CZ94899A3 - Vakcinační přípravek použitelný při produkci aktivní imunity, použití a způsob jeho přípravy - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Způsob produkce aktivní imunity proti bakteriálnímu nebo protozoálnímu onemocnění subjektu zahrnuje aplikaci vakcinačního konjugátu subjektu, přičemž konjugát obsahuje živé bakterie nebo protozoa a neutralizující faktor vázaný na živé bakterie nebo protozoa. Neutralizující faktor se vybral ze skupiny zahrnující protilátky a fragmenty protilátek. Živé bakterie a protozoa jsou ty, které produkují onemocnění subjektu a protilátka a fragment protilátky je schopen neutralizovat živé bakterie a protozoa Je též popsáno použití a způsob přípravy vakciny.

Vakcinační přípravek použitelný při produkci aktivní imunity, použití a způsob jeho přípravy.

Oblast techniky

Vynález popisuje způsob produkce aktivní imunity proti bakteriálním nebo protozoickému onemocnění, který spočívá v aplikaci vakcinačního konjugátu subjektům. Vakcinační konjugát obsahuje živé bakterie nebo protozoa a neutralizující protilátky nebo jejich fragmenty.

Dosavadní stav techniky

V US patentech č. 5, 397,568 a 5, 397, 569 (Whitfill et al. ) se popisují způsoby produkce aktivní imunity proti virovému onemocnění aplikaci vakcinačního konjugátu, přičemž vakcinační konjugát obsahuje živý virus a virové neutralizující protilátky. Tyto publikace se vztahují pouze k virovému onemocnění.

Způsoby léčby kokcidiózy, což je protozoické onemocnění ptáků a savců způsobené různými druhy Eímiera, se popisují v US patentu č. 4,935, 007 (Baffundo et al.) a v US patentu č. 5,055,292 (McDonald et al.) . Inokulace ín ovo proti kokcidióze se popisuje v přihláškách PCT WO 96/40233 a 96/40234.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje způsob produkce aktivní imunity subjektu proti bakteriálnímu a protozoálnímu onemocnění. Způsob zahrnuje aplikaci vakcinačního konjugátu, který obsahuje živé bakterie nebo protozoa a neutralizující faktor vázaný na živé bakterie nebo protozoa. Neutralizující faktor se vybral ze skupiny zahrnující protilátky a fragmenty protilátek. Protilátka nebo fragment protilátky je schopen neutralizovat živé bakterie nebo protozoa. Vakcinační konjugát se aplikuje

2.

v množství, které je účinné při vyvolání imunitní odpovědi u subjektu proti živým bakteriím nebo prvokům.

Dále vynález popisuje použití pro výrobu vakciny pro produkci aktivní imunity proti bakteriálnímu nebo protozoálnímu onemocnění produktem, obsahující (i) živý organismus vybraný ze skupiny zahrnující bakterie a protozoa a (ii) neutralizující faktor vázaný na živé bakterie nebo protozoa. Neutralizující faktor se vybral ze skupiny zahrnující protilátky a fragmenty protilátek. Protilátka nebo fragment protilátky je schopný neutralizovat živé bakterie nebo protozoa.

Dalším aspektem předloženého vynálezu je způsob výroby vakciny pro produkci aktivní imunity proti bakteriálnímu nebo protozoálnímu onemocnění charakterizovaný tím, že je do vakcinačního přípravku vložen konjugát obsahující (i) živý organismus vybraný ze skupiny zahrnující bakterie a protozoa a (íí) neutralizující faktor vázaný na živé bakterie nebo protozoa. Neutralizující faktor se vybral ze skupiny zahrnující protilátky a fragmenty protilátek. Protilátka nebo fragment protilátky je schopný neutralizovat živé bakterie nebo protozoa.

Vynález dále popisuje produkt výroby zahrnující uzavřený kontejner, který nepropouští patogeny, a sterilní vakcinační formulaci popsanou shora v textu uzavřenou v uvedeném kontejneru.

Vynález popisuje vakcinační přípravek. obsahující živý organizmus (bakterie nebo protozoa) v komplexu s neutralizujícími protilátkami, které jsou specifické pro organizmus. Množství komplexů neutralizující protilátky je takové, že organizmus zůstává schopný indukovat aktivní imunitní odezvu, zatímco ve stejném okamžiku poskytuje určitý stupeň ochrany proti škodlivým účinkům patogenu. V současné době se věří, že výsledkem použiti vakcinačního komplexu bude jistá forma opožděného uvolnění patogenního organizmu.

• · · · · · • · · ·

• ·

Věří se, že vakcinační komplex nejdříve chrání vakcinovaný subjekt před patogeními účinky vakcinačního organizmu a nebo oddaluje jeho působení. Toto oddálení nebo počáteční ochrana je pouze dočasná (na rozdíl od toho, co se očekává při použití ···· ···· ·· ·· mrtvého nebo neaktivního vakcinačního organizmu). Vakcinační organizmus obsažený v komplexu infikuje subjekt, který indukuje aktivní imunitu. Míra oddálení závisí na množství použité protilátky, zvláště na vakcinačním organizmu a na vakcinovaném subjektu. Takové oddálení infekce je důležité v případě, že se vakcinují mladé subjekty, zvláště když se vakcinuje velké množství subjektů. Je například jednoduší a méně finančně náročné vakcinovat kuřata in ovo než vakcinovat čerstvě vylíhnutá kuřata.

V preferovaném provedení vynálezu se poskytuje neutralizující faktor v množství, které oddaluje projevení patologických změn spojených s infekcí subjektu živým vakcinovaným organizmem. Oddálení je komparativní; patologické změny jsou oddáleny ve srovnání s těmi, ke kterým dojde, jestliže se bude živý vakcinační organizmus aplikovat bez přítomnosti neutralizujícího faktoru v komplexu.

Použití uvedených vakcinačních konjugátů je méně nebezpečné než použití nekojugovaného organizmu ještě schopného indukovat ochrannou aktivní imunitní odpověď. Termín „méně nebezpečné zde znamená, že výhody vakcíny u většiny vakcinovaných jednotlivců převažují nad libovolným nebezpečím.

Protilátky používané podle vynálezu jsou protilátky neutralizující bakterie nebo protozoa. Protilátky neutralizující bakterie nebo protozoa jsou ty, které bojují s nakažlivostí bakterií nebo prvoků in vivo, v případě, že se umožní bakteriím nebo prvokům a protilátkám společně reagovat po dostatečnou dobu. Zdroj bakteriálních nebo protozoálních neutralizujících protilátek není rozhodující. Mohou pocházet z libovolného zvířete, zahrnující ptáky (např. kuře, krocan) a savce (např. krysa, králík, koza, kůň). Protilátky neutralizující bakterie a protozoa mohou být polyklonální nebo monoklonální, což se popisuje například v publikacích M. Walker et al., 26 Molecular Immunology 403 (1989).

• · • ••4 • 4 4

Protilátky neutralizující bakterie a protozoa podle vynálezu mohou být imunolgobíny libovolného izotypu zahrnující IgM, IgG, IgA, IgD, a IgE. Více se preferují IgG a IgM, nejvíce preferované imunoglobíny jsou IgG (např. IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4).

Fragmenty protilátek podle vynálezu jsou fragmnety protilátek neutralizující bakterie a protozoa, kterým zbyla variabilní oblast jejich vazebného místa. Příkladem jsou fragmenty F(ab')₂, F(ab) a Fab, které se popisují v publikaci Immunology: Bsaic Processess, 95-97 (J. Bellanti Ed. 2d ed.

1985).

Protilátky nebo fragmenty protilátek podle vynálezu mohou mít připojené další elementy. K protilátce nebo k fragmentům protilátek se například může připojit mikrosféra nebo mikropartikule, jak se popisuje v US patentu č. 4,493,825 (Platt) .

Vynález se zvláště s výhodou používá v případě bakterií nebo prvoků, které by byly pro léčený subjekt patogenní (to znamená, že jsou schopny způsobit onemocnění), když netvoří konjugaci s neutralizujícím faktorem. Patogenita bakterií nebo prvoků může tkvít v samotných bakteriích nebo prvocích nebo ji způsobuje náchylnost léčeného subjektu (například ptáci in ovo). Řada patogenních bakterií nebo prvoků vyvolává u jimi infikovaných subjektů aktivní imunitu a řada atenuovaných vakcinačních kmenů bakterií a prvoků má schopnost způsobovat u subjektů alespoň některé onemocnění. Proto termín „patogenní popisující bakterie nebo protozoa znamená, že způsobené poškození subjektu aplikací bakterií nebo prvoků předčí jakoukoli výhodu, která bude výsledkem jejich aplikace. Termíny „aktivní nebo „živý organizmus označují organizmus, který není usmrcen. Termín „vakcínační oragnizmus označuje ten organizmus, který se používá při indukci ochranné imunitní odpovědi, dokonce i v případě, kdy se může objevit negativní vedlejší účinek (v takovém případě výhoda indukce aktivní ·♦ · ·· ···· imunity převládá nad negativními vedlejšími účinky). Preferuje se, aby bakterie nebo protozoa byly živé organizmy schopné produkovat aktivní imunitní odpověď léčeného subjektu. Vakcinační konjugát je obsažen ve vakcinačních formulacích v takovém množství na jednotkovou dávku, aby vyvolalo u léčeného subjektu aktivní imunitní odpověď proti bakteriím nebo prvokům. Termín „imunitní odpověď znamená libovolný stupeň ochrany před následným vystavením působení bakterií nebo prvoků, která pro populaci subjektů přináší jisté výhody ať už ve formě snížené úmrtnosti, snížení výskytu lézi, zlepšení poměru konverze krmivá nebo redukce libovolného jiného škodlivého účinku onemocnění bez ohledu na to, zda ochrana je částečná nebo úplná.

S ohledem na stupeň ochrany, který poskytuje neutralizační faktor, není nutné, aby množství neutralizačního faktoru aplikovaného v kombinaci s bakteriemi nebo prvoky ve vakcíně bylo dostatečné k poskytnutí celkové ochrany proti bakteriím nebo prvokům, pokud škodlivá odezva vyvolaná bakteriemi a prvoky je redukována na úroveň, při které výhody imunitní odpovědi převládají nad libovolnou újmou vyplývající z infekce.

Termín „subjekty zahrnuje mezi jinými savce a ptáky. Příklady savců jsou myši, krysy, prasata, vepři, králíci, ovce, fretky, psi, kočky, krávy, koně a primáti, zahrnují také člověka. Termín „pták zahrnuje samce a samice libovolného ptačího druhu, ale primárně se zdůrazňuje drůbež, která se chová na maso nebo pro vejce. Termín „pták zvláště zahrnuje kuřata, krocany, kachny, husy, křepelky a bažanty.

