DE2951221C2

DE2951221C2 - Testmittel und Testvorrichtung zur Bestimmung von Glucose in einer Körperflüssigkeit und deren Verwendung bei der Bestimmung von Glucose

Info

Publication number: DE2951221C2
Application number: DE2951221A
Authority: DE
Inventors: Bert South Bend Ind. Walter
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1979-02-23
Filing date: 1979-12-19
Publication date: 1987-03-12
Also published as: GB2045427B; JPS55120798A; DE2951221A1; IL58921A; FR2449727A1; NL7909224A; SE8001063L; CA1131107A; NO800497L; AU5580780A; AU521192B2; US4273868A; IT8047555A0; JPS5729160B2; DK78980A; FR2449727B1; GB2045427A; AT368190B; IT1126878B; LU82187A1

Description

Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Diagnosetests und insbesondere Tests, die zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Glucose geeignet sind, und wobei Glucose in ein Peroxid überführt wird.
Glucoseoxidase wandelt Glucose enzymatisch in Gluconsäure und Wasserstoffperoxid um. Das dabei gebildete Wasserstoffperoxid kann durch eine peroxidativ aktive Substanz in Gegenwart eines Indikatorsystems zu H₂O reduziert werden, wobei das Indikatorsystem oxidiert wird und eine Anzeige wie eine Farbänderung liefert. Der chromogene Indikator O-Tolidin ist seit geraumer Zeit in Glucosetestsystemen verwendet worden, aber man erhält dabei Ergebnisse, bei denen der oxidierte Indikator durch störende Substanzen, wie Ascorbinsäure, reduziert wird. Außerdem ist die Sicherheit von O-Tolidin fraglich.
Aus den zur DE-OS 24 60 903 korrespondierenden GB-PS 14 64 359 und 14 64 360 ist die Verwendung von 3,3&min;,5,5&min;- Tetramethylbenzidin und ähnlichen Verbindungen und die Anwendung dieser Verbindungen zum Nachweis und zum Bestimmen von Wasserstoffperoxid oder von Bestandteilen, die unter Bildung von Peroxiden reagieren, bekannt. Die Konzentration der dort angegebenen Benzidin-Derivate ist dort ganz unterschiedlich, aber im allgemeinen werden nicht mehr als etwa 6 mg/ml der Imprägnierlösung verwendet.
Bei der Verwendung von Benzidin-Derivaten, in den in den GB-PS angegebenen Konzentrationen findet eine verhältnismäßig langsame Bildung einer Farbe statt, oder man erhält Farben, die über einen gewissen Zeitraum nicht stabil sind. In letzterem Fall neigt die entwickelte Farbe beim Stehen dazu, zu verblassen oder sich zu verändern, und die Ablesungen sind deshalb mit einem Fehler behaftet und es ist sehr schwer oder unmöglich, die Ablesung mit untrainiertem Personal durchzuführen.
In der Z. Anal. Chem. 252, 224-228 (1970) wird ein Testsystem zur Bestimmung von Glucose unter Verwendung von ABTS als Indikator beschrieben, wobei aber unter optimalen Bedingungen erst nach ca. 30 Minuten eine weitgehend stabile Färbung erreicht wird. Messungen zu einem früheren Zeitpunkt sind nicht möglich, da sie zu falschen Resultaten führen.
Es ist ein Hauptziel der Erfindung, einen verbesserten Test für die Glucosebestimmung zu zeigen. Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung einen verbesserten Glucosetest zu zeigen, unter Verwendung von Materialien, die sicher gehandhabt werden können. Verbunden mit dieser Aufgabe ist ein Test für die Bestimmung von Glucose, bei welcher die gebildete Farbe über einen langen Zeitraum stabil bleibt.
