 ml der Lösung wurden entnommen, und 2 ml eines α-Amylase- und Glucoamylase-Lösungsgemisches, in dem 200 Einheiten Glucoamylase, die von Aspergillus oryzae IFO-4176 abgeleitet wurde, gelöst worden waren, wurden zu der Lösung gegeben. Das Gemisch wurde bei 50ºC gehalten.
Die Menge an Glucose, die 2 Stunden später gebildet wurde, wurde gemessen, und als Ergebnis erreichte sie ungefähr 70%, bezogen auf die Anzahl der Glucosereste in dem untersuchten Glycogenmolekül. Bei diesem Punkt betrug das Molekulargewicht 1 · 10&sup5;.
Die Lösung wurde in ein Cellophanröhrchen für die Dialyse gegeben und bei 8ºC für 17 Stunden gegen 5 l Wasser dialysiert. Der Inhalt wurde gefriergetrocknet, wobei man 0,85 g eines weißen Pulvers erhielt. Der mittlere Polymerisationsgrad der verzweigten Ketten des Pulvers wurde zu 3,6 bestimmt.
Zu diesem Pulver wurden 10 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wurde auf 70ºC unter Rühren erwärmt, um das Pulver zu lösen und eine viskose Lösung herzustellen. Sodann wurden 35 ml 6 n Natriumhydroxid zu der Lösung gegeben. Das Gemisch wurde in einen 200 ml fassenden Reaktionskolben, der mit einem Rührer und einem Rückflußkühler ausgestattet war, gegeben. Anschließend wurden 150 ml Epichlorhydrin zu dem Gemisch gegeben. Dann wurde 5,2 Stunden auf 70ºC unter Rühren bei 20 U/min erwärmt.
Nach Abschluß der Reaktion wurde der Inhalt auf Raumtemperatur gekühlt, und das gelierte Produkt in der unteren wäßrigen Phase wurde abfiltriert.
Zu dem gelatineartigen Produkt wurden 50 ml Ethanol gegeben. Nach Rühren wurde das gelatineartige Produkt abfiltriert und gewonnen. Das gewonnene Gel wurde erneut in 50 ml Ethanol suspendiert. Die Suspension wurde filtriert, um das gelatineartige Produkt zu gewinnen. Dieser Schritt wurde weitere 3 mal wiederholt. Sodann wurde das gelatineartige Produkt in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert und durch Filtration isoliert. Nach 3-maliger Wiederholung dieses Schritts wurde der Stoff erneut in 60 ml Ethanol dispergiert. Die Dispersion wurde filtriert. Nach Trocknen wurde das gelatineartige Produkt zu einem Pulver gemahlen, wobei man 0,7 g eines weißen Pulvers erhielt.
Die Löslichkeit des Pulvers in Wasser bei 60ºC betrug 0,001 g oder weniger, bezogen auf 100 g Wasser. Nach weiterem Eintauchen des Pulvers in Wasser bei 60ºC für 1 Tag betrug das Gewichtsverhältnis von hydratisiertem Gel zu Pulver 14,1. Durch Messung des nicht-reduzierenden Endes des Pulvers wurde der mittlere Polymerisationsgrad der verzweigten Ketten zu 2,9 bestimmt. Sodann wurde der folgende Versuch durchgeführt, um die Adsorptionseigenschaften von Glucoamylase an das Pulver zu untersuchen.
40 ml eines Kulturfiltrats (mit einem Gehalt an 0,50 Einheiten/ml α-Amylase, 0,98 Einheiten/ml β-Amylase und 1,30 Einheiten/ml Glucoamylase) von Aspergillus oryzae IFO-4176 wurden auf 6ºC gekühlt und 0,2 g des vorstehend beschriebenen Adsorbenspulvers wurden zugegeben. Sie wurden miteinander durch Mischen für 2 Minuten bei 5 U/min in Kontakt gebracht. Der Inhalt wurde durch eine Säule (10 (Φ) · 50 mm), die mit einem Filter am Boden ausgestattet war, filtriert, und die α-Amylase-Aktivität, die β-Amylase-Aktivität und die Glucoamylase-Aktivität im Filtrat wurden gemessen.
Im Überstand betrugen α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase 0,50 Einheiten/ml, 0,06 Einheiten/ml bzw. 0,013 Einheiten/ml. Die Menge der einzelnen Enzyme, die an das vorstehend beschriebene Adsorbens adsorbiert worden waren, wurde als ein Wert berechnet, der durch Abziehen einer Enzymkonzentration nach dem Kontakt mit dem Adsorbens von einer Enzymkonzentration vor dem Kontakt erhalten wurde. Als Ergebnis wurde im Kulturfiltrat enthaltene α-Amylase im wesentlichen nicht adsorbiert, es wurden jedoch 3,1% (0,95 Einheiten/ml) β-Amylase und 98% (0,013 Einheiten/ml) Glucoamylase an das Adsorbens adsorbiert.
Sodann wurde eine wäßrige 0,5 m Natriumchloridlösung, deren pH-Wert mit einer Natriumhydroxidlösung auf 7,5 eingestellt worden war, durch die Säule geleitet, an die die vorstehend genannten Enzyme adsorbiert worden waren, und das ausströmende Medium wurde aufgefangen. Anschließend wurden 2 ml Wasser durchgeleitet, um die Säule zu spülen. Die Spülflüssigkeit und das vorstehend beschriebene ausströmende Medium wurden vereinigt, wobei man 6 ml Enzymdesorptionslösung erhielt.
Die Enzymkonzentrationen in der vorstehend beschrieben Enzymdesorptionslösung wurden gemessen. Als Ergebnis wurde keine α-Amylase nachgewiesen, β-Amylase und Glucoamylase betrugen jedoch 1,41 Einheiten/ml bzw. 8,42 Einheiten/ml. Durch Multiplikation der Konzentrationen der entsprechenden Enzyme in der Desorptionslösung mit 6 ml als Menge der Lösung wurden die entsprechenden gewonnenen Mengen zu 0 Einheiten α-Amylase, 8,5 Einheiten β-Amylase und 50,5 Einheiten Glucoamylase bestimmt. Unter den in der rohen Lösung vorhandenen Enzymen konnten also 0% α-Amylase, 3,6% β-Amylase und 91,0% Glucoamylase durch Adsorption und Desorption in diesem Beispiel gewonnen werden. Ferner wurde in der Lösung keine Protease-Aktivität nachgewiesen, und es wurde weder eine Verfärbung noch ein Geruch festgestellt. Außerdem wurden die Mengen an organischen und anorganischen Stoffen in der Lösung auf 0,86% bzw. 1,1%, bezogen auf die Gehalte in der rohen Lösung, verringert. Durch Verwendung des vorliegenden Adsorbens können α-Amylase und β-Amylase selektiv mit dem Filtrat und Glucoamylase selektiv mit dem aus strömenden Medium von Adsorbens getrennt werden.
Im Hinblick auf das ausströmende Medium wurde Glucoamylase auf das 6,5-fache, bezogen auf die rohe Lösung, konzentriert, während β-Amylase auf das 2,5-fache verdünnt wurde.

