DD291094A5 - Analytisches element zur bestimmung von invertase - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein analytisches Element zur Bestimmung von Invertase, das zur UEberpruefung des Pasteurisationseffektes invertasehaltiger Getraenke in Brauereien, bei der Weinherstellung sowie in der Nahrungsmittelindustrie angewendet werden kann. Auf einem transparenten oder weisz eingefaerbten Traegermaterial (PETP, Celluloseacetat) oder einem saugfaehigen Material (Filterpapier, Vlies) ist eine quellfaehige Polymerschicht angeordnet, die Saccharose, Glucoseoxidase, Peroxidase und eine zur Oxidation faehige Farbstoffvorstufe und gegebenenfalls Mutarotase als Nachweissystem enthaelt. Das Element kann auch zweischichtig aufgebaut sein, wobei Saccharose und gegebenenfalls Mutarotase als zweite Schicht aufgebracht sind. Durch Tauchung in ein invertasehaltiges Pruefmedium wird eine in Abhaengigkeit von der Invertaseaktivitaet proportionale Faerbung erzeugt, die visuell oder fotometrisch vermessen werden kann.{Pasteurisierungseffekt; invertasehaltiges Getraenk; Traegermaterial; quellfaehige Polymerschicht; Nachweissystem; Saccharose, Glucoseoxidase, Peroxidase; zur Oxidation faehige Farbstoffvorstufe}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein analytisches Element zur Bestimmung von Invortaso. Die Erfindung wird insbesondere in der Getränkeindustrie zur Kontrollo des Pasteurisationseffektes in Brauereien, bei der Weinherstellung sowie in der Nahrungsmittelindustrie und Biochemie angewendet.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Der allgemeine analytische Nachweis von Invertase erfolgt als Küvettentest indirekt durch Spaltung von Saccharose in Gegenwart von Invertase. Die freigesetzte Glucose wird durch Glucoseoxidase/Peroxidase und o-Dianisidin bestimmt (Dahlquist, A., Anal.Biochem. [1968] 99-107)

Zur Kontrolle der Pasteurisatipn von Getränkon, insbusondere bei der Bierherstellung, wird ei Anwesenheit der vorwiegend durch die Hefe in das Getränk gelangten Invertase zur Bestimmung ausgenutzt. Da die Invertase bei der vorgeschriebenen Pasteurisationstemperatur von > 60⁰C bei entsprechender Einwirkzeit sehr schnell inaktiviert wird, ist sie in pasteurisierten Getränken nicht mehr nachweisbar. Bei unvollständig oder nichtpasteurisiorten Getränken gelingt der indirekte Nachweis dahingehend, daß dem Getränk Saccharose zugesetzt wird, die bei Anwesenheit von Invertase in Glucose und Fructose aufgespalten wird.

Diese reduzierenden Zucker worden

a) unter Zugabe von Fehlingscher Lösung, oder

b) polarimetrisch nachgewiesen.

Bei ausreichender Pasteurisation verläuft der Nachweis reduzierender Zucker bei Saccharosezusatz negativ.

Alle diese Methoden sind sogenannte Küvettentests' und nur in einem gut ausgerüsteten Labor mit einem Spektralcolorimeter bzw. Polarimeter durchführbar. Außerdem erfordert die Polarimetrie klare Lösungen.

Eine schnelle, unkomplizierte, keine Vorbereitungen benötigende Analyse vor Ort bei der Überwachung von Produktionsprozessen, oder als schnelle Entscheidungshilfe bei gleichzeitiger Dokumentation bzw. Archivierbarkeit des Analysenergebnisses ist nicht möglich.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Überprüfung des Pasteurisationseffektes invertasehaltiger Getränke ohne großen materielltechnischen Aufwand in kürzester Zeit. _c

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch Schaffung eines analytischen Elementes eine schnelle, sichere und bequem handhabbare Methode zur Bestimmung der Invertaseaktivität zu ermöglichen. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das analytische Element aus einem Trägermaterial und mindestens einer quellfähigen Polymerschicht besteht und daß es Saccharose, Glucoseoxidase, Peroxidase und eine zur Oxidation fähige Farbstoffvorstufe enthält. Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen analytischen Elementes besteht darin, daß bei Tauchung des Elementes in ein invertasehaltiges Prüfmedium eine in Abhängigkeit von der Invertaseaktivität proportionale Färbung des analytischen Elementes erzeugt wird, die visuell gegen einen Farbkomparator oder fotometrisch im Durchlicht oder im Reflexionslicht entsprechend transparentem oder weißem Trägermaterial vermessen werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht das analytische Element zur Bestimmung von Invertase aus einem Trägermaterial mit einer unmittelbar darauf angeordneten Polymerschicht, die gleichzeitig Saccharose, Glucoseoxidase, Peroxidase und die zur Oxidation fähige Farbstoffvorstufe enthält. Gegebenenfalls kann zusätzlich Mutarotase enthalten sein.

