CZ357997A3 - Promotory pro genovou expresi - Google Patents
Promotory pro genovou expresi Download PDFInfo
- Publication number
- CZ357997A3 CZ357997A3 CZ973579A CZ357997A CZ357997A3 CZ 357997 A3 CZ357997 A3 CZ 357997A3 CZ 973579 A CZ973579 A CZ 973579A CZ 357997 A CZ357997 A CZ 357997A CZ 357997 A3 CZ357997 A3 CZ 357997A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- protein
- recombinant dna
- promoter
- dna construct
- sequence
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 67
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 22
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 7
- 101001135770 Homo sapiens Parathyroid hormone Proteins 0.000 claims description 3
- 101001135995 Homo sapiens Probable peptidyl-tRNA hydrolase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000058004 human PTH Human genes 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 claims 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract description 7
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 8
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 8
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 7
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 7
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 7
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 7
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 7
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 7
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 3
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 3
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241000701988 Escherichia virus T5 Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101710198884 GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 1
- 102400000326 Glucagon-like peptide 2 Human genes 0.000 description 1
- 101800000221 Glucagon-like peptide 2 Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 102400001355 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- TWSALRJGPBVBQU-PKQQPRCHSA-N glucagon-like peptide 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 TWSALRJGPBVBQU-PKQQPRCHSA-N 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 101150019416 trpA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Tento vynález se týká oblasti genetického inženýrství aplikovaného na bakteriální hostitele. Přesněji, vynález se týká expresních systémů pro produkci proteinů v bakteriálních hostitelých.
Dosavadní stav techniky
Příchod rekombinantní DNA technologie umožnil produkci různých přirozeně se vyskytujících a syntetických proteinů v organismech jako jsou bakterie, houby, kvasinky a savčí buňky. Obecně tato produkce vyžaduje inserci genů, které kódují požadovaný protein do hostitelského organismu a využití buněčného mechanismu pro expresi genu.
Rekombinantní DNA technologie se kontinuálně vyvíjí pro dosažení produkce v komerčně akceptovatelných množstvích. Limitujícím faktorem v rekombinantní produkci proteinů je stupeň, ve kterém je gen kódující požadovaný protein exprivován. Přesněji, bylo zjištěno, že promotorovy region genu je zásadní pro proces transkripce genové exprese. Účinný promotor jako je trp promotor nalezený v E. coli, se váže těsně na DNA-zaměřenou RNA polymerasu pro navození trankripce genu v generování mRNA. Méně účinný promotor jako je lac promotor se váže na RNA polymerasu méně těsně, což vede k nižšímu stupni generování mRNA.
trp promotor je široce používán v produkci heterologních • · · ··· ··· ··· ·· ·· ··· ·· ·· proteinů vzhledem ke své schopnosti účinně iniciovat transkripci. Navzdory jeho účinnosti, základní nevýhodou trp promotoru je to, že není snadno kontrolovatelný. Přesněji, trp promotor není plně reprivovatelný, t.j. může řídit transkripci před tím, než je hostitel v kultuře kultivován do vhodné fáze pro produkci proteinu. Jiným široce používaným promotorem je lac promotor, který je méně účinný než trp, ale je lépe kontrolovatelný.
Pro vývoj nových účinných promotorů byly kombinovány funkční složky různých promotorů, například jak je to popsáno v U.S: patentu č. 5.362.646. V jednom příkladu byly části bakteriofágového T7 promotoru Αχ (P ) kombinovány se dvěma lac operátory. Přesněji, intergenový region mezi takzvanými -35 a -10 regiony bakteriofágového T7 promotoru byl nahrazen modifikovanou sekvencí lac operátoru a pro kontrolu vzniklého promotorového hybridu byl druhý lac operátor zaveden downstream. Bylo zjištěno, že vzniklý promotor/operátorový systém, který je inkorporován do komerčně dostupných pUHE plasmidů, účinně iniciuje transkripci za indukce a je vysoce reprivovatelný před indukcí.
