JPS61224991A - 専門化リボソームおよびその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はタンパク合成に関するものである。更に詳しく
は、本発明は、予め選択されたタンパク質を専門的に生
産するための細胞内タンパク合成要素の利用に関するも
のである。

大腸菌（Ｅ　、ｃｏｌｉ）のメツセンジャーＲＮＡ（ｎ
＋ＲＮＡ）の開始コドン上流に、１６ＳリボソームＲＮ
Ａ（１６Ｓ　ｒＲＮＡ）の３′末端に極く近い領域内に
見出されるヌクレオチド配列と相補的な配列が存在して
いる、ということをシャイン（Ｓｈｉｎｅ）とダルガル
ノ（Ｄ　ａｌｇａｒｎｏ）とが気付いてから１０年以上
経過したが、インビボ（生体内）でのタンパク合成の開
始については、今日、その各々についてようやく理解さ
れ始めてきた種々の事象からなる複雑なカスケードで表
わされる、ということ力１分かってきたにすぎない。上
記の発見以来、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列とし
て知られているこの配列は、ＧＧＡＧＧ（５’から３′
へ向けて、左から右へ読む）で示される。ところで、こ
の配列は、最も頻繁に見られるヌクレオチドのコンセン
サス（共通塩基）配列であるということを理解しなけれ
ばならない。従って、ＳＤ配列という語句は、このコン
センサスＳＤ配列のみならず他のリボソームｍＲＮＡ結
合部位のＳＤ配列をも指すものとする。大腸菌のリボソ
ームによって認識され得る他（７）ＳＤ配列ニハ、ＡＧ
ＧＡＧＧＵ、ＧＡＧＧＡ、ＧＧＧＧＵ、ＵＧＧＧＵ、　
ＧＡＧＧＵ、　ＵＧＡＧＧＡ　、　ＵＡＡＧＧＡ　、　
ＧＧＡ　、　ＡＧＧＵ、　ＧＡＧＧ　Ｕ　、　ＡＧＧＡ
Ｇｃ　、　ＬＩ　ＡＡｃｃＡｃＧｕ　、　ＧＧＬＩＧＡ
Ｕ　、　ＡＧＧＡＧＵ　、　ＡＧＧＡ　、　ｃＡｃｃｕ
ｃＡｕ　、　ＡＧＧＡＧ、　ＡＡＧＧＡＧ、　ＧＧＡＧ
　、　ＧＧＵ、　ＧＡＧ、　ＡＧＧ　、　ＡＧＧＡ　、
　ＧＧＵＧＧＵ、　ＵＧＧＡＧおよびＵＡＡＧＡＡが含
まれる［ゴールドバーガー（Ｆ　、ｇｏｌｄｂｅｒｇｅ
ｒ）ら、１９７９ｒバイオロジカルレギユレーシヨン・
アンド・デベロップメント（Ｂ　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　
Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔ）　Ｊｖｏｌ、　Ｉ　Ｎ　ｐ。

３４９〜３９９コ。実質的には、ＳＤ配列には様々なも
のがあるが、部分的にみれば、シトシンを含まず、また
、１６ＳｒＲＮＡの３′末端領域部分でＲＮＡと塩基対
コンプレックスを形成し得るという特徴を有している。

ｒＲＮＡのこの領域を抗（アンチ）−ＳＤ（ＡＳＤ）配
列と称する。１６ＳｒＲＮＡのＡＳＤ配列付近の３′末
端ヌクレオヂド配列は、細菌、酵母および真核生物を通
じて保存性が高く［ファン・チャールドープ（Ｖａｎ　
Ｃｈａｒｌｄｏｒｐ）ら、１９８２ｒヌクレイツク・ア
シッズ・リザーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ）　ＪＩＯ（４）：　　１１４９−１１５
８］、細菌では全体的に良く保存されている。例えば、
大腸菌およびＰ６ブルガリス（Ｐ　、　Ｖ　ｕｌｇａｒ
ｉｓ）の１６ＳｒＲＮＡの３′末端はいずれもｔｌｃＡ
ｃｃＵｃｃＵＵＡ　　であり、Ｂ、ステアロＯ１＋ サーモフィリス（Ｂ　、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｉｓ）のそれはｔｌｃＡｃｃＵｃｃＵＵＵｃｔｌＡ
ｏＨ，そしてシネココッカス（Ｓ　ｙｎｅｃｈｏｃｏｃ
ｃｕｓ）のそれはＵＣＡＣＣＵＣＣＩＪＵＩＪ　　であ
る。

Ｈ ＡＳＤのＣＣＵＣＧ配列はＳＤコンセンサス配列である
ＧＧＡＧＧと相補的である。にもかかわらず、良く保存
されたＡＳＤ配列は、前記の様々なＳＤ配列を有するｍ
ＲＮＡからの翻訳の開始に寄与することができる。

ＳＤ配列の機能は以下の如くであると考えられている；
翻訳の開始に先立ち、３０Ｓリボソーム・サブユニット
がその構造ＲＮＡ（１６Ｓ　ｒＲＮＡ）を介して、この
メツセンジャーＲＮＡのＳＤ配列と結合する。この結合
によって、３０８粒子（パーティクル）のいわゆるＰ一
部位にあるＡＴＧにｆＭｅｔ−ｔＲＮＡが結合する様に
、この３０Ｓ粒子が正しく位置付けられることになる。

これらの現象が起きた後、５０Ｓリボソーム・サブユニ
ットが結合して？ＯＳリボソーム粒子が形成されるこの
時点でタンパク質合成の開始は完了し、延長相（工ａン
ゲンシジーン・フェーズ）が始まる。

細菌内でのｍＲＮＡの翻訳効率の大きさには数段階の開
きかある。翻訳効率に影響を及ぼすパラメーター類に関
する知識はあまり無いが、ＳＤ配列の性質もその内の１
つであることが分かっている。この知見は、ＳＤ配列に
対する偶発的な突然変異、あるいは予め定められた、特
定部位での突然変異に関する研究から導かれた。例えば
、ある突然変異はｍＲＮＡと１６ＳｒｌＮＡとの塩基対
の形成を促進し、翻訳効率を増すことが分かった。

他方、別の突然変異はｍＲＮＡとｒＲＮＡとの間の５Ｄ
−ＡＳＤ相補性を８〜４塩基分減少させるが、この突然
変異は翻訳効率に何ら影響を及ぼさなかった。このこと
は、おそらく、残る４残基が、１６Ｓ　ｒＲＮＡとの相
互反応にとって最も好ましい位置を占めていたことによ
ると思われる。その様な突然変異の総説は、コザック（
Ｋｏｚａｋ）によって報告されている［「マイクロバイ
オロジカル・レビュ、　　−ズ（Ｍｆｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ）Ｊ４７　（１）：　１−
４５（１９８３）］。

更に、ポータプルなＳＤ領領域用いてｍＲＮＡとｒＲＮ
Ａ間での５Ｄ−ＡＳＤ相浦性を４塩基から１３塩基にわ
たって増加させると、翻訳効率は約２倍減少することが
知られている［ドウ・ボーアら（ｄｅ　Ｂｏｅｒ　ｅｔ
、ａｌ、）ａ１９８３、「バイオケミカル・ソサエティ
・シンポジウム（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｓ　ｏｃＳｙｍ
ｐ、）Ｊ４８：２３３−２４４］。また、今日では。

