DE4447531C2

DE4447531C2 - Immobilisierte Lipase

Info

Publication number: DE4447531C2
Application number: DE4447531A
Authority: DE
Inventors: Yoshihide Kawamura; Hiroaki Tanibe; Shigeyuki Imamura; Junko Harada
Original assignee: Fuji Spinning Co Ltd
Current assignee: Fuji Spinning Co Ltd
Priority date: 1993-09-27
Filing date: 1994-08-16
Publication date: 1996-08-29
Anticipated expiration: 2014-08-17

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine immobilisierte Lipase von ausgezeichneter katalytischer Aktivität bei der Hydrolyse, Synthese oder Austauschreaktion von Esterbindun gen, wobei das Enzym in einem organischen Lösungsmittel ver wendet wird. Im einzelnen, soll die vorliegende Erfindung eine immobilisierte Lipase vorsehen, welche bei organischen Synthesen über Austauschreaktionen einer Vielfalt von Estern asymmetrische Synthesen mit größerer Wirksamkeit durchzufüh ren vermag, als freie Lipase.

Es ist bekannt, daß vernetzte Produkte aus regeneriertem po rösen Chitosan in Teilchenform als Enzyme immobilisierende Träger eine breite Anwendung finden.

Die Vorteile von regeneriertem porösen Chitosan in Teilchen form umfassen, daß das Material natürlichen Ursprungs und somit weitgehend unschädlich ist, daß das Chitosan zur Ver wendung als Träger mit größeren, gleichmäßig verteilten Poren, die von der Oberfläche in das Innere des Trägers füh ren, versehen ist als Träger aus Kunstharz, so daß es eine größere Diffusion in das Substrat zuläßt, daß hochreaktive Aminogruppen, die zum Immobilisieren von Enzymen durch kova lente Bindung förderlich sind, innerhalb des Moleküls ange ordnet sind, und daß das Chitosan selbst eine größere Affi nität für die Enzyme aufweist, so daß deshalb eine größere Menge an Enzymen auf dem Chitosan immobilisierbar ist.

Träger aus regeneriertem und vernetztem Chitosan in Teilchenform, das regeneriertes Polysaccharide ist, weisen Vorteile auf, wonach zusätzlich zu den hydrophilen Eigenschaften und der Porosität der Produkte deren Stabilität in einem organischen Lösungsmittel sehr hoch ist. Die Produkte weisen jedoch Nachteile im Hinblick auf ihr Vermögen, eine enzymatische Aktivität zu entwickeln auf, da die Träger aus regeneriertem porösen Chitosan, das mit polyfunktionalen Reagentien vernetzt ist, stark hydrophil sind. Wenn solche Träger für Proteasen und Enzyme, die Zucker katalysieren und für die Gruppe von Enzymen, dessen Substrate hydrophobe Substanzen wie Lipide sind, verwendet werden, haben sie eine geringere wirksame Enzymaktivität, da Proteasen und Enzyme, die Zucker katalysieren, ein gewisses Maß an Hydrophobie für den Träger benötigen.

Bei der Immobilisierung der Gruppe von Enzymen, für die ein bestimmtes Ausmaß an hydrophoben Eigenschaften des immobili sierenden Trägers erforderlich ist, darunter die Gruppe von Enzymen, deren Substrat ein hydrophobes Lipid ist, sowie die Enzyme, die Zucker als Substrat benötigen, und Proteasen, weist das poröse teilchenförmige Chitosan, das mit 4,4′-Di phenylmethandiisocyanat oder Hexamethylendiisocyanat vernetzt ist, und das in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. Sho 63-54285 offenbart ist, in nachteiliger Weise eine ge ringe immobilisierte Aktivität und eine geringe wirksame En zymaktivität auf.

Neuerlich sind aktive Forschungsarbeiten der Anwendung von Chitosan bei enzymatischen organischen Synthesen gewidmet worden. Grund hierfür sind die hervorragenden charakteristi schen Eigenschaften von Enzymen, die darin bestehen, daß En zyme bei Umgebungstemperaturen und Umgebungsdrücken derart reaktiv sind, daß sogar thermisch instabile Substanzen mit Enzymen synthetisierbar sind, daß enzymatische Reaktionen in ener giesparender Weise ohne Verschmutzung der Umwelt ablaufen, und daß Enzyme eine gute Reaktionsspezifität wie eine Posi tionsspezifität und Substratspezifität aufweisen und asym metrische Synthesen auszuführen vermögen.

Enzymreaktionen insbesondere in organischen Lösungsmitteln ziehen Aufmerksamkeit auf sich im Hinblick darauf, daß Hydro lasen bei verschiedenen Synthese- und Übergangsreaktionen einsetzbar sind. Im Vergleich mit anderen Enzymen sind viele Lipidhydrolasen wie z. B. Lipasen gegenüber organischen Lösungsmit teln derart hochresistent, daß diese Lipasen Reaktionen zum Esteraustausch und zur Estersynthese mit hohem Wirkungsgrad begünstigten können. Hierzu sind weitreichende Forschungsar beiten ausgeführt worden. Weil jedoch die Herstellung und Reinigung von Lipasen mühsame Arbeiten erfordert, ist für die industrielle Anwendung von Lipasen die Entwicklung einer immobilisierten Lipase höherer Wirksamkeit zu einem wichtigen Thema geworden.

Eine Übersicht über die Immobilisierung von Lipasen ist im "Journal of American Oil Chemist′s Society", Band 67, Seiten 890 bis 910 (1990) zu finden, wo Beispiele repräsentativer Träger zum Immobilisieren von Lipasen angegeben sind, die anorganische Träger wie Diatomeenerde, Siliciumoxid, poröses Glas usw., verschiedene Kunstharze und Ionenaustauscher kunstharze und natürliche Polysaccharidträger wie Cellulose und vernetztes Dextrin, in die Ionenaustauschergruppen ein geführt worden sind einschließen. In dieser Literaturstelle wird berichtet, daß diese Träger in hydrophile Träger und hydrophobe Träger eingestuft werden, und daß eine auf einem hydrophoben Träger wie ein Kunstharz immobilisierte Lipase eine größere Aktivität beim Esteraustausch aufweist, als eine auf einem hydrophilen Träger immobilisierte Lipase.

Ein Beispiel einer auf einem Ionenaustauscherkunstharz immo bilisierten Lipase ist in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. Hei 4-287689 offenbart. Gemäß dieser Literaturstelle zeigt Lipase aus Pseudomonas, die auf Amberlite XAD-2 immo bilisiert ist, eine Aktivität bei der Esteraustauschreaktion zwischen einem Vinylacetatmonomer und alpha-D,L-Phenylethyl alkohol. Obwohl ein derartiges Ionenaustauscherkunstharz als Träger größere hydrophobe Eigenschaften aufweist, ist der Austauscher mit Nachteilen behaftet, wonach die restlichen Monomere löslich werden und das Harz aufquillt, wenn die im mobilisierte Lipase für eine Enzymreaktion in einem organi schen Lösungsmittel verwendet wird, obwohl eine derartige Verwendung einer immobilisierten Lipase von Wichtigkeit ist.

Als alternatives Verfahren zum Immobilisieren von Lipase ist von der Behandlung von Lipase mit einem Phospholipid oder einer Fettsäure berichtet worden. Zum Immobilisieren von Lipase sind Verfahren zum Behandeln eines immobilisierenden Trägers mit einem Phospholipid oder einer Fettsäure in der japani schen Offenlegungsschrift Nr. Sho 62-134090, Nr. Hei 1-153090 und Nr. Hei 4-335893 offenbart worden. Gemäß allen dieser Verfahren wird das Phospholipid oder die Fettsäure, die durch Adsorption oder hydrophobe Bindung auf den immobilisierenden Träger fixiert worden ist, während der Verwendung des Trägers desorbiert, was in nachteiliger Weise zu einer verringerten Wirksamkeit führt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Enzyme immobilisierenden Trägers eine immobilisierte Lipase vorzu sehen, die eine geeignete katalytische Aktivität bei der Hydrolyse, Synthese und Austauschreaktion von Esterbindungen in organischen Lösungsmitteln aufweist und bei der Esteraus tauschreaktion von erhöhter Wirksamkeit ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft eine immobilisierte Lipase mit einer Lipidhydrolyseaktivität von 0,01 bis 2 U/mg, bezogen auf das Trockengewicht der immobilisierten Lipase, die hergestellt wird durch Auflösen eines Chitosans niederen Molekulargewichtes in einer wäßrigen sauren Lösung, Einträu feln der Lösung in eine basische Lösung zum Erzeugen eines regenerierten porösen Chitosan in Teilchenform, Einführen des Glycidylethers (Glycidether) eines aliphati- schen Polyalkohols in das regenerierte poröse Chitosan in einem Verhältnis von 0,01 bis 0,4 mol pro 1 mol des Pyranoseringrestes des Chito sans, um ein vernetztes regeneriertes poröses Chitosan zu erhalten und Einführen einer höheren Fettsäure mit insgesamt 6 bis 20 Kohlenstoffatomen in einem Anteil von 0,05 bis 1 mol pro 1 mol des Pyranoseringrestes des Chitosans und das Einführen einer Lipase, wodurch die Lipase durch kovalente Bindung immobilisiert wird. Die Li pidhydrolyseaktivität wird hier wie nachstehend definiert. Unter Verwendung einer Acetonlösung als Substratlösung, die 300 mmol/l Monolaurin und 2% Wasser enthält, reagiert die Lipase mit der Lösung bei 37°C im Verlauf einer Zeitdauer von 15 Minuten, wie in den Beispielen dargestellt. Bei der Er zeugung von 1 µmol Glycerin im Verlauf von 1 Minute wird die Menge der Lipase als 1 U definiert.