Jiný promotor popsaný Tsungem et al., (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 5940) obsahuje účinný trp -35 region, -10 region z vysoce účinného IppP-5 promotoru (varianty Ipp promotoru) a intergen odvozený od lac promotoru. U tohoto promotoru bylo ukázáno, že je vysoce účinný v iniciaci transkripce, což vede k buněčné letalitě. Zatímco různé jiné promotory umožňují zlepšení zisku proteinů z mikrobiálních hostitelů, stále existuje potřeba promotorů, které ještě účiněji řídí produkci proteinů komerční hodnoty.
··· ·· · ·· ·· • · · ···· ···* • · · · · · · ···· • · · · · · · · ···· * ··· · · · · · · ·· · · · ·· ··· · · ··
Oblast vynálezu
Podle jednoho aspektu předkládaného vynálezu je zde poskytnut rekombinantní DNA konstrukt použitelný pro expresi proteinu v bakteriálním hostiteli. Konstrukt obsahuje kódující region pro protein a s ním navázaný kontrolní region obsahuj ící promotor mající DNA sekvenci vybranou z:
' -TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3 ' ; a
5'-TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-3'.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obrázek 1 ilustruje nukleotidovou sekvenci a schematickou representaci expresní kazety inkorporující rekombinantní DNA konstrukty podle předkládaného vynálezu.
Obrázky 2 a 3 ilustrují nukleotidovou sekvenci DNA konstruktů podle předkládaného vynálezu obsahující promotorový a operátorový region.
Předkládaný vynález poskytuje DNA sekvence použitelné v řízení DNA exprese s vysokou účiností v bakteriálních hostitelích jako je E. coli. Použití expresních vektorů obsahujících tyto sekvence poskytuje hodnotné prostředky pro dosažení zvýšené produkce expresibilních proteinů, jak endogeních, tak heterologních. V jednom aspektu vynálezu je zde poskytnut nový rekombinantní DNA konstrukt použitelný pro expresi proteinu v bakteriálním hostiteli. Konstrukt obsahuje kódující region pro protein operativně navázaný na promotor pro umožnění exprese uvedeného proteinu v hostiteli, kde promotor obsahuje DNA sekvenci vybranou z:
' -TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3 ' ; a
5'-TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-3'.
Tyto promotory mají společnou konsensuální sekvenci -35 regionu TTGACA a sekvenci -10 regionu TATACT. Intergenová sekvence, t.j. sekvence o 18 bazích, která je vmezeřena, může být podle předkládaného vynálezu buď sekvence ACATAAAAAACTTTGTGT nebo CTTTATGCTTCCGGCTCG, a preferovaně je to sekvence ACATAAAAAACTTTGTGT. V souladu s tím poskytuje vynález v preferovaném provedení DNA konstrukty, ve kterých je DNA kódující požadovaný protein operativně navázána pod expresní kontrolou na promotor sekvenci 5'-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3'.
Odborníci v oboru ocení, že promotory podle předkládaného vynálezu vytvářejí jeden základní element požadovaných složek, uvnitř funkčního kontrolního regionu, pro řízení exprese. Kromě toho, tyto promotory mohou být insertovány za použití standartních postupů do jakéhokoliv vhodného expresního vektoru, který se může replikovat v Gram + nebo - bakteriích. Přesněji, a pro vytvoření kontrolního regionu genové exprese, předkládané promotory budou inkorporovány s takovými dalšími kontrolními elementy, které jsou typicky vyžadovány pro tuto expresi, včetně vazebného místa pro ribosomy a, v provedeních podle předkládaného vynálezu, operátorem, který účinkuje pro kontrolu • · funkce promotoru.
Tyto složky musí být sestaveny ve vztahu jedna k druhé jak je to nutné pro průběh exprese podle dobře známých pravidel genové exprese.
V jednom provedení vynálezu inkorporuje kontrolní region konstruktu operátor. Operátory, které mohou být použity, zahrnují ty, které jsou přímo indukovatelné chemickými induktory a ty, jako je lac, které jsou de-reprivovatelné. Příklady vhodných operátorů zahrnují E. coli laktosový, galaktosový, tryptofanový a tetracyklinový operátor (viz Miller et al., The Operon, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980, a Hillen et al., J. Mol. Biol., 1984, 172: 185). Preferované operátory jsou vysoce reprivovatelné, takže exprese DNA kódující protein může být kontrolována. Ve specifickém provedení obsahuje kontrolní region lac operátor (obr. 1), který brání expresi z promotoru za absence syntetického induktoru izopropyl-S-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG) a přirozeného induktoru laktosy.
