CZ344398A3

CZ344398A3 - Použití c inhibitorů proteinové kinázy ke zlepšení klinické účinnosti onkologických činidel a radioterapie

Info

Publication number: CZ344398A3
Application number: CZ983443A
Authority: CZ
Inventors: Michael R. Jirousek; Lawrence E. Stramm; Douglas Kirk Ways
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1996-05-01
Filing date: 1997-05-01
Publication date: 1999-07-14
Also published as: NO985065L; PL330862A1; HUP0100285A3; NO985065D0; EA199800971A1; BR9710704A; KR20000065223A; US20010001791A1; US6232299B1; EP0914135A4; EP0914135A1; WO1997040842A1; CA2253263A1; AU718098B2; HUP0100285A2; IL126768A0; US6288053B1; JP2000510828A; US6486179B2; AU3000297A

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu zvýšení antineoplastických účinků chemoterapie a terapie ozařováním pomocí PKC inhibitorů. Vynález se zvláště týká použití inhibitorů proteinové kinázy C (PCK), zvláště určité třídy selektivních PKC inhibitorů isozymu ve spojení s onkolytickým činidlem nebo gama-zářením, aby se zvýšily jejich antineoplastické účinky při léčbě novotvarů. Dosavadní stav techniky

Terapeutická léčba novotvarů byla vyvíjena po řadu let. Existují dva hlavní přístupy léčby novotvarů: 1) chemoterapie používající onkolytická činidla a 2) terapie zářením, například gamazářením. Onkolytická činidla a gama-záření působí cytotoxicky přednostně na nádorové buňky a zapříčiňují smrt buněk.

Studie ukázaly, že gama-záření a určitá onkolytická činidla uplatňují své cytotoxické účinky pomocí aktivace programované buněčné smrti nebo apoptózy. Rovnováha mezi aktivitami apoptotických a antiapoptotických cest intracelulárního přenosu signálu je důležitá pro osud buněk podrobujících se apoptóze jako výsledek výše zmíněné chemoterapie a také terapie ozářením.

PKC inhibitory byly navrženy pro rakovinnou terapii, například U.S. 5,552,391, a bylo zjištěno, že PCK aktivity projevují antiapopnotické účinky, zvláště při reakci na terapii zářením, například gama-zářením. Zvláště se ukázalo, že aktivace PKC inhibuje apoptózu způsobenou anti-neoplastickými činidly, například Ara-c, 2-chlor-2-deoxyadenosinem, 9-beta-D-arabinosyl2-fluoradeninem a terapií gama-zářením. Také se naznačovalo, že snížení PKC aktivit v rakovinných buňkách zvýší apoptózu stimulovanou onkolytickými činidly. Bylo ukázáno, že PKC aktivace oslabuje smrt buněk způsobenou gama-zářením.

Ve stavu techniky vznikla potřeba vyvinout terapeutická činidla, která zvýší apoptotickou cestu přenosu signálu v buňkách a tím zvýší klinickou účinnost onkolytických činidel a terapie ozářením.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je poskytnout způsoby léčby novotvaru.

• · ·

Dalším předmětem vynálezu je poskytnout způsoby pro zvýšení antineoplastického účinku onkolytického činidla.

Ještě dalším předmětem vynálezu je poskytnout způsoby pro zvýšení antineoplastických účinků terapie ozářením.

Tyto a další předměty vynálezu jsou zabezpečeny jedním nebo více provedeními popsanými níže.

Jedno provedení vynálezu poskytuje způsob léčby novotvaru, který zahrnuje podání savci, který takovou léčbu potřebuje, onkolytického činidla nebo gama-záření společně s inhibitorem proteinové kinázy C.

V ještě dalším provedení vynálezu se poskytuje způsob pro zvýšení účinku antineoplastické chemoterapie a terapie ozářením, který zahrnuje podávání inhibitoru proteinové kinázy C společně s uvedeným onkolytickým činidlem nebo terapií ozářením.