シャインータルガルノ配列の直後の塩基が翻訳効率に影
響を及ぼすことも分かっている（コザックら、面掲）。

ＡまたはＴ残基は、翻訳に関して肯定的に作用するが、
Ｃ残基（および、より少ない程度であるがＣ残基）は、
翻訳の可能性を大きく減少させる（ドウ・ボアーら、前
掲）。更には、開始コドン上流の配列も翻訳効率を左右
することが分かっている［ヒュイら（Ｈｕｔ　ｅｔ、ａ
ｌ、）ａ１９８４「ザーＥＭＢＯジャーナル（Ｔｈｅ　
ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ）Ｊ３（３）：６２３−６２９
］。この様に、翻訳効率がｍＲＮＡ−ｒＲＮＡ相補性の
みの関数でないことは明らかであり、従って、開始領域
内での突然変異の影響についても不明である。そこで突
然変異の効果を評価するためにスクリーニングを行うこ
とにした。

１６ＳｒＲＮＡの中央領域をコードしているＤＮＡの特
定部位における挿入突然変異が知られている［スターク
ら（Ｓ　Ｌａｒｋ　ｅｔ、ａｌ、）　１９８４　「ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジイ（Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）ｊｌ　７８　：３０３−３２２］
。これらの突然変異体からの転写物は、プロセラソング
やアッセンブリィ（集合）機能を大きく損なわれており
、ときには、これらの両工程が突然変異の結果、完全に
破壊され、また、ときには、ｒＲＮＡの成熟並びにリボ
ソームのアッセンブリィが遅延される。

本発明は、既存の細胞機構を利用して、細胞内でタンパ
ク質を組換え合成する方法に関するものである。一般に
、プラスミドなどのベクターを用いて宿主細胞をトラン
スフェクトする。これらベクターに含まれるり、ＮＡは
、細胞性ポリメラーゼによって複製され、ｍＲＮＡに転
写され、次いで、このｍＲＮＡは内因性リボソーム集団
（群）によって翻訳される（このリボソーム群は、通常
の細胞タンパク質の合成をも並行して行う）。組換えタ
ンパク合成の目的は、特定の所望のタンパク質を高収率
で得ることであるので、宿主細胞に、該宿主細胞の他の
タンパク質よりも所望のタンパク質を集中的に生産させ
るため、様々な技術が開発されてきた。例えば、誘導可
能なプロモーターをヘテロローガスな（異種の）タンパ
ク質をコードしているＤＮＡに結合させることにより、
細胞を誘導用試薬にさらすことで該ＤＮＡの転写が活性
化される様にした。かくして、この宿主細胞を、外来Ｄ
ＮＡの転写活性化の前に充分に確立された状態にするこ
とができる。それにも拘わらず、新規な転写物は限られ
た数のリボソーム群（大腸菌の場合は細胞光たり約２５
０，０００）を、宿主細胞のｍＲＮＡと競合しなければ
ならず、そのために、誘導された転写物の翻訳が減少し
、その結果、所望のタンパク質の収率が低くなってしま
う。

従って、宿主細胞の翻訳機構を、他の通常の細胞タンパ
ク質以外の、ある特定の所望のタンパク　　。

質の合成に向けて集中させる方法が必要である。

加えて、宿主細胞内での所望のタンパク質の合成におい
て最大の翻訳効率を上げるために、リボソームとメツセ
ンジャーＲＮＡとの相互作用を最適にするためのより優
れた方法が必要である。

さらに、１６ｓ　ｒＲＮＡ　ＡＳＤ配列、およびそのフ
ランキング（非翻訳）領域を、予め定めた様に修飾する
方法が必要である。

これらの、またはその他の本発明の目的は、本明細書全
体を考慮することにより、明らかとなるであろう。

川 本発明は、上記の目的を達成するための方法であって、 １）　（ａ）突然変異ＡＳＤ配列を有する１６ＳｒＲＮ
ＡをコードしているＤＮＡ配列と、（ｂ）あるタンパク
質をコードしていると共に、１６Ｓ、ｒＲＮＡの突然変
異ＡＳＤ配列と相補的な突然変異ＳＤ配列を含む非翻訳
５′領域を有しているＤＮＡ配列とを含む少なくとも１
個のベクターを得、２）このベクターで宿主細胞をトラ
ンスフェクトし、次いで、 ３）この宿主細胞を培養して該タンパク質を発現させる
ことからなる方法に関するものである。

上記において、突然変異１６ｓ　ｒＲＮＡ　ＡＳＤ配列
と突然変異ｍＲＮＡ５Ｄ配列とが相補性を有することが
重要である。この突然変異１６Ｓ　ｒＲＮＡ　ＡＳＤ配
列は、それが実質上、最大限に内因性の細胞ｍＲＮＡと
結合せず、または内因性細胞ｍＲＮＡからのタンパク合
成を開始することができない様に、そしてその逆である
様に選択される。従って、突然変異１６Ｓ　ｒＲＮＡ　
ＡＳＤ配列を有効に含有しているリボソームは、その修
飾されたリボソームに合ったメツセンジャーからのタン
パク質を専門的に合成することになる。

突然変異１６Ｓ　ｒＲ’ＮＡ　ＡＳＤ配列をコードして
いるＤＮＡの活性な転写の後に集合したリボソームは、
宿主細胞の増殖を阻害すると思われる。

しかし、このことは、突然変異ｒＲＮＡを、発現系内で
、誘導可能なプロモーターのコントロール下におくこと
により、改良される。

本発明の方法は、１６ＳリボソームＲＮＡの３′末端の
最後の約２０ヌクレオチド内に予め定められた突然変異
を有するＲＮＡをコードしている新規なりＮＡを用いる
ことにより、容易となった。

ｒＲＮＡのこの領域にはＡＳＤ配列が含まれている。さ
らに詳しくは、このＤＮＡは、１６ｓリボソームＲＮＡ
であって、式： ％式％ （式中、Ｎはヌクレオチド、ａはθ〜約５の整数、ｂは
０〜約１０の整数、そして、Ｙは約３〜１５ヌクレオチ
ドを含んでいる、ＣＣＵＣＣ以外のオリゴリボヌクレオ
チドを表わす） で示される３′末端を有するＲＮＡをコードしている。

また、本発明方法には、突然変異ｒＲＮＡと相補的なｍ
ＲＮＡをコードしているＤＮＡも含まれる。このｍＲＮ
Ａはシトシンヌクレオチドの含有量が約２５モル％以上
であり、シトシンに富むという点において特異的である
。

図面に関する簡単な記述 第１Ａ、ＩＢおよびＩＣ図は突然変異ｍＲＮＡのＳＤ配
列をコードしているＤＮＡを発現するためのベクターの
組み立て模式図である。

第２　Ａ、２　Ｂ、２　Ｃ，２Ｄおよび２Ｅ図は突然変
異１６ｓ　ｒＲＮＡ　ＡＳＤ配列と、それに相補的な突
然変異ｍＲＮＡとをコードしているＤＮＡを含むベクタ
ーの組み立て模式図である。

第３図は第２図で示したベクターを有する突然変異体に
よるヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）の合成状態を示すグラ
フである。このグラフは、形質転換体内で専門化された
リボソームが合成されており、しかも、それらが目的の
タンパク質の生産に関して活性であることを示している
。

詳しい記述 １６ｓ　ｒＲＮＡ　ＡＳＤをコードしているＤＮＡ１お
よびｍＲＮＡ　ＳＤ配列をコードしているＤＮＡの両者
を、それらが互いに相補的になる様に突然変異させる。