Kontrolní region dále obsahuje sekvenci vazebného místa pro ribosom (RBS) pro usnadnění vazby ribosomů na mRNA transkript a tak pro iniciaci translace RNA kódujícího regionu pro generování proteinu. Vhodná vazebná místa pro ribosomy obsahují lac a bakteriofág T5. V preferovaném provedení je RBS sekvence odvozená od T5 bakteriofágového RBS majícího sekvenci 5 ' -ATTAAAGAGGAGAAATTAAGC-3 ' .
Kontrolní regiony konstruktů podle předkládaného vynálezu jsou operativně navázány na kódující regiony pro endogení a * · · · • · · · ··· · · ♦ · · ·· ·· • * ··· · • · · · • · ·
heterologní proteiny. Termín heterologní proteiny označuje polypeptidy nebo proteiny, které, ačkoliv nejsou přirozeně produkovány bakteriálním hostitelem, jsou exprivocány tímto hostitelem, pokud je vhodně transformován DNA kódující protein; genomová DNA, cDNA a syntetická DNA může být použita pro transformaci hostitele. Proteiny, které mohou být produkovány za použití systému zde popsaného zahrnují, ale nejsou omezeny na, hormony jako je parathyreoidální hormon (PTH), glukagon nebo jeho fragmenty a příbuzné peptidy jako je GLP-1 a GLP-2, růstové faktory jako je epidermální růstový faktor (EGF); a lymfokiny jako je interleukin-6 a -8 (IL-6, -8). Pro usnadnění izolace autentických forem proteinu, t.j. proteinu bez dalšího Met zbytku, mohou být také produkovány fúsní proteiny, které jsou štěpeny po expresi. Například, DNA kódující požadovaný protein může být předcházena DNA kódující signálním peptidem, tak jako je E. coli zevní membránový protein ompA. V tomto případě dává exprivovaný protein vznoknout fúsnímu proteinu obsahujícímu N-Met-obsahující ompA signální peptid, který je následován požadovaným proteinem. Signální peptid nese fúsní protein přes intermembránu bakterie, kde je signální peptid štěpen. Jiné signální peptidy, které mohou být použity, obsahují alkalickou fosfatasu, E. coli termostabilní enterotoxin II a protein A od Streptococcus. Alternativně, fúsní protein může být syntetizován a štěpen ve zvláštním postupu za získání požadovaného proteinu. Například glutathion-S-transferasa (GST) může být štěpena z požadovaného proteinu thrombinem nebo faktorem Xa.
Ve specifickém provedení vynálezu obsahuje kódující region DNA kódující lidský PTH, jehož aminokyselinová sekvence je popsána Hendym et al., (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1981, 78: 7365) . V příkladech zde popsaných je DNA sekvence kódující PTH
Ί navázána přímo na a ve čtecím rámečku s DNA kódující ompA signální peptid.
Preferované rekombinantní DNA konstrukty ilustrované na obrázku 1, mající Ipp nebo lacUV5 intergen, byly produkovány z jednořetězcových oligonukleotidů syntetizovaných fosforamiditovou metodou. Gelově purifikovaný řetězec obsahující sekvence od Xhol do EcoRI restrikčního místa byly potom použity jako iniciální PCR cíl a byl PCR amplifikován do dvouřetězcového DNA fragmentu za použití komplementárních jednořetězcových DNA oligonukleotidů, které specificky hybridizují na konce buď iniciální ukázané oligonukleotidové sekvence nebo na její komplementární řetězec. Tak jsou připraveny konstrukty za použití standartní metody genové syntesy, jak je popsána například v Maniatis et al., (Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratories, 1982) a Innis et al (PCR protocols, A guide to Methods and Applications).
V jiném aspektu vynálezu zde jsou poskytnuty expresní vektory použitelné pro produkci transformantů bakteriálních hostitelských buněk, které inkorporují rekombinantní DNA konstrukt podle předkládaného vynálezu. DNA konstrukty podle předkládaného vynálezu mohou být inkorporovány jako kazeta do vektoru, preferovaně do plasmidového vektoru, zavedenými technikami. Obecně, vektor je štěpen v restrikčních místech, která korespondují s restrikčními místy na jednom z konců kazety. Kazeta je potom zavedena ligací konců do komplementárně štěpených míst vektoru.