Zur Lösung der vorstehenden Aufgabe dient erfindungsgemäß ein neues Testmittel aus Glucoseoxidase, einer peroxidativ aktiven Substanz und einem 3,3&min;,5,5&min;-Tetraalkylbenzidin- Indikator, wobei der letztere in einer ausreichenden Menge vorliegt, um bei Berührung des Testmittels mit einer vorbestimmten Menge einer glucosehaltigen Probe ausreichend schnell ein stabiles gefärbtes Reaktionsprodukt zu liefern.
Fig. 1 ist eine grafische Darstellung der in Tabelle I enthaltenen Daten bei Verwendung einer Glucosetestvorrichtung, die unter Anwendung einer Imprägnierlösung gemäß Formel (I) in Beispiel 1 hergestellt worden war, wobei man diese Kurve erhielt, indem man K/S, was nachfolgend noch erläutert wird, gegen die Glucosekonzentration aufträgt.
Fig. 2 ist eine grafische Darstellung der in Tabelle I enthaltenen Daten bei Verwendung einer Glucosetestvorrichtung, die unter Anwendung einer Imprägnierlösung gemäß Formel (II) in Beispiel 1 hergestellt worden war, wobei man die Kurve erhält, indem man K/S gegen die Glucosekonzentration aufträgt.
Fig. 3 ist eine grafische Darstellung der in Tabelle I enthaltenen Daten bei Verwendung einer Glucosetestvorrichtung, die unter Anwendung einer Imprägnierlösung gemäß Formel (III) in Beispiel 1 hergestellt worden war, wobei man die Kurve erhält, indem man K/S gegen die Glucosekonzentration aufträgt.
Fig. 4 ist eine grafische Darstellung der in Tabelle I enthaltenen Daten bei Verwendung einer Glucosetestvorrichtung, die unter Anwendung einer Imprägnierlösung gemäß Formel (IV) in Beispiel 1 hergestellt worden war, wobei man die Kurve erhält, indem man K/S gegen die Glucosekonzentration aufträgt.
Fig. 5 ist eine grafische Darstellung der beobachteten prozentualen Farbänderung, definiert als (Δ K/S)/K/S × 100 für die Testvorrichtung, welche zum Erhalt der in Fig. 1 bis 4 angezeigten Daten verwendet wurde.
Im Gegensatz zu den Zusammensetzungen des Standes der Technik sind die erfindungsgemäßen praktisch frei von dem Problem der Farbzersetzung oder -verblassung. Diese unerwartete Eigenschaft beobachtet man bei einem Ansteigen der Konzentration des 3,3&min;,5,5&min;-Tetraalkylbenzidin-Indikators. Deshalb unterscheidet sich die Erfindung von den bekannten Verfahren darin, daß sie schnell eine Farbe ergibt, die im Anschluß an die Bildung stabil bleibt. Man muß nicht warten, bis sich der Farbindikator stabilisiert, noch muß man sich um eine ständige Veränderung der Farbe während der Zeit nach Einleiten der Farbbildung kümmern. Infolgedessen wird durch die Erfindung eine Zusammensetzung und ein Mittel zur Verfügung gestellt, bei dem man 3,3&min;,5,5&min;-Tetraalkylbenzidin anwendet und welches schnell bei Berührung mit einer Glucose im Bereich von einer geringen aber wahrnehmbaren Menge bis zu wenigstens etwa 500 mg/dl enthaltenden Probe eine stabile Farbe ergibt.
Erfindungsgemäß werden Testmittel und eine Testvorrichtung zur Verfügung gestellt, sowie deren Verwendung zur Bestimmung von Glucose in einer Probe beschrieben. Insbesondere umfassen die Testmittel Glucoseoxidase, eine peroxidativ aktive Substanz, wie Peroxidase, und einen 3,3&min;,5,5&min;-Tetraalkylbenzidin- Indikator in einer Menge, die ausreicht, um bei Kontakt des Testmittels mit einer vorbestimmten Menge einer glucosehaltigen Probe schnell ein stabil gefärbtes Reaktionsprodukt zu liefern, wobei die Konzentration von 3,3&min;,5,5&min;- Tetraalkylbenzidin in bezug auf die Menge der vorhandenen Glucoseoxidase in dem Testmittel der Erfindung kritisch ist.
