DD245727A5 - Ein verfahren zum nachweis und/oder messen klinischer parameter beim immunisierungsprozess von enzymen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung klinischer Parameter in biologischen Fluessigkeiten fuer die Anwendung in der medizinischen Diagnostik. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens auf der Grundlage einer Enzymimmunoreaktion, das eine leichte und schnelle Ausfuehrung mit hoher Ansprechempfindlichkeit und Spezifitaet verbindet. Erfindungsgemaess wird die biologische Fluessigkeit nacheinander in Kontakt gebracht mit(a) enzymmarkiertem Antikoerpern oder Antigenen, die auf einer festen Unterlage reversibel adsorbiert sind;(b) Antikoerpern, Antigenen, Anti-Antikoerpern oder Antigen-Antikoerper-Komplexen, die auf einer festen Unterlage in einer Menge immobilisiert sind, die der der enzymmarkierten Antikoerper oder Antigene stoechiometrisch gleich ist;(c) einem oder mehreren Chromogensubstraten, die eine Nachweisreaktion mit den antikoerper- oder antigenassoziierten Enzymen hervorbringen koennen. Fig. 1
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung klinischer Parameter in biologischen Flüssigkeiten durch Enzymprozesse. Insbesondere betrifft die Erfindung ein diagnostisches Verfahren und eine Vorrichtung zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung klinischer Parameter durch einen Enzymimmunoprozeß unter Anwendung derAffinitätschromatografie. Die Erfindung ist besonders nützlich für die Analyse biologischer Substanzen in biologischen Flüssigkeiten wie Harnstoffen, Plasma, Blut, Exsudaten, Gewebeextrakten usw.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Die immunoenzym-diagnostischen Verfahren sind seit langem bekannt. Sie basieren auf der Reaktion zwischen einem Antikörper und seinem Antigen, von denen eines einem Enzym assoziiert wird, das die Nachweisreaktion hervorbringen kann (von Chromogen oder anderer Art), wenn es mit einem geeigneten Substrat in Kontakt gebracht wird. Danach führt der enzymgekennzeichnete Antigen-Antikörper-Komplex durch Kontakt mit dem Nachweissubstrat zu einer Reaktion, die für die qualitative oder quantitative Bestimmung des interessierenden Antigens oder Antikörpers genutzt werden kann.
Alle am häufigsten in der Diagnostik eingesetzten Enzymimmunotechniken haben eine Reihe von Mangeln, die im wesentlichen den komplizierten und delikaten sowie den langen Inkubationszeiten, welche ein wiederholtes Waschen des reaktiven Systems bedingen, zuzuschreiben sind.
Die Ausführung dieser Techniken ist daher auf qualifizierte Labors beschränkt, während eine allgemeinere Anwendung, beispielsweise in der ambulanten oder sogar häuslichen Praxis, bisher nicht möglich war. Tatsächlich bringen, auch wenn die herkömmlichen Verfahren keine besonderen Schwierigkeiten für Fachkräfte beinhalten, die Handhabung und das Ablesen der Testergebnisse Probleme mit sich, die von unerfahrenen Kräften nur schwer, wenn überhaupt, zu bewältigen sind.
Beispielsweise gibt es ein Verfahren, das unter der Abkürzung „ELISA" (enzymvernetzte Immunosorbensarialyse, Immunochem., 8,871-874 [1971] bekannt ist, das neben langen Inkubations- und Reaktionszeiten sowie wiederholten Waschvorgängen auch geschickten Umgang und Manipulation verlangt.
Die „ΕΜΓΓ'-Methode dagegen hat die Einschränkung, daß sie die Bestimmung von Molekülen mit hohem Molekulargewicht nicht ermöglicht.
Schließlich verlangt ein Verfahren, das in Fachkreisen als „FIA"-Methode bekannt ist, den Einsatz spezieller Anzeigeinstrumente.
Zu einer detaillierten Beschreibung der oben genannten Diagnoseverfahren wird auch „Enzyme Immunoassay" (Enzymimmunoprobe), E. Ishikawa, T. Kawai, K. Miyai, Igaku-Shoin-Tokio-New York (1981), verwiesen.
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten diagnostischen Verfahrens auf der Grundlage einer Enzymimmunoreaktion, das leichte und schnelle Ausführung mit Ansprechempfindlichkeit und der Spezifität verbindet, die diesen immunoenzymatischen Verfahren eigen sind.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, welche die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der gewünschten Weise gestattet.
Die Erfindung überwindet die bei den bisherigen Techniken auftretenden Probleme durch die Schaffung eines Verfahrens und einer Vorrichtung, mit denen es, selbst auf quantitativer Basis, möglich ist, klinische Parameter jeder Art ohne Rückgriff auf besondere Manipulationen zu bestimmen.