Ačkoliv bakteriofágové vektory mohou být použity, preferovány jsou plasmidové vektory jako je pBR322 a pUC serie plasmidů. Po • · • · inkorporování do vhodného vektoru může být vzniklý plasmid amplifikován v hostiteli pro poskytnutí dostatečných množství pro následné klonování. Bude oceněno, že DNA kódující vybraný protein je vhodně inkorporována na plasmid, který poskytuje mnoho klonovacích míst, za použití standartních klonovacích/ligačních metod. Plasmid také musí inkorporovat zdroj replikace a je žádoucí, aby inkorporoval markéry jako jsou geny resistence na ampicilin nebo tetracyklin pro umožnění selekce transformovaných buněk. Bude také oceněno, že translační stop kodony ve všech třech čtecích rámečcích a správně umístěný transkripční terminační region budou vyžadovány pro uspokojivou expresi požadovaného proteinu. Vhodné transkripční terminátory zahrnují transkripční terminátory z E. coli trpA, thr, his a phe genů.
Po inkorporování DNA kódující požadovaný protein do vektoru je tímto vektorem transformován vybraný bakteriální hostitel za použití standartní chloridem vápenatým mediované transformační techniky. Vhodní bakteriální hostitelé zahrnují gram negativní bakterie jako je E. coli a Salmonella. Preferovaným hostitelem je komerčně dostupný kmen E. coli a nejlépe JM101 a jeho deriváty.
Pokud kontrolní region NA konstruktu obsahuje lac operátor, jak je zde popsáno podrobněji dále, pak by transformovaný hostitelský kmen měl být schopen exprivovat, a požadovaně v některých případech nadprodukovat, lac produkt, takže funkce promotoru a proto exprese proteinu mohou být regulovány. Potřeba nadprodukce láci některými transformanty může být dosažena, podle jednoho provedení vynálezu, použitím hostitelů, kteří již nesou láci'3 gen odpovědný za naprodukci láci produktu. Láci
nadprodukující kmeny E. coli, které mohou být použity jako hostitelé, zahrnují JM sérii kmenů dostupnou od Clontech Laboratories lne., California, USA. Specifické hostitelské kmeny vhodné pro použití zahrnují JM101, JM105 a JM107. Alternativně, láci nadprodukce v transformantech může být dosažena inkorporací laclq genu na vektory podle předkládaného vynálezu. Protože je, v této situaci, nadprodukce láci zprostředkována vektorem, může být využit kterýkoliv z mnoha komerčně dostupných bakteriálních hostitelských kmenů, včetně E. coli kmenů DH1, RR1, C600, CMK603 a EB505. Láci13 gen, který má být inkorporován do vektoru, může být získán jako 1,2 kb HindlII fragment plasmidu pMMB22 (který popsal Bagdasarian et al (Gene 1983, 26: 273) a potom může být inkorporován bez narušení v jakémkoliv místě plasmidového vektoru.
Pro zvýšení stability dědičnosti vektorů, v určitých plasmidech, z původně transformovaného kmenu na jeho potomstvo, může být oddělující element (par) funkční v E. coli také inkorporován do vektoru. Jeden takový par element může být uvolněn z pSCIOl jako 380 bp HincII/Avall fragment a může být potom klonován do vhodného místa vektoru.
Po transformaci jsou bakteriální hostitelé nesoucí expresní vektor kultivováni v kultivačním mediu nejvhodnějším pro vybraného hostitele. Pro E. coli může být použit LB bujón nebo 2YT medium (kvasinkový extrakt/trypton) pro kultivaci zde preferovaných kmenů. Selektivní tlak pro plasmidové transformanty by měl být udržován cytotoxickým agens, které zabíjí netransformované hostitelské buňky. Například, transformanty s plasmidem nesoucím gen pro resistenci na tetracyklin by měly být kultivovány v mediu obsahujícím • 9 ·· · · • · · 0 • · 9 9
9 9 9
9 9 ·· tetracyklin. Vhodné jsou koncentrace tetracyklinu v mediu okolo 5-15 /ig/ml.