Vynález zahrnuje znalosti spolu se způsobem zvýšení apoptotických účinků v buňkách a je tedy účinný při zvyšování anti-neoplastatických účinků chemoterapie a terapie ozářením.

Podle vynálezu bylo objeveno, že použití PKC inhibitorů, zvláště určité třídy inhibitorů proteinové kinázy C, redukuje nebo inhibuje apoptotické účinky v buňkách. Proto tedy mohou být takové sloučeniny použity ke zvýšení anti-neoplastických účinků chemoterapie a terapie ozářením.

Způsob podle vynálezu může využít jakékoliv PKC inhibitory známé ve stavu techniky včetně nespecifických PKC inhibitorů různých isoforem. Informace o PKC inhibitorech a způsobech jejich přípravy jsou snadno dostupné ve stavu techniky. Například různé druhy PKC inhibitorů a jejich příprava jsou popsány vUS patentech 5621101, 5621098, 5616577, 5578590, 5545636, 5491242, 5488167, 5481003, 5461146, 5270310, 5216014, 5204370, 5141957, 4990519 a 4937232, které všechny jsou zde zahrnuty tímto odkazem. S výhodou jsou podle vynálezu použity inhibitory proteinové kinázy C, které účinně inhibují beta-isozym. Jedna vhodná skupina sloučenin je obecně popsána ve stavu techniky jako bis-indolylmaleinimidy nebo makrocyklické bis-indolylmaleinimidy. Bis-indolylmaleinimidy byly dobře popsány ve stavu techniky včetně těch sloučenin popsaných v US patentech 521098, 5552396, 554536, 5481003, 5491242, a 5057614, všechny jsou zde zahrnuty tímto odkazem.

Makrocyklické bis-indolylmaleinimidy jsou především představovány sloučeninami vzorce I. Tyto sloučeniny a způsoby jejich přípravy byly popsány v US patentu 5 552 396, který je zde zahrnut tímto odkazem. V souladu s vynálezem jsou tyto sloučeniny aplikovány společně • · · · • · · · • · · · • · · · · · • · « · s jinými anti-neoplastickými terapiemi savcům, kteří takovou léčbu potřebují. Především mohou být tyto sloučeniny použity ke zvýšení antineoplastických účinků chemoterapií a terapií ozářením.

Jedna výhodná třída sloučenin pro použití ve způsobu podle vynálezu má obecný vzorec I

R²

kde

W je -0-, -S-, -S0-, -SO2-, -C0-, C2-Cg alkylen, substituovaný alkylen, C2-Cg alkenylen, -aryl-, -aryl(CH2)_m0-, -heterocykl-, -heterocykl-(CH2)_mO-,-kondenzovaný bicykl, kondenzovaný bicykl(CH2)_m0-, -NR³-, -NOR³-, -CONH- nebo -NHC0-,

X a Y jsou nezávisle C4-C4 alkylen, substituovaný alkylen, nebo společně X, Y a W tvoří -(CH₂)_n-AA-,

Rl jsou vodík nebo až čtyři případné substituenty nezávisle vybrané z halogenu, C4-C4 alkylu, hydroxy, C4-C4 alkoxy, halogenalkylu, nitro, NR⁴R^, nebo -NHC0(C]-C4 alkyl),

R^ je vodík, CH3CO-, NH2 nebo hydroxy,

R³ je vodík, (CH2)maryl, C1-C4 alkyl, -COO(Ci-C4 alkyl), -CONR⁴R⁵, -(C=NH)NH2, SO(C!-C₄ alkyl), -SO₂(NR⁴R⁵) nebo -SO₂(Ci-C₄ alkyl),

R⁴ a R^ jsou nezávisle vodík, C4-C4 alkyl, fenyl, benzyl nebo spolu s dusíkem, ke kterému jsou připojeny, tvoří nasycený nebo nenasycený 5 nebo 6 členný kruh

AA je zbytek aminokyseliny, mje nezávisle O, 1, 2 nebo 3 a n je nezávisle 2, 3, 4 nebo 5 nebo farmaceuticky přijatelná sůl, proléčivo nebo jejich ester.