Nach der Erfindung läßt man eine biologische Flüssigkeit, welche den (die) zu bestimmenden Parameter enthält, aufwärts oder abwärts durch eine auf herkömmliche Weise gebildete Auflage fließen, welche besteht aüst
(a) einer ersten oder Zwischenzone, auf der Substanzen adsorbiert werden können, die Interferenzen mit der Probe verhindern können;
(b) einer Zone, aufweiche vorher eines oder mehrere Antigene oder enzymmarkierte Antikörper, die im Vergleich zu einem oder mehreren Epitopen gezogen wurden (N.R.Jerne, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 24,1985,810-816), die für die zu bestimmenden klinischen Parameter spezifisch sind, auf reversible Weise adsorbiert wurden;
(c) einer weiteren Zone, die an die vorhergehende Zone angrenzt, auf welcher die Antikörper oder Antigene, die die zu bestimmenden klinischen Parameter bilden, durch bekannte Verfahren in einer Menge immobilisiert werden, die gleich der oder größer als die der enzymmarkierten Antikörper oder Antigene ist. In dieser Zone können auch Antikörper eingesetzt werden, die im Vergleich zu einem oder mehreren Epitopen gezogen wurden, die sich von dem (den) Epitopen unterscheiden, die durch die Antikörper der Zone (b) erkannt wurden (Sandwich-Analyse). In diesem Fall sollten diechromogenen Substrate (das Substrat) für die enzymmarkierten Antikörper der Zone (b) an die Zone (c) gebunden sein. Als Alternative dazu könnte(n) die chromogenen Substrate (das chromogene Substrat) auf reversible Weise auf einer darunter liegenden Zone adsorbiert werden. Als eine Alternative kann diese Zone (c) einen Anti-Antikörper haben, der darauf immobilisiert ist und der für einen Antigen-Antikörper-Komplex spezifisch ist, in diesem Fall wird die Zone (b) wiederum in zwei Abschnitte unterteilt, wobei beispielsweise auf dem ersten Abschnitt das enzymmarkierte Antigen adsorbiert ist, und ein zweiter Abschnitt den entsprechenden Antikörperträgt oder umgekehrt.
(d) einer Zone, auf der ein chromogenes Substrat adsorbiert wird für das in der Zone (b) vorhandene Antigenenzym oder antikörperassoziierte Enzym oder eine oder mehrere Träger, die in der Lage sind, biologische Flüssigkeiten fließen zu lassen (Sandwich-Analyse).
Die biologische Flüssigkeit, die durch die Schwerkraft, Kapillarwirkung, Chromatografie oder Diffusion durch die Auflage nach oben oder unten fließt, wird veranlaßt, zuerst die Zone (b) zu kontaktieren, das Antigen oder der Antikörper, die vorhanden sein können, reagieren mit den komplementären enzymmarkierten Antikörpern oder Antigenen.
Der so gebildete Komplex oder das kombinierte System steigen (oder fallen) chromatografisch durch die Auflage, um durch die Zone (c) zu gelangen, wo der überschüssige enzymmarkierte Antikörper oder das Antigen, soweit vorhanden, an das komplementäre, immobilisierte Antigen oder den Antikörper gebunden werden. Bei der Sandwich-Analyse wird der spezifische Komplex gebunden, wodurch eine „Sandwich"-Anordnung entsteht.
Nach dem Passieren der Zwischenzone, wo alle störenden Substanzen entfernt werden können (beispielsweise durch Adsorption, chemische Bindung, Zersetzung usw.), erreicht der enzymmarkierte Antigen-Antikörper-Komplex das chromogene Substrat, um eine Färbung (positiverTest) hervorzurufen, die sowohl für die quantitative als auch für die qualitative Bestimmung verwendet werden kann, beispielsweise durch den Vergleich mit einer Farbskala. Ist andererseits in der biologischen Flüssigkeit kein klinischer Parameter vorhanden (negativer Test), wird das enzymmarkierte Antigen oder der Antikörper in einem Fall vollständig auf die Zone (c) durch i mm unochemische Reaktion fixiert, wodurch verhindert wird, daß sie das Chromogensubstrat erreichen; oder im anderen Fall (Sandwich-Analyse) wird der enzymmarkierte Antikörper nicht auf die Zone (c) fixiert und die während des Durchgangs des antikörperassoziierten Enzyms gebildete Farbe durch den Fluß der biologischen Flüssigkeit aus der Zone ausgewaschen (negativer Test).