Als Trägermaterial wird eine mit einer Haftschicht versohene transparente Folio, vorzugsweise aus Polyethylenterephthalat oder Celluloseacetat, verwendet. Die Trägeriolie kann zur Auswertung des analytischen Elementes im Roflexionslicht in Masse weiß eingefärbt oder mit einer bekannten Beschichtungstochnologie mit TiO], BaSO₄ oder einem anderen geeignoton Pigment zur Erzeugung eines hohen Weißgrades einseitig oder beidseitig beschichtet werdon.

Auf die transparente oder weiße Folie wird eine Schicht eines quellfähigen und filmbildondon Polymers, vorzugsweise Gelatine oder Gelatine in Kombination mit Polyvinylalkohol, Polyacrylamid, Agarose aufgetragen, die das Nachwoissystem Saccharose, Glucoseoxidase (GOD), Peroxidase (POD) und die zur Oxidation fähige Farbstoffvorstufo enthält. Zur Erzielung einer ausreichenden Wischfestigkeit dos analytischen Elomentos enthält dio Schicht ein übliches Härtungsmittel für Gelatine, z. B.

Cr³*-acotat.

Din Saccharosekonzontration richtet sich nach dem Anwendungszweck des analytischen Elementes. Zur Untersuchung des Pasteurlsationseffektes invertasehaltigor Getränke kann sie im Bereich von 0,05 bis 1 mmol Saccharose/g Bindemittel liegen. Die Schichtdicke der quellfähigen Polymerschicht kann zur Erzielung oiner ausreichenden Farbdichte bei zeitlich vertretbaren Diffusionszeiten des invertasohaltigen Getränks im Bereich von 1-20Mm, voizugsweise 5-10μ, liogen. Als zur Oxidation fähige Farbstoffvorstufen enthält das erfindungsgemäße analytische Element z. B. semichinonbildonde Benzidinderivate oder p-Pheny lendiaminderivate bei gleichzeitiger Anwesenheit von in der fotografischen Industrie als Farbkuppler verwendeten Leukofarbstoffen.

Pro g Bindemittel werdon als Glucoseoxidase 1000-3000 Units und als Peroxidase 250-750 Units eingesetzt.

Das Verhältnis GOD/Mutarotaso, die gegebenenfalls der Polymerschicht zur Verkürzung der Reaktionszeit zugesetzt wird, boträgt 1:1 (Units/Units).

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung läßt sich das analytische Element auch zweischichtig aufbauen, Indem das an sich bekdnnto Glucosbnachweissystom unmittelbar auf dem Trägermaterial als unterste Polymerschicht angeordnet ist und die Saccharose und gegebenenfalls Mutarotase enthaltende Schicht auf dieser Glucosenachweisschicht aufgetragen ist.

In einer weiteren Ausführungsform dos orfindungsyomäßon analytischen Elementes läßt sich als Trägermaterial auch ein saugfähiges Material wie Vlies oder Filterpapier verwonden. Hierbei wird das Glucosenachweissystem zusammen mit Saccharose und einer zur Oxidation fähigen Farbstoffvorstufe durch Tauchung oder mittels eines Anspülgießers in einem Arbeitsgang aufgetragen. Nach anschließender Trocknung ist das Material gebrauchsfähig.

Das beschichtete analytische Element (auf Basis Folie oder Vlies) wird in Rollen geschnitten und mittels Klebeband mit einer 40mm breiton Rolle aus beispielsweise PETP-Folie, die als Griffleiste dient, verbunden. Durch Schneiden von breiten Streifen einheitlicher Breite aus dieser Verbundrolle, erhält man einheitlich konfektionierte Teststreifen, die aus dem eigentlichen analytischen Element und einer Griffleiste bestehen und eine bequeme Handhabung bei der Analysendurchführung gewährleisten.