Bakterie, které se využívají v souladu s vynálezem zahrnují, ale neomezují se na Avtinobacillosis lignieresi, Actinomyces bovis, Aerobacter aerogenes, Anaplasma marginale, Bacíllus anthracis, Borrelia anserina, Brucella canis, Clostridium chauvoei, C. hemolyiticium, C. novy, C. perfringens, C. septicum, C. tetani, Corynebacterium equi, C. pyogenes, C.

• fl flflfl · • fl ·♦ » flfl ⁴ hyopneumoniae, anatipestifer, renale, Cowdria ruminantium, Dermatophilus congolensis,

Erysipelothrix insidiosa, Escherichia coli, Fusiformis necrophorus, Haemobartonella canis, Hemophilus spp. H. suis,

Leptospira spp. , Moraxella bovis, Mycoplasma spp. M.

Nanophyetus salmincola, Pasteurella

P. hemolytica, P. multocida, Salmonella abortus-ovis, Shigella equirulis, Staphylococcus aureus, S. hyicus S. hyos, Strepococcus agalactiae, S.dysgalactiae, S. equi, S. uberis a Vibrio fetus (odpovídající onemocnění se popisuje v publikaci Veterinary Pharmacology and Therapeutics 5^th Edition, pg 746 Table 50.2 (N. Booth and L. McDonald Eds., 1982) (Iowa State University Press); a Corynobacterium diptheriae, Mycobacterium bovis, M. leprae, M. tuberculosis, Nocardia asteroides, Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, C. difficile, C. perfringens,

Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae,

Bordetella pertusiss, Pseudomonas aeruginos,

C. tetani,

S. pyoenes, Campolybacter

Neisseria

Rickettsia gonorrhoeae, mooseria, R jejuni, Brucella spp., Francisella tularenssis, Legionella pneumophila, Chlamydia psittaci, C. trachomítas, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, S. typhimurium, Yersinia enterocolitica, Y. pestis, Vibrio cholerae, Haemophilus influenza, mycoplazma pneumoniae,

N. meningitidis, Coxiella burneti, prowazekii, R. ricketesii, R. tsutsugamushi, Borrelia spp., Leptospira interrogans, Treponema pallidum a Listeria monocytogenes (odpovídající onemocnění se popisují v publikaci R. Stainer et al., The Microbial World, pg. 637-38 Table 32.3 (5^th Edition 1986)).

Protozoa, která se používají podle vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny na agens způsobující kokcodiózu druh Eimeria (E. tenella, E.necatrix, E. brunetti, E. acervulina, E. mivati a E. maxima), Anaplasma marginela, druh Giardia (například Giardia lamblia), druh Babesia (například B. canis, B. gibsoni, B. equi, B. caballi, B. bigemina, B. argentina, B.

···· ·· ···· divergens, a Β. bovis), Trichomonas foetus, Entamoeba histolytica a Balentidium coli; druh Plasmodium (například P. falciparum, P. maiariae, P. vaívax a P. ovále), druh Leishmania (například L. donovani, L. braziliensis, L. tropica a L. mexicana), druh Trypanosoma (například T. bručel a T. cruzi), Entamoeba histolytica, Trichomonas vaginalis, Toxoplasmosa gondií a Pneumocystís carinii. Termín „ptačí prvok znamená ten prvok, který infikuje ptáky.

Organizmy se aplikují v libovolné vhodné formě zahrnující jejich spory nebo cysty. Infekční kokcidiální organizmy se mohou aplikovat ve formě sporulovaných oocyst, sporozoit a sporocyst.

Přesný počet organizmů, které se aplikují ve formě konjugátu není rozhodující, ale jejich počet musí být účinný při vyvolání imunologické odpovědi u zvířete. V závislosti na aplikovaném organizmu, místu a způsobu aplikace, věku a stavu subjektu atd., se počet organizmů pohybuje v rozmezí od 1, 10 nebo 100 organizmů až do 1 000, 10 000, 100 000 nebo 1 000 000 organizmů. V případě, že organizmy se aplikují ptákům in ovo (do vajec) ve formě konjugátu, dávka se pohybuje od 50, 100 nebo 500 až do 2 000, 10 000, 20 000, 30 000, 50 000 nebo 100 000 organizmů nebo více.

Subjektům se mohou aplikovat vakcíny podle vynálezu libovolným vhodným způsobem. Například orální aplikací, intramuskulární injekcí, podkožní injekcí, intravenózní injekci, intraperitonální injekcí, ve formě očních kapek nebo nosního spreje. V případě, že léčeným subjektem je pták, může jít o vylíhnutého ptáka, čerstvě vylíhnutého ptáka (to znamená první tři dny po vylíhnutí), adolescenční ptáky a dospělé ptáky. Ptákům se může aplikovat vakcína in ovo, jak se popisuje v US patentu č. 4,485,630 (Sharma).

Aplikace vakcíny in ovo zahrnuje zavedení do vejce. Vejce vhodná pro aplikaci vakcíny podle vynálezu jsou oplodněná vejce s výhodou ve čtvrté čtvrtině inkubace. V případě • 4 ··«· • 444 • 4 ·· • 4 4 4 4 · 4 • · 4 · · · 4 • · · · 444444 • · · · · 4 ·· <4 44 ·♦ kuřecích vajec se vakcína aplikuje přibližně 15. až 19. den inkubace, nejvýhodnější je aplikace přibližně 18. den inkubace (18. den vývoje embrya). Vejce krůty se přednostně ošetřují přibližně 21. až 26. den inkubace, nejvýhodnější se jeví aplikace přibližně 25. den inkubace.

Vakcína podle vynálezu se do vajec aplikuje způsobem, který transportuje látku skořápkou. Preferovanou metodou aplikace je však injekce. Místo infekce je s výhodou buď v oblasti definované jako amnion, která zahrnuje amniotickou kapalinu a samotné embryo ve žloutkovém vaku nebo ve vzduchové bublině. Upřednostňuje se, aby se injekce aplikovala do oblasti definované amnionem. Na začátku čtvrté čtvrtiny inkubace je amnion dostatečně zvětšen, takže jeho penetrace je jistá skoro ve všech případech, kdy se injekce provádí z prostředku velkého konce vejce podél podélné osy.

Mechanizmus zavedení injekce do vejce není podstatný, ale preferuje se, a aby zvolený způsob nadměrně nepoškodil tkáně a orgány embrya nebo extraembryonální membrány, které je obklopují, aby ošetření vajec nezrychlilo líhnutí. Pro tyto účely je vhodná hypodermická stříkačka s jehlou o přibližné velikosti 18 až 22. Při injekci do vzduchové bubliny je nutné jehlu zavést do vejce maximálně dva milimetry pod skořápku. Jehla o délce 2,5 cm, která se celá zavede do vejce z prostředku velkého konce vejce, projde skořápkou, vnější a vnitřní membránou uzavírající vzduchovou bublinu a amnion. V závislosti na skutečném stádiu vývoje a poloze embrya konec jehly o této délce se nachází buď v kapalině nad zárodkem kuřete nebo v samotném zárodku. Před zavedením jehly, aby nedošlo k jejímu poškození, je možné prorazit nebo navrtat do skořápky pokusnou dírku. Je~li to nutné, aby se zabránilo proniknutí dalších nežádoucích bakterií, vejce se může uzavřít materiálem, který v podstatě nepropouští bakterie, jako je vosk nebo podobně.

·· *·*· • *·<· ·· 4 • · • » • 4 • ·· · • · » • · · · • · 4 · • · *· ·» ·· • · · · • 4 · · • 9 4 ··· • · ··

Je zřejmé, že automatizované injekční systémy s vysokými rychlostmi jsou pro účely vynálezu v případě ptačích embryí částečně vhodné. Řada takových přístrojů je dostupných. Popisují se v US patentech č. 4,681,063 (Hebrank) a US patenty č. 4,040,388; 4,469,047 a 4,593,646 (Miller). Všechny takové přístroje adaptované pro účely vynálezu zahrnují injektor obsahující zde popsanou vakcínu, umístěný tak, aby injektoval vejce, které je uchyceno v přístroji. Další rysy aparátu se popisují shora v textu. Dále se pro účely uzavření díry po injekci, je-li to nutné, operativně spojí injekční aparát se zatavovacím přístrojem.

Preferovaný injekční přístroj podle vynálezu se popisuje v US patentech č. 4,681,063 a 4,903,635 (Hebrank). Toto zařízení zahrnuje injekční aparát pro zavedení kapalných substancí do velkého množství vajec a přístroj z podtlakem, který současně nabere a zvedne velké množství jednotlivých vajec za jejich nahoru směřující části a kooperuje s injekčním aparátem, aby došlo k injekci. Rysy tohoto aparátu se pro použití podle vynálezu mohou kombinovat z rysy přístroje, který se popisuje shora v textu. Preferovanými subjekty pro provedení vynálezu jsou ptáci.

Vakcinační konjugát podle vynálezu se připravuje mícháním neutralizujícího faktoru s živými bakteriemi a prvoky ve farmaceuticky přijatelném nosiči po dostatečně dlouhou dobu, aby vznikl konjugát živé bakterie nebo protozoa-neutralízující faktor (například před aplikací subjektu se konjugát tvoří kombinací neutralizujícího faktoru a bakterií nebo protozoa v běžném kapalném nosiči). To jednoduše probíhá jednoduchým přidáním hyperimunního séra, které obsahuje neutralizující protilátky, k vodnému roztoku obsahujícímu živé bakterie nebo protozoa. Vakcinační formulace podle vynálezu s výhodou obsahuje vakcinační konjugát v lyofilizované formě nebo vakcinační konjugát ve farmaceuticky přijatelném nosiči. Farmaceuticky přijatelné nosiče jsou s výhodou kapaliny, • · • · · · · ·· ······ • · · · · · · · ···· ·· ίβ ·· « · zvláště vodné nosiče. Pro účely přípravy takových vakcinačních formulací se mohou neutralizující faktory a bakterie nebo protozoa smísit ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanem sodným (pH 7,4), v běžném médiu, jako je MEM nebo v bakteriálním růstovém médiu. Vakcinační formulace se může uchovávat ve sterilním skleněném kontejneru uzavřeném gumou, přes kterou se kapaliny mohou přidat a naopak formulace se může vytáhnout stříkačkou.

Vakcinační konjugát nebo komplex podle vynálezu je komplex nebo konjugát protilátek a živých vakcinačních organizmů; vazbu mezi protilátkou vakcinačním organizmem je možné uvolnit, nejde o kovalentní vazbu. Množství neutralizujících protilátek vhodné pro použití s daným vakcinačním organizmem a daným subjektem se může jednoduše stanovit metodami dostupnými v oboru. Při použití příliš malého množství protilátek dojde k silným patogenním účinkům vakcinačního organizmu nebo se jeho účinky projeví příliš brzo; při použití příliš velkého množství protilátek může dojít k úplné deaktivaci vakcinačního organizmu nebo nelze indukovat ochrannou imunitní odpověď.