Mit anderen Worten, das System basiert auf einem Existenzkampf zwischen dem Antigen oder Antikörper, die in der biologischen Flüssigkeit vorhanden sind, und dem immobilisierten Antigen oder Antikörper, das im Falle einer negativen Reaktion im ersten Fall als Barriere für den enzymmarkierten Antikörper oder das Antigen funktioniert, um dessen Wanderung zur chromogensubstrathaltigen Zone zu verhindern, oder im zweiten Fall als nichtreaktives Material, das nicht in der Lage ist, enzymmarkierte Antikörper zu binden.
Die Vorrichtung nach der Erfindung kann die Form eines Streifens, Bandes, Films, Röhrchens, Spezimens, Kolbens, Unterlage usw. haben. Die verschiedenen Bestandteile können entweder direkt auf dem die Vorrichtung bildenden Material adsorbiert oder immobilisiert werden, oder es kann dafür eine geeignete feste Trägersubstanz verwendet werden, die sich in der Vorrichtung befindet oder auf deren Oberfläche in Form eines Gels, Pulvers, von Körnchen, kleinen Kügelchen, Kugeln usw. aufgebracht
Die Materialien der Vorrichtung und die festen Auflagen oder Trägersubstanzen in den verschiedenen Reaktionszonen können gleich oder verschieden sein. Beispiele für geeignete Materialien und Trägersubstanzen sind Glas, Siliziumdioxidderivate, Papier-oder Zellulosederivate, Metalle, Polymere wie Polyvinylchlorid, Polystyren, Polybutadien, Nylon, Polyakrylamide, Methakrylate usw., Polysaccharide oder Polyole, Stärke, stabilisierte menschliche oder tierische rote Blutzellen, organische Substanzen wie BaSO4, TiO2, Kaolin, Diatomeenerde usw. Die Vorrichtung besteht vorzugsweise aus einem undurchsichtigen Material, angenommen den Anzeigebereich, der durchsichtig ist.
Die immobilisierende Bindung des Antigens oder Antikörpers an die genannten Materialien kann durch physikalische oder chemische Prozesse (Ester-oder Amidbindung usw.) nach
US-PS 4003988 und folgenden Literaturangaben erreicht werden: B.K.VanWeemenundA. H.W.Schuurs, Febs Letters—Bd. 15, Nr.3, Juni 1971,S.232-235; P.Leinikki undSuvi Passila, J. din. Path., 1976,29, S. 1116-1120; B.R.Brodeur, F.E.Ashton und
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Die Adsorptionsbindung der nicht immobilisierten Bestandteile andererseits kann nach bekannten Techniken erreicht werden, eine Sache, die aus der Affinitätschrpmatografie allgemein bekannt ist.
Sowohl die immobilisierten als auch die enzymmarkierten Antikörper, die in der Erfindung von Nutzen sind, können in toto oder in Fragmenten polyklonisch oder monoklonisch sein, wie beispielsweise Fab' und F)ab')2, möglicherweise in Mischung miteinander, und sie können spezifisch für eine oder mehrere aktive Stellen des Antigens sein.
Die Enzymmarkierung der Antigene oder Antikörper kann nach bekannten Verfahren erfolgen, beispielsweise den in dem oben genannten Text „Enzyme Immunoassay" genannten, wobei jedes Enzym verwendet werden kann, das/nit Beziehung zu einem Substrat eine Chromogenreaktion hervorrufen kann, wie beispielsweise Peroxidase, alkalische Phosphatase, /3-Galaktosidase oder ähnliche. Diese Enzyme können beispielsweise durch Glutaraldehyd, Dimaleimid und deren Ester nach den Verfahren assoziiert werden, die auf den Seiten 54 bis 113 des oben genannten Textes „Enzyme Immunoassay" beschrieben werden.
Beide, Antikörper und Antigene, können hinsichtlich der Menge ohne Einschränkung auf die Unterlage aufgebracht werden, wobei die Menge, in Abhängigkeit vom jeweitigen Analysetyp, wenigstens zwischen 1 und 10 mg/cm2 schwanken kann und nur zu berücksichtigen ist, daß die enzymmarkierte Komponente wenigstens in stöchiometrisch gleichen Mengen vorhanden ist.
Wie bereits ausgeführt, ist eine quantitative Bestimmung durch eine Ermittlung des Pegels der entwickelten Farbe entweder auf willkürliche Weise oder anhand eines geeigneten Anzeigegerätes möglich.
Die erste oder Trennzwischenzone schließlich kann einfach aus einem Material bestehen, das als chromatografische Unterlage dienen kann, auf denen solche Substanzen adsorbiert werden können, die in der Lage sind. Verbindungen zu entfernen, welche die Identifikationsreaktion stören können. Sie kann beispielsweise bestehen aus lonenaustauschharzen zum Maskieren von Schwermetallen; immobilisierten Enzymen zum Abbau von Harnstoff oder anderen Stoffwechselprodukten; Antiproteinantikörpernzum Entfernen von Albumin; Antikörpern, die spezifisch für Moleküle mit einer Ähnlichkeit zu dem zu bestimmenden Antigen sind, usw.