Promotor na konstruktu je preferovaně regulovatelný prostřednictvím vazby represorové molekuly na operátor umístěný v sousedství promotoru v kontrolním regionu. V preferovaném provedení se láci genový produkt váže na lac operátor umístěný v sousedství promotoru. V tomto případě reprivuje vazba láci produktu promotor, což snižuje expresní hladiny kódující DNA, která je pod jeho kontrolou. Pro zvýšení hladin exprese je chemický IPTG (izopropyl-S-D-thiogalaktopyranosid), který se váže na láci a dereprivuje promotor, přidán do kultivačního media pro derepresi promotoru a indukci exprese. Vhodně je IPTG přidán do kultivačního media tehdy, pokud buňky dosáhly střední log růstové fáze.
Pro určení optimální hustoty, při které by kultura měla být kultivována pro dosažení maximálního výtěžku požadovaného proteinu mohou být provedeny pokusy a může být testována hladina proteinu v během pokusu. Obecně, dostatečný zisk proteinu může být získán tehdy, pokud buňky dosáhnou střední log fáze, akumulace vyššího množství hodin potom.
ačkoliv proteinu může být očekávána během 4 být purifikován technikami zavedenými pro tento protein. Ve specifickém přes kde je získán
Požadovaný protein může v oboru, které jsou vhodné provedení vynálezu je exprivovaný PTH exkretován periplasmatický prostor a do kultivačního media, přímo. Pokud je exkretován, pak může být vyčerpané medium izolováno za použití biochemických technik, které respektují charakter protein ve smyslu jeho molekulové velikosti, náboje, izoelektrického bodu atd. Medium může být nejprve koncentrováno, například lyofilizací. Dále, pokud jsou dostupné protilátky nebo přirozený ligand pro protein, mohou být použity afinitní kolony.
Specifická provedení vynálezu budou nyní doložena příklady s odkazem na obrázky.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Ve své zralé formě je PTH 84 aminokyselinový peptid, který u lidí zvyšuje hladinu vápníku v krvi a moduluje tvorbu kostí. DNA kódující lidský PTH byla syntetizována za použití zavedených technik a podle aminokyselinové sekvence publikované Hendym et al., výše, a byla inkorporována do konstruktů popsaných dále, jak je ukázáno na obrázku 1.
Preferované rekombinantní DNA konstrukty inkorporující promotor č. 1 a 2, stejně jako referenční promotory č. 3 a 4, ilustrované v tabulce 1 a na obrázku 1, na které odkazujeme, byly produkovány z jednořetězcového oligonukleotidu syntetizovaného fosfforamiditovou metodou. Gelově purifikovaný řetězec obsahující sekvence od Xhol do EcoRI restrikčního místa byly potom použity jako iniciální PCR cíl a byl PCR amplifikován do dvouřetězcového DNA fragmentu za použití komplementárních jednořetězcových DNA oligonukleotidů, které specificky hybridizují na konce buď iniciální ukázané oligonukleotidové sekvence nebo na její komplementární řetězec. Tak jsou připraveny konstrukty za použití standartní metody genové syntesy, jak je popsána například v Maniatis et al., (Molecular * · • ·
Cloning Cold Spring Harbor Laboratories, 1982) a Innis et al (PCR protocols, A guide to Methods and Applications).
Konstrukty byly potom klonovány do pUC18 odvozených plasmidů, které udílejí resistenci na tetracyklin místo resistence na ampicilin. JM101 odvozený kmen E. coli byl potom transfektován podle zavedených technik (viz Maniatis et al., Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratories, 1982).
Příklad 2
Exprese transformovaných hostitelů
Transformanty obsahující PTH vektory byly kultivovány přes noc při 30 °C ve 2YT bujónu obsahujícím 0,5% glukosu a tetracyklin a potom byly inokulovány do čerstvého media stejného složení, kde pokračovala kultivace při 30 °C dokud nebyla dosažena log fáze. Kultury byly potom indukovány (1 mM IPTG) v 1 hodinových intervalech, aliquoty kultur byly odebrány a frakcionovány za produkce vzorků kultivačního media pro identifikaci exkretovaných PTH produktů za použití standartního Allegro testu. Výsledky testu jsou dány v tabulce 1, dále.