In Übereinstimmung mit der Erfindung liegt das 3,3&min;,5,5&min;- Tetraalkylbenzidin in den Testmitteln in einer Konzentration von wenigstens 2,5 mMol (mM) pro 1000 internationale Einheiten (I. U.) an Glucoseoxidaseaktivität vor.
Das stabile gefärbte Reaktionsprodukt, das wahrscheinlich aus einer reduzierten und oxidierten Form des Indikators in stabilem Gleichgewicht besteht, wird in einem Zeitraum von nicht mehr als etwa 60 Sekunden und insbesondere zwischen etwa 30 und 60 Sekunden nach Kontakt des Testmittels mit der zu prüfenden Körperflüssigkeit gebildet.
Die 3,3&min;,5,5&min;-Tetraalkylbenzidin-Verbindungen sind auch deshalb besonders vorteilhaft, weil deren nichtkarzinogenen Eigenschaften bekannt sind.
Weiterhin wird eine Testvorrichtung zur Bestimmung von Glucose gezeigt, welche aus einem Träger oder einer Matrix besteht, in welcher die Testmittel gemäß der Erfindung enthalten sind. Eine Testvorrichtung kann die Form einer Tablette oder vorzugsweise eines Teststreifens haben. Ein längliches Blatt aus dem Trägermaterial, in welches die Testmittel der Erfindung eingebracht worden sind, kann als Testvorrichtung verwendet werden. Bei der Herstellung und Verteilung können diese länglichen Blätter von Vorratsrollen, wie Filterpapiermaterial, entnommen werden. Die Vorrichtung wird z. B. hergestellt, indem man einen Träger mit einer Lösung der erfindungemäßen Testmittel imprägniert und den so imprägnierten Träger anschließend trocknet.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung werden die Testmittel bzw. die Testvorrichtung mit einer Flüssigkeitsprobe in Berührung gebracht und die entstehende Farbänderung beobachtet.
In der nachfolgenden Beschreibung werden bestimmte Ausdrücke aus Gründen der Klarheit verwendet, aber diese Ausdrücke beziehen sich immer nur auf eine bestimmte Ausführungsform der Erfindung, die als Beispiel dient und in keiner Weise die Grenzen des Umfangs der Erfindung angibt.
Die Testmittel gemäß der Erfindung können viele physikalische Formen annehmen und schließen viele bestimmte 3,3&min;,5,5&min; -Tetraalkylbenzidine ein, unabhängig von der Form. Es werden diese Testmittel, zusammen mit bekannten Additiven, wie Stabilisierungsmitteln, die man gewünschtenfalls zusätzlich verwenden kann, beschrieben. Die Testmittel werden zum Nachweis von Glucose verwendet, indem man sie mit einer Probe, wie Urin, Blut, Serum, Rückenmarkflüssigkeit oder der überstehenden Flüssigkeit von Gewebekulturen und dergleichen, in Berührung bringt.
Die verschiedenen verwendbaren Benzidin-Indikatoren schließen 3,3&min;,5,5&min;-Tetraalkylbenzidin, bei denen das Alkyl ein C₁-C₄- Alkyl ist, ein, wobei 3,3&min;,5,5&min;-Tetramethylbenzidin besonders bevorzugt wird. Andere verwendbare Tetraalkylbenzidine sind 3-Methyl-, 3&min;-methyl-, 5-ethyl-, 5&min;-ethylbenzidin und 3,3&min;,5,5&min;- Tetraethylbenzidin. Wie aus diesen Beispielen hervorgeht, können alle vier Alkylgruppen gleich oder verschieden sein.
Verwendbare Glucoseenzyme sind solche, die mit der zu prüfenden glucosehaltigen Flüssigkeit ein vorbestimmtes Reaktionsprodukt, wie Wasserstoffperoxid, liefern. Zum Beispiel kann man Glucoseoxidase aus Schimmelpilzen verwenden. Diese werden im allgemeinen als Flavo-Enzyme bezeichnet, weil sie als prosthetische Gruppe oder Coenzym ein Flavin oder Isoalloxazin enthalten.