Vergleichsbeispiel 1

Isolierung und Reinigung von Glucoamylase und β-Amylase unter Verwendung von Amylose

40 ml eines Kulturfiltrats (mit einem Gehalt an 0,50 Einheiten/ml α-Amylase, 0,98 Einheiten/ml β-Amylase und 1,30 Einheiten/ml Glucoamylase) von Aspergillus oryzae IFO-4176 der gleichen Charge wie in den Beispielen wurde auf 6ºC gekühlt, und 0,2 g des vorstehend beschriebenen Adsorbenspulvers wurden zugegeben. Sie wurden miteinander durch Mischen für 2 Minuten bei 5 U/min in Kontakt gebracht. Das Gemisch wurde filtriert, und die α-Amylase-Aktivität, die β-Amylase- Aktivität und die Glucoamylase-Aktivität im Filtrat wurden gemessen.
Im Überstand betrugen α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase 0,02 Einheiten/ml, 0,96 Einheiten/ml bzw. 1,29 Einheiten/ml. Die Menge der einzelnen Enzyme, die an das vorstehend beschriebene Amylosepulver adsorbiert waren, wurde als ein Wert berechnet, der durch Abziehen einer Enzymkonzentration nach dem Kontakt mit der Amylose von der Enzymkonzentration vor dem Kontakt erhalten wurde. Als Ergebnis wurden 96% (0,48 Einheiten/ml) α-Amylase und 2% (0,02 Einheiten/ml) β-Amylase adsorbiert, und Glucoamylase betrug 1% (0,01 Einheit/ml), was zeigt, daß von α-Amylase verschiedene Enzyme nicht wesentlich adsorbiert wurden.