Vakcinační formulace podle vynálezu mohou obsahovat jedno nebo více adjuvans. Může se použít libovolné vhodné adjuvans zahrnujíci chemické a polypeptidové imunostimulátory, které zvyšují odpověď imunitního systému proti antigenům. Adjuvans, jako je hydroxid hlinitý/ fosforečnan hlinitý, rostlinné a zvířecí oleje a podobně se s výhodou aplikují s vakcinačním konjugátem v množství, které je dostatečné, aby zesílilo imunitní odpověď subjektu na vakcinační konjugát. Množství adjuvans, které se přidává k vakcinačnímu konjugátu značně závisí na podstatě adjuvans. V obecném případě se pohybuje v rozmezí od přibližně 0,1 do přibližně 100 násobku hmotnosti protozoa nebo bakterií. S výhodou se pohybuje v rozmezí od přibližně 1 do přibližně 10-ti násobku hmotnosti bakterií nebo protozoa.

0 ·· 0 00 0 0 · 0 0 • 0 000 ·000 • · 00 · · · 000 000

0000 0 0

0000 00 00 0» ·0 Vakcínační formulace podle vynálezu mohou obsahovat jeden nebo více stabilizátorů. Může se použit libovolný vhodný stabilizátor zahrnující sacharidy, jako je sorbitol, manitol, škrob, sacharózu, dextrin nebo glukózu; proteiny, jako je albumin nebo kasein; a pufry, jako jsou fosforečnany alkalických kovů a podobně. Použití stabilizátoru je zvláště výhodné, vakcinační formulace je lyofolizovaná formulace.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 je graf znázorňující srovnáni produkce oocyst u ptáků vakcinovaných vakcinačním konjugátem, který obsahuje 500 oocyst E. acervulina v komplexu buď s 2,5, 25 nebo 150 μΐ polyklonální protilátky, a u kontroly, která není vakcinovaná (cntrl), a u kontroly vakcinované pouze oocysty bez přítomnosti protilátky. K měření infekčnosti se používá produkce oocyst.

Na obrázku č. 2 je graf znázorňující srovnání produkce oocyst u ptáků vakcinovaných vakcinačním konjugátem, který obsahuje 500 oocyst E. acervulina v komplexu buď s 25 nebo 150 μΐ polyklonální protilátky, a u kontroly, která není vakcinovaná (cntrl), a u kontroly vakcinované pouze oocysty bez přítomnosti protilátky. K měření infekčnosti se používá produkce oocyst.

Na obrázku č. 3 je graf znázorňující produkci oocyst po vakcinaci a aplikaci nízké dávky E. acervulina. Při vakcinaci se použil vakcinační konjugát, který obsahuje 500 oocyst E.acervulina v komplexu buď s 2,5, 25 nebo 150 μΐ polyklonální protilátky; jako kontroly slouží kontrola, která není vakcinovaná (cntrl) a kontrola vakcinované pouze oocysty bez přítomnosti protilátky (0).

Na obrázku č. 4 je znázorněn graf váhových přírůstků u ptáků (v gramech) po vakcinaci aplikaci a vysoké dávky E.

acervulina. Při vakcinaci se použil vakcinační konjugát, který φ · φφφφ tt φφ • * · φ φ φ φφφφ • · · · · φφφφ • · · · · · φ φφφφφφ φφ ΦΦ·Φ φ φ φφφφ φφ φφ φ φ φφ obsahuje 500 oocyst Ε.acervulina v komplexu buď s 25 nebo 150 μΐ polyklonální protilátky; jako kontroly slouží kontrola, která není vakcinovaná (cntrl) a kontrola vakcinovaná pouze oocysty bez přítomnosti protilátky (0).

Na obrázku č. 5 je graf znázorňující stav lézí u ptáků po vakcinaci a aplikaci vysoké dávky E. acervulina. Při vakcinaci se použil vakcinační konjugát, který obsahuje 500 oocyst E.acervulina v komplexu buď s 25 nebo 150 μΐ polyklonální protilátky; jako kontroly slouží kontrola, která není vakcinovaná (cntrl) a kontrola vakcinované pouze oocysty bez přítomnosti protilátky (0).

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1: Bakteriální druhy

Bakterie Pasteurella multocida způsobuje akutní vysoce nakažlivé onemocnění u mnoha ptačích druhů. Onemocnění Fowlova cholera se často objevuje jako septické onemocnění způsobující vysokou morbiditu a mortalitu. Proti Fowlově choleře existuje několik živých vakcín, které se mohou aplikovat jak u kuřat tak u krůt.

Kmen P. multocida tvoří in vitro komplexy s protilátkami specifcikými k P. multocida za vzniku komplexů bakterieprotilátka. Za účelem stanovení poměru, při kterém bakterie zůstávají ještě aktivní a který stále umožňuje vznik aktivní imunitní odpovědi, se testovaly různé poměrové zastoupení bakterie a protilátka. Tyto komplexy se používají jako vakcína u kuřat i krůt. Sleduje se odpověď na vakcínu a porovnává se odpověďmi ptáků, které se vakcinovaly stejnou dávkou vakciny obsahující pouze P. multocida bez protilátek. Během testu se sledují léze po vakcinaci, časový průběh protilátkové odpovědi a obecný zdravotní stav ptáků.

Podobným způsobem se také testují jiné bakterie . Tyto bakterie zahrnují, ale nejsou omezeny na Mycoplasma gallísepricum u kuřat nebo krůt, Bordetella avium u krůt, druhy Salmonella u kuřat nebo krůt a druhy Salmonella a

Li steria u hlodavců.

Vakcinační konjugát se aplikuje u ptáků buď in ovo, jak se popisuje shora v textu, nebo po vylíhnutí.

Příklad 2: Protozoální druhy

Prvok Eimeria acervulina (přesněji jeho sporocysty nebo oocysty) je v komplexu in vitro s protilátkami specifickými k Eimeria acervulina za vzniku komplexů protozoa-protilátky. Tyto komplexy se používají při vakcinaci kuřat. Sledují se odpovědi na vakcinační komplexy protozoum~protilátka a porovnávají se s odpověďmi ptáků vakcinovaných stejnou dávkou E. acervulina, která není v komplexu s protilátkou. Za účelem stanovení poměru, při kterém zůstává protozoum ještě aktivní a stále umožňuje aktivní imunitní odpověď, se testují rozdílná zastoupení prvoka a protilátky. Po vakcinaci se sleduje množství oocyst ve fekáliich, absorpční schopnost střev (což se stanovuje absorpcí kartenoidů) a tělesná váha. 10 až 21 dní po vakcinaci ptáků se každé vakcinované skupině ptáků aplikuje virulentní injekce s £. acervulina, U vakcinovaných jedinců a u nevakcinované kontroly se stanovuje množství oocyst ve fekáliich, přírůstek tělesné hmotnosti během doby aplikace virulentních kmenů a absorpční schopnost střev (což se stanovuje absorpcí kartenoidů).

U kuřat, krůt nebo hlodavců se také testují jiné druhy Eimeria, stejně jako u kuřat nebo krůt se testují Cryptosporidium a Histomonas meleagridis.

Vakcinační konjugáty se aplikovaly ptákům buď in ovo, jak se popisuje shora v textu, nebo po vylíhnutí.

Příklad 3: Produkce oocyst Eimeria následující po vakcinaci • · · · • · · ·· · · · · · • · 4 4 · 4 · 4 4

4 44 4 44 44·«·· • · ···· · ·

4·· · · ·· ·· · ·

Za účelem stanovení účinků vakcinačních komplexů oocyst E. acervulina s protilátkou se studovala vakcinovaná kuřata. Studovaly se čtyři vakcinační strategie. Léčené skupiny se vakcinovaly (orální výživou) s 500 sporulovanými oocystami E. acervulina v komplexu buď s 0, 2,5, 25 nebo 150 jednotkami polyklonální protilátky specifické pro E. acervulina. Každá léčba se aplikovala ve třech skupinách pěti kuřat (Leghorn) (v každé skupině se nacházelo celkem 15 ptáků; celkem se léčilo 60 ptáků). Kontrolní skupině tvořené 15-ti ptáky (5 ptáků ve třech opakováních) se neaplikovaly žádné oocysty ani protilátka, ale jeden den po vylíhnutí se podalo formou orální výživy 0,1 ml PBS, pak se následně exponovaly organizmu. Jednotky protilátek se definovaly na volumetrickém základě, kde 1 μΐ se rovná 1 jednotce. Test ELISA se použil pro stanovení „titračních jednotek přípravku protilátek, který se používal v tomto příkladu; test se však nevalidoval. Podle testu ELISA přípravek protilátek E. acervulina měl titr 90 782 jednotek/ml. Zde používané dávky poskytují relativní srovnání; správné množství protilátky použitelné v komplexu s daným organizmem závisí na organizmu, na protilátkovém přípravku a subjektu. Odborník použitím metod známých v oboru bude schopen pro dané použití stanovit správný poměr organizmus:protilátka. Oocysty a protilátky se před vakcinací smíchají dohromady v PBS po dobu minimálně jedné hodiny při teplotě místnosti. Vakcinační komplex se pak uchovává při teplotě 4 °C až do doby aplikace. Kuřata se vakcinovala v den vylíhnutí.

Za účelem stanovení produkce oocyst po vakcinací se 4 až 8 dní po vakcinací shromažďovaly výkaly a počítaly se v nich oocysty. U každé skupiny se stanovila střední a standardní odchylka produkce oocyst. Jak ukazuje tabulka č. 1, při použití 150 μΐ protilátky v komplexu s 500 oocysty se podstatně redukuje produkce oocyst.

Tabulka č. 1

9 999 «9 99·· 99 99 ·· 9 ·· 9 9999

9 ··· 9999 • 9 99 · 99 ······

9999 9 9

9999 9999 9999

Infekčnost - produkce oocyst na jednoho ptáka

Léčba vakcínou	Průměr oocyst/pták (xlO6)
Nic
Střed	0, 00
Standardní odchylka	0, 00
N	31 2
0 μΐ Abs + oocysty	(a)1
Střed	11,65
Standardní odchylka	2,91
N	32
2,5 μΐ Abs + oocysty	(a)1
Střed	10,18
Standardní odchylka	2,54
N	32
25 μΐ Abs + oocysty	(a)1
Střed	10, 61
Standardní odchylka	4,28
N	32
150 μΐ Abs + oocysty	(b)1
Střed	5,40
Standardní odchylka	1,94
N	32

1. a,b: odlišovány při stupni 0,15 testem LSD. Hladina významnosti je 0,20, což je způsobeno malým počtem vzorků. Kontroly se nezahrnuly do statistického modelu.