Vorzugsweise ist ein duales Enzymsystem vorhanden: ein Enzym wandelt Glucose unter Bildung von Waserstoffperoxid um, während das andere Enzym peroxidative Aktivität hat. Substanzen mit peroxidativer Aktivität, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, kann man aus den verschiedenen organischen und anorganischen Quellen auswählen. Man kann Pflanzenperoxidasen, wie Meerrettichperoxidase oder Kartoffelperoxidase, verwenden. Anorganische Verbindungen mit Peroxidaseaktivität schließen Jodide, wie Natrium- und Ammoniumjodide und Molybdate, wie Kalium- und Ammoniummolybdate, ein. Außerdem kann man Urohämin und eine Anzahl anderer Porphyrin-Substanzen mit peroxidativer Aktivität verwenden. Weitere Substanzen, die keine Enzyme sind, aber peroxidative Aktivität aufweisen, sind Verbindungen wie Eisensulfocyanat, Eisentannat, Ferri-Ferrocyanid, Kaliumchromsulfat und dergleichen.
Weil die Zusammensetzungen, z. B. zur Messung von Blutglucose, bei einem pH im Bereich von etwa 4 bis etwa 7,5 gehalten werden sollen, ist für diesen Zweck ein Puffersystem aus Tris( hydroxymethyl/aminomethan, Malonsäure und Dinatriummalonat besonders geeignet.
Ein Interpolymer aus Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid ist für die Formulierung eines erfindungsgemäßen Glucoseindikators gleichfalls geeignet. Ein solches Interpolymer wird unter dem Handelsnamen Gantrez AN-139 von der GAF Corporation vertrieben. Löst man dieses Interpolymere in Alkohol, so bildet es ein Partiell-Esterderivat und wenn das Interpolymer in Wasser gelöst wird, bildet es ein Säurederivat. Weil die Testmittel gemäß der vorliegenden Erfindung typischerweise aus wäßrigen alkoholischen Medien hergestellt werden, enthalten die Zusammensetzungen im Endprodukt entweder ein Säurederivat oder ein Teilesterderivat oder eine Mischung der Derivate. Die Gegenwart des vorerwähnten Interpolymer-Derivats zusammen mit Polyvinylpyrrolidion (PVP) mit beispielsweise einem Durchschnittsmolekulargewicht von etwa 40 000 verstärkt die Farbe ganz erheblich, wenn farbbildende Indikatoren des Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase oxidiert werden. Diese Farbverstärkung macht eine noch schärfere Unterscheidung der verschiedenen Farbschattierungen für unterschiedliche Glucosegehaltniveaus in einer gegebenen Flüssigkeitsprobe möglich. Dies ist für den Arzt besonders wichtig, der einen beginnenden diabetischen Zustand diagnostizieren muß.
Die Erfindung betrifft auch Testvorrichtungen, welche die Testmittel gemäß der Erfindung enthalten, wobei man die Testmittel z. B. durch Imprägnierung in einen Träger einbringt. Außer der vorerwähnten Imprägnierung kann die Kombination des Trägers mit den Testmitteln auch durch andere geeignete Verfahren, wie Drucken oder Sprühen der Testzusammensetzung auf den Träger vorgenommen werden.
Vorzugsweise wird die Testvorrichtung hergestellt, indem man einen Träger mit einer ersten Lösung, enthaltend etwa 4 × 10⁴ bis etwa 8 × 10⁴ internationale Einheiten an Glucoseoxidaseaktivität pro Liter imprägniert und nach dem Trocknen des Trägers diesen mit einer zweiten Lösung mit wenigstens 6 g 3,3&min;,5,5&min;-Tetraalkylbenzidin pro Liter für jeweils 1 × 10⁴ internationale Einheiten an Glucoseoxidaseaktivität pro Liter der ersten Lösung imprägniert. Nach der zweiten Imprägnierung wird der imprägnierte Träger wiederum getrocknet.