• ·

Výhodnější třída sloučenin pro použití podle vynálezu je představována obecným vzorcem

I, kde části -X-W-Y- obsahují 4 až 8 atomů, které mohou být substituovány nebo nesubstituovány. Nejvýhodněji části -X-W-Y- obsahují 6 atomů.

Ostatní výhodné sloučeniny pro použití způsobu podle vynálezu jsou takové sloučeniny obecného vzorce I, kde R^ a R² jsou vodík a W je substituovaný alkylen, -0-, -S-, -C0NH-, NHCO- nebo -NR³-.

Zvláště výhodné sloučeniny jsou sloučeniny obecného vzorce Ia:

kde Z je -(CH₂)_p, nebo -(CH₂)_p-O-(CH₂)_p,

R⁴ je hydroxy, -SH, Ci-C₄alkyl, (CH₂)aryl,-NH(aryl), -N(CH₃) (CF₃), -NH(CF₃), nebo NRSr⁶,

R³ je vodík nebo C1-C4 alkyl R6 je vodík, C1-C4 alkyl nebo benzyl, p je O, 1 nebo 2 a m je nezávisle 2 nebo 3, nebo farmaceuticky přijatelná sůl, proléčivo nebo jejich ester. Nejvýhodnější sloučeniny podle obecného vzorce Ia jsou ty, kde Z je CH2 a R⁴ je NH2, NH(CF₃) nebo -N(CH₃)₂.

Jiné výhodné sloučeniny pro použití ve způsobu podle vynálezu jsou sloučeniny, kde W v obecném vzorci I je -Ο-, Y je substituovaný alkylen a X je alkylen. Tyto výhodné sloučeniny jsou představovány obecným vzorcem Ib:

H ,· ·♦ ·· « · · · · • · · · ’ • · · · · · · * » · ’ b · · · · · ·

Ib kde Z je -(CH2)_p,

R⁴ je -N(CH₃) (CF₃), -NH(CF₃), nebo -NR⁵R⁶,

R⁵ a R⁶ jsou nezávisle vodík nebo C4-C4 alkyl, m je nezávisle 2 nebo 3, nebo farmaceuticky přijatelná sůl, proléčivo nebo jejich ester. Nejvýhodnější sloučeniny podle obecného vzorce Ib jsou ty, kde p je 1 a R^ a R^ jsou methyl.

Protože obsahují bazickou oblast, sloučeniny podle obecných vzorců I, la a Ib mohou také existovat jako farmaceuticky přijatelné kyselé adiční soli. K tvorbě takových solí se obecně používají kyseliny včetně anorganických kyselin, například kyselina chlorovodíková, bromovodíková, jodovodíková, sírová a fosforečná, a také organické kyseliny jako paratoluensulfonová, methansulfonová, oxalová, para-bromfenylsulfonová, uhličitá, jantarová, citrónová, benzoová a octová, a jim příbuzné anorganické a organické kyseliny. Takové farmaceuticky přijatelné soli tedy zahrnují síran, disíran, hydrogensíran, siřičitan, hydrogensiřičitan, fosforečnan, hydrogenfosforečnan, dihydrogenfosforečnan, metafosfát, « · • · pyrofosfát, chlorid, bromid, jodid, acetát, propionát, dekanoát, kaprylát, akrylát, formiát, isobutyrát, heptanoát, propiolát, oxalát, malonát, sukcinát, suberát, sebakát, fumarát, maleát, 2butin-l,4-diolát, 3-hexin-2,5-diolát, benzoát, chlorbenzoát, hydroxybenzoát, methoxybenzoát, ftalát, xylensulfonát, fenylacetát, fenylpropionát, fenylbutyrát, citrát, laktát, hippurát, betahydroxybutyrát, glykolát, maleát, vinan, methansulfonát, propansulfonát, nabalen-1 -sulfonát, naftalen-2-sulfonát, mandelát a podobně. Zvláště se používají chloridy a mesyláty.