Mit dem oben beschriebenen Verfahren und der Vorrichtung schafft die Erfindung ein Mittel, mit dem es möglich ist, auf einfache, schnelle und genaue Weise eine große Zahl unterschiedlicher klinischer Parameter zu bestimmen, beispielsweise Peptidhormone wie HCG, LH, Steroidhormone wie Progesteron, Estronglukoronid, Prägnanediolglukoronid oder andere Parameter von allgemeinen klinischen Interesse wie Streptolysin, Immunglobuline, Viren wie Herpesviren, HTLV-3-Viren usw.
Außerdem können auf derselben Unterlage mehrere enzymmarkierte Antigen und/oder Antikörper zusammen mit den entsprechenden immobilisierten Antikörper/Antigenen untergebracht werden, wodurch es möglich ist, durch das Vorhandensein einer entsprechenden Zahl von Chromogensubstraten, die vorzugsweise so ausgewählt werden, daß sie durch die Reaktion mit unterschiedlichen enzymmarkierten Komplexen unterschiedliche Farben entwickeln, in verschiedenen Zonen gleichzeitig eine Reihe klinischer Parameter zu bestimmen.
Ausführungsbeispiei
Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.
In den beiliegenden Zeichnungsfiguren bezeichnet das Symbol -vp> d.as Antigen; bezeichnet das Symbol
\ 0 das immobilisierte Antigen; bezeichnet das Symbol -^J> C. das enzymassoziierte Antigen,
während die Symbole > - , > 0, } T" auf gleiche Weiseden Antikörper,
den immobilisierten Antikörper bzw. den enzymassoziierten Antikörper bezeichnen. Schließlich bezeichnet das Symbol
OdasChromogensubstrat, Q 0 bezeichnet den immobilisierten Anti-Antikörper, und
der Pfeil bezeichnet die Richtung der ankommenden Flüssigkeit.
In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1: schematisch eine Anordnung, die es nach einem Ausführungsbeispiel der Erfindung ermöglicht, ein Antigen zu bestimmen und die besteht aus einer Auflage (Streifen, Rohr oder einem anderen Element) mit einer ersten Zone, welche den enzymmarkierten Antikörper enthält, der spezifisch für das zu bestimmende Antigen ist, einer zweiten, an die erste angrenzenden Zone, welche das immobilisierte Antigen enthält und an die sich eine Trennzone anschließt, und schließlich einer Zone mit dem Chromogensubstrat. Wenn ein Rohr als Auflage verwendet wird, können die Rohrenden durch poröse Membranen geschlossen werden.
Fig. 2: den Fall, daß ein Antikörper zu bestimmen ist. Bei diesem Ausführungsbeispiel wird die biologische Flüssigkeit im Gegensatz zum vorangegangenen Fall veranlaßt, in der durch den Pfeil bezeichneten Abwärtsrichtung durchzulaufen, um nacheinander zuerst mit dem enzymmarkierten Antigen, dann mit dem immobilisierten Antikörper und zum Schluß mit dem Chromogensubstrat in Kontakt zu kommen, das, statt auf die feste Unterlage adsorbiert zu werden, der aus dem unteren Ende der Vorrichtung austretenden Flüssigkeit zugesetzt werden kann.
Fig. 3: für den in der Fig. 1 gezeigten Fall die verschiedenen Migrationsschritte unter den Bedingungen eines positiven (+)und eines negativen (-) Verlaufs des Tests (Vorhandensein oder Fehlen des betreffenden Antigens).
Fig.4: ein anderes Ausführungsbeispiel, das dem in der Fig. 1 gezeigten ähnlich ist und sich nur darin unterscheidet, daß das immobilisierte Antigen mit dem enzymmarkierten Antikörper voragglutiniert ist; jedes in der biologischen Flüssigkeit vorhandene Antigen tritt damit mit dem immobilisierten Antigen in einen Wettstreit, um den markierten Antikörper freizusetzen, wodurch dieser in das Chromogensubstrat wandern kann.