Das regenerierte poröse Chitosan in Teilchenform ist nach dem Verfahren, das in der japanischen Patentveröf fentlichung Nr. Hei 1-16420 offenbart worden ist, wie folgt herstellbar. Das regenerierte Chitosan wird hergestellt durch Auflösen von Chitosan niederen Molekulargewichtes mit einem durchschnittlichen Molekulargewichtsbereich von 10.000 bis 230.000 in einer wäßrigen sauren Lösung und Einträufeln der Lösung in eine basische Lösung, wodurch poröses Chitosan verfestigt und regeniert wird.

Die Vernetzungsreaktion des regenierten porösen Chitosans in Teilchenform mit dem Glycidylether eines aliphatischen Poly alkohols und die nachfolgende Reaktion mit dem Säurehalogenid oder Säureanhydrid einer höheren Fettsäure wird wie nachste hend durchgeführt.

Verwendet wird regeneriertes poröses Chitosan in Teilchenform, das vor der nachstehend beschriebenen Reaktion zum Einführen einer höhe ren Fettsäure quervernetzt worden ist, weil nicht-vernetztes regeneriertes poröses Chitosan in Teilchenform sich möglicherweise in Fett säuren und anorganischen Säuren, die bei der Reaktion zum Einführen einer höheren Fettsäure er zeugt werden, lösen kann.

Wie in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. Hei 3-290188 offenbart worden ist, findet die Vernetzungsreaktion des re generierten porösen Chitosans in Teilchenform über eine Reak tion des Glycidylethers eines aliphatischen Polyalkohols statt.

Der Glycidylether eines aliphatischen Polyalkohols, der gemäß der vorliegenden Erfindung als Vernetzungsmittel in der Ver netzungsreaktion eingesetzt wird, umfaßt z. B. Ethylenglykol diglycidylether oder Polyethylenglykoldiglycidylether mit einer Anzahl aufeinanderfolgender Dimethylenethergruppen von 1 bis 22; Polypropylenglykoldiglycidylether mit einer Anzahl aufeinanderfolgender Polypropylenethergruppen von 1 bis 66; Glycerinpolyglycidylether mit 2 bis 3 Glycidylethergruppen und dergleichen. Beispiele von Polyethylengly koldiglycidylether beinhalten Ethylenglykoldiglycidylether, Diethy lenglykoldiglycidylether usw.; Beispiele von Polypropylenglykoldiglycidyl ether beinhalten Propylenglykoldiglycidylether, Dipropylenglykol diglycidylether usw.; Beispiele von Glycerinpolyglycidylether beinhalten Glycerindiglycidylether, Glycerin triglycidylether usw.

Die Reaktion zum Einführen des Glycidylethers eines alipha tischen Polyalkohols in das regenerierte poröse Chitosan in Teilchenform läuft unter leichtem Rühren ab, wenn die Konzentra tion des Glycidylethers des aliphatischen Polyalkohols 0,005 bis 2 Epoxidäquivalente/Liter, das Flüssigkeitsvolumen das 1- bis 5fache des Trägervolumens, die Reaktionstemperatur 20 bis 90°C und die Reaktionszeit 1 bis 24 Stunden beträgt.

Bei Verwendung des regenerierten porösen Chitosans in Teilchenform zur Herstellung eines Trägers zum Immobilisieren von Lipase wird der Glycicylether eines aliphatischen Polyalkohols vorzugsweise in einem Anteil von 0,01 bis 0,4 mol pro 1 mol des Pyranose ringrestes des regenerierten, porösen Chitosans während der Vernetzungsreaktion des regenerierten, porösen Chitosans eingeführt.

Wenn die Menge an eingeführtem Glycidylether unterhalb von 0,01 mol pro 1 mol des Pyranoseringrestes des Chitosans liegt, schrumpft die immobilisierte Lipase während der Ent wässerung und dem Trocknen der immobilisierten Lipase zur Verwendung in einem organischen Lösungsmittel in auffallender Weise, was zu einer geringeren Lipaseaktivität bei der Esteraustauschreaktion führt. Andererseits ist es schwierig und unpraktisch, die Menge an Ether auf mehr als 0,4 mol pro 1 mol des Pyranoseringrestes des Chitosans zu erhöhen und es wird in einem derartigem Fall eine nachteilige Abnahme der Aktivität beobachtet.

Nachfolgend wird das Säurehalogenid oder Säureanhydrid einer höheren Fettsäure in das regenerierte vernetzte poröse Chi tosan in Teilchenform durch kovalente Bindung eingeführt.

Das in dem regenerierten vernetzten porösen Chitosan in Teilchenform enthaltene Wasser wird in ausrei chender Weise mit einem polaren organischen Lösungsmittel entfernt. Derartige polare organische Lösungsmittel umfassen z. B. Dioxan, Ethanol, Isopropylalkohol, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid, Pyridin und dgl. Bei der nachfolgenden Einführung der höheren Fettsäure kann von einer Lösungsmit telmischung dieser polaren organischen Lösungsmittel mit einem nicht polaren organischen Lösungsmittel wie Hexan, Methylenchlorid, Chloroform usw. Gebrauch gemacht werden. Unter diesen Lösungsmitteln kann ein Lösungsmittel, das ge genüber dem Säureanhydrid oder Säurehalogenid einer führenden höheren Fettsäure inaktiv ist, in geeigneter Weise ausgewählt werden. Bei einer hochreaktiven Substanz wie einem Säurehalogenid wird vorzugsweise z. B. eines der Lösungsmittel Dioxan, Dimethylformamid und Dimethylacetamid oder eine Mi schung daraus verwendet.

Die gemäß der vorliegenden Erfindung einzusetzende höhere Fettsäure ist vorzugsweise eine gesättigte oder ungesättigte Fettsäure mit einer Anzahl von Kohlenstoffatomen, bei der der Kohlenwasserstoff hydrophob ist. Die Gesamtanzahl an Kohlen stoffatomen beträgt im allgemeinen 6 bis 20.

Das Säureanhydrid einer höheren Fettsäure oder das Säurehalogenid, z. B. ein Säurechlorid oder ein Säurebromid davon kann eingesetzt werden. Vorzugsweise besteht das Säureanhydrid z. B. aus Laurinsäureanhydrid, Myristinsäure anhydrid, Palmitinsäureanhydrid, Stearinsäureanhydrid, Öl säureanhydrid usw. Das Säurehalogenid besteht vorzugsweise z. B. aus Lauroylchlorid, Myristoylchlorid, Palmitoylchlorid, Stearoylchlorid, Oleylchlorid usw. Das Säurehalogenid wird aufgrund der höheren mit dem Säurehalogenid eingeführten Menge an Fettsäure dem Säureanhydrid vorgezogen.

Die Reaktion zum Einführen einer höheren Fettsäure verläuft unter leichtem Rühren ab, wenn die Konzentration der höheren Fettsäure 10 bis 1000 mmol/l, das Flüssigkeitsvolumen das 1- bis 5fache des Trägervolumens, die Reaktionstemperatur 10 bis 70°C und die Reaktionsdauer 1 bis 24 Stunden beträgt.

Wird ein Desoxidationsmittel zum Zwecke der Entfernung der während der Reaktion erzeugten Fettsäuren oder anorganischen Säuren zugegeben, können jegliche Desoxidationsmittel, die in dem Reaktionslösungsmittel löslich sind, ohne spezifische Einschränkung eingesetzt werden. Vorgezogen wird Triethylamin oder Pyridin.