Tabulka 1
| Promotor | RBS | Max PTH (mg/1) 6-8 hod. | |||
| v c. | -35 region | intergen | -10 region | ||
| 1 | trp | ipp | lppP-5 | T5 lac | 245 148 |
| 2 | trp | lacUVS | lppP-5 | T5 | 121 |
| lac | 10 | ||||
| 3 | trp | lacO | lppP-5 | T5 lac | 50 5 |
| 4 | T7 | lacO | T7 | T5 lac | 100 10 |
Výsledky Allegro testu ukazují, že promotory inkorporující 18 bp lpp a lacUVS sekvence usnadňují zvýšení hladin heterologního PTH proteinu. Promotory č. 1 a č.2 jsou lepší ve srovnání s promotorem č. 3, ve kterém byl intergen substituován modifikovanou sekvencí lac operátoru (lacO); a ve srovnání s promotorem č. 4, kde je -35 a -10 region z bakteriofágu T7 a intergen je lacO promotor. Studie se stejnými promotory exprivujícími gen kódující chlaramfenikol acetyl transferasu (CAT) ukázaly podobné výsledky zvýšené exprese pro promotory č. 1 a č. 2. Také bylo zaznamenáno, že každý ze studovaných promotorů -vykazoval zvýšený výnos proteinu, pokud byl kombinován s RBS z bakteriofágu T ve srovnání s RBS odvozeným od lac.
Claims (14)
1. Rekombinantní DNA konstrukt, který exprivuj e protein v bakteriálním hostiteli, kde konstrukt obsahuje kódující region pro protein operativně navázaný na kontrolní region obsahující promotor, který navozuje expresi uvedeného proteinu v hostitelské buňce, kde promotor obsahuje DNA sekvenci skládající se z:
5'-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3'(SEQ ID NO: 1); a
5’-TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-3'(SEQ ID NO: 2).
2. Rekombinantní DNA konstrukt podle nároku 1, kde uvedený promotorový region obsahuje DNA sekvenci
5 ' -TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3 ' (SEQ ID NO: 1).
3. Rekombinantní DNA konstrukt podle nároku 1 nebo 2, kde uvedenou bakteriální buňkou je buňka E. coli.
4. Rekombinantní DNA konstrukt podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3, kde uvedený kontrolní region dále obsahuje operátor pro regulaci exprese proteinu.
5. Rekombinantní DNA konstrukt podle nároku 4, kde operátor je lac operátor.
6. Rekombinantní DNA konstrukt podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5, kde protein je lidský parathyreoidální hormon.
změněné nároky
7. Rekombinantní DNA konstrukt podle jakéhokoliv z nároků 1 až 6, který dále obsahuje DNA kódující OmpA signální peptid ve čtecím rámečku s kódujícím regionem, což navozuje sekreci proteinu do periplasmy hostitelské buňky.
8. Rekombinantní DNA konstrukt podle jakéhokoliv z nároků 1 až 7, kde kontrolní region obsahuje T5 ribosomové vazebné místo mající DNA sekvenci
ATTAAAGAGGAGAAATTAAGC (SEQ ID NO: 5) .
9. Rekombinantní DNA konstrukt podle jakéhokoliv z nároků 1 až 8, kde kontrolní region obsahuje sekvenci danou na obrázku 2 (SEQ ID NO: 12).
10. Rekombinantní DNA konstrukt podle jakéhokoliv z nároků 1 až 8, mající sekvenci kde kontrolní region obsahuje sekvenci danou na obrázku 3 (SEQ ID NO: 13).
11. Vektor obsahující rekombinantní DNA konstrukt podle jakéhokoliv z nároků 1 až 10.
12. bakteriální hostitelská buňka transformovaná vektorem podle nároku 11.