Fig. 5: eine weitere Variante des Verfahrens zur Bestimmung von Antigenen. In diesem Fall besteht die Unterlage aus einer ersten Zone, welche ein enzymmarkiertes Antigen enthält, einer zweiten Zone, auf die ein entsprechender Antikörper adsorbiert wurde, schließlich einer Zone, welche einen immobilisierten Anti-Antikörper enthält (beispielsweise . Sepharoseprotein A oder Anti-lgC, gebunden an PVC), an die sich wiederum das Chromogensubstrat anschließt; auch in diesem Fall ist es nur der Kampf mit dem in der biologischen Flüssigkeit vorhandenen freien Antigen, der bewirkt, daß das enzymmarkierte Antigen das Substrat erreicht, während der Antikörper-Antigen-Komplex durch den Anti-Antikörper gefangen bleibt. I
Fig. 6a und 6 b: einen anderen Typ der Vorrichtung, gesehen im Querschnitt bzw. in der Draufsicht. Die Vorrichtung besteht aus einem Auflagestreifen 2, der mit Löchern 1 für das Hindurchfließen einer Flüssigkeit versehen ist, und der einen undurchlässigen transparenten Überzug 3 hat, der es ermöglicht, die chromogenhaltige Schicht 4 visuell zu überprüfen. In diesem Fall kann das Ablesen zur qualitativen Bestimmung visuell oder mit Hilfe eines Auslenkmeßgerätes zur quantitativen Bestimmung erfolgen.
Die gezeigten Ausführungsbeispiele sollen nur das Prinzip der Erfindung veranschaulichen?ohne diese einzuschränken. So kann beispielsweise die Größe der einzelnen Zonen in jedem einzelnen Fall unterschiedlich sein, sie liegt normalerweise im Bereich zwischen einigen Millimetern und einigen Zentimetern. Außerdem wurden bestimmte Details nicht gezeigt, die eine einfachere Anwendung der Auflage der Erfindung ermöglichen könnten, beispielsweise Tragegriffe, Vorrichtung zum Absaugen der biologischen Flüssigkeit, Kennzeichnungen zur Angabe der Seite, auf welcher die biologische Flüssigkeit einzuführen ist," Farbskalen, die auf einer Seite der das'Chromogensubstrat enthaltenden Zone angebracht sind, usw. Die Vorrichtungen nach der Erfindung können auch symmetrische Vorrichtung mit einer an beiden Enden angeordneten enzymmarkierten Komponente sein, an diese schließen sich dann die oben genannten Folgezonen an. Diese Maßnahme dient dazu, ein falsches Einführen der Flüssigkeit zu vermeiden. Außerdem können für den häuslichen Gebrauch entsprechend verpackte Kompakteinheiten geschaffen werden, die im erforderlichen Maße über sterile, stabile, abgestimmte Eigenschaften usw. verfügen.
Aus dem Vorstehenden geht hervor, daß die Methode und Vorrichtung nach der Erfindung vielseitig und praktisch in der Anwendung sind und in einem breiten Bereich der klinischen Analyse angewendet werden können, ohne daß spezielle Ausrüstungen oder Fähigkeiten erforderlich sind. Sie ermöglichen es außerdem und vor allem, Analyseergebnisse in kurzer Zeit, in der Regel in der Spanne von Minuten, zu ermitteln.
Die Erfindung wird nun anhand des folgenden Beispiels ausführlicher erklärt, welches aber in keiner Weise den Geist und den Rahmen der Erfindung einschränken soll.
a. Herstellung von auf PVC immobilisiertem HCG
100g PVC, Teilchengröße 200μ, werden in einer Lösung von HCG zu 50 Einheiten/ml in Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,2 bei 370C über Nacht behandelt. Das beschichtete Polymer wird fünfmal mit demselben Puffer gewaschen und bei 370C 10 Stunden lang getrocknet.
b. Herstellung von peroxidasemarkiertem Anti-HCG
Anti-HCG (10ml) von Kaninchen wird dreimal mit 18%igem anhydrischen Natriumsulfat ausgefällt und das Produkt nach jeder Ausfällung aus 10 ml destilliertem Wasser gewonnen. Dann wird das Produkt über Nacht bei +40C anhand eines Phosphatpuffers bei einem pH-Wert von 7,2,1OmMoI, diaiysiert.
Diedialysierte Lösung wird mit 100mg Peroxydase RZ 3.00 und 25ml 25%igem Glutaraldehyd bei +40C 48 Stunden behandelt. Die Lösung wird auf Sephadex G 150, das mit Natriumchlorid, 5OmMoI, ausgewogen ist, eluiert. Der eluierte Anti-HCG-Peroxidase-Komplex kann bei -2O0C gelagert werden.
c. Herstellung von markiertem, auf der Unterlage adsorbierten Antikörper
Glas, 50g, wird mit Anti-HCG-Peroxidase, 5ml, 1:500 in Posphatpuffer verdünnt, 1OmMoI, pH-Wert 7,2, behandelt, und das Produkt wird über Nacht bei 37°C getrocknet.
d. Herstellung des auf der Unterlage adsorbierten Chromogens
50g Glas werden mit 50mg Tetramethylbenzidin, das in 5ml DMSO-Wasser aufgelöst ist, behandelt.
e. Säulenfüllung
Eine Glassäule (3,5 mm Innendurchmesser, 15 cm Höhe) wird von unten nach oben mit folgenden Materialien gefüllt: adsorbierte Anti-HCG-Peroxidase, immobilisierte HCG, adsorbiertes Chromogen, die nach obenstehenden Ausführungen hergestellt wurden.