2, N jsou tři skupiny po pěti ptácích.

Příklad 4: Produkce oocyst Eimeria následující po expozici

Ptáci v léčené skupině popsáni v příkladu 1 se pak exponovali třináctý den po vylíhnutí 250 oocyty E. acervulina v PBS, které se aplikovaly orální výživou. Čtvrtý až osmý den po expozici se shromáždily fekálie a stanovila se průměrná produkce oocyst jako procento produkce oocyst kontrolní skupiny (statistický model zahrnuje kontrolní skupinu).

• · 4 4 · 44 444444 • 4 4444 4 4

4 4 4 4 4 ·· 4 4 44

Výsledky se uvádějí v tabulce č. 2. Větší produkce oocyst, která následuje po expozici indikuje menší ochranu proti expozici patogenu.

Tabulka č. 2 Ochrana po expozici

Léčba vakcínou	Průměrná oocyst na expozici	produkce ptáka; po (x 10s)	Průměr oocyst kontroly)2	(%
Kontrola2		A1		A1
Střed		23,08		100,00
Standardní	odchylka	1, 67		7,22
N		3		3
0 μΐ Abs +	oocysty	C1		C1
Střed		5,20		22, 54
Standardní	odchylka	0,72		3,13
N		3		3
2,5 μΐ Abs	+ oocysty	B1		C1
Střed		8,72		37,76
Standardní	odchylka	2,45		10, 60
N		3		3
25 μΐ Abs +	oocysty	B1		B1
Střed		9,76		42,29
Standardní	odchylka	1,78		7,70
N		3		3
150 μΐ Abs	+ oocysty	B1		B1
Střed		10,49		45,47
Standardní	odchylka	2,33		10,10
N		3		3

1. A,B,C: odlišovány při stupni 0,05 testem SNK.

2. Jako kontrola se používají exponovaní ptáci, kteří nejsou vakcinováni.

Příklad 5: Ochrana proti následující expozici

Data uvedená v tabulce č. 2 se znovu analyzovala, aniž se do statistického modelu zahrnula kontrolní skupina dat. Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 3.

• ·· · · · · · · • · · · · • · · · · · ····

Tabulka č. 3

Léčba vakcínou	Průměr expozici	oocyst (x 106)	po	Průměr oocyst kontroly)2	(%
Kontrola2
Střed	23,08			100,00
Standardní odchylka	1,67			7,22
N	3			3
0 μΐ Abs + oocysty
	B1			B1
Střed	5,20			22,54
Standardní odchylka	0,72			3,13
N	3			3
2,5 μΐ Abs + oocysty
	ΆΒ1			ΆΒ1
Střed	8,72			37,76
Standardní odchylka	2,45			10, 60
N	3			3
25 μΐ Abs + oocysty
	A1			A1
Střed	9,76			42,29
Standardní odchylka	1,78			7,70
N	3			3
150 μΐ Abs + oocysty
	A1			A1
Střed	10,49			45, 47
Standardní odchylka	2,33			10,10
N	3			3

1. A,B,Č: odlišovány při stupni 0,05 testem SNK.

2. Jako kontrola se použivaji exponováni ptáci, kteří nejsou vakcinováni.

Výsledky uvedené v příkladech 1 až 3 indikují, že použití 150 μΐ protilátek v konjugaci s vakcinační dávkou 500 oocyst E. acervulina vede ke zmírnění patogenních účinků vakcinace (porovnává se použití stejné vakcíny s menším, množstvím protilátek nebo bez protilátek; což se projevilo snížením produkce oocyst po vakcinaci) nebo k oddálení patogenních účinků vakcinační dávky. Jak je uvedeno v tabulce č. 1, použití 150 μΐ protilátek v konjugaci s vakcinačními oocysty vede ke snížení infekčnosti ve srovnání s vakcínou, která

9 ··· 999

9 9 » 9 9 9 9 <

neobsahuje protilátky nebo menší množství protilátek (p

0,15) .

Jak ukazuje tabulka č. 2, ptáci vakcinováni vakcinou s nevakcinovanými ptáky E. acervulina redukovanou indikují, že vakcinační protilátka-oocysty ve srovnání vykazují po expozici 250 oocyst produkci oocyst. Tyto výsledky přípravek obsahující protilátku-oocysty je účinný při indukci ochranné imunitní odpovědi proti expozici patogenu. Ochrana byla nejvyšší ve skupině léčených vakcinou s oocystami, ale bez protilátek. Hladina významnosti je 0,05. Jak je uvedeno v tabulce č. 3, mezí ptáky léčenými vakcinou protilátkaoocysty nejvyšší ochrany opět dosáhla skupina léčená oocysty bez protilátky.

Shora uvedené výsledky indikují, že použití vakcinačního komplexu protilátka a oocysty vedou ke snížení patogenních účinků vakcinačních ooccystů nebo k oddálení účinků vakcinačních oocystů, zatímco stále ochrannou imunitní odpověď. Očekávají se oba účinky, čímž se zvýší bezpečnost vakcíny a pak je možné aplikovat vakcíny subjektům, které jsou více citlivé na patogenní účinky vakcinačního organizmu nebo velmi mladým subjektům (jako jsou ptáci in ovo).

patogenních vyvolávají

Příklad 6: Použití vakcinačního konjugátu protilátka-oocysty (Eimeria acervulina) v imunizačním modelu s nízkou dávkou

V této studii se testoval vakcinační komplex 500 oocyst Eimeria acervulina s kolísavým množstvím protilátky (2,5 až 150 μΐ) . Léčba se srovnávala s kontrolou, která nebyla vakcinována, a s kontrolou vakcínovanou bez protilátek. Všechny vakcíny se aplikovaly v den vylíhnutí. V případě všech vakcín se měřila 4. až 8. den po vakcinaci produkce oocyst. Produkce oocyst se také měřila po 13. dni, kdy došlo k expozici patogenu.

* * · · · · · · a i ί ·::.:···:··:

···· ·· ·· ·*··*

Materiály a metody:

Kuřata Hyvac SPF Leghorn se použily k vyloučení účinku mateřských protilátek. Polyklonální protilátky se produkovaly z kuřat imunizovaných oocysty E. acervulina. Kombinovaly se dva protilátkové přípravky za vzniku protilátek E. acervulina s konečným titrem 90 782. Léčené skupiny a uspořádání pokusů se uvádí v tabulce č. 4.

Tabulka č. 4

Léčba	Dávka oocyst	Protilátky (μί)	Počet ptáků v souboru	Počet souborů	Celkový počet ptáků
1 (Α,Β,Ο	0	0	5	3	15
2 (Α,Β,Ο	500	0	5	3	15
3 (Α,Β,Ο	500	2,5	5	3	15
4 (Α,Β,Ο	500	25	5	3	15
5 (Α,Β,Ο	500	150	5	3	15

Vakcinační komplex vznikl smíšením oocyst (USDA #12 Lot 28-13136) s protilátkou ve správném objemu. Komplex se inkuboval jednu hodinu před aplikací při teplotě okolí. Ptákům se v den vylíhnutí sondou do žaludku podala dávka 200 μϊ. Od čtvrtého dne do osmého dne se shromáždil fekální materiál. Zpracovaly se fekální vzorky a za použiti McMasterovi komůrky se stanovila produkce oocyst na jednoho ptáka.

Ptáci se přenesly do jednotek líhně a 13. den po vylíhnutí se exponovaly nízkou dávkou patogenu (250 oocyst E. acervalina). 4. až 8. den po expozici se shromáždily vzorky fekálií a spočítala se produkce oocyst, jak se uvádí shora v textu. Vakcinovaná kontrola vykazuje produkci oocyst na jendoho ptáka přibližně 12 x 10®. Léčba s 2,5 μϊ a 25 μΐ vykazuje podobné výsledky. Léčba 150 μΐ protilátky může inhibovat produkci oocyst. Vykazuje pouze 46 % produkce ve srovnání s kontrolou, což je zobrazeno na obrázku č. 1.

444· ♦ 4 4 4 · ·· · 9 9 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4

4 44 4 44 444444

4444 · 4

44 44 44 44 44

Po expozocí nízkou dávkou bylo možné vidět podobné výsledky u všech léčených skupin vakcinovaných protilátkou. Tři skupiny léčené protilátkou dosáhly přibližně 40 % produkce kontroly. Vakcinovaná kontrola vykazuje pouze produkci 23 % kontroly.

Příklad 7: Použití vakcinačního konjugátu protilátka-oocysty (Eímeria acervulina) v imunizačním modelu s vysokou dávkou.

V imunizačním modelu s vysokou dávkou se testovaly dvě formulace vakcinačních konjugátů protilátka-oocysty. Nakažlivost se měřila produkcí oocyst a odpověď na expozici se stanovila jako přírůstkem hmotnosti a skóre lézí. Vakcinační konjugáty obsahují 500 oocyst E. acervulina v komplexu s buď 25 μΐ nebo 150 μΐ protilátky (jak se popisuje v příkladu 6) ; což se uvádí v tabulce č. 5. Použil se stejný ptačí kmen, protilátka a oocysty jako v příkladu 6 shora v textu.

Tabulka č. 5

Léčba	Dávka oocyst	Protilátky (μΐ)	Počet ptáků v souboru	Počet souborů	Celkový počet ptáků
1 (A, B,C)	0	0	10	3	30
2 (A, B,C)	500	0	10	3	30
3 (A,B,C)	500	25	10	3	30
4 (A,B,C)	500	150	10	3	30

Vakcíny se připravily, jak se popisuje shora v textu a aplikovaly se v den 0 po vylíhnutí v objemu 200 μΐ. V den 4 až 8 se shromáždil fekální materiál a počítala se produkce oocyst.

Parametry po expozici měřené v tomto experimentu se liší od parametrů získaných v příkladu 6. V den 13 se všechny léčené skupiny vystavily expozici ve vysoké dávce a zaznamenala se tělesná váha každého jednotlivého ptáka. Po osmi dnech (den 21) se ptáci vážily a určilo se skóre lézí.

• 0000 00 «000 0« 00 · · · · · · 0 « • * 000 0000 • 0 ·0 · 00000 000

0000 · *

0000 00 00 00 40

Produkce lézí v tomto experimentu ve srovnání s příkladem 6 byla nižší u vakcinované kontroly stejně jako v případě léčby dvěma protilátkami; vakcinovaná kontrola (kde nebyly aplikovány protilátky) vykazuje 20-ti násobné snížení produkce oocyst (obrázek č. 2) . Co způsobuje tuto redukci není jasné. Všechny léčené skupiny se vystavily expozici s vysokou dávkou (expozice 500~ti oocystami) a stanovila se přírůstek tělesné váhy a skóre lézí. Výsledky přírůstku tělesné váhy (obrázek č.