Soll das vernetzte regenerierte poröse Chitosan als Träger zum Immobilisieren von Lipase verwendet werden, wird das vernetzte regenerierte poröse Chitosan vorzugsweise in der Weise modifiziert, daß eine höhere Fettsäure in einem Verhältnis von 0,5 bis 1 mol pro 1 mol des Pyranoseringrestes des Chitosans eingeführt wird.

Beträgt die Menge an eingeführter höherer Fettsäure weniger als 0,05 mol, dann sind die Lipidhydrolyseaktivität und die Esteraustauschaktivität stark verringert, was zu einer Ver ringerung des Verhältnisses von wirksamer Enzymaktivität zu immobilierter Aktivität bei der Lipidhydrolyse führt. In einem derartigen Fall ist das Verfahren zur Immobilisierung unzweckmäßig. Das Verhältnis wird aufgrund einer Erhöhung der eingeführten Menge an höherer Fettsäure verbessert, jedoch liegt, wenn die Menge an höherer Fettsäure oberhalb von 1 mol ist, das Verhältnis nahe bei der Sätti gung, so daß die Wirkung einer Erhöhung der eingeführten Menge nicht mehr wahrnehmbar ist.

Nachstehend erfolgen Erläuterungen bezüglich der immobili sierten Lipase, die durch Immobilisieren von Lipase auf dem in vorstehender Weise erhaltenen modifizierten, vernetzten, regenerierten porösen Chitosan hergestellt wird.

In der nachstehenden Beschreibung besteht der Träger aus dem modifizierten vernetzten regenerierten porösen Chitosan in Teilchenform, welches durch die Vernetzungsreaktion mit dem Glycidylether eines aliphati schen Polyalkohols und nachfolgender Reaktion zum Einführen des Säurehalogenids oder Säureanhydrids einer höheren Fett säure erhalten worden ist.

Auf dem hergestellten Träger wird die Lipase nachträglich immobilisiert. Als Lipase wird beispielsweise verwendet eine Lipase aus einem Mikroorganismus wie allgemein Rhizopus, Aspergillus, Mucor, Pseudomonas, Penicillium, Chromobacterium und Candida sowie Lipase tierischen Ursprungs, z. B. Pancre aslipase. Vorgezogen werden Lipasen insbesondere aus Chromo bacterium und Pseudomonas.

Die Lipase ist vorzugsweise von hoher Reinheit und liegt vorzugsweise in einer Menge von mehr als 50% des gesamten Proteins vor. Zum Immobilisieren der Lipase sollte die Reak tionstemperatur in einem Bereich liegen, in dem keine Inak tivierung auftritt, und z. B. 0 bis 60°C, vorzugsweise 5 bis 40°C betragen. Eine wäßrige Lipaselösung sollte auch in einem pH-Bereich liegen, in dem keine Inaktivierung des Enzyms auftritt, vorzugsweise im pH-Bereich von 3 bis 9.

Zur Verbesserung der Toleranz der immobilisierten Lipase ist eine kovalente Bindung des Enzyms an den Träger, erhalten unter Verwendung eines polyfunktionellen Vernetzungsmittels, von Bedeutung. Beispiele derartiger polyfunktioneller Ver netzungsmittel sind Glyoxal, Glutaraldeyhd, Malonaldehyd, Succinylaldehyd, Bis-Sulfosuccinimidylsuberat, Dimethylsub erimidat, Ethylenglykol-bis-Sulfosuccinimidylsuccinat, Di cyclohexylcarbodiimid, Hexamethylendiisocyanat und dgl. Die Mittel können in Mengen von 1,2 bis 2 mol pro 1 mol der Lipase eingesetzt werden.

Diese polyfunktionellen Vernetzungsmittel können anfänglich vor dem Immobilisieren der Lipase mit dem Träger reagieren oder es kann der Vernetzungsvorgang der Reaktion des Trägers mit der Lipase durch hydrophobe Bindung folgen. Bei der vor liegenden Erfindung wird das durch Immobilisieren von Lipase auf dem Träger erhaltene immobilisierte Enzym als "immobili sierte Lipase" bezeichnet.

Bei einer Messung der hydrolytischen Aktivität der Lipase in Wasser löst sich im allgemeinen das als Substrat dienende Li pidtriglycerid nicht in Wasser auf. Aus diesem Grund wird das Lipid durch kräftiges Bewegen einer Mischung aus Wasser und dem Lipid im Wasser suspendiert oder es wird durch Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels zum Dispergieren des Lipids das Lipid in Form einer Emulsion zubereitet. Wird die Reak tion der immobilisierten Lipase in Wasser ausgeführt, kann das in Form von Mikroteilchen vorliegende Lipid nicht mit der innerhalb des Trägers immobilisierten Lipase in Kontakt kom men, was zu einer größeren Abnahme des Verhältnisses von wirksamer Enzymaktivität zu immobilisierter Aktivität der Lipase führt. Folglich sollte das in einem organischen Lö sungsmittel gelöste Lipid als Indikator der Aktivität der immobilisierten Lipase verwendet werden.

Wird die immobilisierte Lipase in einem organischen Lösungs mittel eingesetzt, dann wird das in der immobilisierten Li pase enthaltene Wasser mit dem organischen Lösungsmittel entfernt, wonach die immobilisierte Lipase in Vakuum getrocknet wird. Die erhaltene trockene immobilisierte Lipase wird Reaktionen zur Esterhydrolyse, zum Esteraustausch und zur Estersynthese unterzogen. Der Wassergehalt der getrockneten immobilisierten Lipase sollte weniger als 5% betragen.

Wie die weiter unten beschriebenen Beispiele zeigen, wird die Lipidhydrolyseaktivität der trockenen immobilisierten Lipase wie nachstehend definiert. Unter Verwendung einer Acetonlö sung, die 300 mmol Monolaurin und 2% Wasser enthält, als Substratlösung reagiert die Lipase mit der Lösung bei 37°C während einer Zeitdauer von 15 Minuten, wie dies die nach stehend beschriebenen Beispiele zeigen. Wird 1 µmol Glycerin während einer Zeitdauer von 1 Minute hergestellt, dann wird die Menge an Lipase als 1 U bezeichnet.

Unter Zugrundelegung ihrer Aktivität bei der Hydrolyse von Lipid (Monolaurin) in Aceton als Bezugsgröße, wird für die Reaktionen einer Esterhydrolyse, eines Esteraustausches und einer Estersynthese eine immobilisierte Lipase mit einer Li pidhydrolyseaktivität von 0,01 bis 2 U/mg auf Trockenbasis der immobilisierten Lipase vorgezogen. Liegt die Aktivität der immobilisierten Lipase unterhalb von 0,01 U/mg, ist die immobilisierte Lipase weniger stabil und wird bei Lagerung in einem organischen Lösungsmittel inaktiv. Aus diesem Grund ist die nach einem Lagern gemessene Aktivität in bemerkenswerter Weise reduziert. Sogar wenn die Menge an immobilisierter Li pase zur Erzielung einer Aktivität oberhalb von 2 U/mg erhöht wird, ist die wirksame Aktivität geringer als diejenige, die aus der Menge an Lipase zu erwarten wäre; in anderen Worten, es wächst die Aktivität nicht relativ zu der wachsenden Menge an Lipase, was einen Verlust an Enzym verursacht. Eine spezifisch bevorzugte Lipidhy drolyseaktivität liegt im Bereich von 0,1 bis 1,5 U/mg.

Die auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltene immobi lisierte Lipase kann einer in Wasser suspendierten Substrat dispersion oder einer Pufferlösung oder einer Substratlösung in einem organischen Lösungsmittel zugegeben und unter Umrühren zwecks Vermischung verwendet werden. Ebenfalls können durch Hindurchführen einer Substratlösung durch ein Reaktionsgefäß wie eine Säule, die vorher mit der immobili sierten Lipase beschickt worden ist, die Reaktionen einer Esterhydrolyse, eines Esteraustausches und einer Estersyn these leicht durchgeführt werden.