Die Glassäule wird an beiden Enden mit Baumwolle oder einem anderen geeigneten porösen Stopfen verschlossen.
f. Durchführung der Analyse
Die oben beschriebene Säule wird mit dem zu analysierenden Harnstoff in Kontakt gebracht, der durch die Kapillarwirkung in der Säule nach oben steigt. Wenn HCG im Harnstoff vorhanden ist, wird er an die Anti-HCG-Peroxidase gebunden, die im ersten Säulenabschnitt enthalten ist; beim weiteren Aufsteigen ruft er keine weitere Agglutinierungsreaktion mit dem immobilisierten HCG hervor, das im zweiten Säulenabschnitt enthalten ist, so daß er seinen Weg bis zum letzten Säulenabschnitt fortsetzt, in welchem sich das Chromogensubstrat befindet, das durch die Reaktion mit dem Enzym eine blaue Farbe entwickelt; bei einer Sandwich-Analyse wird der Komplex spezifisch an die Zone (c) durch immunochemische Reaktion gebunden, und die blaue Farbe wird durch die Reaktion mit dem Enzym und dem Chromogensubstrat hervorgerufen, wobei die blaue Farbe in der Zone (c) sichtbar wird. Ist dagegen kein HCG im Harnstoff enthalten, erreicht der Anti-HCG-Peroxidasekomplex im ersten Säulenabschnitt nach freiem Aufsteigen die Säulenzone, in der sich das immobilisierte HCG befindet, und wird durch immunochemische Reaktion an dieses gebunden, so daß er das Chromogensubstrat nicht erreichen kann. Es bildet sich also keine Farbe heraus; bei der Sandwich-Analyse wird die Anti-HCG-Peroxidase in der Zone (c) nicht gebunden und aus dieser Zone ausgewaschen, auch auf diese Weise wird keine Farbe entwickelt
Der oben beschriebene Prozeß kann auch beim Systemen mit absteigender Flüssigkeit angewendet werden.
Claims (22)
- -1- 245 72:Erfindungsanspruch:1. Verfahren zur Bestimmung klinischer Parameter in biologischen Flüssigkeiten durch den Enzymimmunprozeß, gekennzeichnet dadurch, daß eine biologische Flüssigkeit nacheinander in Kontakt gebracht wird mita. enzymmarkierten Antikörpern oder Antigenen, die reversibel auf einer festen Unterlage adsorbiert sind;b. Antikörpern, Antigenen, Anti-Antikörpern oder Antigen-Antikörper-Komplexen, die auf einer festen Unterlage in einer Menge immobilisiert sind, die den enzymmarkierten Antikörpern oder Antigenen mindestens stöchiometrisch gleich ist; undc. einem oder mehreren Chromogensubstratert, die eine Nachweisreaktion mit den Enzymen hervorrufen können, die den Antikörpern oder Antigenen assoziiert sind.
- 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die biologische Flüssigkeit vordem Kontakt mit dem Chromogensubstrat durch ein chromatografisches Material fließt, auf welchem Substanzen adsorbiert sein können, welche Verbindungen entfernen können, die die betreffende Analyse stören können.
- 3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2 in der Anwendung zur Bestimmung von Antigenen, gekennzeichnet dadurch, daß die biologische Flüssigkeit nacheinander in Kontakt gebracht wird mita. dem komplementären, enzymmarkierten Antikörper, der auf eine reversible Weise auf einer festen Unterlage adsorbiert ist;b. dem gleichen Antigen, das auf einer festen Unterlage in einer Menge immobilisiert wird, die der des enzymmarkierten Antikörpers zumindest stöchiometrisch gleich ist;c. einem Chromogensubstrat.
- 4. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, angewendet zur Bestimmung eines Antigens, gekennzeichnet dadurch, daß die biologische Flüssigkeit in Kontakt gebracht wird mita. dem komplementären, enzymmarkierten Antikörper, der auf einer festen Unterlage reversibel adsorbiert ist;b. einem oder mehreren immobilisierten Antikörpern und einem Chromogensubstrat, die reversibel oder immobilisiert auf einer festen Unterlage adsorbiert sind;c. einer oder mehreren Unterlagen, die den Fluß der biologischen Flüssigkeiten zulassen können.