Vedle farmaceuticky přijatelných solí mohou existovat jiné soli. Ty mohou sloužit jako meziprodukty při čistění sloučenin, při přípravě jiných solí, nebo při identifikaci a charakterizaci sloučenin nebo meziproduktů.

Farmaceuticky přijatelné soli sloučenin obecných vzorců I, Ia a Ib existují také ve formě různých solvátů, například s vodou, methanolem, ethanolem, dimethylformamidem, ethylacetátem a podobně. Směsi takových solvátů se také mohou připravit. Zdrojem takových solvátů může být rozpouštědlo z krystalizace, inherentní v rozpouštědle při přípravě nebo krystalizaci nebo přidané k takovému rozpouštědlu.

Je známo, že mohou existovat různé stereoizomemí formy sloučenin obecných vzorců I, Ia, Ib, například W může obsahovat chirální atom uhlíku v substituované alkylenové části. Sloučeniny se normálně připraví jako racemáty a mohou být pohodlně použity jako takové. Případně se mohou izolovat oba individuální enantiomery nebo se mohou syntetizovat konvenčními technikami, pokud se to požaduje. Takové racemáty a individuální enantiomery a jejich směsi tvoří část sloučenin používaných ve způsobu podle vynálezu.

Sloučeniny použité ve vynálezu také zahrnují farmaceuticky přijatelné proléčiva sloučenin obecných vzorců I, Ia, Ib. Proléčivo je léčivem, které se chemicky modifikuje a může být biologicky inaktivní ve místě účinku, ale které může být degradováno nebo modifikováno jedním nebo více enzymy nebo jinými in vivo procesy na bioaktivní formu základní látky. Toto proléčivo může mít pravděpodobně odlišný farmakokinetický profil než má základní látka, což umožňuje snadnější absorpci přes mukózní epitel, lepší tvorbu solí nebo rozpustnost a nebo lepší stabilitu v systému (například zvýšení poločasu v plazmě). Typicky takové chemické modifikace zahrnují následující:

1) esterové nebo amidové deriváty, které mohou být štěpeny esterázami nebo lipázami,

2) peptidy, které mohou být rozpoznány specifickými nebo nespecifickými proteázami, nebo

3) deriváty, které se v místě účinku hromadí membránovou selekcí formy proléčiva nebo modifikované formy proléčiva, nebo jakákoliv kombinace 1 až 3 shora. Běžné postupy pro výběr a přípravu vhodných derivátů proléčiva jsou popsány například v H. Bundgaard, Design of Prodrugs, (1985).

Syntéza různých derivátů bis-indol-N-maleimidu je popsána v Davis a j. US patent 5,057,614 a syntéza výhodných sloučenin vhodných pro použití v tomto vynálezu je popsána v dříve uvedeném US patentu 5,552,396 a v Faul a j., EP publikace 0 657 411 Al, všechny jsou zde zahrnuty tímto odkazem.

Jeden zvláště výhodný inhibitor proteinkinázy C pro použití ve způsobu podle vynálezu je sloučenina popsaná v příkladu 5g dříve zmíněného U.S.patentu 5,552,396 hydrochloridová sůl ((S)-3,4-N,N'-l,l'-((2-ethoxy)-3'(O)-4'-(N,N-dimethylamino)-butan)-bis-(3,3'-indolyl)-l(H)pyrol-2,5-dionu). Tato sloučenina je silným inhibitorem proteinkinázy C. Je selektivní k proteinkináze C více než k ostatním kinázám a je vysoce selektivní k isozymům, například je selektivní k beta-1 a beta-2 isozymům. Ostatní soli této sloučeniny jsou také výhodné, zvláště mesylátové soli.