Anhand der Figuren und der nachstehend angegebenen Beispiele wird die vorliegende Erfindung noch näher erläutert, jedoch ist die Erfindung nicht auf diesen Umfang eingeschränkt. Es zeigen:

Fig. 1 ein Spektrum eines im Beispiel 1 erhaltenen En zyme immobilisierenden Trägers nach dem Einführen einer höheren Fettsäure, aufgenommen mit einem Fourier-Transformations-Infrarotspektrometer;

Fig. 2 ein Spektrum des im Beispiel 2 erhaltenen Enzyme immobilisierenden Trägers nach dem Einführen ei ner höheren Fettsäure, aufgenommen mit einem Fou rier-Transformations-Infrarotspektrometer;

Fig. 3 ein Spektrum des im Beispiel 3 erhaltenen Enzyme immobilisierenden Trägers nach dem Einführen ei ner höheren Fettsäure, aufgenommen mit einem Fou rier-Transformations-Infrarotspektrometer;

Fig. 4 ein Spektrum des im Beispiel 4 erhaltenen Enzyme immobilisierenden Trägers nach dem Einführen ei ner höheren Fettsäure, aufgenommen mit einem Fou rier-Transformations-Infrarotspektrometer;

Fig. 5 die Ergebnisse einer Analyse des Chitosanträgers L′ mit einem Fourier-Transformations-Infrarot spektrometer;

Fig. 6 die Ergebnisse einer Analyse des Chitosanträgers M′ mit einem Fourier-Transformations-Infrarot spektrometer;

Fig. 7 die Ergebnisse einer Analyse des Chitosanträgers N′ mit einem Fourier-Transformations-Infrarot spektrometer;

Fig. 8 die Ergebnisse einer Analyse des Chitosanträgers O′ mit einem Fourier-Transformations-Infrarot spektrometer;

Fig. 9 die Ergebnisse einer Analyse des Chitosanträgers P′ mit einem Fourier-Transformations-Infrarot spektrometer;

Fig. 10 die Ergebnisse einer Analyse des Chitosanträgers Q′ mit einem Fourier-Transformations-Infrarot spektrometer;

Fig. 11 die Ergebnisse einer Analyse des Chitosanträgers R′ mit einem Fourier-Transformations-Infrarot spektrometer; und

Fig. 12 die Ergebnisse einer Analyse des Chitosanträgers S′ mit einem Fourier-Transformations-Infrarot spektrometer.

Unter Verwendung eines Fourier-Transformations-Infrarotspek trometers (nachstehend abgekürzt als "FT-IR") wurde gemäß der nachstehenden Verfahrensweise bestätigt, daß nach der Reak tion mit dem Glycidylether eines aliphatischen Polyalkohols eine höhere Fettsäure in das regenerierte, poröse teilchenförmige Chitosan einge führt worden war.

FT-IR-Analyse

Das teilchenförmige regenerierte poröse Chitosan, in das eine höhere Fettsäure eingeführt worden war, wurde getrocknet, gemahlen und mit KBr vermischt. Aufgrund der Vergrößerung der Absorp tion bei 2850 cm^-1, 2925 cm^-1 und 1750 cm^-1 wurde das Ein führen der höheren Fettsäure mit einem FT-IR vom Typ JIR-AQS 20 M/FX6160 (hergestellt von der Fa. JEOL Ltd.) bestätigt.

Die Aktivität einer Enzymlösung, die wirksame Aktivität im immobilisierten Zustand und die immobilisierte Enzymaktivität wurden gemäß den nachstehend angegebenen Verfahrensweisen gemessen.

Nachstehend erfolgen in Beispielen 1 bis 5 Erläuterungen bezüglich immobilisierter Lipase, die durch Immobilisierung von Lipase auf den Enzyme immobilisierenden Trägern aus re generiertem porösen teilchenförmigen Chitosan erhalten wurde. Unter Verwendung der im folgenden beschriebenen Prüfverfahren wurden verschiedene Messungen durchgeführt.

1. Verfahren zum Messen der Menge an Glycidylether eines aliphatischen Polyalkohols, die in dem regenerier tem porösen teilchenförmigen Chitosan eingeführt worden war

i) Nach der Reaktion des Glycidylethers eines aliphatischen Polyalkohols mit dem regenerierten porösen teil chenförmigen Chitosan wurde der Träger abfiltriert und die verbleibende Reaktionslösung wiedergewonnen.
ii) Dem Chitosanträger wurde reines Wasser in demselben Volumen wie das des Trägers zugegeben, und 20 Minuten bei Raumtemperatur umgerührt; es folgte ein Waschen. Der Chi tosanträger wurde abfiltriert und die verbleibende Lösung wurde wiedergewonnen. Diese Verfahrensweise wurde viermal wiederholt.
iii) Die verbleibenden wiedergewonnenen Reaktionslösungen wurden unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, bis das Wasser ausreichend bis zur Trockenheit durch Verdampfung entfernt war.
iv) Der verbleibende Glycidylether des aliphatischen Po lyalkohols wurde in Tetrahydrofuran zur HPLC-Analyse gelöst. Eine vor der Reaktion gleichzeitig hergestellte weitere wäß rige Lösung des Glycidylethers des aliphatischen Polyalko hols, der nicht umgesetzt wurde, wurde durch HPLC analysiert.
v) Die folgende Formel wird zur Bestimmung der Menge des eingeführten Ethers pro Pyranoseringrest verwendet.

Eingeführte Menge (mol) = (A - B)M/WPE(C × V) (6)

worin
A = Menge des Glycidylethers des eingesetzten aliphatischen Polyalkohols (g)
B = Verbleibende Menge des Glycidylethers des aliphatischen Polyalkohols nach der Reaktion (g)
WPE = Epoxidäquivalent des Glycidylethers des eingesetzten aliphatischen Polyalkohols
N = Anzahl der Epoxidgruppen im Molekül des Glycidylethers des aliphatischen Polyalkohols
V = Volumen des eingesetzten Trägers aus regeneriertem po rösen teilchenförmigen Chitosan (ml)
C = Trockengewicht von 1 ml des Trägers aus regeneriertem porösen teilchenförmigen Chitosan (g/ml)
M = Molekulargewicht des Pyranoseringrestes.

2. Verfahren zum Messen der Menge der in den Träger eingeführten höheren Fettsäure

i) Das Säureanhydrid oder Säurehalogenid einer höheren Fettsäure wurde dem vernetzten regenerierten po rösen teilchenförmigen Chitosan in Konzentrationen von 20, 50, 100, 150, 300 und 500 mmol/l zur Reaktion in einem Lö sungsmittel zugegeben. Dann wurde der Träger abfiltriert und die verbleibende Reaktionslösung wiedergewonnen.
ii) Dem vernetzten regenerierten porösen teil chenförmigen Chitosan wurde nach dem Einführen einer höheren Fettsäure das gleiche Lösungsmittel im gleichen Volumen zu gegeben wie bei der Reaktion, wonach bei Zimmertemperatur 20 Minuten umgerührt wurde; es folgte ein Waschen. Das vernetzte regenerierte poröse teilchenförmige Chito san wurde abfiltriert und die verbleibende Lösung wieder gewonnen. Diese Verfahrensweise wurde zweimal wiederholt.
iii) Nachfolgend wurde eine Reaktionslösung, die 1000 mmol/l Triethylamin enthielt, dem vernetzten regenerier ten porösen teilchenförmigen Chitosan im gleichen Volumen, wie das des Chitosan-Trägers, zugegeben und bei Zimmertemperatur 30 Minuten umgerührt; es folgte ein Waschen. Das vernetzte re generierte poröse teilchenförmige Chitosan wurde abfiltriert und die verbleibende Lösung wiedergewonnen.
iv) Dem Träger aus vernetztem regenerierten porösen teil chenförmigen Chitosan wurde das gleiche Lösungsmittel, wie bei der Reaktion verwendet, im gleichen Volumen wie das des Trägers zugegeben und bei Raumtemperatur 20 Minuten umge rührt; es folgte ein Waschen. Der Träger aus vernetztem re generierten porösen teilchenförmigen Chitosan wurde abfil triert und die verbleibende Lösung wiedergewonnen. Diese Verfahrensweise wurde viermal wiederholt.
v) Der höheren Fettsäure und dem Säureanhydrid oder Säure halogenid der höheren Fettsäure, die in den verbleibenden wiedergewonnenen Lösungen enthalten waren, wurde Tetrame thylammoniumhydroxid als Methylierungsmittel zugegeben. Das nichtumgesetzte Säureanhydrid oder Säurehalogenid der höheren Fettsäure wurde analysiert und durch thermolytische Gaschro matographie unter Verwendung des thermolytischen Systems, "Curie Point Pyrolyzer" (Japan Analytical Industry Co., Ltd.; Typ JHP-3) und eines Gaschromatographiesystems (hergestellt von Shimadzu, Co.; Typ GCMS-QP 2000 GF) gemessen.
vi) Durch Abziehen der Menge an nichtreagiertem Säureanhy drid oder Säurehalogenid der höheren Fettsäure von der eingesetzten Menge an Säureanhydrid oder Säurehalogenid kann die Menge an eingeführter höherer Fettsäure errechnet werden.

Durch die folgende Formel wird die eingeführte Menge an höherer Fettsäure pro Glucosaminrest berechnet.