Vergleichsbeispiel 2

Isolierung und Reinigung von β-Amylase und Glucoamylase durch Anwendung von Aussalzen und Chromatographie

Ammoniumsulfat wurde portionsweise zu 40 ml eines Kulturfiltrats, (mit einem Gehalt an 20 Einheiten/ml α-Amylase, 0,5 Einheiten/ml; 39 Einheiten β-Amylase, 0.98 Einheiten/ml; 52 Einheiten Glucoamylase, 1,3 Einheiten/ml) von Aspergillus oryzae IFO-4176 bei 6ºC unter Rühren gegeben. Die Endkonzentration wurde auf 12% (Gew./Gew.) eingestellt. Anschließend wurde 30 Minuten gerührt. Die Lösung wurde bei 3000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert, wobei Niederschläge von Amylase-Aktivität freie Verunreinigungen durch Sedimentation entfernt wurden und der Überstand als Enzymfraktion gewonnen wurde. Ammoniumsulfat wurde weiter zu dem Überstand gegeben, so daß die Konzentration 35% (Gew./Gew.) erreichte, um dadurch die drei vorstehend beschriebenen Enzyme auszufällen. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und gewonnen. Die Aktivitäten in den Niederschlägen betrugen 7,5 Einheiten α-Amylase, 2,7 Einheiten β-Amylase und 17 Einheiten Glucoamylase. Ammoniumsulfat wurde ferner zu dem zentrifugierten Überstand gegeben, um eine 40%-ige Lösung (nahe der Löslichkeit von Ammoniumsulfat) zu erhalten. Es wurde jedoch keine Amylase-Aktivität in den gebildeten Niederschlägen festgestellt; die Amylasen waren immer noch gelöst, und es war unmöglich, sie als Niederschläge durch Aussalzen zu gewinnen.
Sodann wurden die vorstehend beschriebenen Niederschläge in 5 ml gelöst. Die Lösung wurde an eine Diethylaminoethylcellulosesäule (10 (Φ) · 70 mm) adsorbiert. Während die Salzkonzentration von 0,05 m Tris-aminomethan-hydrochlorid-Puffer (pH-Wert: 6,0) von 0 bis 1 m mit einem linearen Gradienten erhöht wurde, wurden die Enzyme mit dem Puffer eluiert. Die eluierten Fraktionen (150 ml), die beliebige der drei Enzyme enthielten, wurden fraktioniert, und die Enzymaktivitäten in der Lösung wurden gemessen. α-Amylase, β-Amylase und Glucoamylase betrugen 4,8 Einheiten, 9,8 Einheiten bzw. 11,3 Einheiten. Dementsprechend konnten von den in der rohen Lösung vorhandenen Enzymen 24% α-Amylase, 25% β-Amylase und 19% Glucoamylase durch den Reinigungsschritt in diesem Vergleichsbeispiel in ihren Aktivitätsmengen gewonnen werden. Es wurde weder eine Verfärbung noch ein Geruch festgestellt. Die Menge an hochmolekularen organischen Stoffen in der Lösung wurde auf 3,5%, bezogen auf den Gehalt in der rohen Lösung, verringert. Die Salzkonzentration wurde auf das 7,2-fache erhöht. Im Hinblick auf die entsprechenden Enzymkonzentrationen der gereinigten Enzymlösung erreichte α-Amylase ein 1/16, β-Amylase ein 1/15 und Glucoamylase 1/20, bezogen auf die entsprechenden Enzyme in der rohen Lösung.

Claims

1. Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Amylasen umfassend:

eine wäßrige Rohenzym-Lösung, die eine oder beide, von einem Mikroorganismus abgeleitete Glucoamylase oder von einem Mikroorganismus abgeleitete α-Amylase enthält, mit einer dreidimensionalen, vernetzten, hochmolekularen Substanz in Kontakt zu bringen, welche erhalten wird durch