相補性とは、例えばＲＮＡ配列が水素結合によってヘテ
ロデュプレックス（二重鎖）コンプレックスを形成する
ならば、それらは相補的であるとされている。本明細書
においては、相補的な塩基対合を形成するヌクレオチド
を、ＧとＣ，ＡとＵ、およびＧとＵとし、相補的なヌク
レオチドが約３〜７個連続して含まれている配列を相補
的な配列とする。しかしながら、相補配列中に含まれて
いるヌクレオチド全てが塩基対を形成している必要はな
い。通常、塩基対を形成していない内部ヌクレオチドが
幾つか含まれていることによってヘテロ二重鎖コンプレ
ックスの形成が妨げられることはなく、特に、問題のヌ
クレオチド（例えばＵとＧ）に関して相補性が許容し得
るものであれば、二重鎖コンプレックスの形成は妨げら
れない。本明細書に於いて、シャイン−ダルガルノ（Ｓ
Ｄ）配列および抗−シャイン−ダルガルノ（ＡＳＤ）配
列という語句は、通常の構成的な意味ではなく、それら
の機能に基づいて用いられていると理解すべきである。

実際、本発明の突然変異ＳＤ配列および突然変異ＡＳＤ
配列は、野生型ＳＤおよび野性型ＡＳＤとは大いに反対
の相補物である。しかしながら、これらは−緒になって
適切にタンパク合成を開始する様に作用するので、上記
の事があるにも拘わらず、ＳＤおよびＡＳＤ配列と称さ
れる。

相補的な突然変異体ｒＲＮＡおよびｍＲＮＡのＳＤ並び
にＡＳＤ配列は、内因性の宿主メツセンジャーＲＮＡと
の結合、並びにそれに関するタンパク合成の開始、を最
少限に止める上で充分な長さと性質を有する。これは、
後述の如くにして誘導可能なプロモーターのコントロー
ル下にある一連の相補的な突然変異体を調製し、宿主細
胞をトランスフェクトし、同一増殖段階の突然変異体１
６ＳｒＲＮＡ類を誘導し、次いで形質転換体間における
誘導後の増殖速度を測定する、という方法で決定された
。増殖抑制作用が最少限度に止まっており、しかも内因
性メツセンジャーの翻訳には実質上関与し得ない様な突
然変異体ｒＲＮＡが本発明に用いる上で適している。し
かしながら、通常、１６ＳｒＲＮＡの突然変異ＡＳＤ配
列のグアニジンのモル含有率（％）は高い（グアニジン
がヌクレオチドの約２５〜１００モル％を占める）。こ
の。

点でグアニジンを含有していない正常のＡＳＤとこれら
突然変異体とを識別できる。勿論、相補的なｍＲＮＡ　
ＳＤ配列は過剰量のシトシンを含有しており、これもま
た、通常のメツセンジャーの開始部位と異なり、シトシ
ン含量が約２５モル％以上であろう。実際的なｌ態様と
して、天然のｍＲＮＡ並びにｒＲＮＡのＡＳＤ配列とＳ
Ｄ配列とは置換され得る。　　１６ＳｒＲＮＡの３′末
端に突然変異ＡＳＤ配列が含有される。この突然変異Ａ
ＳＤ配列は、天然の配列と同じ位置に存在していること
が望ましい。しかし、この突然変異配列は、天然の配列
（これは通常、５ヌクレオチドの長さである）よりも長
くても、または短くても良い。

突然変異配列の長さは約３〜１５ヌクレオチドである（
その中に、非相補的ヌクレオチドが、５ヌクレオチドに
ついて１個以下の割合で含まれていても良い）。突然変
異配列の長さは、約４〜６ヌクレオチドであることが好
ましい。

突然変異ｒＲＮＡ配列と突然変異ｍＲＮＡ配列とは、天
然のＡＳＤ配列とＳＤ配列上の正確に同一箇所で置換さ
れている必要（よない。例えば、ゲノム陰性菌の１６Ｓ
ｒＲＮＡの３′末末端コンセンサス列は、式：　ＵＧＧ
ＡｔｌＣＡＣＣＵＣＣＵＵＡｏ、、　［式中、ｍＲＮＡ
のＳＤコンセンサス配列（ＧＧＡＧＧ）と相補的な配列
には下線が施されているコで示される。突然変異ＡＳＤ
配列は、ＡＳＤの５個のヌクレオチドＣＣＵＣＧに、Ｇ
に富んだ置換突然変異が起きているものが好ましく、最
も好ましいのは、ＧＧＡＧＧで置換されたものである。

しかしながら、ＣＣＵＣＣを、より長い、または短い配
列（例えばＴＧＧＡＧＧまたはＧＧＡＧ）で置換しても
良い。あるいは、またはその上に、突然変異配列を上流
または下流にシフトさせ、例えば、ＵＧＧＡＵＣＧＧＡ
ＧＧＡＵＵＡ　　またはＵＧＧＡＵＣＡＵＧＧＡＧＧＵ
＾　としてもよい。

ＯＨＯＨ 前記の突然変異体のいずれにおいても、相補的な挿入体
と境界を接する（フランキング）領域内で、ｌまたは１
以上のヌクレオチドを欠失させ、例えばＵＧＧＡＵＣＡ
ＧＧＡＧＧＵＡ　　の如くにできる。しかじながＯＨ ら、突然変異部位が、３’　ｒＲＮＡの相補領域下流の
長さを増減させる様な置換に係る場合には、相補的ｍＲ
ＮＡ　ＳＥ配列とｍＲＮＡ開始コドンとの間に存在する
ヌクレオチドの数をも、好ましくは、同じ方向に、また
、同じヌクレオチド数になる様、調整すべきである。一
般に、１６ＳｒＲＮＡ　ＡＳＤ突然変異は、このｒＲＮ
Ａの３′末端の最後の約７〜２０ヌクレオチドの間に位
置している。

１６ＳｒＲＮＡは、大腸菌の７個の遺伝子によってコー
ドされており、これら遺伝子のいずれも同じ３′末端を
コードしている。これらの遺伝子、並びに他の微生物由
来の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が同定されており、大腸菌ま
たは他の細胞性ゲノムから、一般に入手可能である。例
えば、ｒｒｎＢ　ｒＲＮＡオペロン（プロモーターと、
ｒｒｎＢ　ｒＲＮＡをコードしているＤＮＡからなる）
はクローンされ、配列決定されており［ブロシウス（Ｊ
、ＢｒｏｓｉｕＳ）ら、１９８１ｒプラスミド（Ｐ　ｌ
ａｓｍｉｄ）Ｊ６　：　ｌ　Ｉ２−１１８１、これを適
当な出発物質として用いている。１６ＳｒＲＮＡをコー
ドしているＤＮＡ（好ましくは、意図する宿主細胞から
のもの）を複製可能なベクター内で常法通りクローンす
る（ブロシウスら、前掲参照）。また、別の態様では、
１６ＳｒＲＮＡとしてエリスロマイシン耐性Ｉ６Ｓ　ｒ
ＲＮＡが選択されている［シグムンド（Ｓｉｇｍｕｎｄ
）ら、１９８４ｒヌクレイツク・アシッズ・リサーチＪ
１２：４６５３−４６６３コ。次いで、一般にこれらの
ベクターを２つの方法で修飾する。まず第１に、１６Ｓ
ｒＲＮＡ−暗号化ＤＮＡを誘導可能なプロモーターのコ
ントロール下に置く。第２に、ＡＳＤ配列をコードして
いるＤＮＡ（所望により、さらにそのフランキング領域
をも含めて）を所望通り突然変異させ、ｍＲＮＡに用い
られる突然変異ＳＤ配列と相補的な配列を調製する。