Der Ausdruck "Träger" bezieht sich auf Matrices, die unlöslich sind und ihre strukturelle Einheit in einer physiologischen oder einer anderen zu prüfenden Flüssigkeit beibehalten. Geeignete Matrices sind Papier, Cellulose, Holz und synthetische Harzvliese, Glasfasern, Gewebe und Vliese, Gelatine, verschiedene organische Polymere, wie Polypropylen und andere Materialien, die als Filmbildner dem Fachmann bekannt sind. Alternativ kann der Träger auch die Form einer verpreßten oder geformten Tablette, die ein übliches Trägermaterial enthält, annehmen. Für die bessere Handhabung kann man den Träger an einen unlöslichen Trägerteil oder einen in die Hand zu nehmenden Teil befestigen, der aus Polystyrol bestehen kann.
Wird die Testvorrichtung zum Nachweis von Glucose im Blut angewendet, so wird die Oberfläche der imprägnierten Trägermatrix vorteilhafterweise mit einem halbdurchlässigen transparenten Schutzfilm aus Äthylcellulose oder einem anderen geeigneten Material überzogen. Dies kann man vornehmen, indem man eine Schicht aus Äthylcellulose, gelöst in Benzol, aufbringt, z. B. auf die Oberfläche der imprägnierten Trägermatrix, und dann das Lösungsmittel durch Verdampfungstrocknung entfernt. Alternativ kann die Äthylcellulose auch Teil bei der zweiten Imprägnierlösung sein, wie dies im Beispiel gezeigt wird.
Glucosetestvorrichtungen in Form von behandelten Trägermatrices werden oft vor Gebrauch über erhebliche Zeiträume gelagert, und deshalb ist es wünschenswert, daß man Reagenzien wählt, die nicht leicht an der Luft autooxidabel sind. Es ist auch zweckmäßig, die Trägermatrix vor Licht zu schützen und in einigen Fällen ist es wünschenswert, die Trägermatrix in Feuchtigkeit abweisenden Verpackungen, die erst kurz vor ihrer Anwendung geöffnet werden, aufzubewahren.
Gewünschtenfalls kann eine Trägermatrix so behandelt werden, daß sie eine Hintergrundfärbung mit einer bestimmten Farbe aufweist, z. B. gelb, so daß die Farbe, die durch die Testreaktion gebildet wird, sich mit der Hintergrundfarbe mischt und unterschiedliche Färbungen ergibt, die den Konzentrationen der zu untersuchenden Flüssigkeit oder Lösung entspricht. Es kann insbesondere wünschenswert sein, die Matrix gelb zu färben, wenn die gebildete Farbprobe blau ist.
Die Testvorrichtung wird mit Vorteil angewendet, indem man sie kurz in die Testprobe eintaucht oder indem man auf andere Weise die Testprobe auf die Trägermatrix aufbringt, wodurch eine merkliche Farbänderung beim Vorliegen von Glucose erfolgt. Die Volumenkapazität des Trägers dient dazu, die Menge der durch diesen absorbierten Probe zu beschränken. Überschüssige Probe kann man durch Waschen oder Aufsaugen entfernen, so daß dadurch die Menge der zu prüfenden Probe und deren Volumen, die tatsächlich in die Trägermatrix eingebracht wird, begrenzt wird. Die Testvorrichtung kann in gleicher Weise verwendet werden, wenn als Proben, Plasma, Serum oder andere Flüssigkeiten untersucht werden.
Extinktionsablesungen der durch die in der Probe enthaltenen Glucose gebildeten Farbe kann man mit handelsüblichen Spektrofotometern, wie einem Beckmann DK-2 Spektrofotometer der Beckmann Instruments Inc., Fullerton, California/USA, oder einem Spektrokolorimeter SCF-1 der Israel Electro-Optical Industry Ltd. vornehmen.