Výhodná mesylátová sůl může být připravena reakcí sloučeniny obecného vzorce II

N(_CH₃)₂ • ·

s methansulfonovou kyselinou v nereaktivním organickém rozpouštědle, s výhodou směsi organické rozpouštědlo/voda a nejlépe voda-aceton. Ostatní rozpouštědla, například methanol, aceton, ethylacetát a jejich směsi jsou funkční. Poměr rozpouštědla k vodě není kritický a obecně je určený rozpustností reagentů. Výhodné poměry rozpouštědla k vodě jsou obecně od 0,1:1 až 100:1 objemových dílů rozpouštědla k vodě. S výhodou je poměr 1:1 až 20:1 a nejlépe 5:1 až 10:1. Optimální poměr závisí na vybraném rozpouštědle a v případě výhodného acetonu je poměr 9:1 rozpouštědlo k vodě.

Reakce obecně zahrnuje přibližně ekvimolární množství obou reagentů, třebaže jiné poměry, zvláště ty, kde je kyselina methansulfonová v přebytku, jsou operativní. Rychlost přidávání kyseliny methansulfonové není v reakci kritická a může se přidávat rychle (pod 5 minut), nebo pomalu během 6 nebo více hodin. Reakce se provádí při teplotách pohybujících se o

od 0 C až k refluxu. Reakční směs se míchá, dokud není tvorba soli dokončena, což se stanoví rentgenovou práškovou difrakcí a může to trvat od 5 minut do 12 hodin.

Soli podle vynálezu se s výhodou snadno připraví v krystalické formě. Trihydrátová forma soli se může snadno přeměnit na monohydrát sušením nebo vystavením 20 až 60 % relativní vlhkosti. Sůl je podstatně krystalická, což demonstruje definovaná teplota tání, dvojlom a charakteristické rysy rentgenové difrakce. Obecně krystaly mají méně než 10 % amorfní pevné látky a s výhodou méně než 5 % a nejlépe méně než 1 % amorfní pevné látky.

Mesylátová sůl se izoluje filtrací nebo jinou separační technikou, uvedenou ve stavu techniky, přímo z reakční směsi ve výtěžcích pohybujících se od 50 % do 100 %. Rekrystalizace a jiné techniky čištění známé ve stavu techniky mohou být využity pro další přečištění soli, pokud je to vyžadováno.

PKC inhibitory, včetně sloučenin uvedených výše, se používají ve spojení s obvyklými anti-neoplastickými terapiemi k léčbě savců, zvláště lidí s neoplazií. Postupy pro běžné antineoplastické terapie, včetně chemoterapií, například použití onkolytických činidel a terapie ozářením, například gama-ozářením, jsou známé, snadno dostupné a běžně prováděné ve stavu techniky, viz například 11. vydání Harrisonova Principles of Intemal Medicine, McGraw-Hill Book Company.

Neoplazie je charakterizovaná abnormálním růstem buněk, který má často za následek invazi normálních tkání, například primární nádory nebo nádory rozšířené ve vzdálených orgánech, například metastáze. Léčba jakékoliv neoplazie běžnými anti-neoplazmickými terapiemi může být zlepšena podle vynálezu. Takový neoplastický růst zahrnuje, ale není na ně omezen, primární nádory, které byly neúplně odstraněny chirurgickými technikami, primární • ·

nádory, které byly vhodně ošetřeny, ale které se mohou s vysokým rizikem následně vyvinout v metastatickou chorobu a propuklou metastatickou chorobu.