誘導可能なプロモーター類は周知であり、一般に入手可
能である。その例には、ラムダファージＰＬプロモータ
ー、メタロチオナインプロモーター、および１ａｃ−Ｕ
Ｖ５プロモーター等があり、これらはそれぞれ、培養温
度の上昇、培地への銅イオンの添加、またはイソプロピ
ル−Ｂ−Ｄ、チオガラクトジッドの添加により誘導され
る。意図する宿主細胞が認識し得るその他の適当なプロ
モーターは当業者にとって自明であり、それには、例え
ばｔａｃプロモーター［ドウ・ボワー（ｄｅ　Ｂｏｅｒ
）ら、［ジーン（Ｇｅｎｅ）：構造と機能（Ｓ　ｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）Ｊｐｐ、２
　０　５　−　２　４　８（１９８３）コがある。一般
に、誘導可能なプロモーターは、そのプロモーターが誘
導された場合のＲＮＡと、誘導されていない場合のＲＮ
　Ａとの比率が約１０・１以上でなければならない。１
６ＳｒＲＮＡとメツセンジャーＲＮＡの両者をコードし
ているＤＮＡを誘導可能なプロモーター類のコントロー
ル下におくことが望ましい。これら両者に同じプロモー
ターを用いることもできるが、普通、誘導する必要があ
るのはｒＲＮＡのみである。

所望のタンパク質産物をコードしている出発物質ＤＮＡ
は真核性または原核性起源から得られる。

このタンパク質は、宿主細胞にとってヘテロジーニアス
であることを要しない。通常、この出発物質ＤＮＡは固
有の５′非翻訳領域を含むｃＤＮＡである。このｃＤＮ
Ａが真核性ｍＲＮＡの逆転写物であれば、ＳＤ配列は存
在していない。このＤＮＡを原核生物内で発現させるた
めには、真核性ＤＮＡの５′非翻訳領域を除去し、ＳＤ
配列を含む原核性の５′配列で置き換えることが好まし
い。

この配列は、インビトロでの合成によるか、あるいは、
プロモーターの供給源である遺伝子から容易に得ること
かできる。多くの原核性５′領域が知られており、それ
らを上記の目的で用いることができる。別法として、突
然変異された相捕領域を、出発コドンから適当な間隔を
あけて（出発コドンから約５〜９ヌクレオチド上流）ａ
真核細胞の５′領域のヌクレオチドと単に置き換えても
良い。

突然変異ｒＲＮＡと突然変異ｍＲＮＡとをコードしてい
る各ＤＮＡ配列は、同一のベクター内にあることが好ま
しい。こうすることにより、両ＤＮＡ配列により形質転
換を、単一の選択用試薬（例えばａｍｐｒ遺伝子−担持
ベクターの場合ならばアンピシリン）によって選択する
ことができる。２個のベクターを用いる場合には、同時
形質転換の結果を確かめるために、２種類の選択用試薬
を用いなければならない。

本発明に用いるのに好ましい宿主細胞は原核性細胞であ
り、これは、原核性のタンパク合成開始システムの方が
、真核性（特に、哺乳類細胞の如き高等な真核細胞）の
開始システムよりも良く理解されているからである。適
当な原核生物には、例えば、大腸菌やシュードモーナス
（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａＳ）等のダラム陰性菌、並び
にバチルス（ＢａｃＮｌｕｓ）等のダラム陽性菌が含ま
れる。しかしながら、本発明の原理は、真核生物内での
専門的な発現システムにも等しく適用することができる
。例えば、哺乳類細胞の１６ｓ細胞質ｒＲＮＡは３′末
末端列ＵＣＡＵＵＡ−ＯＨを含有している。この配列を
原核性の抗−シャイン−ダルガルノ配列ＣＣＵＣＣに一
致する様に突然変異させ末端配列ＵＣＡＣＣＵＣＣＵＵ
Ａ−ＯＨを有する突然変異体１６ＳｒＲＮＡを得る。次
いで、このＤＮＡを、所望のタンパク質の開始コドンの
５′側であり１．かつ、選択遺伝子（例えばＤＨＰＲ）
の開始コドンの５′側に相補配列を有するｍＲＮＡをコ
ードしているＤＮＡと一緒に宿主細胞に導入し、同時形
質転換する。従って、トランスフェクトされたＤＮＡを
取り込んだ宿主細胞であって、専門化されたリボソーム
系内でタンパク質を発現することができる宿主細胞だけ
が選択工程で生き残ることができる。

突然変異ＡＳＤを含有しているｒＲＮＡは誘導可能なプ
ロモーターのコントロール下にあるが、宿主細胞はこの
誘導可能なプロモーターを抑制し得る必要がある（例え
ば、宿主細胞は、充分量のリプレッサータンパク質を産
生ずる必要がある）。

例えば、Ｉａｃまたはｔａｃプロモーターは、本来、１
ａＣリプレツサーを過剰生産することが当業界において
知られている宿主株（例えば大腸菌ＤＩ２１０１ａｃｉ
ｇ）に用いるのが適当である。

誘導可能なｒＲＮＡで形質転換された細胞培養物を、増
殖サイクルのどの様な特定の時点で誘導するか、という
ことは重要でないが、指数増殖期に入った時点で培養物
を誘導するのが好ましい。

こうすることにより、培養物中に、例えば、専門化リボ
ソーム類を支える上で必要なリボソームタンパク質やポ
リメラーゼ類を合成するのに充分な量の内因性リボソー
ムを蓄積することができる。

エリスロマイシン耐性１６ＳｒＲＮＡを用いる場合には
、専門化リボソームが実質的な数、合成された後におい
てのみ、エリスロマイシンを加えるべきである。

実施例の記載を簡単にするため、頻繁に用いられる方法
を短い熟語に略して示す。

プラスミドは小文字のｐを先頭にし、そして／または大
文字および／または数字を続けることによって表わされ
る。本発明の出発物質であるプラスミドは市販されてい
るか、または非制限的な施設から一般に入手可能であり
、あるいはこの様にして入手し得るプラスミドから、公
知の方法に従って組み立てることができる。更に、その
他の同等なプラスミドも当業者には知られており、通常
の技術者にとって自明であろう。

ＤＮＡの“消化”とは、ＤＮＡを、該ＤＮＡのある位置
に対してのみ作用する酵素で触媒的に開裂することを指
す。その様な酵素を制限酵素と称し、該酵素にとって特
異的な部位を制限部位（サイト）と称する。“部分”消
化とは、制限酵素による不完全な消化であり、与えられ
たエンドヌクレアーゼに対するＤＮＡ基質中の部位の全
てでなく、そのうちのいくつかを開裂する様な条件を選
んで行う。

本発明において用いる様々な制限酵素は市販されており
、その反応条件、コファクター、およびその他必要なも
のは、酵素の供給業者の指示に従って使用した。制限酵
素類は、各制限酵素が最初に得られた微生物を表示する
大文字、次いで他の文字、更に、通常、数字からなる略
号で表わされる。

一般に、特別の場合を除き、約１μ９のプラスミドまた
はＤＮＡフラグメントを、約２０μＱの緩衝液中の約１
単位の酵素と共に使用する。特定の酵素について適当な
緩衝液および基質の量は、製造業者によって明示されて
いる。通常２、インキュベーション時間は３７℃で１時
間とするが、供給者の指示に従って変えてもよい。イン
キュベーションした後、フェノールおよびクロロホルム
でタンパク質を抽出して除き、消化された核酸を水性フ
ラクションからエタノール沈澱によって回収する。