4) nevykazují rozdíl mezi léčenými skupinami zahrnující vakcinované a nevakcinované kontroly. Skóre lézí (obrázek č.

5) indikuje ochranu všech vakcinovaných skupin narozdíl od nevakcinovaných kontrol.

Příklad 8: Pasteurella multocida

Produkce antiséra proti P. multocida:

Deset kuřat SPF jsou od vylíhnutí v čisté místnosti; ve stáří čtyři týdny se každému ptáku aplikovalo (podkožní injekcí do krku) 0,5 ml „Pabac podle Solvay. Jde o běžně dostupnou deaktivovanou vakcínu proti P. multocida v olejové emulzi obsahující sérotypy 1, 3 a 4. Když uvedená kuřata byla stará 8 týdnů aplikovala se do krku podkožní injekcí dalších 0,5 ml a dalších 0,5 ml se zavedlo intramuskulární injekcí do pravého prsu. Ve věku deseti týdnů se každému kuřeti odebralo kardiální punkcí 20 ml krve. Z krve se shromáždilo antisérum a filtrovalo se přes filtr s velikostí pórů 0,45 gm. Po té, co řada testů sterility dala negativní výsledky, antiséra se rozdělila do zkumavek o různých velikostech a umístily se do mrazáku s teplotou -20 °C.

Izolace a stanovení titru kmenů P. multocida Cu a M9:

Kmeny P. multocida Cu a M9: se kultivovaly z živých vakcín Choleramune Cu a Multimune M, které produkuje firma Biomune. Zjistilo se, že tyto kmeny P. multocida se nejlépe uchovávají

0000

00

0 0

0 0 •00 000 • 0

0 00 *··· mrazením pří teplotě -70 10 % glycerolu.

°C ve směsi o složení:

• 0 · · 0 0 • 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 • · 0 0 0 0

000 0 00 00

90% kultury a

Příklad 9: Schopnost líhnutí u vajec inokulovaných 18. den bakterií P. multocida

Tento experiment se navrhl za účelem stanovení, zda různý počet jednotek tvořících kolonie (CFU) kmenů P. multocida Cu a M9 ovlivňuje schopnost líhnutí SPF kuřat po inokulaci in ovo 18. den inkubace. Každý kmen P. multocida se naředil ředěným fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem (PBS), přičemž vznikají tři ředění: 1 000 CFU na 0,lml; 100 CFU na 0,1 ml; a 10 CFU na 0,1 ml. 18. den inkubace se inokulovalo 14 SPF vajec 0,1 ml každého ředění každého kmene. 13 vajec se inokulovalo 0,1 ml směsi půdy BHI (Brain Heart Infusion Broth), PBS a glycerolu (kontrola) a 13 vajec se vůbec neinokulovalo.

Výsledky uvedené v tabulce č. 6 ukazují, že schopnost líhnutí vajec SPF je silně snížena ve skupině 2 až 7.

Tabulka č. 6

Schopnost líhnutí u vajec inokulovaných 18. den P. multocida

	Skupina 1 BHI, PBS qlycerol	Skupina 2 Cu, 1000 CFU	Skupina 3 Cu, 100 CFU	Skupina 4 Cu, 10 CFU	Skupina 5 M9, 1000 CFU	Skupina 6 M9 100 CFU	Skupina 7 M9, 10 CFU	Skupina 8 Není inokulová na
Normálně vylíhnutá	12			3			1	11
Nevylihnu tá	1	14	14	11	14	14	13	2
% vylíhnutý ch	92	0	0	21	0	0	7	85

Každé ínokulované vejce se inokulovalo 0,1 ml směsi kultury/PBS obsahující správný počet CFU. Ředění obsahující 1 χ 10² CFU/ml se titrovalo pro každý kmen a titry se trochu lišily od cílových čísel. Skupina 4 skutečně obsahovala 10,5 CFU/vejce, skupina 3 obsahovala 105 CFU/vejce a skupina 2 obsahovala 1050 CFU/vejce. Skupina 7 obsahovala 12,5

CFU/vejce, skupina 6 obsahovala 125 CFU/vejce a skupina 5 ·♦*· • · · · · · · · obsahovala 1 250 CFU na vejce. Vejce skupiny 1 se inokulovala 0,1 ml směsi BHI/PBS/glycerol.

Příklad 10: Růst kolonií P. multocida po vytvoření komplexu s kuřecím antisérem.

Jeden mililitr kuřecího antiséra proti P. multocida (uvedeno v příkladu 8) uchovávaný při teplotě -20 °C se rozmrazilo při teplotě místnosti. Sérum se v sérii dvakrát ředilo PBS. Půl mililitru každého ředění séra se smíchalo s 0,5 ml kultury kmenu P. multocida Cu obsahujícího 100 CFU/0,5 ml. Tato směs se ponechala spolu reagovat po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Po jedné hodině inkubace 0,5 ml každého ředění séra se naneslo na dvě plotny TSA a 200 CFU/ml zásobního roztoku kmene P. multocida Cu se naneslo na tři plotny. Plotny se inkubovaly po dobu 48 hodin při teplotě 37 °C. Kolonie se počítaly po 24 hodinách a po 48 hodinách inkubace. Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 7 a 8.

Tabulka č. 7

Šedáni séra	CFU/0,5ml směsi po 24 hodinách	průměr	CFU/l ml	Očekávaný* počet CFU	Změny v počtu CFU/lml po 48 hod
1:16	114 + 96	105 x 2	210	152	Bez změny
1:32	72 + 75	73,5 x 2	147	152	Bez změny
1:64	92 + 86	89 x 2	178	152	Bez změny
1:128	98 + 71	84,5 x 2	169	152	Bez změny
1:256	81 + 92	86,5 x 2	173	152	Bez změny
1:512	64 + 80	72 x 2	144	152	Bez změny
1:1024	63 + 101	82 x 2	164	152	Bez změny
1:2048	73 + 73	73 x 2	146	152	Bez změny
1:4096	68 + 81	74,5 x 2	149	152	Bez změny
1:8192	60 + 61	60,5 x 2	121	152	Bez změny
1:16384	42 + 61	51,5 x 2	103	152	Bez změny
1:32768	56 + 59	57,5 x 2	115	152	Bez změny

Udává počet CFU očekávaný v 1 ml směsi z titrů uvedených v tabulce č. 8

Tabulka č 8

Titr 2 x 10² zásobního roztoku kmene P. multocida Cu ··*· *· 9999

99

9 9 9 9 · 9 9 · · • * 9 9 · · · 9 9

9 99 9 99 999999

9 9 9 9 9 9 9

999 9 99 99 99 99

CFU/0,5 ml	průměr	per 1 ml
176
131	152 x 2	304
150

Po té, co se připravily všechny směsi, zásobní roztok vzorků v tabulce č. 8 se nanesl na plotny. Smícháním 0,5 ml tohoto zásobního roztoku a 0,5 ml antíséra vedlo k očekávanému výsledku 152 CFU/ml směsi.

Výsledky vykazují snížení počtu bakteriálních CFU od nejméně ředěného antiséra k nejvíce ředěnému antiséru (tabulka č.7) . To může způsobit délka reakční doby. Nejvíce ředěná antiséra ve srovnání s nejméně ředěnými antiséry reagovala déle s živou kulturou (o 20 až 30 minut déle) . Prodloužení času může zvýšit počet odumřelých kolonií. Opakované míchání zásobního roztoku na vortexu (3 až 4 CFU/ml) může také vést ke snížení počtu kolonií. Tento trend dále zkoumá následující příklad.

Příklad 11:

Tento experiment zkoumá reakci mezi koloniemi kmene P. multocida Cu a stejného ředění antiséra proti P. multocida, jak se uvádí v tabulce č. 6.

Místo míchání zásobního roztoku „2 x 10² kmene P. multocida Cu na vortexu, jak tomu bylo u předešlého experimentu, se roztok jemně míchal pipetou. Za účelem vzniku komplexu protilátkabakterie se smíchal 1 ml ředění antiséra s 1 ml ředění zásobní kultury. Směs se nechala reagovat po dobu 4 hodin. Zásobní roztok se nanesl na TSA plotny ve třech provedeních a zjistilo se, že obsahuje 186 CFU/ml (tabulka 9). Zbytek uvedeného roztoku se nechal po dobu čtyř hodin při teplotě místnosti.

Pak se 0,5 ml každé promíchané směsi protilátka-bakterium naneslo na TSA plotny ve dvou provedeních. Zásobní roztok obsahující 186 CFU/ml se promíchal a nanesl se na TSA plotny ve třech provedeních (0,5 ml/plotnu). Kolonie se počítaly po

4944 99 4444 44 00

1*0 0 00 4 0000

0 000 0000

0 ·0 0 00 000000

0000 0 0 »000 00 00 00 00 ·· ···· hodinách inkubace při teplotě 37 °C a opět po 96 hodinách. Výsledky se uvádí v tabulkách 9 a 10.

Tabulka č. 9

Titr plánovaného konečného roztoku 2 χ 10² CSU/ml kmene P.

multocida Cu

Bezprostředně po přidání 1 ml vzorku do séra	Po inkubaci po dobu 4 hodin při teplotě místnosti
CFU/0,5ml	Průměr	Per lml	CFU/0,5ml	průměr	Per lml
			39
93	93	186	47	44,7	89
			48

Tabulka č. 10

Ředění séra	CFU/0,5ml Po 24 hodinách	průměr	CFU/1 ml	Očekávaný* počet CFU	96 hodin
1:16	114 + 92	103	206	93	Bez změny
1:32	79 + 73	76	152	93	Bez změny
1:64	50 + 48	49	98	93	Bez změny
1:128	58 + 69	63, 5	127	93	Bez změny
1:256	52 + 67	59,5	119	93	Bez změny
1:512	72 + 63	67,5	135	93	Bez změny
1:1024	55 + 63	59	118	93	Bez změny
1:2048	55 + 62	58,5	117	93	Bez změny
1:4096	51 + 53	52	104	93	Bez změny
1:8192	28 + 34	31	64	93	Bez změny
1:16384	20 + 26	23	46	93	Bez změny
1:32768	24 + 20	22	44	93	Bez změny

Data v tabulce 10 ukazují stejně snižující se počet kolonií se vzrůstajícím ředěním antiséra stejně jako je tomu v předcházejícím experimentu. V ředěních 1:16 až 1:4096 se zdá být více CFU/ml než se očekávalo. Podobné zjištění je také uvedeno v tabulce 7. Počet kolonií uvedených v tabulce 9 naznačuje, že CFU odumřelo v PBS během doby, kdy nebylo přítomno sérum. Tato skutečnost způsobila nižší počet kolonií než se očekávalo v ředěních 1:8192 až 1:32768 u obou studií. Antisérum ve vyšších ředěních může demonstrovat schopnosti inhibice růstu, zatímco vykazuje posilující účinky růstu při nižších ředěních. Další experiment se provedl za účelem zjištění, co způsobuje tato pozorování.