- 5. Verfahren nach Punkt 1 oder 2 in der Anwendung zur Bestimmung eines Antikörpers, gekennzeichnet dadurch, daß die biologische Flüssigkeit nacheinander in Kontakt gebracht wird mita. dem komplementären, enzymmarkierten Antigen, das reversibel auf einer festen Unterlage adsorbiert ist;b. dem gleichen Antikörper, der auf einer festen Unterlage in einer Menge immobilisiert ist, die dem enzymmarkierten Antigen stöchiometrisch zumindest gleich ist, undc. einem Chromogensubstrat.
- 6. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß der enzymmarkierte Antikörper und das immobilisierte Antigen auf derselben festen Unterlage agglutiniert sind.
- 7. Verfahren nach Punkt 1 oder 2 in der Anwendung für die Bestimmung eines Antigens, gekennzeichnet dadurch, daß die biologische Flüssigkeit nacheinander in Kontakt gebracht wird mita. dem gleichen enzymmarkierten Antigen, das auf einer festen Unterlage in reversibler Weise adsorbiert ist;b. dem komplementären Antikörper, der reversibel auf einer festen Unterlage adsorbiert ist;c. einem Anti-Antikörper, der für den Antigen-Antikörper-Komplex spezifisch ist, der auf einer festen Unterlage immobilisiert ist, und · 'd. einem Chromogensubstrat.
- 8. Verfahren nach Punkt 1 in der Anwendung zur Bestimmung von verschiedenen klinischen Parametern in einem Arbeitsgang, gekennzeichnet dadurch, daß auf derselben festen Unterlage die entsprechenden enzymmarkierten Antikörper oder Antigene und die entsprechenden immobilisierten Antikörper oder Antigene aufgebracht sind und daß die für das jeweils verwendete Enzym spezifischen Chromogensubstrate sich auf einzelnen Unterlagen befinden.
- 9. Verfahren nach einem der vorstehenden Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß die Auflagen, die für die verschiedenen Komponenten gleich oder verschieden sein können, aus Glas oder Siliziumdioxidderivaten, Papier- oder Zellulosederivaten, Polymeren, Polysacchariden oder Polyolen, Kaolin, T1O2, BaSO4, Diatomeenerde, Metallen oder stabilisierten roten Blutzellen bestehen können.
- 10. Verfahren nach einem der Punkte 1,2,3,6 bis 9, gekennzeichnet dadurch, daß es für die Bestimmung von Peptidhormonen (HCG, LH), Steroidhormonen, Proteinen, Streptolysin oder Viren angewendet wird.
- 11. Verfahren nach einem der Punkte 1,2,5,8 oder 9, gekennzeichnet dadurch, daß es für die Bestimmung von Immunglobulinen und anderen Antikörpern von diagnostischem Interesse angewendet wird.
- 12. Vorrichtung zur Bestimmung klinischer Parameter der Art, die durch das Aufsteigen oder Herabsinken von biologischen Flüssigkeiten transportiert werden können, welche die Form eines Rohres, Spezimen, Streifens, Kissens, Kolbens, Films hat, gekennzeichnet dadurch, daß die Vorrichtung besteht ausa. einer ersten oder Trennzwischenzone, auf der die Substanzen adsorbiert werden können, die in der Lage sind, Verbindungen zu entfernen, welche die betreffende Analyse stören können;b. einer Zone, auf der vorher ein oder mehrere enzymmarkierte Antikörper oder Antigene adsorbiert worden sind, welche für die zu bestimmenden klinischen Parameter spezifisch sind;c. einer weiteren, sich an die vorausgehende Zone anschließenden Zone, auf welche die Antikörper, Antigene, AntiAntikörper oder Antikörper-Antigen-Komplexe, welche die zu bestimmenden Parameter bilden, vorher durch bekannte Mengen in einer Menge immobilisiert worden sind, welche zumindest gleich der der enzymmarkierten Antikörper oder Antigene ist, undd. einer Zone, auf der Chromogensubstrate für die Nutzung durch die antigen oder antikörperassoziierten Enzyme adsorbiert worden sind.
- 13. Vorrichtung zur Bestimmung klinischer Parameter des Typs, die durch das Aufsteigen oder Herabsinken von biologischen Flüssigkeiten transportiert werden können, welche die Form eines Rohres, Spezimen, Streifens, Kissens, Kolben, Films hat, gekennzeichnet dadurch, daß die Vorrichtung besteht ausa. einer ersten oder Trennzwischenzone, auf welche die Substanzen adsorbiert worden sind, die solche Verbindungen entfernen können, welche die betreffende Analyse beeinträchtigen können;b. einer Zone, auf die vorher ein oder mehrere enzymmarkierte Antikörper (gezogen im Vergleich zu einem oder mehreren Epitopen) adsorbiert wurden, welche für die zu bestimmenden klinischen Parameter spezifisch sind;c. einer Zone, auf der ein oder mehrere Antikörper (die im Vergleich zu einem oder mehreren Epitopen gezogen wurden, die sich von den durch die enzymassoziierten Antikörper der Zone b) erkannten Epitopen unterscheiden) immobilisiert wurden und Chromogensubstrat(e) reversibel adsorbiert oder immobilisiert ist (sind);d. einer Zone mit einem oder mehreren Auflagematerialien, die den Fluß der biologischen Flüssigkeiten zulassen.