ＤＮＡフラグメントの２つの制限的開裂末端か閉環（サ
ーキュライディング）したり、閉じたループを形成する
ことにより、該制限部位に他のＤＮＡフラグメントが挿
入されにくくなるのを防止するために、制限酵素による
消化の後、５′末端のホスフェートを細菌性アルカリホ
スファターゼで加水分解することが、時々ある。明示し
ない限り、プラスミドの消化には、５′末端の脱りん酸
反応は伴わないものとする。脱りん酸の方法および試薬
は常法に従う［Ｔ、マニアナイス（Ｔ　、Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ）ら、１９８２、モレキュラー・クローニング（Ｍ
。

１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｔｏｎｉｎｇ）ｐｐ、　１３３−１
３４　］。

制限酵素による消化によって得られたＤＮＡフラグメン
トの“回収”または“単離”とは、この消化物をポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけて分離し、フラグメン
トの移動度を分子量既知のマーカーＤＮＡフラグメント
のそれと比較して所望のフラグメントを同定し、該フラ
グメントを含むゲルの部分を取り除き、該ゲルからＤＮ
Ａを分離することを意味する。この方法は一般的に知ら
れている。例、Ｒ，Ｏ−ン（Ｒ、Ｌ　ａｗｎ）ら、１９
８１、“ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ”９：６１
０３−６１１４およびり、ゲラデル（Ｄ　、　Ｇ　ｏｅ
ｄｄｅｌ）ら、１９８０“ヌクレイツク・アシッズ・リ
サーチ”８：４０５７参照。

“サザーン分析”とは、消化物中のＤＮＡ配列またはＤ
ＮＡ含有組成物中のＤＮＡ配列の存在を、既知の、標識
したオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメントとの
ハイブリダイゼーションによって確認する方法である。

本明細書中では、特に断らない限り、サザーン分析とい
う時は、Ｅ、サザーン（Ｅ　、　Ｓ　ｏｕｔｈｅｒｎ）
ａ■９７５″ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジイ（Ｊ　、Ｍｏ１．Ｂ　ｉｏｌ。

）”９８：５０３−５１７、の方法に従って、消化物を
１％アガロース上で分離し、変性し、そしてニトロセル
ロース上に移し、Ｔ、マニアナイスらの方法［１９７８
、“セル”１５：６８７−７０１］に従ってハイブリダ
イゼーションを行うことを意味する。

“形質転換”とは、ＤＮＡを生物内に導入することを意
味し、その結果ＤＮＡが染色体外成分として、あるいは
染色体内に組み込まれて複製されることを意味する。特
に明示しない限り、本発明における大腸菌の形質転換法
はマンデル（Ｍａｎｄｅｌ）らのＣａＣＱ、法（１９７
０、“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジイ
”５３：１５４）を採用する。

“ライゲーション（結合）”とは、２個の二本鎖核酸フ
ラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する工程
を言う（Ｔ、マニアナイスら、前掲ｐ１４６）。特に明
示しない限り、ライゲーションは既知の緩衝液と条件を
使用し、略等羊ル量のライゲートすべきＤＮＡフラグメ
ント０．５μｇ当たりＴ４ＤＮＡリガーゼ（“リガーゼ
）１０単位を用いて行う。

形質転換体からのＤＮＡの調製は、クローンしたプラス
ミドＤＮＡを微生物培養物中から単離することにより、
行なわれる。明示しない限り、マニアナイスらのアルカ
リ性／ＳＤＳ法（同上ｐ、９０）を採用する。

“オリゴヌクレオチド”とは、短い一本鎖または二本鎖
ポリデオキシヌクレオチドであって、既知の方法によっ
て化学的に合成され、次いでポリアクリルアミドゲル上
で精製されたものである。

文献は、参考までに引用したものである。

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、これらは本
発明を制限するものではない。

実施例１　突然変異体ｍＲＮＡ開始配列をコードしてい
るＤＮＡを担ったベクターの組み立てこの組み立ては第
１図に示されている。ｐＢＲ３２２誘導体であって、単
ｌのＥｃｏＲＩ部位を有し、ｔｒｐプロモーターのコン
トロール下にヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）をコードして
いるＤＮＡを担っているｐＨＧＨ２０７−１＊［グレイ
（Ｇｒａｙ）ら、１９８４［バイオチクノロシイＪ２：
１６１−１６５およびトウーボアー（ｄｅ　Ｂｏｅｒ）
ら、１９８２、遺伝子からタンパク質へ、生物工学への
翻訳（Ｆｒｏｎ　Ｇｅｎｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ：　
Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　１ｎｔｏ　Ｂｉ。

ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）ａマイアミ・ウィンター・シン
ボジア（Ｍｉａｍｉ　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉａ
）　ｌ　９　：３０９−３２７］を、ＨｐａＩとＥｃｏ
ＲＩとで順次消化した。

Ｈｐａｌはこれをブリブノウ・ボックス（Ｐｒｉｂｎｏ
ｗＢ　ｏｘ）内のＳＤ領領域近位において開裂させ、ま
たＥｃｏＲｌは、ＨＧＨ開始コＶンの直ぐ前方で切断す
るので、２個のベクターフラグメント（小片）が得られ
た。大きい方のベクターフラグメントを回収した。この
フラグメントは、ｔｒｐＳＤ配列を除去されている。

オリゴヌクレオチドＰＳＤＲ−ＩＸをインビトロで合成
し、文献記載［ドウ・ボアーら、１９８３ｒＤＮＡＪ２
（３）：２３１−２３５、およびドウ・ボアーら、１９
８３ｒバイオケム・ツク・シンプ（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｓ
ｏｃ、Ｓｙｍｐ、）Ｊ４８　：２３３−２４４］の方法
と同様にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入した。

ＰＳＤＲ−ＩＸの配列は第１図に示されている。これは
、ベクターの、Ｈｐａｌ切断による平滑末端とのライゲ
ーションのための５′平滑末端と、３’ＥＣ０ＲＩ粘着
末端とを有する。ＰＳＤＲ−ＩＸは突然変異ｍＲＮＡ　
ＳＤ配列（ＯＣＴ　ＣＣ）を含有しており、この配列は
転写されてＣＣＵＣＣとなり、大腸菌ｒＲＮＡ　ＡＳＤ
配列のコンセンサス配列と同一（従って、これと相補的
ではない）の配列となる。このライゲーション混合物を
用いて大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換
した。ａｍｐｍココーからプラスミドを回収し、Ｂａｍ
ＨＩで消化して該プラスミドを線状化した。第１図に示
した様に、この消化プラスミドにＢａｍＨＩ−ＣｅａＩ
コンバーター（ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）をライゲートし、
得られたライゲーション混合物を用いて大腸菌２９４を
形質転換した。この工程は、ＢａｍＨ■部位をＣｌ２ａ
１部位に変換することを目的とするものである。ａｍｐ
ｒコロニーからｐＨＧＨ−ＰＳＤＲ−［Ｘを回収し、第
１図に示した様に、その配列を確認した。この配列には
、修飾されたｔｒｐプロモーターＰｒｉｂｎｏｗ　Ｂｏ
ｘ（二重線のオーバライン）ａ欠失Ｈｐａ１部位（ΔＨ
ｐａｌ）ａ転写開始部位（′″Ｉ）ａ並びに出発物質プ
ラスミドに由来する配列（小文字のヌクレオチド部分）
が含まれている。