Eingeführte Menge (mol) = (A-B)M/W(C × V) (7)

worin
A = Menge an Säureanhydrid oder Säurehalogenid der einge setzten höheren Fettsäure (g)
B = Verbleibende Menge an Säureanhydrid oder Säurehalogenid der höheren Fettsäure nach der Reaktion (g)
W = Molekulargewicht des Säureanhydrids oder Säurehalogenids der höheren Fettsäure
V = Volumen des eingesetzten Trägers aus regeneriertem porö sen teilchenförmigen Chitosan (ml)
C = Trockengewicht von 1 ml des Trägers aus regeneriertem porösen teilchenförmigen Chitosan (g/ml)
M = Molekulargewicht des Pyranoseringrestes.

vii) Der Träger wurde getrocknet und gemahlen.
viii) Dem gemahlenen Träger wurde Tetramethylammoniumhydroxid als Methylierungsmittel wie oben unter v) zugegeben, und die in die Probe eingeführte Menge an höherer Fettsäure wurde durch thermolytische Gaschromatographie bestimmt.

Aus den Ergebnissen wird die eingeführte Menge an höherer Fettsäure im Träger gemessen und durch thermolytische Gas chromatographie bestimmt.

3. Verfahren zur FT-IR-Analyse

Ein getrockneter und gemahlener Träger wurde mit KBr verdünnt und mit einem FT-IR (Typ JIR-DIAMOND 20, hergestellt von JEOL, Ltd.) analysiert. Durch die Vergrößerung der Absorption von Methylen bei 2850 cm^-1 und 2925 cm^-1 und der Absorption des Esters bei 1750 cm^-1 wird das Einführen von Stearoyl gruppen bestätigt.

4. Verfahren zum Herstellen immobilisierter Lipase

i) Ein Träger (1 g Naßgewicht) wurde als Probe genommen.
ii) Eine vorgegebene Konzentration an wäßriger Lipaselösung (1 ml), 1 mol/l Phosphatpufferlösung bei pH 7,5 (0,5 ml) und reines Wasser (23,5 ml) wurden zusammengemischt. Die sich ergebende Mischlösung wird als "Enzymlösung" bezeichnet, zu der der Träger zugegeben wurde.
iii) Damit Lipase auf dem Träger adsorbiert wird, wurde die Lösung bei 37°C eine Stunde umgerührt.
iv) Der Träger wurde abfiltriert und ausreichend in Wasser gewaschen.
v) Eine 1 mol/l Phosphatpufferlösung bei pH 7,5 (0,5 ml), reines Wasser (24,25 ml) und eine wäßrige 1%ige Glutaral dehydlösung (0,25 ml) wurden zusammengemischt und die sich ergebende Lösung wird als "immobilisierende Lösung" bezeich net.
vi) Der Träger wurde nach der Lipaseadsorption der immobi lisierenden Lösung zugegeben und bei 37°C eine Stunde umge rührt, um die Lipase auf den Träger durch kovalente Bindung zu immobilisieren.
vii) Der Träger wurde abfiltriert und dann ausreichend in Wasser gewaschen, um feuchte immobilisierte Lipase zu erhalten.
viii) Das in der immobilisierten Lipase enthaltene Wasser wird mit Aceton vollständig entfernt; es folgt ein Trocknen im Vakuum, um trockene immobilisierte Lipase mit einem Was sergehalt unter 5% zu erhalten.

5. Verfahren zum Messen der Lipidhydrolyseaktivität von freier Lipase

i) Eine Acetonlösung (4,9 ml), enthaltend 306 mmol/l Mono laurin, wurde hergestellt.
ii) Der Lösung wurde eine 2 mg/ml wäßrige Lipaselösung (0,1 ml) zur Reaktion bei 37°C während einer Zeitdauer von 15 Mi nuten zugegeben. (Die Konzentration an Monolaurin war dann 300 mmol/l bei einem Wassergehalt von 2%.)
iii) Nach der Reaktion wurden die Lösung (0,5 ml) und 0,2 N HCl (0,5 ml) zusammengemischt und bei 50°C 10 Minuten ste hengelassen, um die Lipase zu inaktivieren, wodurch eine hydrolysierte Lipidlösung erhalten wurde.
iv) Eine Prüflösung der folgenden Zusammensetzung wurde her gestellt
50 mmol/l Tris-HCl-Puffer (pH 7,5)
0,05% oberflächenaktives Mittel (Triton X-100, hergestellt bei Roam und Hers, Co., Ltd.)
1 mmol/l MgCl₂
1 mmol/l Adenosintriphosphat
1 U/ml Glycerinkinase
5 U/ml Glycerinphosphatoxidase
0,03% 4-Aminoantipyrin
0,03% 3, 5-Dimethoxy-N-ethyl-(2-hydroxy-3-sulfopropyl) anilin, Natriumsalz
4,5 U/ml Peroxidase.
v) Die Lösung wurde nach der Reaktion mit Lipase 11-fach mit 2%igem Triton X-100 verdünnt und nachfolgend wurde die verdünnte Lösung (20 µl) der Prüflösung (0,5 ml), wie in iv) beschrieben, zur Farbentwicklungsreaktion bei 37°C während einer Zeitdauer von 10 Minuten zugegeben.
vi) Nach Zugabe von 0,5%igem Natriumdodecylsulfat (1 ml) wurde die Absorption bei 600 nm gemessen.
vii) Die Lipidhydrolyseaktivität wurde durch die folgende Formel bestimmt: Lipidhydrolyseaktivität von freier Lipase (U/mg)
= Absorptionsmaß bei 600 nm × 1,52 × 11 × 5 × 2/ 7,2 × 0.02 × 15 × 0,2 (8).

6. Verfahren zum Messen der wirksamen Lipidhydrolyseaktivität von trockener immobilisierter Lipase

i) Einer Acetonlösung (5 ml), die 300 mmol/l Monolaurin und 2% Wasser enthielt, wurde trockene immobilisierte Lipase zur Reaktion unter Rühren bei 37°C während einer Zeitdauer von 15 Minuten zugegeben.
ii) Die immobilisierte Lipase wurde abfiltriert, um eine Lösung hydrolysierten Lipids zu erhalten.
iii) Durch das im Abschnitt v), oben beschriebene Verfahren zum Messen der Lipidhydrolyseaktivität von freier Lipase" wurde das Absorptionsmaß gemessen.
iv) Die Aktivität wurde durch die folgende Formel bestimmt: Wirksame Lipidhydrolyseaktivität von immobilisierter Lipase (U/mg)
= Absorptionsmaß bei 600 nm × 1,52 × 11 × 5/ 7,2 × 0,02 × 15 × 10 (9)

7. Verfahren zum Messen der wirksamen Esteraustauschaktivität von freier Lipase

i) Eine Hexanlösung, die 2,5% alpha-D,L-Phenylethylalkohol und 2% Vinylacetatmonomer enthielt, wurde hergestellt und als Substrat bezeichnet.
ii) Pulvrige Lipase in einer Gewichtsmenge entsprechend 5 U Hydrolyseaktivität wurde abgewogen und anschließend dem Substrat (2 ml) zugegeben und bei 25°C 3 Stunden umgerührt, um die Esteraustauschreaktion zu fördern.
iii) Nach der Vervollständigung der Reaktion wurde die immo bilisierte Lipase sofort abfiltriert und die Reaktionslösung auf -50°C zum Beenden der Reaktion abgekühlt.
iv) Unter Verwendung einer Säule für optische Auflösung (CHIRALCEL OB, hergestellt von Diacell Chemical Industries, Ltd.) wurde die Zusammensetzung der Reaktionslösung durch HPLC analysiert, um die Abnahme der Menge an alpha-L- Phenylethylalkohol (in µmol) zu bestimmen.
v) Wenn freie Lipase 1 µmol alpha-L-Phenylethylalkohol bei 25°C pro Minute acyliert, wird die Esteraustauschaktivität als 1 U bezeichnet. Die Aktivität wurde durch die folgende Formel bestimmt: Esteraustauschaktivität von freier Lipase (U/mg) = ΔQ/(3 × 60) W (10)worin
ΔQ = Abnahme der Menge an alpha-L-Phenylethylalkohol (in µmol).
W = für die Reaktion erforderliche freie Lipase (mg).