13. Bakteriální hostitelská buňka podle nároku 12, kterou je E. coli buňka.
14. Způsob pro produkci rekombinantního proteinu vyznačuj ícísetím, že obsahuje kultivování hostitelské buňky podle nároku 12 nebo 13 za podmínek, za změněné nároky ti kterých je uvedený protein produkován, a získání uvedeného proteinu.
změněné nároky
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/445,133 US5629205A (en) | 1995-05-19 | 1995-05-19 | Promoters for gene expression |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ357997A3 true CZ357997A3 (cs) | 1998-04-15 |
Family
ID=23767732
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ973579A CZ357997A3 (cs) | 1995-05-19 | 1996-05-16 | Promotory pro genovou expresi |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5629205A (cs) |
| EP (1) | EP0828844B1 (cs) |
| JP (2) | JP3828576B2 (cs) |
| KR (1) | KR19990014906A (cs) |
| CN (1) | CN1131313C (cs) |
| AT (1) | ATE248923T1 (cs) |
| AU (1) | AU698656B2 (cs) |
| BR (1) | BR9609102A (cs) |
| CA (1) | CA2221587C (cs) |
| CZ (1) | CZ357997A3 (cs) |
| DE (1) | DE69629808T2 (cs) |
| DK (1) | DK0828844T3 (cs) |
| EE (1) | EE9700355A (cs) |
| ES (1) | ES2202436T3 (cs) |
| HK (1) | HK1004148A1 (cs) |
| HU (1) | HUP9900750A3 (cs) |
| IS (1) | IS4609A (cs) |
| MX (1) | MX9708689A (cs) |
| NO (1) | NO325879B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ306536A (cs) |
| PL (1) | PL324226A1 (cs) |
| PT (1) | PT828844E (cs) |
| SK (1) | SK154997A3 (cs) |
| TR (1) | TR199701394T1 (cs) |
| WO (1) | WO1996036721A1 (cs) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6194168B1 (en) * | 1997-09-30 | 2001-02-27 | Human Genome Sciences, Inc. | Expression control sequences |
| CA2485703A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Fred W. Wagner | Method for enzymatic production of glp-2(1-33) and glp-2-(1-34) peptides |
| WO2005046798A1 (en) * | 2003-11-12 | 2005-05-26 | Nps Allelix Corp. | Treatment of bone loss utilizing full length parathyroid hormone |
| ATE541932T1 (de) | 2003-11-21 | 2012-02-15 | Nps Pharma Inc | Herstellung von glucagonähnlichem peptid 2 und analogen |
| US20060177895A1 (en) * | 2003-12-12 | 2006-08-10 | Chung Chan | Methods for enhancing expression of recombinant proteins |
| CN106940268B (zh) | 2012-02-23 | 2021-09-21 | 朱诺治疗有限公司 | 细胞和其它复杂生物材料的色谱分离 |
| MA45489A (fr) | 2015-10-22 | 2018-08-29 | Juno Therapeutics Gmbh | Procédés de culture de cellules, kits et appareil associés |
| CN108474002B (zh) | 2015-10-22 | 2023-05-23 | 朱诺治疗学有限公司 | 用于转导的方法、反应剂盒、反应剂和设备 |
| AR111625A1 (es) | 2017-04-27 | 2019-07-31 | Juno Therapeutics Gmbh | Reactivos de partículas oligoméricas y métodos de uso de los mismos |
| CN108060168B (zh) * | 2017-12-29 | 2021-06-29 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 一种改进的启动子及其组成的t载体和应用 |
| CN108118059B (zh) * | 2017-12-30 | 2021-03-19 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 一种改进的启动子及其组成的载体和应用 |
| CN108165551B (zh) * | 2017-12-30 | 2021-06-29 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 一种改进的启动子及其组成的t载体和应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8517071D0 (en) * | 1985-07-05 | 1985-08-14 | Hoffmann La Roche | Gram-positive expression control sequence |
| ATE123526T1 (de) * | 1987-08-17 | 1995-06-15 | Hoffmann La Roche | Hochreprimierbare expressionskontrollsequenzen. |
| US5223407A (en) * | 1988-08-31 | 1993-06-29 | Allelix Inc. | Excretion of heterologous proteins from e. coli |
| US5171670A (en) * | 1989-05-12 | 1992-12-15 | The General Hospital Corporation | Recombinant dna method for production of parathyroid hormone |
| ES2076544T3 (es) * | 1990-08-28 | 1995-11-01 | Du Pont | Procedimiento para seleccion rapida de vectores de secrecion eficaces. |
-
1995