上記の工程を、ＰＳＤＲ−Ｘを用いて行った。

この場合、突然変異ｍＲＮＡ　ＳＤ配列ＧＴＧＴＧは、
ＰＳＤＲ−ＩＸ中のＣＣＴＣＣ配列ヨリも、コンセンサ
スＧＧＡＧＧ　　ＳＤ配列からの基の逸脱度は少なかっ
た。

同様にすることにより、ＳＤ配列、および、ＳＤフラン
キング領域内の開始コドンおよび／またはヌクレオチド
、に関する空間的な位置が変化している突然変異体の膨
大なバンク（貯蔵物）を、単に、異なった合成フラグメ
ントを調製するだけで生成させ得ることは明らかである
。

実施例２　相補的な突然変異１６ＳｒＲＮＡをコードし
ているＤＮＡを含むベクターの組み立て既知の方法でプ
ラスミドｐＫＫ３５３５を調製した［ブラシウス（Ｂ　
ｒａｓｉｕｓ）ら、１９８１Ｆジヤーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジイＪＩ４８：１０７−１２７、お
よびブロシウスら、１９８１［プラスミドＪ６：１１２
−１１８］。このプラスミドは、後者の引用例中の第２
図、および本明細書の第２図に示されている。これは、
ｐＢ　Ｒ３２２ベクター内に、−列に並んでいる（タン
デムな）ＰＩおよびＰ２ｒＲＮＡプロモーターのコント
ロール下にあるｒｒｎＢ　ｒＲＮＡオペロン（１６ｒＲ
ＮＡと２３ＳｒＲＮＡとをコードしている）を含有して
いる。このｒｒｎＢリボソームＲＮＡオペロンは大腸菌
ゲノムから得られた。第２図において、ｒＡｓＤＪと命
名されている黒色の領域はｒＲＮＡ転写物の３′末端に
見出される標的抗ＳＤ配列である。この１６ＳｒＲＮＡ
の５′側黒色領域にコードされているＲＮＡは、転写後
、１６Ｓ　ｒＲＮＡからプロセッシングされた。ＴＩお
よびＴ２は転写終止領域である。本発明においては、出
発物質プラスミドはプロセッシングされる前の１６Ｓｒ
ＲＮＡをコードしており、また、大腸菌によって認識さ
れ得る転写ターミネータ−を含有していなければならな
い。以下の如くにして、挿入的なＫｐｎ［部位を付加し
た。

プラスミドｐＫＫ３５３５を、モリナガ（Ｍａｒｉｎａ
ｇａ）らのヘテロ二重鎖コンプレックス突然変異誘発法
（［バイオチクノロシイＪ１９８４年７月号、ｐｐ、６
３６−６３９）で処理し、−列に並んだＰ１プロモータ
ーとＰ２プロモーターを含む約１ＯＯｂｐフラグメント
を除去した。これは、構成的なＰｌおよびＰ２プロモー
ターを誘導可能なプロモーターで置き換えるための第一
歩である。第１に、ｐＫＫ３５３５約１１１９をＣＱａ
ＩとＰｖｕｌで消化した。第２に、約１μ９をＰｓｔｌ
消化およびＨｉｎｄＩ［Ｉ部分消化に付した。各消化混
合物中から切断されたプラスミドを単離し、プラスミド
の小片を混合し、ＤＮＡ二本鎖を１００℃で３分間加熱
することによって変性した後、以下の式： で示される合成オリゴヌクレオチドプライマーを加えた
。数値は、ブロシウス（Ｂｒｏｓｉｕｓ、前掲）らによ
って示された、ｐＫＫ３５３５のｒｒｎＢ中の位置と対
応する値である。反応混合物を４℃まで徐々に冷却し、
Ｔ４ＤＮＡリガｉゼ（１００単位）ａ大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼの大きいフラグメント（５単位）ａおよび４種
類のデオキシヌクレオチド全て（終濃度０．０５ｍＭ）
を加えた。この試料を１２．５℃で一夜インキユベート
した。インキュベートした試料で大腸菌２９４をトラン
スフェクトし、ａｍｐｒコロニーから所望の構造を有す
るプラスミドＤＮＡを単離した。このプラスミドは第２
図に示されている様に、ＰｌおよびＰ２と側面を接して
ＫｐｎＩ部位を有している。このプラスミドをＫｐｎｌ
消化に付し、大きい方のフラグメントを単離し、次いで
ライゲートさせて該プラスミドを閉環させた。こうして
、Ｐプロモーター類が欠失されたプラスミドであるｐＫ
Ｋ３５３５ΔＰＩＰ２を回収した。

次の工程は、実施例１のＰＳＤＲ−Ｉ　ＸまたはＰＳＤ
Ｒ−Ｘ配列と相補的な突然変異ＡＳＤ領域を導入するこ
とを目的としている。第１に、プラスミドｐＫＫ３５３
５ΔＰ、ＩＰ２約１μ９をＢｓｔＥ■とＸｂａｌで消化
し、第２に、同じく、ＰｖｕｌとＣｌ２ａＩで消化し、
各消化混合物中から切断されたプラスミドを単離し、得
られたフラグメントを一緒にして１００℃において３分
間加熱することにより二重鎖を変性させ、次いで、式； ％式％ （式中、点を付した部分は、野性型１６ＳｒＲＮＡをコ
ードしているＤＮＡの３′領域と相補的な塩基であるこ
とを表わしている） で示される合成オリゴヌクレオチドプライマーの存在下
で再アニールした。ｐＫＫ３５３５ΔＰＩＰ２ＡＳＤＩ
Ｘ中の修飾された１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３′末端をコ
ードしている、該ＤＮＡの転写により、以下の式： ％式％ で示される配列を含有するｒＲＮＡが得られる。

従って、ＡＳＤＩＸ配列は、実施例Ｉにおいて突然変異
ｐＨＧＨ−ＰＳＤＲ−ＩＸプラスミドに含有せしめた正
常なＡＳＤ配列ＣＣＵＣＣと相補的である。

以下の式： ％式％ で示される突然変異誘発プライマー（Ａ　Ｓ　Ｄ　Ｘと
命名）を用い、上記の方法と同様にして行った。

得られたｐＫＫ３５３５ΔＰＩＰ２ＡＳＤＸから転写さ
れたｒＲＮＡは、式： ％式％ （式中、ＣＡＣＡＣ領域は、実施例１におけるｐＨＧ　
Ｈ−Ｐ　Ｓ　Ｄ　ＲＸから転写された突然変異ｍＲＮＡ
と相補的である） で示される配列を含有している。

同様にして、ＡＳＤ５’　ＣＡＵＡＣ（ＡＳＤＸと、塩
基１個が相違している）を有する１６ＳｒＲＮＡをコー
ドしている別の突然変異ＤＮＡを、同様の方法で調製し
た。この突然変異体をｐＫＫ３５３５ΔＰＩＰ２ＡＳＤ
ＸＩと命名した。これらのプラスミドは、どれも１６Ｓ
ｒＲＮＡを発現せず、従って、それらは致死的でなく大
腸菌内で安定に維持される。

ｐＫＫ３５３５ΔＰＩＰ２ＡＳＤＸ、ＸＩまたはＩＸの
内、いずれかを以下の如くに処理する。

便宜上、後者のプラスミドについて説明し、それを第２
図に示す。即ち、プラスミドｐＫＫ３５３５ΔＰＩＰ２
ＡＳＤｒＸをＰｖｕＩとＣＱａｒとで同時に消化し、大
きい方のベクターフラグメントを回収した。

ｐＨＧＨ−ＰＳＤＲＩＸをＰｖｕｌとＣＱａＩとで同時
に消化し、ｔｒｐプロモーターとＨＧ　Ｈ遺伝子とを含
有している約１８００ｂｐのベクターフラグメントを単
離した。このフラグメントを、前節で得た大きいベクタ
ーフラグメントとライゲートし、このライゲーション混
合物を用いて大腸菌２９４を形質転換し、ａｍｐ’コロ
ニーからｐＡＳＤＩＸ−ＰＳＤＲＩＸを回収した。