8. Verfahren zum Messen der Esteraustauschaktivität trockener immobilisierter Lipase

i) Nach dem Entfernen des in feuchter immobilisierter Li pase enthaltenen Wassers mit Aceton und dem Trocknen der Li pase in Vakuum zum Entfernen des Acetons wurde eine trockene immobilisierte Lipase erhalten.
ii) Eine Hexanlösung enthaltend 2,5% alpha-D,L-Phenyl ethylalkohol und 2% Vinylacetatmonomer wurde hergestellt, welche als Substrat bezeichnet wurde.
iii) Pulverförmige immobilisierte Lipase in einer Gewichts menge, welche einer Hydrolyseaktivität von 10 U entsprach, wurde ausgewogen und nachfolgend dem Substrat (2 ml) zugege ben, wonach die Mischung 3 Stunden bei 25°C umgerührt wurde, um die Esteraustauschreaktion zu fördern.
iv) Nach Beendigung der Reaktion wurde die immobilisierte Lipase sofort abfiltriert, um die Reaktion zu beenden.
v) Unter Verwendung einer eine optische Auflösung ermögli chenden Säule (CHIRALCEL OB, hergestellt von der Firma Dai cell Chemical Industries, Ltd.) wurde die Zusammensetzung der Reaktionslösung mittels einer HPLC analysiert, um die Verrin gerung der Menge an alpha-L-Phenylethylalkohol (in µmol) festzustellen.
vi) Bei einer Acylierung von 1 µmol alpha-L-Phenylethylalko hol bei 25°C pro Minute mit freier Lipase wird die Esteraus tauschaktivität als 1 U bezeichnet. Die Aktivität wird gemäß der folgenden Formel bestimmt: Wirksame Esteraustauschaktivität von trockener immobilisierter Lipase (U/mg) = ΔQ/(3 × 60) W (11)worin
ΔQ = die Verringerung der Menge an alpha-L-Phenylethylalko hol (in µmol).
W = Menge an trockener immobilisierter Lipase, die für die Reaktion benötigt wird (mg).

9. Verfahren zum Messen des Immobilisierungsverhältnisses von Lipase

i) Olivenöl (20 g; hergestellt von der Firma Kanto Chemical, Co., Inc.) wurde mit einem oberflächenaktiven Mittel (20 g; Adecatal S0-120, hergestellt von der Firma Asahi Denka Kogyo, K.K.) und reinem Wasser (60 ml) vermischt, und es wurde die entstehende Mischung als "Substratemulsion" bezeichnet.
ii) Dem Substrat (25 ml) wurde reines Wasser (10 ml) zugege ben und es wurde die Mischung 10 Minuten bei 37°C vorerhitzt.
iii) Dem Substrat wurde eine wäßrige Enzymlösung (0,1 ml) zum Immobilisieren der Enzyme in einer Reaktion bei 37°C während einer Zeitdauer von 5 Minuten zugegeben.
iv) Der Reaktionslösung wurde Ethanol (80 ml), das 50% Aceton enthielt, unter Rühren zugegeben, um die Enzymreaktion zu beenden.
v) Die Menge an NaOH-Lösung einer Konzentration von 50 mmol/l, die zur Titration der durch die Enzymreaktion freige setzten Fettsäure erforderlich war, wurde bestimmt.
vi) Es wurde ein Leerversuch gemäß dem vorstehend beschrie benen Verfahren durchgeführt, bei dem jedoch in dem Schritt iii) anstelle der Enzymlösung reines Wasser (0,1 ml) zugege ben wurde. Die zur Titration erforderliche Menge an NaOH-Lö sung wurde bestimmt.
vii) Die Aktivität der wäßrigen Lipaselösung bei der Zerset zung einer Lipidemulsion wurde vor dem Immobilisierungsvor gang (Aktivität A; U/ml der wäßrigen Lösung) anhand der fol genden Formel bestimmt: Lipasehydrolyseaktivität im Emulsionssystem = ΔV × 50 × f/5 × 0,1 (12)worin
ΔV = (die zur Titration der Enzymreaktionslösung erforder liche Menge an NaOH-Lösung) - (die zur Titration der Leer versuchslösung erforderliche Menge an NaOH-Lösung)
f = ein Faktor für die NaOH-Lösung einer Konzentration von 50 mmol/l.
viii) Die Aktivität des Filtrats bei der Zersetzung der Lipi demulsion nach dem Immobilisieren (Aktivität B; U/ml wäßriger Lösung) wurde in gleicher Weise wie unter vii) beschrieben bestimmt.
ix) Aus den in den vorstehenden Schritten vii) und viii) be stimmten Werten für A und B wurde das Immobilisierungsver hältnis C gemäß der nachstehenden Formel bestimmt: Immobilisierungsverhältnis C = (A-B)/A (13).

10. Verfahren zum Messen des Prozentsatzes der wirksamen Ak tivität

i) Das Gewicht der Lipase, die bei der im Abschnitt 4 be schriebenen Immobilisierung eingesetzt wurde, wurde als D (mg) definiert. Andererseits Weise wurde das Trockengewicht der immobilisierten Lipase als E (mg) definiert.
ii) Auf Grundlage der Lipidhydrolyseaktivität der freien Lipase (F U/mg), die nach dem vorstehend im Abschnitt 5 beschriebenen Verfahren bestimmt wurde, und der Lipidhy drolyseaktivität der immobilisierten Lipase (G U/mg), die gemäß dem vorstehend im Abschnitt 6 beschriebenen Verfahren bestimmt wurde, wurde der Prozentsatz der wirksamen Aktivität bei der Lipidhydrolyseaktivität gemäß der folgenden Formel berechnet: Prozentsatz der wirksamen Aktivität bei der Lipidhydrolyse aktivität des Lipids (Monolaurin)
= G/F × E/D × 1/C × 100 (14).
iii) Auf Grundlage der Esteraustauschaktivität der freien Lipase (H U/mg), die nach dem vorstehend im Abschnitt 7 be schriebenen Verfahren bestimmt wurde, und der Esteraus tauschaktivität der immobilisierten Lipase (1 U/mg), die ge mäß dem vorstehend im Abschnitt 8 beschriebenen Verfahren bestimmt wurde, wurde der Prozentsatz der wirksamen Ester austauschaktivität gemäß der folgenden Formel berechnet: Prozentsatz der wirksamen Esteraustauschaktivität = I/H × E/D × 1/C × 100 (15).

Beispiel 1

Bis zu 80% desacetyliertes Chitosan (1200 g) (das durch schnittliche Molekulargewicht pro Pyranoseringrest des Chitosans betrug 169,5) mit einem durchschnittlichen Moleku largewicht von 60.000 wurde in einer wäßrigen 3,5%igen Ace tatlösung (18.800 g) aufgelöst. Die wäßrige Lösung wurde in eine Verfestigungslösung eingeträufelt, die aus 7% Natrium hydroxid, 20% Ethanol und 73% Wasser bestand, um das Chito san als poröses Material in Teilchenform zu verfestigen und regenerieren, wonach dieses bis zu einem neutralen pH-Wert in Wasser gewaschen wurde, wodurch regeneriertes poröses teilchenförmiges Chitosan (10.000 ml im feuchten Zustand) mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 0,1 mm erhalten wurde. Es wurden 100 ml des auf diese Weise erhaltenen regenerierten porösen teilchenförmigen Chitosans getrocknet, wonach das Gewicht des trockenen Chitosans 5,086 g betrug. Die Menge des Pyranoseringrestes des Chitosans, die in 100 ml des regenerierten porösen teilchenförmigen Chitosans enthalten war, betrug 0,0300 mol.

Zu Mengen von 100 ml des regenerierten porösen teilchenför migen Chitosans wurden jeweils Wasser (100 ml) und Ethylen glycoldiglycidylether in den in Tabelle 2 angegebenen Mengen (entsprechend 87,13 Epoxidäquivalenten) zugegeben, um im Verlauf von 1 Stunde eine Vernetzungsreaktion bei 60°C durchzuführen. Nach Beendigung der Reaktion wurden die Pro dukte in Wasser gewaschen, um 6 Proben von rege neriertem porösen teilchenförmigen Chitosan, d. h. F, G, H, I, J und K zu ergeben. Jede der Proben wies ein Volumen von 100 ml auf. Die Menge an eingeführtem Ethylenglycoldi glycidylether wurde gemessen und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Das in jedem vernetzten regenerierten porösen teilchen förmigem Chitosan enthaltene Wasser wurde mit Dimethylaceta mid ausreichend entfernt. Zu 100 ml jeder der Proben aus ver netztem regenerierten porösen teilchenförmigen Chitosan wurde Dimethylformamid (100 ml), Stearoylchlorid (1,524 g) und Triethylamin (0,506 g) zugegeben. Die Konzentrationen des Stearoylchlorids und Triethylamins betrugen jeweils 50 mmol/liter.