Für ganz genaue Bestimmungen von Glucosekonzentrationen kann man eine fotoelektrische Colorimetrie oder Spektrofotometrie zur Bestimmung der Farbanzeigung anwenden. Das EYETON®-Beugungs- Colorimeter (Ames Company, Division of Miles Laboratories Inc.) ist ein tragbares Instrument, das zur quantitativen Messung der Gesamtblutglucose bestimmt ist, zusammen mit DEXTROSTIX®-Reagenzstreifen (Ames Company, Division of Miles Laboratories Inc.) Das EYETONE-Beugungs-Colorimeter mißt das an der Oberfläche der Reagenzfläche des Reagenzstreifens reflektierte Licht und wandelt diese Messung durch eine elektronische Schaltung in eine Ablesung um, die genau an einer kalibrierten metrischen Skala des Instrumentes ablesbar ist und Blutglucose im Bereich von 10 bis 400 mg/100 ml anzeigt. Je höher die Menge an Blutglucose, umso dunkler ist der Streifen und umso weniger Licht wird reflektiert. Umgekehrt ist bei einem niedrigeren Blutglucoseniveau der Streifen heller und die Lichtreflexion größer. Die hier beschriebene, farbbildende Mischung ist besonders geeignet, weil sie eine einzigartige Farbansprechung ergibt, die mit dem EYETONE-Beugungs-Colorimeter in gleicher Weise gemessen werden kann wie bei DEXTROSTIX-Reagenzstreifen. Alternativ kann man halbquantitative Ergebnisse erzielen, wenn man den erfindungsgemäßen Glucose-Indikator und die Farbe dann mit einer Skala von Standardfarben vergleicht, die man mit bekannten Glucosekonzentrationen unter Anwendung des gleichen Glucose-Indikators erzielt hat.
Die Beziehung zwischen K (dem Absorptionskoeffizienten der Probe) und der Konzentration der absorbierenden Spezies (d. h. Glucose) wird durch die Kubelka-Monk-Gleichung hergestellt, die, zusammen mit einer ausführlichen Diskussion der Beugungsspektrofotometrie in Kortüm, G., Reflectance Spectroscopy, Springer-Verlag Inc., New York, 1969, beschrieben wird.
Der Ausdruck K/S, wie er im Beispiel verwendet wird, bedeutet das Verhältnis, das durch die Formel (1-R)²/2R gegeben ist, wobei R die Extinktion und S der Streuungskoeffizient des jeweils verwendeten Trägers ist. Deshalb ist K/S proportional der Menge des bei der Umsetzung gebildeten Chromogens. Die Ablesungen in den Beispielen erfolgten bei den angegebenen Wellenlängen.
Meerrettich-Peroxidase und Glucoseoxidase, wie sie in den Beispielen verwendet wurde, stammten von The Research Products Division, Miles Laboratories Inc., Elkhart, Indiana. Ein Copolymer aus Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid (Gantrez AN-139) und Polyvinylpyrrolidon (VPV) wurde von der GAF Corp., Chemical Products, New York, N. Y., erhalten. Das bei der Zubereitung der Lösung verwendete Lösungsmittel kann Wasser, eine physiologische Lösung, ein organisches Lösungsmittel, wie Methanol oder eine Mischung davon sein.
Die Beispiele sind nur beschreibend, ohne daß sie die Erfindung in irgendeiner Weise beschränken. Für den Fachmann ist es ersichtlich, daß man eine Reihe von Änderungen und dergleichen hinsichtlich der Bestandteile und der Parameter vornehmen kann, ohne vom Geist der Erfindung abzuweichen.

Beispiel 1

Es wurden Vorrichtungen hergestellt, in denen Zusammensetzungen zur quantitativen Bestimmung von Glucose eingebracht waren. Die bei der Zubereitung der Vorrichtungen verwendeten Zusammensetzungen hatten jeweils unterschiedliche Konzentrationen des Indikators 3,3&min;,5,5&min;-Tetramethylbenzidin (TMB). Die Wirkung dieser Unterschiede auf die Stabilität der Farbe im Laufe der Zeit wurde untersucht.