ｐＫＣ３０Δｎｕｔ［ｐＮ　０２６７８とも称する、ゴ
ース（Ｇｏｕｒｓｅ）ら、１９８５ｒプロシーデインゲ
ス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエ
ンスイズ（Ｐｒｏｔ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）
ＵＳＡ　Ｊ８２：１０６９−１０７３］は、ｐＢＲ３２
２の誘導体であって、λファージｎｕｔ　Ｌ配列を含ん
でいないλＰＬオペロンを担持している。プラスミドｐ
Ｋｃ３０ΔｎｕｔをＨｉｎｄｌｌｆとＫｐｕＩとを同時
に用いて消化し、λファージＰＬプロモーター・オペレ
ーターを含有している約１３００ｂｐのフラグメントを
回収した。このフラグメントを含有しているλファージ
のＤＮＡ配列は、ヘンドリックス（Ｈｅｎｄｒｉｘ）ら
［ラムダ■（Ｌａｍｂｄａ　ＩＩ）ａｐｐ、６ｆ９−６
２３、コールドスプリングハーバ−・ラボラトリイ、１
９８３］によって示され、それは、塩基約３５５８０か
ら約３６８８０に及んでいる。この１３００ｂｐλＰＩ
、フラグメントと、式：で示される合成オリゴヌクレオ
チドとライゲートすることにより、Ｈｉ　ｎ、ｄ　Ｉ１
１部位をＫｐｎ１部位に変換した。

このオリゴヌクレオチドは、該コンバーターが自己相補
性であるため、りん酸化（キナーゼ処理）しない。即ち
、りん酸塩（ホスフェート）はベクターの粘着末端から
与えられるのであり、上方の鎖だけがライゲートする。

下方の鎖とベクターとの間に残存しているギャップは、
インビボで、下記の如くに埋められる。

変換後の１３００ｂｐフラグメントをＫｐｎＩ消化ｐＡ
ＳＤ　Ｉ　Ｘ−ＰＳＤＲＩ　Ｘにライゲートし、次いで
、大腸菌に５６３７（ｃ夏８５７）にトランスフェクト
して３０℃で増殖させた。　ａｍｐｒコロニーからプラ
スミドを単離し、Ｂｇｆ２１１およびＴ−ＩｉｎｄＩＩ
［を用いて制限酵素分析法による分析を行い、λＰＬプ
ロモーターを正しい（前向き）方向性で含有しているプ
ラスミドｐＡＳＤＩＸ−ＰＳＤＲＩＸ’−ＰＬを同定し
た。大腸菌に５６３７（ｃ１８５７）は大腸菌ｗ３１　
ＩＱ（ＡＴＣＣ２７３２５）の誘導体であって、常法通
り調製され、λＣ１８５７ΔＢａｍＣｒｏ”　Ｏａｍ１
９表現型を有している。それに関連した要素は、λリプ
レッサー遺伝子の温度感受性Ｃｌ８５７アレルを含有し
ている欠損性（ｄｅｒｅｃｔ　１ｖｅ）λプロファージ
（ゲノム挿入体）である。このλＣ１８５７リプレツサ
ーは、λＰＬプロモーターのコントロールの下、３０℃
でほぼ完全に転写を抑制するタンパク質である。しかし
ながら、λＣｌ８５７は４２℃で不活性化されるので、
この程度の温度でインキュベートすると、培養中のλＰ
Ｌは脱抑制される。ｃ１８５７アレルを伴っているλリ
ソーゲン（ｌｙｓｏｇｅｎ）を含むその他の宿主細胞［
例えば、ゴースら（前掲）の記載に係るＣ６００λ］も
用いることができる。

プラスミドｐＡＳＤ　［Ｘ−ＰＳＤＲＩＸ−ＰＬおよび
ｐＡＳＤＸ−ＰＳＤＲＸ−ＰＬの外、プラスミドｐＡＳ
ＤＸ　Ｉ−ＰＳＤＲＸ−ＰＬも上記と同様にして調製さ
れた。ここにおいて、１６Ｓ　ｒＲＮ人ＡＳＤ突然変異
体とｍＲＮＡ　ＳＤ突然変異体とは相補的であるが、こ
の相補性は、完壁な塩基対に基づくものではない。

実施例３　専門化リボソームを用いたＨＧＨの合成 ｐＡＳＤＩＸ−ＰＳＤＲＩＸ−ＰＬ、ｐＡＳＤＸ−ＰＳ
ＤＲＸ−ＰＬ、Ｉ）ＡＳＤＸ　Ｉ−ＰＳＤＲＸ−ＰＬお
よび対照、の各プラスミドを用い、下記の方法に従って
大腸菌に５６３７を形質転換し、ＨＧＨを合成させた。

プラスミドＤＮＡ約１０ｎｇを大腸菌に５６３７（Ｃｆ
８５７）またはこれと同等な菌株のコンピテントな細胞
に加え、常法通り形質転換した。ａｍｐｒ形質転換体を
得、これを３０℃において、Ｍｇ培地で一夜増殖させた
。１６時間後、ＯＤ、、１ｃ１１が０．０５を示してい
るこの同培地に、３０℃で新しい培地を接種した。１時
間後、温度は４２℃に上った。細胞標本１＋ｇを採取し
、細胞を遠心して沈降させ、溶菌した後、免疫学的手段
に基づく標準的手法によってｈＧＨ含有量を測定した。

実施例２で得た、λＰＬプロモーターを誤った方向性で
有しているプラスミドｐＡ　Ｓ　Ｄ　Ｘ　−Ｐ　５ＤＲ
Ｘを負対照に用いた。このプラスミドを含有する形質転
換体は突然変異１６ＳｒＲＮＡを生成し、また、突然変
異ｍＲＮＡ　ＰＳＤＲＸは、実質上、野性型宿主細胞の
リボソームによって認識されない。同様に、ＰＨＧＨ−
ＰＳＤＲＸ（実施例１）の転写物もこの宿主細胞に認識
されないので、これも負対照となる。

３種の正対照を用いた。それは、実際上、市販の対照物
として役立つｐＨＧＨ２０７−１、ｐＨＧＨ２０？−Ｉ
　　ＡＳＤｗｉ−ＰＬおよびｐＨＧＨ２０７〜Ｉ　　Ａ
ＳＤｖｔである。プラスミドｐＨＧ）１２０７−Ｉ　　
ＡＳＤｗＴ−ＰＬは、ＡＳＤ　Ｉ　Ｘの代わりに野性型
ＡＳＤ配列（ＣＣＵＣＣ）をコードしている１６ＳｒＲ
ＮＡを用いる外は、実質上、ｐＡＳＤＩＸ−ＰＳＤＲＩ
Ｘ−ＰＬと同様にして調製された。プラスミドｐＨＧＨ
２０７−ｔ　　ＡＳＤｗｔは、λＰＬプロモーターが挿
入されていない点を除いて、プラスミドｐＨＧＨ２（Ｌ
７−Ｉ　　ＡＳＤ＋ｖｔ−ＰＬと同一である。これら３
種の正対照は、トランスフェクトされたプラスミドがｔ
ｒｐプロモーターで促進される野性型ＨＧ　Ｈ遺伝子を
含有しており、転写物が正常な宿主細胞のリボソームに
よって認識されるが、専門化リボソームの発生をもたら
さないので、ＨＧＨを合成するものと思われる。