Bei der Überprüfung des Pasteurisationseffektes, beispielsweise bei der Bierherstellung, wird dei Teststreifen in ein beliebiges Biervolumen getaucht. Durch die bei ungenügender Pasteurisation im Bier noch vorhandene Invertase erfolgt nach kurzem Eindiffundieren der Invertase in die Polymerschicht die Spaltung der Saccharose in Glucose und Fructose, Konvorsion dor zuerst entstehenden α-Glucose zum natürlichen Verhältnis von α- und ß-Glucose mit anschließender Farbbildung nach ca. 10 Minuten durch das an sich bekannte Glucosenachweissystem. Bei ausreichender Pasteurisierung bleibt diese Farbstoffbildung aus.

Das erfindungsgemäße analytische Element gestattet auch ein quantitatives Arbeiten. Dabei wird der Teststreifen mit einer genau einzuhaltenden Zeitspanne (vorzugsweise 30 oder 60 Sekunden) in das invertasehaltige Prüfmedium getaucht. Nach Entfernen der anhaftenden überschüssigen Lösung wird nach 10 Minuten eine Färbung beobachtet, die nach maximal 15 Minuten abgeschlossen ist.

Mit dem erfindungsgemäßen analytischen Element, das die Nachweissubstanzen in nur einer quellfähigen Polymerschicht enthält, wird die Analysenzeit in vorteilhafter Weise unter 10 Minuten gesenkt, da die Diffusionswege für alle auftretenden Zwischenprodukte kurz sind.

Eine weitere Vorkürzung der Reaktionszeit wird durch die Anwesenheit von Mutarotase erreicht. Bei einem einschichtigen Element beträgt die Reaktionszeit zur Ausbildung einer konstanten Farbdichte nur noch 8min, bei Verwendung von Filterpapier oder Vlies nur noch 6min.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen analytischen Elementes besteht darin, daß durch die Einstellung einer definierten Quellkinetik des polymeren Bindemittels mit bekannten organischen oder anorganischen Härtungsmitteln in einem definierten Zeitraum nur ein ganz bestimmtes Flüssigkeitsvolumen in die Polymerschicht/en eindiffundiert, eine Dosierung des Probevolumens ist deshalb nicht erforderlich.

Das erfindungsgemäße analytische Element ermöglicht es, in einfacher Weise ohne apparativen Aufwand und in kurzer Zeit durch eine visuelle Auswertung des entstandenen Farbstoffs gegen eine Vergleichsskala oder durch eine fotometrif ehe Auswertung des sich entsprechend der Invertasekonzentration der Probelösung äquivalent bildenden Farbstoffs den Invertasegehalt zu ermitteln. Vorteilhaft ist auch die Archivierbarkeit der entsprechend der Invertasekonzentration gefärbten Teststreifen, beispielsweise bei Reklamationen.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

Einer 7%igen Gelatinelösung werden bei 40°C 6g/l o-Tolidindihydrochlorid, 10ml Ethylenglykol/1,10g Saccharose p.a./l Glucoseoxidase (100000 Units/I), Peroxidase (20000 Units/I) zugesetzt. Als Härtungsmittel wird Cr^-acetat in einer Konzentration von 2g/l verwendet. Die Lösung wird auf ein Trägermaterial, bestehend aus einer mit einer Haftschicht versehenen Celluloseacetatfolie (130μιη) aufgetragen. Nach dem Erstarren und Trocknen der Schicht wird das Material bei 80% rel. Feuchte und einer Temperatur von 25⁰C bis zur Einstellung einer konstanten Wasseraufnahme konditioniert und danach bei 30-35% rel. Feuchte und 25⁰C nochmals 2h getrocknet. Das analytische Element wird nun zeitlich definiert (1 min) mit der invertasehaltigen Probelösung in Kontakt gebracht (Tauchung oder Betropfen). Nach einer Reaktionszeit von 10min nach der Tauchung wird die bei Anwesenheit von Invertase entstandene blaugrüne Färbung (Xrnax = 610pm) des analytischen Elementes visuell oder spektral fotometrisch ausgewertet.

Beispiel 2.