• 444 «Η» • 4 ·4 • 4 4 44 4 4444 • 4 4 · 4 4444 * «4 4 4« 444444

4444 4 4 • 44 4 44 44 44 44

Příklad 12:

Účinky antiséra proti P. multocida a negativního séra (kuřecí sérum, které neobsahuje protilátky proti P. multocida} na růst kmene P. multocida M9 se porovnávaly in vitro. Ředění séra a kultury P. multocida se připravilo jako v příkladu 11. Jeden mililitr kultury obsahující 139 CFU/ml (tabulka 6) se smíchal s jedním mililitrem ředěného séra. Připravila se tři ředění (1:16, 1:512 a 1: 32768) negativního séra a smíchala se se správným množstvím bakteriální kultury. Směsi bakteriální kultura/ředěné sérum společně reagovaly při teplotě místnosti po dobu jedné hodiny.

Směsi sérové protilátky-bakterie se nanesly na TSA plotny (0,5 ml) ve dvou provedení a směs negativní sérum-bakterie se nanesly na plotny ve třech provedeních. Následuje reakční doba jedna hodina. Zásobní roztok kmene P. multocida M9 se nanesl na plotny po přidání jednoho mililitru ke všem ředěním antiséra a negativního séra ve třech provedeních a opět se nechaly stát po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Kolonie se spočítaly po 24 hodinové inkubaci při teplotě 37°C a zaznamenaly se všechny změny v počtu kolonií po době inkubace 48 hodin. Výsledky tohoto experimentu se uvádějí v tabulce 11 a 12.

Tabulka 11

Titr plánovaného konečného roztoku 2 χ 10² CSU/ml kmene P.

multocida M9

Bezprostředně po přidání 1 ml vzorku do séra	Po inkubaci po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti
CFU/0,5ml	Průměr	Per lml	CFU/0,5ml	průměr	Per lml
68 76 69, 3 138,6 64	61
63	64, 3	128, 6
69

Tabulka č. 12 • *··· ·· <··· ·· ·· ·· · · Β ····· • · ΒΒΒ BBBB • · ΒΒΒ *4 ΒΒΒ ΒΒΒ • · · · · · Β Β ··· α *· ·· ββ ··

Ředění séra	Antisérum proti P. multocida po 24 hodinách	Očekávaný* počet CFU v 1 ml	Negativní antisérum po 24 hod.
CFU/0,5ml	průměr	Per 1 ml	CFU/0,5ml	průměr Per 1 ml
1:16	36 + 34	35	70	69	34+55+ 50	46,3	92,6
1:32	39 + 33	36	72	69
1:64	40 + 37	38, 5	77	69
1:128	53 + 33	43	86	69
1:256	33 + 35	34	68	69
1:512	34 + 51	42,5	85	69	44+43+ 40	42, 3	84, 6
1:1024	36 + 35	35, 5	71	69
1:2048	32 + 37	34,5	69	69
1:4096	34 + 29	31,5	63	69
1:8192	34 + 44	39	78	69
1:16384	24 + 25	24,5	49	69
1:32768	18 + 38	28	56	69	40+39+ 33	37,3	74, 6

* Počet CFU očekávaných v 1 ml směsi z titru v tabulce č. 11.

Po 48 hodinách inkubace při teplotě 37 °C se nevyskytly žádné změny v počtu kolonií.

Data uvedená v příkladech 10 až 12 ukazují počáteční nárůst vedoucí k postupnému snížení počtu CFU v závislosti na skutečnosti, jak se sérum proti P. multocida stává více ředěným. Kombinovaná data naznačují, že oba kmeny P. multocida mohou současně použít sérum jako růstové médium. Jak se snižuje koncentrace séra, tak činní i růst P.multocida. Některé výsledky naznačují, že P. multocida odumírá, když se ředí PBS a nechá se stát při teplotě místnosti po dobu mezi jednou a čtyřmi hodinami. To má za následek menší počet CFU u ředění 1:8192 až 1:32768, než se očekávalo. Jak se sérum stává méně koncentrovaným, koncentrace PBS roste. V tomto příkladu neexistují velké rozdíly v počtu kolonií před a po jedné hodině reakčního času. Stále existuje malý počet kolonií ve velkém ředění.

···· • · • · • · · · · · · • · · ·· ······ • · · · · · • « ·· · · · ·

Počet kolonií v sérových směsích, které neobsahují žádné protilátky proti P. multocida, když se srovnávají s jejich protějškem, které obsahují protilátky proti P. multocida, a se zásobním roztokem, může ukazovat na určité inhibiční schopnosti antiséra s protilátkami proti P. multocida. Počet CFU ve vzorcích bez antiséra proti P. multocida byly zpočátku vysoké. Jejich počet se snížil, i když neklesl níže, než se očekávalo ve srovnání s počtem CFU v zásobním roztoku po jedné hodině reakčního času. Počet CFU u dvou ze tří vzorků, které obsahují protilátky proti P. multocida, byl nižší než ve vzorcích s negativním sérem bez protilátek proti P. multocida. Inhibice růstu způsobená antisérem proti P. multocida se může maskovat jinými přítomnými faktory.

Příklad 13: Schopnost líhnutí vajec injektovaných 18. den po inkubaci s antisérem P. multocida - CFU P. multocida

Tato studie se navrhla za účelem testování účinku komplexů sérová protilátka - bakterie, které se aplikují do SPF vajec in ovo. Stejný počet CFU (cílem bylo 5) kmene P. multocida M9 se smísilo s různým množstvím antiséra proti P. multocida a pak 0,1 ml každé směsi se inokulovala do 15 SPF vajec každé ze sedmi skupin. Za použití kultury kmene P. multocida M9 se připravil zásobní roztok obsahující 100 CFU/ml. Aby se získala jistota, že každé vejce obdrželo stejný počet CFU, v pětiminutových intervalech se pro každou skupinu smíchalo vhodné množství séra s vhodným množstvím zásobního roztoku. Tyto směsi se držely při teplotě místnosti po dobu 30 minut.

Po této době se 18. den inkubace 0,1 ml směsí se inokulovalo do 15 vajec. Zásobní roztok obsahující 100 CFU/ml se nanesl na plotny ve třech provedeních a následovala příprava konečné skupinové směsi. Konečná skupinová směs se nechala reagovat po dobu 30 minut (tabulka 13) a opět se nanesla na plotny. Plotny se všechny inkubovaly při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin a pak • ···· ·· ··· · ·· • · · · • 999 999 se počítaly kolonie. Tabulka č. 4 ukazuje data schopnosti líhnutí pro každou skupinu.

Tabulka č. 13

	Titr plánovaného zásobního roztoku 2 χ 102 kmene P. multocida M9
	CFU/0,5 ml	Průměr	Per lml
Před 30 minutami	38 28 30	32	64
Po 30 minutách	30 30 27	29	58

Tabulka č. 14

Schopnost líhnutí inokulovaných SPF vajec 18. den inkubace s 1 ml směsí obsahujících antisérum proti P. multocida a CFU kmene P. multocida M9.

	Skupina 1 Bez séra + 3,2 CFU	Skupina 2 Ο,ΐμΐ séra+3,2 CFU	Skupina 3 Ι,ΟμΙ séra+3,2 CFU	Skupina 4 ΙΟ,ΟμΙ séra+3,2 CFU	Skupina 5 25,0μ1 séra+3,2 CFU	Skupina 6 50,0μ1 séra+3,2 CFU	Skupina 7 50,0μ1 séra 50μ1 PBS/vej ce
Normálně vylíhnutá		2	1		2	4	15
Vylíhnutá (mrtvá)
Vylíhnutá (klinicky postižená)	1		3	3	3	5
Nevylíhnutá	14	13	11	12	10	6
% vylíhnutých	6,7	13,3	26,7	20,	33	60	100

Tato studie se původně navrhla tak, aby každé vejce obdrželo 5,0 CFU bakterie smíchané s vhodným objemem antiséra proti P. multocida. Informace o titru získané z tabulky č. 13 ukazují, že vejce dostala počet CFU blížící se spíše hodnotě 3,2 než 5 a že došlo ke ztrátě malých kolonií jako výsledek 30-ti minut reakční periody. Výsledky v tabulce 14 ukazují, že SPF vejce může poškodit dokonce i malý počet CFU kmene P. multocida M9, když se aplikují 18. den inkubace. Kontroly ve skupině 7 vykazují 100% vylíhnutí. V ostatních skupinách bylo líhnutí silně ovlivněno. Z těchto skupin skupiny 5 a 6 vykázaly další nejvyšší procento celkově vylíhnutých ptáků. Vejce ve skupině • · · · ·· ·· · · se inokulovala nejvyšším poměrem antiséra proti P. multocida (50 μΐ + 3,2 CFU) a vykazuje 60 % líhnutí z toho 27 % normálně vylíhnutých. Tento trend naznačuje, že antisérum proti P. multocida, když se kombinuje s živými bakteriemi, může kuřecím embryím poskytnout určitý stupeň ochrany buď redukcí nebo oddálením patogenních účinků bakterie.

Data v tabulce 12 a 14 srovnávající sérum s protilátkami proti P. multocida a bez nich a s různým množstvím sérových protilátek ukazují možný inhibiční účinek sérových protilátek proti P. multocida na růst a možná patogenní účinky organizmu. Tabulka 14 ukazuje, že dvě největší množství protilátek (skupina 5 a 6) vede k lepšímu líhnutí ve srovnání se skupinou imunizovanou samotnými bakteriemi (skupina 1) .

Příklad 14: Růst M. gallisepticum; Produkce hyperimunního séra

Kultura bakterie Mycoplasma gallisepticum kmen F se získal z instituce North Carolina State University, Mycoplasma Lab, College of Veterinary Medicine. Kmen F bakterie M. gallisepticum se použil ke komerční výrobě vajec jako živá vakcína. Čtyřicet mililitrů Freyova média doplněných 15 % prasečího séra (FMS) se inokulovalo 1,33 ml bakteriální kultury. Tato směs se pak inkubovala přibližně 18 hodin při teplotě 37°C a kultivovaná kultura se smísila v poměru 80/20 se setrilním glycerolem za účelem zmrazení při teplotě -70°C, Sterilita této směsi se testovala na tryptikázovém sojovém agaru (TSA) a nevyrostl žádný organizmus. Hodnota titru zásobního roztoku bakterie M. gallisepticum kmene F po 24 hodinách při -70°C byla 5,8 χ 10® CFU/ml.