結果を第３図に示した。予測通り、ｐＡ　Ｓ　Ｄ　Ｘ−
ＰＳＤ１１ＸとｐＨＧＨ−ＰＳＤＲＸは、突然変異ＳＤ
が宿主細胞リボソームによって認識されず、また突然変
異１６ＳｒＲＮＡが促進されないか、あるいは、それが
コードしているＤＮＡが完全に失われている、という理
由で、実質上、ＨＧＨを生成しなかった。

ＰＬプロモーターのコントロール下で、１６ＳｒＲＮＡ
野性型ＡＳＤを含有している吐ＩＧＨ２０７−Ｉ　　Ａ
ＳＤｗｔ−ＰＬのＨＧ　Ｈ生成がｐＨＧＨ２０７−Ｉ　
　ＡＳＤｗｔや叶ＩＧＨ２０７−１よりも少ないのは、
操作可能（オペレイティブ）な、強いＰＬプロモーター
が存在しており、しかもそのベクターサイズが大きいこ
とによるものと思われる。

一般に、強力なベクタープロモーターが存在し、ベクタ
ーサイズが大きいと、細胞当たりのベクターコピー数が
相対的に少なくなり、そのために、生産物の合成か低下
することになる。しかしながら、これら３種のプラスミ
ドと全て、ＨＧＨをコードしているＤＮＡとコンセンサ
スＳＤ配列とをｔｒｐプロモーターのコントロール下に
含有しているので、λＰＬの誘導に先立ってＨＧＨ産物
が合成されることが予測される。

相補的な、または実質上相補的な、突然変異５Ｄ−ＡＳ
Ｄ暗号配列を担っているプラスミドに関する結果を検討
したところ、専門化リボソームが生産され、この専門化
システムかタンパク合成に有効であることが分かった。

３００分後においてさえ、ＨＧ　Ｈの量は増え続けてい
るが、内因性リボソームを用いた、従来のプラスミドか
ら合成されるＨＧＨの量は定常状態に達している。更に
、突然変異５Ｄ−ＡＳＤ系の位置および配列を適正化し
たり、培養期間を増加する、等によって本発明方法をよ
り洗練されたものにすることで、タンパク合成における
一層の改善が期待できる。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ、ＩＢおよびｌＣ図は突然変異ｍＲＮＡ５Ｄ配列
をコードしているＤＮＡを発現するためのベクターの組
み立て模式図、第２Ａ、２Ｂ、２Ｃ。 ２Ｄおよび２Ｂ図は突然変異１６Ｓ　ｒＲＮＡ　ＡＳＤ
配列と相補的な突然変異ｍＲＮＡとをコードしているＤ
ＮＡを含むベクターの組み立て模式図、第３図は第２Ａ
〜２Ｅ図に示したベクター等による形質転換体によるヒ
ト成長ホルモンの合成状態を示すグラフである。 特許出廓人　ジェネンテク、インコーポレイテッド代　
理　人　弁理士　青白　葆　ほか１名ＣＰＳＤＲ反）の
挿入 ＰＳＤＲＩＸ： ＤＤＣ ＰＳＤＲＸ： ＤＩ ＥＣＯド１ Ｂａｍ）−ＩＩ−Ｃ１ａＩコンｌぐ−９−（５’−ＧＡ
ＴＣＡＴＣＧＡＴ）の挿入（ＡＭＰ（１１）　　　　　
　　　　　　　　　　　　　ＥＣＯＲＩｐＫＣ３ｏΔｎ
ｕｔがうの ）−１ｉｎｄＩＩＬ−ＫｐｎＩフラブヌント３００ｂｐ Ｔ４ＤＮＡ　リカ゛−ビ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リボソーム１６Ｓ　ＲＮＡの３′末端側の最後の約
   ２０ヌクレオチド内に予め定められた突然変異を有する
   該リボソーム１６Ｓ　ＲＮＡをコードしているＤＮＡ。 ２、式：ＧＧＡ（Ｎ）＿ａＹ（Ｎ）＿ｂ−ＯＨ（式中、
   Ｎはヌクレオチド、ａは０〜約５の整数、ｂは０〜約１
   ０の整数、そして、Ｙは約３〜１５ヌクレオチドからな
   る、ＣＣＵＣＣ以外のオリゴリボヌクレオチドを表わす
   ） で示される３末端を有するリボソーム１６Ｓ　ＲＮＡを
   コードしているＤＮＡ。 ３、（Ｎ）＿ａがＵＣＡである第２項記載のＤＮＡ。 ４、（Ｎ）＿ｂがＵＵＡ、ＵＵＵＣＵＡまたはＵＵＵで
   ある第２項記載のＤＮＡ。 ５、Ｙが約２５モル％以上のグアニンヌクレオチドを含
   有している第２項記載のＤＮＡ。 ６、ＹがＧＧＡＧＧ、ＣＡＣＡＣまたはＣＡＵＡＣであ
   る第２項記載のＤＮＡ。 ７、第１項記載のＤＮＡによってコードされているＲＮ
   Ａを含有しているリボソーム。 ８、第２項記載のＤＮＡによってコードされているＤＮ
   Ａを含有しているリボソーム。 ９、第７項記載のリボソームを含有している細胞。 １０、第８項記載のリボソームを含有している細胞。 １１、第７項記載のリボソームが、細胞にとって内因性
   のｍＲＮＡを、実質上、翻訳し得ないものである第９項
   記載の細胞。 １２、第８項記載のリボソームが、細胞にとって内因性
   のｍＲＮＡを、実質上、翻訳し得ないものである第１０
   項記載の細胞。 １３、オリゴヌクレオチドＹと相補的なシャイン−ダル
   ガルノ配列を含有しているｍＲＮＡをコードしているＤ
   ＮＡにより、トランスフェクトされた第１１項記載の細
   胞。 １４、オリゴヌクレオチドＹと相補的なシャイン−ダル
   ガルノ配列を含有しているｍＲＮＡをコードしているＤ
   ＮＡによりトランスフェクトされた第１２項記載の細胞
   。 １５、２５モル％以上のシトシンヌクレオチドを含むシ
   ャイン−ダルガルノ配列を含有しているｍＲＮＡをコー
   ドしているＤＮＡ。 １６、配列がＣＣＵＣＣで示される第１５項記載のＤＮ
   Ａ。 １７、細胞培養内でタンパク質を生産する方法であって
   、 １）（ａ）突然変異ＡＳＤ配列を有する１６Ｓ　ｒＲＮ
   ＡをコードしているＤＮＡ配列と、 （ｂ）あるタンパク質をコードしていると共に、１６Ｓ
   　ｒＲＮＡの突然変異ＡＳＤ配列と相補的な突然変異Ｓ
   Ｄ配列を含む非翻訳５′領域を有しているＤＮＡ配列、
   とを含む少なくとも１個のベクターを得、 ２）このベクターで宿主細胞をトランスフェクトし、次
   いで、 ３）この宿主細胞を培養して該タンパク質を発現させる
   ことからなる方法。 １８、１６Ｓ　ｒＲＮＡをコードしているＤＮＡ配列と
   、タンパク質をコードしているＤＮＡ配列とが同一のベ
   クターに含まれている第１７項記載の方法。 １９、１６Ｓ　ｒＲＮＡをコードしているＤＮＡが誘導
   可能なプロモーターのコントロール下にある第１７項に
   記載の方法。 ２０、宿主細胞が細菌である第１９項記載の方法。 ２１、タンパク質が真核性タンパク質である第１９項記
   載の方法。 ２２、タンパク質が哺乳類のタンパク質である第２１項
   記載の方法。