Die erhaltenen Mischungen wurden 18 Stunden bei 25°C umge rührt. Nach dem Entfernen der verbleibenden Reaktionslösung wurden die Produkte mit Dimethylformamid gewaschen. Danach wurde das Dimethylformamid mit reinem Wasser entfernt, um die Träger F′, G′, H′, I′, J′ und K′ zu ergeben. Mittels der thermolytischen Gaschromatographie wurden die Mengen an ein geführter Stearinsäure pro Pyranoseringrest des Chitosans gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Träger
Eingeführte Menge an Stearinsäure pro Pyranoseringrest des Chitosans
F′\|0,13 mol
G′	0,19
H′	0,17
I′	0,19
J′	0,15
K′	0,14

Auf jedem der Träger wurde Lipase aus Chromobacterium biscosm (hergestellt von der Asahi Chemical Industry Co., Ltd., Typ T-01) unter Bedingungen immobilisiert, bei denen in dem vorstehend im Abschnitt 4 angegebenen Verfahren zum Herstel len von immobilisierter Lipase die Konzentration auf 20 mg/ml eingestellt war. Auf diese Weise wurden 6 Proben immobili sierter Lipase, d. h. F′′, G′′, H′′, I′′, J′′ und K′′ hergestellt. Tabelle 3 zeigt die immobilisierte Aktivität, die wirksame Aktivität und den Prozentsatz der wirksamen Aktivität des immobilisierten Enzyms gegenüber der immobilisierten Aktivi tät für diese Lipaseproben.

Wie aus diesen Ergebnissen deutlich hervorgeht, ist das Ver hältnis von wirksamer Aktivität des immobilisierten Enzyms zu immobilisierter Aktivität bei der Lipidhydrolyseaktivität und Esteraustauschaktivität sehr hoch, besonders wenn die Menge an eingeführtem Glycidylether des aliphatischen Polyalkohols 0,01 bis 0,4 mol pro 1 mol des Pyranoseringrestes des Chito santrägers beträgt. Hierbei wurde ein Schrumpfen der Probe F′′ bei Verwendung in organischen Lösungsmitteln beobachtet. So mit ist die Probe F′′ zum Gebrauch ungeeignet.

Beispiel 2

Dem regenerierten porösen teilchenförmigen Chitosan (800 ml) wurden in der gleichen Weise wie im Beispiel Wasser (800 ml) und Ethylenglycoldiglycidylether (4,184 g) zur Durchfüh rung einer Vernetzungsreaktion im Verlauf von 1 Stunde bei 60°C zugegeben. Nach der Beendigung der Reaktion wurde das Produkt in Wasser gewaschen, um ein vernetztes regeneriertes poröses teilchenförmiges Chitosan (800 ml) zu erhalten. Die Menge an eingeführtem Ethylenglycoldiglycidylether betrug 0,078 mol.

Das in dem vernetzten regenerierten porösen teilchenförmigen Chitosan enthaltene Wasser wurde mit Dimethylacetamid in aus reichender Weise entfernt. Zu 8 Proben des vernetzten regene rierten porösen teilchenförmigen Chitosans (100 ml), d. h. L, M, N, O, P, Q, R und S wurden Dimethylformamid (100 ml) und Stearoylchlorid und Triethylamin in den in Tabelle 4 angege benen Mengen (die jeweiligen Konzentrationen von Stearoyl chlorid und Triethylamin waren dann wie in Tabelle 4 angege ben) zugegeben, und es wurden die jeweiligen Mischungen 10 Stunden bei 40°C umgerührt.

Tabelle 4

Nach dem Entfernen der verbleibenden Reaktionslösung wurden die Produkte mit Dimethylformamid gewaschen, wonach das Dime thylacetamid mit reinem Wasser entfernt wurde, um die Träger L′, M′, N′, O′, P′, Q′, R′ und S′ zu ergeben. Die Ergebnisse der Analyse der einzelnen Träger mit einem FT-IR sind in Fig. 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 und 12 dargestellt. Es wurde be stätigt, daß die Absorption des Methylens bei 2849 cm^-1 und 2919 cm^-1 und die Absorption des Esters bei 1738 cm^-1 vergrö ßert worden war, was auf ein Einführen der Stearoylgruppe hinwies. Mittels thermolytischer Gaschromatographie wurde die eingeführte Menge an Stearinsäure pro 1 mol des Pyrano seringrestes des Chitosanträgers gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.

Träger
Eingeführte Menge an Stearinsäure pro Pyranoseringrest des Chitosans
L′\|0,03 mol
M′	0,05
N′	0,08
O′	0,18
P′	0,28
Q′	0,56
R′	0,93
S′	1,20

Auf jedem der Träger wurde Lipase aus Chromobacterium biscosm (hergestellt von der Firma Asahi Chemical Industry Co., Ltd., Typ T-01) in gleicher Weise wie im Beispiel 1 immobilisiert. Dann wurden immobilisierte Lipaseproben, d. h. L′′, M′′, N′′, O′′, P′′, Q′′, R′′ und S′′ hergestellt. Tabelle 6 zeigt die immobilisierte Aktivität, die wirksame Aktivität und den Prozentsatz der wirksamen Aktivität gegenüber der immo bilisierten Aktivität für diese Lipaseproben.

Wie aus den Ergebnissen deutlich hervorgeht, ist das Ver hältnis von wirksamer Aktivität des immobilisierten Enzyms zu immobilisierter Aktivität bei der Lipidhydrolyseaktivität und Esteraustauschaktivität sehr hoch, besonders wenn die Menge an eingeführter höherer Fettsäure 0,05 bis 1 mol zu 1 mol des Pyranoseringrestes des Chitosanträgers beträgt.

Beispiel 3

Zu 50 ml des vernetzten regenerierten porösen teilchenförmi gen Chitosans, welches gemäß der gleichen Verfahrensweise wie im Beispiel 1 erhalten worden war, wurde jeweils eine Lösung aus Octanoylchlorid (insgesamt C6), Lauroylchlorid (insgesamt C12), Stearoylchlorid (insgesamt C18) oder Palmitoylchlorid (insgesamt C16) zugegeben (deren Konzentrationen betrugen in gleicher Weise 37,5 mmol/liter; und deren Gewichte betrugen 0,610 g, 0,821 g, 1,136 g bzw. 1,031 g). Diese Substanzen wa ren einzeln in Dimethylacetamid oder Triethylamin (50 ml) ge löst. Die Reaktion wurde 15 Stunden bei 40°C durchgeführt. Nach dem Entfernen der verbleibenden Reaktionslösung durch Filtration wurden die Produkte mit Dimethylacetamid gewa schen, welches danach mit Wasser entfernt wurde. Auf diese Weise wurden die Träger T, U, V und W erhalten. Mittels thermolytischer Gaschromatographie wurde die Menge an einge führter höherer Fettsäure pro 1 mol des Pyranoseringrestes des Chitosanträgers gemessen und die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt.

Tabelle 7

Auf jedem der Träger wurde Lipase aus Chromobacterium biscosm (hergestellt von der Firma Asahi Chemical Industry Co., Ltd., Typ T-01) in gleicher Weise wie im Beispiel 1 immobilisiert, um immobilisierte Lipaseproben, d. h. T′, U′, V′ und W′ zu erhalten. Tabelle 8 zeigt die immobilisierte Aktivität, die wirksame Aktivität und den Prozentsatz der wirksamen Aktivi tät gegenüber der immobilisierten Aktivität.

Wie aus den Ergebnissen deutlich hervorgeht, war das Ver hältnis von wirksamer Aktivität zu immobilisierter Aktivität bei der Lipidhydrolyseaktivität und Esteraustauschaktivität sehr hoch, besonders wenn die Gesamtanzahl an Kohlenstoff atomen der höheren Fettsäure im Bereich von 6 bis 20 lag.

Beispiel 4

Es wurde ein Träger N′ in gleicher Weise wie im Beispiel 2 erhalten. Dem Träger (5 ml) wurden 195.000 U Lipase aus Pseudomonas (hergestellt von der Firma Asahi Chemical In dustry Co., Ltd., Typ T-18) zugegeben, die vorher in einer Phosphatpufferlösung einer Konzentration von 10 mmol/l bei einem pH-Wert von 7,5 (25 ml) aufgelöst worden war, wonach die Mischung 1 Stunde umgerührt wurde. Nach ausreichendem Waschen des Produktes mit einer Phosphatpufferlösung einer Konzentration von 10 mmol/l wurde Glutaraldehyd in einer Menge bis zu 0,2% zugegeben, wonach die Mischung 30 Minuten bei 37°C umgerührt wurde, um eine Vernetzung zu bewirken. Durch Filtration wurde die feuchte immobilisierte Lipase eingesammelt, wonach die immobilisierte Lipase gemäß der gleichen Verfahrensweise wie im Beispiel 1 im Trockenzustand erhalten wurde. Die immobilisierte Aktivität und die wirk same Aktivität bei der Lipidhydrolyse und dem Esteraustausch wurden gemessen; die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt.