Antisérum proti bakterii M. gallisepticum kmene R se získalo z instituce NCSU Mycoplasma Lab. Antisérum se produkovalo hyperimunizací novozélandských bílých králíků s deaktivovanými bakteriemi M. gallisepticum kmene R obsaženými v adjuvans. Králíci se imunizovaly třikrát intramuskulárními a • · · ·

intradermálními injekcemi, pak se odebrala krev. Toto antisérum se označuje jako MGA.

Příklad 15: Inhibiční účinek MGA na růst M. galiisepticum kmene F

Tento experiment zkoumá růst daného množství bakterie M. gallisepticum kmene F po té, co se organizmus smíchal s různým množstvím MGA. Vzorek MGA se zpočátku zředil 1:10 ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanem (PBS). Antisérum se dále zředilo sérií deseti ředění v poměru 1:2 přidáním 0,5ml předchozího ředění k 0,5 ml PBS (ředění 1:20 až 1:10240). Jedna zkumavka zásobní kultury bakterie M. gallisepticum kmene F se nechala rozmrazit při teplotě místnosti a zředila se v poměru 1:100. Toto ředění IO^-2 zásobního roztoku obsahovalo 5,8 x 10⁶ CFU/ml. Komplexy bakterie-protilátka se připravily přidáním 0,4 ml 5,8 x 10⁶ zásobního roztoku ke 0,4 ml každého z 11 ředění MGA. Tyto komplexy se nechaly reagovat po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Zkumavka 12 obsahuje 0,4 ml PBS přidaných k 0,4 ml stejného bakteriálního zásobního roztoku.

Následuje reakční čas 30 minut. Každá z dvanácti zkumavek se sériově zředila v FMS od 10^_1 až 10“⁸. Tyto zkumavky se inkubovaly po dobu 14 dní a růst se stanovil po 41 hodinách, 47,5 hodinách a po 14 dnech. (Růst bakterie M. gallisepticum se detekoval v FMS změnou barvy. Jak roste růst bakterie snižuje se pH média, což způsobuje změnu barvy indikátoru pH fenolové červeně. Jak bakterie roste barva se postupně mění z tmavě červené na oranžovou a eventuálně až na žlutou. Stupeň růstu se může vyhodnotit na základě barvy média). Výsledky se uvádějí v tabulce 15.

Tabulka 15 • · · · • · • · « · · • · · · • « 444 444

Růst MgF po té, co 0,4 ml 12 ředění antiséra, obsahující mezi 0, 039 μΐ a 40,0 μΐ antiséra, se smíchalo s 0,4 ml zásobního roztoku MgF.

MgF*

0, 4 ml MgF**

Růst po 41 hodinách

Růst po 47,5 hodinách

Přito mnost MgF *44

10 (-1)

10 (-2)

10 (-3)

10 (-4)

10 (-5)

10 (-D

10 (-2!

10 (-3)

10 (-4)

10 (-5)

1

40μ1

;3 ο (-· -« >£·

“·

-

-

-

—

±

-

—

-r

10 (-7)

2

20μ1

0,4 ml

±

-

-

+ 1

+

-

-

10 (-6)

3

10μ1

0,4 ml

±

±

±

-

-

+++

+

10 (-6)

4

5μ1

0,4 ml

++

±

—

—

+++

+++

+

10 (-7)

5

2,5μ1

0,4 ml

++ + +

±

·“

++++

+++

±

·

10 (-6)

6

1,25 μΐ

0,4 ml

++++

±

—

““

++++

+++

±

10 í-6)

7

0,625 μΐ

0,4 ml

+ + + +

±

±

++++

+++

—

10 í-6)

8

0,313 μΐ

0,4 ml

++++

+

±

±

±

++++

+++

+

±

±

10 (-6)

±

0,156 μΐ

0,4 ml

+ + + +

±

±

++++

+++

+

—

—

10 (-7)

10

0,078 μΐ

0,4 ml

++++

±

±

—

++++

+ +

±

—

10 (-7)

11

0,039 μΐ

0,4 ml

++++

±

±

*·

++++

++

±

10 (-6)

12

0,4 ml

++++

++++

++

—

10 (-7)

MgF* ~ MgF antisérum ve 0,4ml

0,4 ml MgF** = 0,4 ml MgF 2,32 x 10(-6) přítomnost MgF*** = přítomnost MgF v ředící zkumavce (po 14 dnech inkubace) (neroste; tmavě červená) ± (právě začíná růst; červená je světlejší ve srovnání s kontrolními zkumavkami) + (slabý růst; světle červená) ++ (mírný růst; tmavě oranžová) +++ (mírný až silný růst; světle oranžová) ++++ (silný růst; žlutá)

Růst se detekoval ve všech dvanácti případech v den 14 (tabulka 1) . Růst se oddálil ve skupině 1 až 4, což jsou skupiny obsahující nejvyšší množství MGA. Růst v těchto skupinách nebyl evidentní tak brzy, jako ve skupinách s nižším, obsahem MGA. Tato zjištění naznačují, že větší množství MGA mělo inhibiční účinek na růst bakterií.

Příklad 16: Inhibiční účinky MGA na růst bakterie M. gallisepticum

Zkumavka se zásobním roztokem bakterie M. gallisepticum kmen F se rozmrazil a připravilo se ředění 1:100 ve FMS. Toto ředění 10(-2) obsahovalo přibližně 5x10(6) CFU/ml. Jeden mililitr zásobního ředění 10(-2) po promíchání se umístil do každé z osmi ředících zkumavek. Do každé zkumavky se přidalo určité množství MGA (tabulka č. 16) a smíchaly se komplexy bakterie/antisérum. Komplexy se inkubovaly při teplotě místnosti po dobu 15 minut a pak při teplotě 37 °C. Růst se sledoval v období 13 dní za použití změny barvy v růstovém médiu FMS . Výsledky jsou uvedeny v tabulce 16.

Tabulka 16

MgF 5,0x10(6) CFU/ml	μΐ Mg antiséra (MGA)	Růst po 27 hodinách při teplotě 37°C	Růst po 46 hodinách při teplotě 37°C	Růst po 13 dnech při teplotě 37°C
1,0 ml	Bez séra	+++	++++	++++
1, 0 ml	48	Neroste	Neroste	++++
1,0 ml	24	Neroste	Neroste	++++
1,0 ml	12	Neroste	Neroste	++++
1,0 ml	6	Neroste	+	++++
1,0 ml	3	Neroste	++	++++
1,0 ml	1,5	Neroste	+++	++++
1,0 ml	0,5	++	++++	++++
+ (slabý růsi	t; světle červená)

++ (mírný růst; tmavě oranžová) +++ (mírný až silný růst; světle oranžová) ++++ (silný růst; žlutá)

Ve zkumavce, která neobsahovala antisérum, se mírný růst bakterie M. gallisepticum objevil v prvních 27 hodinách • · · · • · · · • · · · · · · ·· · · ·· ·♦ ·· ·· inkubace a jevil se silným i po dalších 46 hodin při teplotě 37°C (tabulka 16) . Bakteriální růst se nedetekoval v prvních 27 hodinách inkubace ve zkumavkách, které obsahovaly 1,5 μί nebo více MGA. Po 46 hodinách inkubace se růst stále nedetekoval ve zkumavkách, které obsahovaly 12, 24 a 48 μΐ MGA. Všechny zkumavky vykazují silný růst bakterie M. gallisepticum po 13 dnech inkubace při teplotě 37 °C. Tyto výsledky ukazují, že bakterie jsou přítomny ve všech zkumavkách, ale větší množství antiséra oddálilo růst o delší časový úsek, než je tomu u menšího množství antiséra. Doba, která uplynula do okamžiku, kdy se objevil růst, je přímo úměrná množství MGA v komplexu bakterie-sérum.

Příklad 17: Účinek komplexů bakterie M. gallisepticum-MGA na líhnutí

Devět skupin vajec se inokulovalo 18. den inkubace. Sedm z uvedených skupin se inokulovaly jedním ze sedmi různých komplexů M. galiisepticum F-MGA. Jedna skupina se inokulovala pouze bakteriemi a jiná skupina se inokulovala ředěním FMS 1:4 v PBS.

Zkumavka se zásobním roztokem M. galiisepticum kmene F se nechala rozmrazit a připravilo se ředění 1:5 a 1:10 v 10% FMS a 90 % PBS. Vhodné množství těchto ředění se použilo při vzniku komplexů bakterie - MGA. Každému vejci se aplikovala injekce o objemu 0,1 ml obsahující stejný počet CFU bakterie M. gallisepticum s množstvím antiséra vhodným pro určitou skupinu mimo skupiny 1. Vejce ve skupině 1 obdržela 0,1 ml ředidla FMS/PBS. Komplexy se nechaly před inokulací reagovat po dobu 10 minut. Vejce se pak inkubovaly až do doby vylíhnutí.

Ředění bakteriálního roztoku 1:10 se titrovalo tak, že se připravily série sériového ředění do 10(-9) a na plotny TSA se nanesly dvě série ředění a vše se inkubovalo při teplotě 37 • · · · • · · · • flfl « • flfl · • flfl flflfl °C. Všechny tři série ředění vykazují růst bakterií M. gallisepticum. Titr je 8 x 10(8) CFU/ml. Výsledky schopnosti líhnutí jsou uvedeny v tabulce 17.

Tabulka 17

Skupina	MgF CFU	Množství Mg antiséra (MGA)	Počet vylíhnutých va jec/počet inj ektovatelnýc h vajec	Počet zdravých kuřat/počet inj ektovatelný ch vajec
1	0	0	13/14 (93%)	12/14 (86%)
2	8 x 10(6)	40 μΐ	10/11 (91%)	8/11 (73%)
3	8 x 10(6)	20 μΐ	10/10 (100%)	8/10 (80%)
4	8 x 10(6)	10 μΐ	6/11 (55%)	0/11 (0%)
5	8 x 10 (6)	5 μΐ	10/10 (100%)	2/10 (20%)
6	8 x 10(6)	2 μΐ	6/11 (55%)	1/11 (9%)
7	8 x 10(6)	0, 5 μΐ	7/11 (64%)	0/11 (0%)
8	8 x 10(6)	0,05 μΐ	8/11 (73%)	0/11 (0%)
9	8 x 10(6)	0	8/14 (57%)	0/14 (0%)

Komplexy MGA-M. gallisepticum ovlivňují procento líhnutí a zdravotní stav kuřat. Skupiny, které vykazují líhnutí nad 90%, jsou skupiny, které obsahovaly největší poměr MGA ku CFU (výjimkou je skupina 4) . Procenta zdravých kuřat jsou daleko vyšší ve skupině 2 a 3, než v jiných skupinách, kterým se aplikovaly komplexy, jenž obsahují ve formulaci menší množství séra. Tyto zjištění ukazují, že určitý poměr MGA:bakterie má schopnost ochránit vyvíjené kuřecí embryo tím, že se sníží patogenní účinek bakterie a/nebo se tento účinek oddálí.