- 14. Vorrichtung nach Punkt 12 oder 13, gekennzeichnet dadurch, daß sie aus einem oder mehreren Materialien besteht, die ausgewählt werden aus Glas, Metallen, synthetischen oder natürlichen Polymaterialien oder Papier, auf die in Form eines Gels, von Pulvern, Körnern, Mikrokügelchen, Filmen geeignete Auflagematerialien aufgebracht werden können, die für die einzelnen Zonen gleich oder verschieden sein können und ausgewählt werden aus Stärke, Diatomeenerde, Kaolin, BaSO4 oder TiO2.
- 15. Vorrichtung nach Punkt 12 oder 14, gekennzeichnet dadurch, daß die erste oder Zwischenzone (a) lonenaustauschharze, Enzyme wie Urease oder Protease, oxydierende oder reduzierende Substanzen, Antikörper oder Antigene als die Substanzen enthält, die Störsubstanzen entfernen können.
- 16. Vorrichtung nach einem der Punkte 12 bis 15 in der Anwendung zur Bestimmung eines Antigens, gekennzeichnet dadurch, daß sie besteht ausa. einer ersten Zone mit einem komplementären, enzymmarkierten Antikörper, der darauf reversibel adsorbiert ist;b. einer an die erste Zone angrenzenden Zone, auf der das gleiche Antigen in einer Menge immobilisiert ist, die der den enzymmarkierten Antikörpers wenigstens gleich ist;c. einer anschließenden Zone, welche die chromatografische Trennung und, als Option, die Interferenzbeseitigung bewirkt: undd. einer letzten Endzone, in der sich das Chromogensubstrat für das Enzym befindet.
- 17. Vorrichtung nach einem der Punkte 12 bis 15, gekennzeichnet dadurch, daß zur Bestimmung von Antikörpern die Vorrichtung besteht ausa. einer ersten Zone, auf welche das komplementäre, enzymmarkierte Antigen reversibel adsorbiert ist;b. einer an die ersten Zone angrenzenden Zone, auf welcher der gleiche Antikörper in einer Menge immobilisiert ist, die wenigstens gleich der des enzymmarkierten Antigens ist;c. einer Trennzone und — ~ ..d. einer Chromogennachweiszone.
- 18. Vorrichtung nach den Punkten 12 bis 15, gekennzeichnet dadurch, daß zur Bestimmung eines Antigens die Vorrichtung eine erste Zone hat, auf welcher der auf die Auflage aufgebrachte Antikörper mit dem enzymmarkierten Antigen voragglutiniert wird, eine Trennzone und eine Chromogennachweiszone.
- 19. Vorrichtung nach den Punkten 12 bis 15, gekennzeichnet dadurch, daß zur Bestimmung eines Antigens die Vorrichtung besteht aus einer ersten Zone, die mit einem enzymmarkierten Antigen versehen ist, einer zweiten Zone, aufweicher der Antikörper reversibel adsorbiert ist, einer Zone, die mit dem immobilisierten Anti-Antikörper versehen ist, und schließlich der Trenn- und Chromogennachweiszone.
- 20. Vorrichtung nach einem der Punkte 12 bis 19, gekennzeichnet dadurch, daß zur gleichzeitigen Bestimmung verschiedener klinischer Parameter jede der einzelnen Zonen (a) und (b) jeweils eine entsprechende Zahl von enzymmarkierten Antikörpern oder Antigenen und immobilisierten Antigenen oder Antikörpern enthält und verschiedene Chromogennachweiszonen vorhanden sind.
- 21. Vorrichtung nach einem der Punkte 12 bis 20, gekennzeichnet dadurch, daß die Vorrichtung geeignet ist für die Bestimmung von HCG, LH oder anderen Peptidhormonen, Progesteron, Estromglukuronid, Prägnandiolglukuronid oder anderen Steroidhormonen, Streptolysin, Immunglobulinen, Viren.
- 22. Vorrichtung nach einem der Punkte 12 bis 21, gekennzeichnet dadurch, daß die gesamte Vorrichtung mit Ausnahme der Anzeigezone, die aus transparentem (transparenten) Material(ien) ist, aus undurchsichtigem(n) Material(ien) ist.Hierzu 4 Seiten Zeichnungen
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