Einer 10%ig3n wäßrigen Lösung von Polyvinylalkohol (K = 45) werden bei 40°C o-Tolidindihydrochlorid (6g/l), Saccharose p.a. 10g/l, Glucoseoxidase dOOOOOUnits/l) Peroxidase (20000Units/l) zugesetzt und der pH-Wert auf 5,0 eingestellt. Diese Lösung wird durch einen Tränkungsvorgang auf ein saugfähiges, weißes Material (z. B. Filterpapier FN 7) aufgetragen. Nach Trocknung des beschichteten Papiers wird durch Auftropfen der invortasehaltigen Probeläsung oder Tauchung des Testpapiers (1 min) in die Probelösung an Hand dor auftretenden blaugrünen Färbung die Konzentration an Invertase nach 8 min Reaktionszeit visuell oder metrisch im Roflexionslicht bestimmt.

Beispiel 3 Wie Beispiel 1, jedoch enthält die Lösung zusätzlich noch das Enzym Mntarotase (Verhältnis GOD/Mutarotase 1:1), wobei die Lösung auf eine in Masse mit TIO₂ weiß eingefärbte Polyethylenterephtalat-Folie (100μίτ>) als Unterlage beschichtet wird, die

vorher zusätzlich mii einer TIO₂-haltigen Rückschicht (5 pm) versehen wurde. Der Teststreifen ist bereits nach 8minauswertbar.

Beispiel 4

Einer 4,5%igen Gelatinelösung werden 2,7g/l 1-(3'-Sulfo-4'-phenoxy)-phenyl-3-stearoylamino-pyrezolon-(5), 2,4g/l N-butyl-N(4sulfobutyl)-1,4-phenylen-diamln, 1,2g/l Na₂SO₃,1,3g/l Cr³⁺-acetat/l, Glucoseoxidase (100000 μ/Ι), Peroxidase (20000μ/Ι) zugegeben. Nach Anträgen dieser Lösung auf eine präparierte Polyethylenterephtalatfolie und anschließender Trocknung wird in einem zweiten Schichtantrag bei 4O⁰C eine Ansatzlösung folgender Zusammensetzung aufgetragen: Gelatinelösung (4,5%ig), Saccharose p. a. (5g/l), 1,3g Cr'*-acetat/l. Nach Trocknung des Gesamtschichtverbandes und Konditionierung (80% rel. Feuchte, 25⁰C), zur Einstellung eines definierten Wasseraufnahmewertes, wird nach Auftropfen der Probelösung durch visuelle oder metrische Auswertung des sich entsprechend der Invertasekonzentration der Probelösung äquivalent bildend* » Farbstoffs (\max = 564pm) der Invertasegehalt des Prüfmediums ermittelt.

Beispiels Die unterschiedliche Ausgestaltung des erfindungsgemäßen analytischen Elements hat Einfluß auf die Analysedauer und kann

je nach Einsatzzweck vorteilhaft angewendet werden (Tab. 1)

Analytisches Element	Analysenzeit	Archivierbarkeit	Probenvorbereitung
		des Testfeldes
a) zweischichtig	15min	> 6 Monate	keine
b) einschichtig	10min	> 6 Monate	keine
c) einschichtig mit Mutarotase	8min	> 6 Monate
d) einschichtig auf Basis
Filterpapier und Mutarotase	6min	1Tag	keine
e) Küvettentest	1h	-	• Ansatz Nachweis
			reagenzien
			• Dosierung Probevolumen
			ο Dosierung Saccha-
			rosekonz.

Claims (4)

1. Analytisches Element zur Bestimmung von Invertase, gekennzeichnet dadurch, daß es aus einem Trägermaterial und mindestens einer quellfähigen Polymerschicht bosteht und daß es Saccharose, Glucoseoxidase, Peroxidase und eine zur Oxidation fähige Farbstoffvorstufe enthält.

2. Analytisches Element nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die quellfähige Polymerschicht unmittelbar auf dem Trägermaterial angeordnet ist und gleichzeitig Saccharose, Glucoseoxidase, Peroxidase und die zur Oxidation fähige Farbstoffvorstufe enthält.

3. Analytisches Element nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die unmittelbar auf dem Trägermaterial angeordnete Polymerschicht Glucoseoxidase, Peroxidase und die zur Oxidation fähige Farbstoffvorstufe und eine dazu benachbarte Polymerschicht Saccharose enthält.

4. Analytisches Element nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß die quellfähigen Polymerschichten zusätzlich Mutarotase enthalten.