Eine erste Imprägnierlösung wurde aus folgenden Bestandteilen in den angegebenen Mengen hergestellt: °=c:190&udf54;&udf53;vu10&udf54;&udf53;vz18&udf54; &udf53;vu10&udf54;
Eine zweite Imprägnierlösung wurde aus den zu prüfenden TMB- Konzentrationen hergestellt, indem man jeweils 10, 25, 50 bzw. 75 g TMB zu vier 1,0 l Lösungen von Chloroform, enthaltend jeweils 17,5 g Äthylcellulose, gab. Die Endkonzentration von TMB in diesen Imprägnierlösungen betrug 41,9, 104, 208 bzw. 312 mMol (mM) und die Formulierungen dieser Lösungen wurden mit I, II, III und IV bezeichnet. Das Verhältnis der millimolaren Mengen an TMB in den Imprägnierlösungen I bis IV zu der Zahl der Internationalen Einheiten (I. U.) an Glucoseoxidase in der ersten Imprägnierlösung war 0,52, 1,30, 2,60 bzw. 3,90 mMol pro 1000 I. U.
Ebenso betrugen die Gewichtsverhältnisse von TMB in den Imprägnierlösungen I bis IV zu der Anzahl der internationalen Einheiten an Glucoseoxidase in der ersten Imprägnierlösung 0,125, 0,313, 0,625 bzw. 0,038 g/1000 I. U. Alle diese Beziehungen werden in der Tabelle I für die jeweiligen Lösungen I bis IV gezeigt.
Vier Blätter Eaton-Dikeman 205 (E & D) Filterpapier wurden bis zur Sättigung mit der ersten Imprägnierlösung imprägniert und bei 80°C getrocknet. Jeder der so imprägnierten Blätter wurde dann bis zur Sättigung in einer einzelnen der zweiten Imprägnierlösungen imprägniert und bei 60°C getrocknet.
Die so behandelten Papiere wurden in 0,5 cm × 1 cm Streifen unter Ausbildung von Testvorrichtungen geschnitten. Diese Testvorrichtungen wurden auf ein doppelseitiges Klebepapier aufgebracht und dann auf einem organoplastischen Trägerteil fixiert. Jede Testvorrichtung enthielt annähernd 1,7 I. U. Glucoseoxidase und 5,4 I. U. Peroxidase, Die endgültigen Mengen an TMB in den Vorrichtungen, welche die Formulierungen I bis IV enthielten, betrugen annähernd 0,22, 0,55, 1,10 bzw. 1,6 mg.
Die Vorrichtungen mit den jeweiligen Formulierungen wurden geprüft, indem man sie jeweils einzeln in jeweils vier wäßrige Glucoselösungen tauchte. Die Glucosekonzentrationen in diesen Lösungen waren 93, 201,9, 302,4 und 372,2 mg/dl. Nach der Sättigung des Trägers der einzelnen Vorrichtungen in der Probe ließ man die Reaktion 60 Sekunden ablaufen. Dann wurde alle überschüssige Probe aus der Vorrichtung abgewaschen, indem man die Vorrichtung einen Augenblick unter strömendes Wasser hielt und überschüssige Flüssigkeit mit üblichem Gesichtstuch aufsaugte. Die Vorrichtung wurde dann in ein Aufzeichnungs-Beugungsspektrofotometer gegeben und die Farbänderung wurde bei 550 Nanometer (nm) 20 Sekunden und dann nochmals 60 Sekunden nach dem Waschen gemessen. Die Extinktionswerte wurden in K/S-Werte in der vorher angegebenen Weise überführt und die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle I Formel I - 0,52 mM (0,125 g) TMP pro 1000 I.U. Glucoseoxidase (GOD) &udf53;vu10&udf54;&udf53;vz9&udf54; &udf53;vu10&udf54; Formel II - 1,3 mM (0,313 g) TMB pro 1000 I.U. GOD &udf53;vu10&udf54;&udf53;vz9&udf54; &udf53;vu10&udf54; Formel III - 2,60 mM (0,625 g) TMB pro 1000 I.U. GOD &udf53;vu10&udf54;&udf53;vz9&udf54; &udf53;vu10&udf54; Formel IV - 3,90 mM (0,938 g) TMB pro 1000 I.U. GOD &udf53;vu10&udf54;&udf53;vz9&udf54; &udf53;vu10&udf54;