Wie aus den Ergebnissen ersichtlich ist, ergab die Verwendung der Lipase aus Pseudomonas eine hervorragende Lipidhydroly seaktivität und Esteraustauschaktivität.

Beispiel 5

Durch Variieren der Konzentration der Lipase, wie dies in Ta belle 10 dargestellt ist, wurde Lipase aus Chromobacterium biscosm (hergestellt von der Firma Asahi Chemical Industry Co., Ltd.; Typ T-01) auf den erhaltenen Träger N′ (1 g Naßge wicht) gemäß der gleichen Verfahrensweise wie im Beispiel 2 immobilisiert. Gemäß der gleichen Verfahrensweise wie im Bei spiel 1 wurde trockene immobilisierte Lipase hergestellt und es wurden die wirksame Enzymaktivität und der Prozentsatz der wirksamen Aktivität gegenüber der immobilisierten Aktivität bei der Esteraustauschreaktion und der Lipidhydrolysereaktion (Monolaurin) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 ge zeigt. In zusätzlicher Weise wurden 50 mg der trockenen immo bilisierten Lipase ausgewogen und in n-Hexan (2 ml) suspen diert, wonach die Suspension 18 Stunden bei 37°C umgerührt wurde. Danach wurde die Suspension durch ein Glasfilter fil triert, um die immobilisierte Lipase wiederzugewinnen. Danach wurde die Esteraustauschaktivität der immobilisierten Lipase gemessen, woraus der Prozentsatz der nach der Suspension in Hexan verbleibenden Aktivität mittels der nachstehenden Formel berechnet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt.

Verbleibende Aktivität (%) = (Esteraustauschaktivität einer in Hexan suspendierten und bei 37°C behandelten Probe)/(Esteraustauschaktivität einer nicht in Hexan suspendierten Probe) × 100 (16)

Wie aus den Ergebnissen deutlich hervorgeht, betrug die Li pidhydrolyseaktivität mehr als 0,01 U/mg nach dem Lagern in einem organischen Lösungsmittel. Demgemäß war der Prozentsatz der verbleibenden Aktivität hoch. Insbesondere oberhalb von 0,1 U/mg wurde eine extrem stabile immobilisierte Lipase erhalten.

Mit größer werdender Menge an immobilisierter Lipase erhöhte sich die Aktivität. Insbesondere im Bereich von 0,01 bis 1,5 U/mg der Lipidhydrolyseaktivität erhöhte sich die Aktivität proportional zur Menge an immobilisierte Lipase, und der Prozentsatz der verbleibenden Aktivität war nahezu konstant. Betrug die Lipidhydrolyseaktivität mehr als 1,6 U/mg, war die Aktivität nicht proportional zur Menge an immobilisierter Li pase, jedoch nahm der Prozentsatz der verbleibenden Aktivität ab.

Wenn die Lipidhydrolyseaktivität vorzugsweise im Bereich von 0,01 bis 2 U/mg und mehr bevorzugt im Bereich 0,1 bis 1,5 U/mg liegt, sind die Aktivitätsausbeute und der Prozentsatz verbleibender Aktivität in ausgeprägter Weise hervorragend.

Wie aus der Beschreibung der Beispiele hervorgeht, soll bei der vorliegenden Erfindung ein Enzyme immobilisierender Trä ger vorgesehen werden, der hergestellt wird durch Auflösen von Chitosan niedrigen Molekulargewichtes in einer wäßrigen sauren Lösung und Einträufeln der Lösung in eine basische Lösung, um regeneriertes poröses teilchenförmiges Chitosan zu ergeben, Umsetzen des regenerierten porösen teilchenförmigen Chitosans mit dem Glycidylether (Glycidether) eines alipha tischen Polyalkohols und weiteres Umsetzen des erhaltenen Chitosans mit dem Säurehalogenid oder dem Säureanhydrid einer höheren Fettsäure in einem polaren Lösungsmittel. Der erfin dungsgemäße Enzyme immobilisierende Träger ergibt eine höhere immobilisierte Aktivität und wirksame Enzymaktivität bei Enzymen, die einen immobilisierenden Träger mit hydrophoben Eigenschaften benötigen.

Ferner weist die erfindungsgemäße immobilisierte Lipase eine Lipidhydrolyseaktivität von 0,01 bis 2 U/mg auf, bezogen auf das Trockengewicht der immobilisierten Lipase. Sie wird her gestellt durch Auflösen von Chitosan niederen Molekularge wichtes in einer wäßrigen sauren Lösung und Einträufeln der Lösung in eine basische Lösung, wodurch regeneriertes poröses Chitosan in Teilchenform hergestellt wird, Einführen des Glycidylethers (Glycidether) eines aliphatischen Polyalkohols in das teilchenförmige regenerierte poröse Chitosan in einer Menge von 0,01 bis 0,4 mol pro 1 mol des Pyranoseringrestes des Chitosans und auch durch Einführen des Säurehalogenids oder Säureanhydrids einer höheren Fettsäure mit insgesamt 6 bis 20 Kohlenstoff atomen in einer Menge von 0,05 bis 1 mol pro 1 mol des Pyranoseringrestes des Chitosans, wobei die Lipase über ko valente Bindung immobilisiert wird. Die immobilisierte Lipase mit einer Lipidhydrolyseaktivität von 0,01 bis 2 U/mg, bezo gen auf das Trockengewicht der immobilisierten Lipase, weist eine hervorragende katalytische Aktivität bei der Hydrolyse, Synthese oder Austauschreaktion von Esterbindungen in einem organischen Lösungsmittel auf. Insbesondere hat die immobi lisierte Lipase eine hervorragende Wirkung auf die organische Synthese über die Austauschreaktion einer Vielfalt von Estern, z. B. das Vermögen eine asymmetrische Synthese mit weit größerer Wirksamkeit als ein freies Lipaseenzym in Pul verform und übliche immobilisierte Lipase zu bewirken.

Claims

1. Immobilisierte Lipase mit einer Lipidhydrolyseaktivität von 0,01 bis 2 U/mg bezogen auf das Trockengewicht der immobilisierten Lipase, hergestellt durch Auflösen eines Chitosans niederen Molekulargewichts in einer wäßrigen sauren Lösung und Einträufeln der Lösung in eine basische Lösung zur Erzeugung von regeneriertem porösen teilchenförmigen Chitosan, Umsetzen eines Glycidylethers (Glycidether) eines aliphatischen Polyalkohols mit dem regenerierten porösen teilchenförmigen Chitosan in einem Anteil von 0,01 bis 0,4 mol Glycidylether (Glycidether) auf 1 mol des Pyranoseringrestes des Chitosans, um das regenerierte poröse Chitosan zu vernetzen, Umsetzen eines Säurehalogenids oder Säureanhydrids einer höheren Fettsäure mit insgesamt 6 bis 20 Kohlenstoffatomen in einem Anteil von 0,05 bis 1 mol Säurehalogenid oder Säureanhydrid auf 1 mol des Pyranose ringrestes des Chitosans, um einen Enzyme immobilisierenden Träger zu erhalten, und Umsetzen einer Lipase mit dem Enzyme immobilisierenden Träger zur kovalenten Bindung der Lipase an den Enzyme immobilisierenden Träger, um die immobilisierte Lipase unter Verwendung eines polyfunktionalen vernetzenden Agens zu erhalten.

2. Immobilisierte Lipase nach Anspruch 1, bei der der Glycidylether (Glycidether) Ethylenglykoldiglycidylether (Ethylenglykoldiglycidether) ist.

3. Immobilisierte Lipase nach Anspruch 1, bei der das Säurehalogenid einer höheren Fettsäure Stearoylchlorid ist.

4. Immobilisierte Lipase nach Anspruch 1, bei der das Säureanhydrid einer höheren Fettsäure Myristinsäureanhydrid ist.

5. Immobilisierte Lipase nach Anspruch 1, bei der das Säurehalogenid einer höheren Fettsäure Octanoylchlorid ist.

6. Immobilisierte Lipase nach Anspruch 1, bei der das Säurehalogenid einer höheren Fettsäure Lauroylchlorid ist.

7. Immobilisierte Lipase nach Anspruch 1, bei der das Säurehalogenid einer höheren Fettsäure Palmitoylchlorid ist.

8. Immobilisierte Lipase nach Anspruch 1, bei der das polyfunktionale vernetzende Agens Glutaraldehyd ist.