intermolekulares Vernetzen eines α-1,4-verknüpften Glucose-Homooligomers; durch intermolekulares und/oder intramolekulares Vernetzen von Glycogen oder Amylopektin; oder durch intermolekulares und/oder intramolekulares Vernetzen von Glycogen oder Amylopektin, das verzweigte Ketten, die zuvor zum Verkürzen der verzweigten Ketten mit einer Amylase behandelt wurden, aufweist; um dadurch eine oder beide der von einem Mikroorganismus abgeleiteten Glucoamylase und von einem Mikroorganismus abgeleiteten β-Amylase zu adsorbieren;

ein hydratisiertes Gel der dreidimensionalen, vernetzten, hochmolekularen Substanz, an die eine oder beide der von einem Mikroorganismus abgeleiteten Glucoamylase und von einem Mikroorganismus abgeleiteten α-Amylase adsorbiert wurden, aus der Lösung abzutrennen;

das hydratisierte Gel mit einer schwach alkalischen, wäßrigen, wenigstens 0,5 molaren Salzlösung in Kontakt zu bringen, um die adsorbierte Amylase zu desorbieren; und eine oder beide der von einem Mikroorganismus abgeleiteten Glucoamylase und von einem Mikroorganismus abgeleiteten β-Amylase wiederzugewinnen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die wäßrige Rohenzym- Lösung als Verunreinigung α-Amylase enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die dreidimensionale, vernetzte, hochmolekulare Substanz durch intermolekulares Vernetzen eines α-1,4-verknüpften Glucose-Homooligomers mit einem mittleren Polymerisationsgrad von 2 bis 6 und Glucoamylase, die an die hochmolekulare Substanz selektiv adsorbiert ist, erhalten wird.

4. Vorrichtung zur Isolierung und Reinigung von Amylasen umfassend:

einen zellfreien Kulturlösungs-Vorratsbehälter (13) zum Aufbewahren einer wäßrigen Rohenzym-Lösung (12), die eine oder beide von einem Mikroorganismus abgeleitete Glucoamylase und von einem Mikroorganismus abgeleitete β-Amylase enthält; und

einen mit dem Vorrats-Behälter (13) verbundenen Amylase- Adsorptions-Behälter (16), um die wäßrige Rohenzym-Lösung (12) mit einer vernetzten, hochmolekularen Substanz gemäß einem der Ansprüche 1 oder 3, in Kontakt zu bringen.

5. Vorrichtung zur Isolierung und Reinigung von Amylasen nach Anspruch 4, bei der eine Fest-Flüssig-Trennvorrichtung (21) zum Abtrennen der vernetzten, hochmolekularen Substanz, an die die Amylase adsorbiert ist, aus der Lösung mit dem Amylase- Adsorptionsbehälter (16) verbunden ist; und ein Desorptions- Behälter (30) zum Desorbieren der Amylase von der vernetzten, hochmolekularen Substanz, an die die Amylase adsorbiert ist, weiter mit der Fest-Flüssig-Trennvorrichtung (21) verbunden ist.

6. Vorrichtung zur Isolierung und Reinigung von Amylasen nach Anspruch 4 oder 5, bei der der Amylase-Adsorptionsbehälter (16) ein Chargen-Mischbett, ein Flüssigbett oder eine gepackte Schicht umfaßt.

7. Vorrichtung zur Isolierung und Reinigung von Amylasen nach einem der Ansprüche 4 bis 6, bei der ein Vorratsbehälter (19) zum Aufbewahren von Adsorbens für Amylase mit dem Amylase- Adsorptionsbehälter (16) verbunden ist, um das vernetzte Polyglucan oder das vernetzte Homooligomer aufzubewahren.

8. Vorrichtung zur Isolierung und Reinigung von Amylasen nach Anspruch 7, bei der der Vorratsbehälter (19) zum Aufbewahren von Adsorbens für Amylase mit einem Waschwasser-Vorratsbehälter (22), um Waschwasser zum Waschen der vernetzten, hochmolekularen Substanz aufzubewahren, ausgerüstet ist.

9. Vorrichtung zur Isolierung und Reinigung von Amylasen nach Anspruch 7, bei der der Vorratsbehälter (19) zum Aufbewahren von Adsorbens für Amylase mit einem Desorptionslösungs- Vorratsbehälter (27) zum Aufbewahren einer schwach alkalischen, wäßrigen Lösung oder einer wäßrigen, wenigstens 0,5 molaren Salzlösung oder einer wäßrigen, schwach alkalischen, ein Salz enthaltenden Lösung als Desorptionslösung zum Desorbieren der adsorbierten Amylasen, ausgerüstet ist.