Příklad 18: Vakcína obsahující komplex M. gallisepticum kmen F/protilátka

Šest skupin, kde každá zahrnuje 16 vitálních vajec, se inokulovaly 18. den inkubace. 16 vajec ve skupině představující negativní kontrolu (skupina 6) se inokulovaly 18. den 0,1 ml ředidla (1 část FMS v 9 částech PBS) a líhly se ve velké líhni, která neobsahovala jiná vejce.

• · 4 4 4 4

4

O 4 44 4 44 444 4 4 4 4 4 4 4

4·4φ 44 44 44

Zkumavka zásobního roztoku bakterie M. gallisepticum kmen F se nechala roztát při teplotě místnosti a připravilo se ředění 1:5 (roztok 2). Titrace roztoku 2 ukazuje, že obsahuje 7 x 10(7) CFU/ml. Roztok 2 se rozdělil na alikvoty o objemu 0,9 ml a zkombinoval se s 0,5, 10, 20 nebo 40 μΐ MGA. Formulace bakterie-MGA se nechala inkubovat při teplotě místnosti po dobu 15 minut. Tyto komplexy bakterie-MGA se aplikovaly do vajec každé skupiny v dávce 0,1 ml. Vejce skupiny 1 se inokulovala pouze bakteriemi. 16 vajec každé skupiny se pak umístilo do oddělené malé líhně a ponechaly se tam až do doby líhnutí. Množství CFU ve formulacích MGA- M. gallisepticum je uvedeno v tabulce 18.

Zbývající roztok 2 se titroval ve třech separovaných sériových 10-ti násobných ředěních do 10(-9) za použití FMS. Ředění 10 (4), 10(-5) a 10(-6) se nanesly na plotny s FMS agarem ve čtyřech provedeních a inkubovaly se při teplotě 37 °C po dobu devíti dní.

V den líhnutí se skupiny 1 až 5 zpracovaly. U normálních zdravě vypadajících kuřat se testovala přítomnost bakterie M. gallisepticum výtěrem choanální štěrbiny sterilním tamponem a inokulovala se zkumavka obsahující 1,8 ml FMS. Po prozkoumání se kuřata z každé skupiny umístila do místnosti P2. Každá skupina se umístila do separovaných chovatelských klecí, které se nedostaly do kontaktu.

Kuřata v kontrolní skupině 6 vykazují oddálené líhnutí a zkoumaly se další den po vylíhnutí kuřat ze skupiny 1 až 5. U deseti kontrolních kuřat se provedlo výtěr, aby se zjistila přítomnost bakterie M. gallisepticum a umístily se do klece v separované místnosti P2. 21 dní po vylíhnutí kuřat se všechna kuřata použitá ve studii nechala vykrvácet a shromáždilo se sérum za účelem stanovení protilátek proti bakterii M. gallisepticum. Toto stanovení se provedlo destičkovou aglutinací séra (SPA) a testem ELISA. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 18.

• ···

44 44

4 4 4 4 4 4

4 4 4 * 4 4 *4 4 <4 44· 444

4 * 4 4 4

44 44 ·4

Tabulka 18

Skupina Počet CFU/vej ce MGA/vej ce	1* 1,4 x 10(6) 0 μί	2 3,5 x 10(6) 5 μΐ	3 3,5 x 10(6) 10 μί	4 3,5 x 10(6) 20 μΐ	5 3,5 χ 10(6) 40 μΐ	6 bez CFU 100 μί ředidla
Počet normálně vylíhnutých	0	0	0	8	12	10
Počet klinicky poškozených vylíhnutých	9	7	8	3	2	1
NevyllhnuUá/ mrtvá	7	9	8	5	2	5
% vylíhnutých	56,25	43,75	50,0	68,75	87,5	68,75
% normálně vylíhnutých	0	0	0	50	75	62,5
Počet umístěných kuřat	0	0	3	9	10	10
Počet živých kuřat ve třetím týdnu	NA	NA	1	2	7	10
Re-izolace MgF Početpozitiv nich/počet testovaných	Nebylo testováno	3/3	3/3	9/9	9/10	0/10
SPA** Počet pozitivnich/ počet testovaných	NA	NA	1/1	2/2	6/7	0/10
ELISA Titr	NA	NA	599	643	645	0

♦způsobeno chybou výpočtu, vejce ze skupiny 1 dostala 1,4 x

10(6) CFU.

♦♦Všechny pozitivní reakce SPA se označily 3 nebo vyšší podle měřítka 0 až 4, 4 značí nejsilnější reakci.

Vejce, kterým se aplikovaly pouze bakterie bez antišéra (skupina 1) a dvě nižší množství MGA a bakterie M. gallisepticum (skupiny 2 a 3) vykazují nejnižší procento líhnutí a poškozené vylíhnuté ptáky. Kontrolní skupina (skupina 6) vykazuje opožděné líhnutí stejně jako vysoké množství nevylíhnutých kuřat, což se očekávalo. Způsobuje to pravděpodobně skutečnost, že vejce se inkubovala ve velké líhni, která je určená pro inkubaci 2 000 vajec. Navzdory tomuto problému při líhnutí deset kuřat bylo zdravých a test přítomnosti bakterií M. gallisepticum byl negativní a testy na • 000 ··

040 444 měřena testem SPA a komplexy bakterie M.

teorii, že k vakcinační protilátky vyšly také negativně. Skupiny 4 a 5 vykazujíc! lepší procenta líhnutí a procenta normálně vylíhnutých kuřat oproti skupinám 1, 2 a 3. Vejce v těchto dvou skupinách dostaly vyšší množství MGA a skupina 5 (3,5 x 10(6) CFU + 40 μΐ MGA) a vykazují a nejvyšší líhnutí ze všech skupin. Všechny ptáci, kteří zůstali živí v době shromáždění krve, byly zdraví. Protilátková odpověď na bakterie M. gallisepticum.

ELISA ukazuje, že vakcína obsahující gallisepticum kmene F byla účinná pro ptáky ze skupiny 3, 4 a 5.

Je zajímavé poznamenat, že u jednoho ptáka ve skupině 5 byla re-izolace bakterie M. gallisepticum při vylíhnutí negativní, také testy SPA a ELISA vyšly negativně. U všech ostatních testovaných ptáků ze skupiny 3, 4 a 5 vyšly v každém případě negativní. Zdá se, že jeden pták ze skupiny 5 se nikdy neinfikoval.

Příklady 14 až 18 se navrhly pro testování použitelnosti vakcinačního komplexu bakterie - protilátka. Data podporují přidání specifického antiséra (specifického bakterii) proti živým bakteriím ve vhodném množství poskytuje ochranu kuřecího embrya tím, že redukuje nebo oddaluje patogenní účinky bakterie, přičemž současně umožňuje účinnou imunitní odpověď, ke které dochází během inkubace vajec jak je evidentní z aktivní humorální imunitní odpovědi.

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Vakcinační přípravek použitelný při produkci aktivní imunity proti bakteriálnímu nebo protozoálnímu onemocnění, obsahující vakcinační konjugát, vyzná čující se tím, že zahrnuje:

   (i) živý organismus vybraný ze skupiny zahrnující bakterie a protozoa a (ii) neutralizující faktor vázaný na živý organismus, kde uvedený neutralizující faktor vybraný ze skupiny zahrnující protilátky a fragmenty protilátek je schopný neutralizovat živý organimus.
2. 2. Vakcinační přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že neutralizující faktor je vybrán ze skupiny zahrnující imunoglobiny IgG a fragmenty imunoglobinů IgG.
3. 3. Vakcinační přípravek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že neutralizující faktor je polyklonálního původu.
4. 4. Vakcinační přípravek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím., že neutralizující faktor je monoklonálního původu.
5. 5. Vakcinační přípravek podle kterýchkoliv z nároků 1 až 4,vyznačující se tím, že živý organismus je ve formě spor nebo cyst a/nebo kde protilátky nebo fragmenty protilátek mají přídavné elementy k těmto připojené.
6. 6. Vakcinační přípravek podle kterýchkoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že je lyofilizovaný,
7. 7. Vakcinační přípravek podle kterýchkoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že je připravený pro :

   (i) podkožní podávání (ii) intraperitoneální podávání (iii) intramuskulární podávání
8. 8. Vakcinační přípravek podle kterýchkoliv z nároků 1 až 7,vyznačující se tím, že živý organismus je mykoplasma a výhodně Mycoplasma gallisepticum.
9. 9. Vakcinační přípravek podle kterýchkoliv z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že živý organismus schopný způsobit onemocnění u savce nebo ptáka, kde pták je výhodně drůbež.
10. 10. Vakcinační přípravek podle nároku 9, vyznačující se tím, že živý • v ··

    44 44

    4 4 4 4

    4 4 4 4 • 4 4 4 4 4

    4 4

    4 4 4 4 organismus je druh Eimeria a výhodně E. tenella nebo Mycoplasma gallisepticum.
11. 11. Způsob produkce aktivní imunity proti bakteriálnímu nebo protozoálnímu onemocnění ptáků vyznačující se tím, že zahrnuje podávání přípravku podle nároku 9, v kterém je živý organismus schopný způsobit onemocnění nebo přípravku podle nároku 10 pro zplození vajíček.
12. 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že přípravek je podáván pomocí automatizovaného vajíčkového injekčního systému o vysoké rychlosti.
13. 13. Vakcinační přípravek podle kterýchkoliv z nároků 1 až 10 pro použití jako léčivo.
14. 14. Použití pro přípravu vakcíny pro produkci aktivní imunity proti bakteriálnímu nebo protozoálnímu onemocnění produktem, obsahující (i)živý organismus vybraný ze skupiny zahrnující bakterie a protozoa a (ii) neutralizující faktor vázaný na živý organismus, kde uvedený neutralizující faktor vybraný ze skupiny zahrnující protilátky a fragmenty protilátek je schopný neutralizovat živý organimus.
15. 15. Způsob pro přípravu vakcíny pro produkci aktivní imunity proti bakteriálnímu nebo protozoálnímu ·» • · to · «>· • Λ • ··* • to • · • · ·· • ·· · • · · to • » to · toto • to to · to· onemocnění produktem, obsahující (i) živý organismus vybraný ze skupiny zahrnující bakterie a protozoa a (ii) neutralizující faktor vázaný na živý organismus, kde uvedený neutralizující faktor vybraný ze skupiny zahrnující protilátky a fragmenty protilátek je schopný neutralizovat živý organimus.
16. 16. Použití podle nároku 14 nebo způsob podle nároku 15, který je dále charakterizován pomocí znaku/znaků, které jsou citovány podle jednoho nebo více nároků 2 až 10.