- 1995-05-19 US US08/445,133 patent/US5629205A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-05-16 MX MX9708689A patent/MX9708689A/es unknown
- 1996-05-16 CN CN96195518A patent/CN1131313C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-16 NZ NZ306536A patent/NZ306536A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-05-16 PT PT96912181T patent/PT828844E/pt unknown
- 1996-05-16 BR BR9609102A patent/BR9609102A/pt unknown
- 1996-05-16 HU HU9900750A patent/HUP9900750A3/hu unknown
- 1996-05-16 CA CA002221587A patent/CA2221587C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-16 KR KR1019970708251A patent/KR19990014906A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-05-16 AU AU55116/96A patent/AU698656B2/en not_active Expired
- 1996-05-16 CZ CZ973579A patent/CZ357997A3/cs unknown
- 1996-05-16 PL PL96324226A patent/PL324226A1/xx unknown
- 1996-05-16 EP EP96912181A patent/EP0828844B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-16 TR TR97/01394T patent/TR199701394T1/xx unknown
- 1996-05-16 HK HK98103447A patent/HK1004148A1/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-05-16 EE EE9700355A patent/EE9700355A/xx unknown
- 1996-05-16 SK SK1549-97A patent/SK154997A3/sk unknown
- 1996-05-16 DK DK96912181T patent/DK0828844T3/da active
- 1996-05-16 JP JP53467596A patent/JP3828576B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-16 ES ES96912181T patent/ES2202436T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-16 DE DE69629808T patent/DE69629808T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-16 AT AT96912181T patent/ATE248923T1/de active
- 1996-05-16 WO PCT/IB1996/000462 patent/WO1996036721A1/en active IP Right Grant
-
1997
- 1997-11-07 IS IS4609A patent/IS4609A/is unknown
- 1997-11-18 NO NO19975286A patent/NO325879B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-03-13 JP JP2006066844A patent/JP3837154B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3837154B2 (ja) | 遺伝子発現用プロモーター | |
| US5460954A (en) | Production of human proinsulin using a novel vector system | |
| US20040106118A1 (en) | Method for exposing peptides and polypeptides on the cell surface of bacteria | |
| JPH09510611A (ja) | ポリペプチドの分泌促進 | |
| JP3976685B2 (ja) | タンパク質分泌のためのＣｌｙＡ溶血素の使用 | |
| EP1019487A1 (en) | Expression control sequences | |
| AU2001297770A1 (en) | Use of CLyA hemolysin for excretion of fusion proteins | |
| KR19990044525A (ko) | 플라스미드의 안정화 | |
| JPH0376580A (ja) | 大腸菌発現ベクターとそれを利用した抗ウイルス性タンパク質の製造方法 | |
| US6068993A (en) | Vector for expression of heterologous protein and methods for extracting recombinant protein and for purifying isolated recombinant insulin | |
| MXPA97008689A (en) | Promoters of the expression of ge | |
| JPH04502851A (ja) | 原核生物細胞中にポリペプチドを調製するための発現システム | |
| JPH03501801A (ja) | クローン化プロテインｇ変異体遺伝子及びそれから発現されたプロテインｇ変異体 | |
| HU197937B (en) | Process for producing new cloning carriers usable for the expression of polypeptides in microbiological host cells | |
| US8003348B2 (en) | Method for the mass expression of an antimicrobial peptide by co-expression of a basic antimicrobial peptide and an acidic peptide using a translational coupling system | |
| CA2730741C (en) | Self-replicating vector lacking an antibiotic-resistance gene | |
| Yamamoto et al. | Molecular organization of heat-labile enterotoxin genes originating in Escherichia coli of human origin and construction of heat-labile toxoid-producing strains | |
| JP2009511006A (ja) | 新規選択系 | |
| KR102633804B1 (ko) | 재조합 바실러스 속 미생물 및 이를 이용한 모유올리고당 제조방법 | |
| ES2393979T3 (es) | Proceso para la producción de polipéptidos | |
| JPS61224991A (ja) | 専門化リボソームおよびその使用方法 | |
| JPS6091984A (ja) | 新規プラスミドベクタ− | |
| JPH0759580A (ja) | ヒトカルシトニン前駆体ペプチドの製造法 | |
| MXPA00010057A (en) | Novel constructs for controlled expression of recombinant proteins in prokaryotic cells |