Fig. 1 bis 4 geben grafisch die in Tabelle I für die Vorrichtungen, enthaltend Formulierungen I bis IV angegebenen Werte an. Die durchgehenden Linien geben die K/S-Ablesung, die 20 Sekunden nach dem Waschen der Vorrichtung gemessen wurde, an, und die gebrochenen Linien geben die K/S-Ablesung nach 60 Sekunden an. Fig. 5 ist eine grafische Darstellung und gibt den Prozentsatz der beobachteten Farbänderung an, ausgedrückt als (K/S)/K/S × 100) für die die Formulierungen I bis IV enthaltenden Vorrichtungen.
Eine stabile blaue Farbe wurde praktisch unmittelbar nach Entfernen der überschüssigen Probe von der Vorrichtung mit den Formulierungen III und IV beobachtet, während eine nachlassende Färbung, die einen Fehler im Nachweis der Glucosemengen ergab, bei den Vorrichtungen mit den Formulierungen I und II festgestellt wurde. Die Vorrichtungen mit den Formulierungen III und IV haben höhere TMB-Konzentrationen und ergeben im wesentlichen einen unmittelbaren Farbendpunkt, der anschließend stabil bleibt.
Fig. 1 und 2 zeigen, daß eine beachtliche Änderung in den Ablesungen bei 20 Sekunden und bei 60 Sekunden erfolgt. Diese Ablesungen sind proportional der gebildeten Menge des Chromogen. Die Menge der durch solche Vorrichtungen gemessenen Glucose ist deshalb absolut unzuverlässig. Die praktisch identischen Ablesungen, die in den Fig. 3 und 4 gezeigt werden, demonstrieren die Stabilität der erfindungsgemäß gebildeten Farbe.
Fig. 5 zeigt den Prozentsatz der Farbänderung zwischen der Ablesung nach 20 Sekunden und nach 60 Sekunden, der mehr als 30% bei der Formulierung I ausmacht und weniger als 30% bei der Formulierung III. Durch die Erfindung wird deshalb gegenüber dem Stand der Technik eine mehr als 10fache Verbesserung erzielt.

Claims

1. Testmittel zur Bestimmung von Glucose in einer Körperflüssigkeitsprobe, enthaltend Glucoseoxydase, eine peroxidativ wirksame Substanz und einen 3,3&min;,5,5&min;- Tetraalkylbenzidin-Indikator, dadurch gekennzeichnet, daß es den Indikator in einer Menge von mindestens 2,5 mMol/1000 internationale Glucoseoxydase-Aktivitätseinheiten enthält.

2. Testmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es den Indikator in einer Konzentration von wenigstens 3,5 mMol/1000 internationale Glucoseoxydase-Aktivitätseinheiten enthält.

3. Testmittel gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator 3,3&min;,5,5&min;-Tetramethylbenzidin ist.

4. Testmittel gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator 3-Methyl, 3&min;-methyl, 5-ethyl, 5&min;-ethylbenzidin ist.

5. Testvorrichtung zur Bestimmung von Glucose in einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Träger, der mit einem Testmittel gemäß Anspruch 1 bis 4 verbunden ist, besteht.

6. Verwendung eines Testmittels gemäß Anspruch 1 bis 4 oder einer Testvorrichtung gemäß Anspruch 5 zur Bestimmung von Glucose in einer Körperflüssigkeitsprobe.