Specificky PKC inhibitory uvedené výše mohou zvýraznit anti-neoplastický účinek onkolytického činidla. Pro kombinační terapii se podle vynálezu zamýšlí řada onkolytického činidel. Ve výhodném provedení vynálezu se používají onkolytická činidla, která dosahují své cytotoxické účinky aktivací programované buněčné smrti nebo apoptózy, v kombinaci s popsanými PKC inhibitory. Ty zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, 1-beta-Darabinoíuranosylcytosin nebo Ara-e, etoposid nebo VP-16, cis-diamindichlorplatinu(II) nebo cisplatinu, doxorubicidin nebo adriamycin, 2-chlor-2-deoxyadenosin, 9-beta-D-arabinosyl-2fluoradenin a glukokortikoidy. Všechny neoplastické stavy léčitelné takovými onkolytickými činidly lze léčit v souladu s tímto vynálezem použitím kombinace PKC inhibitoru s jedním či více onkolytickými činidly. Onkolytická činidla dosahují anti-neoplastické účinky u řady specifických neoplastických stavů. Například Ara-c se normálně používá pro léčení dětské akutní lymfoidní leukémie (ALL), thymické ALL, ALL B-buněk, akutní myeloidní leukémie, akutní granulocytické leukémie a jejích variací, ne-Hodkinsova lymfomu, myelomonocytoidní leukémie, akutní megakariocytoidní leukémie a Burkitova lymfomu, B-ALL dospělých, akutní myeloidní leukémie, chronické lymfoidní leukémie, chronické myeloidní leukémie a leukémie T buněk. VP-16 se normálně používá pro léčení testikulámího karcinomu, malého a rozsáhlého nemalého karcinomu buněk plic, Hodkinsova lymfomu, ne-Hodkinsova lymfomu, chloriokarcinomu, Ewingova sarkomu a akutní granulocytické leukémie.. Cis-platinu lze použít pro léčení testikulárního karcinomu, tumorů germinálních buněk, karcinomů vaječníků, rakoviny prostaty, rakoviny šíje, endomermetriální rakoviny, rakoviny žaludku, rakoviny prsu a rakoviny hlavy a šíje. 2-Chlor-2-deoxyadenosin a 9-beta-D-arabinosyl-2-fluoradenin lze použít pro léčení chronické lymfoidní leukémie, lymfomů a leukémie vlasových buněk. Doxorubicidin lze použít pro léčení akutní granulocytické leukémie a jejích variací, ALL, rakoviny prsu, rakoviny močového měchýře, rakoviny vaječníků, rakoviny plic, Hodkinsova lymfomu, ne-Hodkinsova lymfomu, sarkomů, karcinomu střev, rakoviny prostaty, endomermetriální rakoviny, Wilmsova tumoru a neuroblastomu. Klinické účinky onkolytických činidel zahrnujících ty, které se diskutovaly shora, lze zvýšit použitím kombinační terapie s identifikovanými PKC inhibitory v souladu s tímto vynálezem.

PKC inhibitory identifikované v tomto vynálezu také mohou zvýšit účinky terapie ozařováním. Obvykle se používá pro ošetření místa pevného tumoru přímo gama-záření.

• · • · • · · · • · · • · · · · ·

Experimentální výsledky zajištěné v tomto vynálezu ukazují, že úplné snížení nebo ztráta proteinové kinázy C-beta je spojena se synergickým zvýšením onkolyticky indukované apoptózy u lidských leukemických buněk (Obr. 1). Podobně významné snížení proteinové kinázy C-beta u lidských U937 leukemických buněk zvýrazňuje smrt buněk stimulovanou ozářením (Obr. 2). Lidské U937 leukemické buňky, které vyjadřují více proteinové kinázy C-beta ukazují odolnost k smrti buněk stimulované ozářením (Obr. 3). Tyto údaje poskytují závažné důkazy, že PKC inhibitory, zejména selektivní inhibitory beta isozymu, výhodně použité v souladu s tímto vynálezem mohou zvýšit smrt buněk nebo antineoplastické účinky chemoterapií a terapií ozařováním a zlepšit klinické odpovědi na tyto běžně používané terapeutické modality.

PKC inhibitory podle vynálezu se podávají v kombinaci s jinými antineoplastickými terapiemi včetně onkolytických činidel a terapie ozářením. Věta v kombinaci s jinými antineoplastickými terapiemi znamená, že se sloučeniny mohou podávat krátce před, krátce po nebo souběžně s takovými jinými antineoplastickými terapiemi. Sloučeniny se mohou podávat v kombinaci s více než jednou antineoplastickou terapií. Ve výhodném provedení se sloučeniny podávají od 2 týdnů do 1 dne před jakoukoliv chemoterapií nebo 2 týdny do 1 dne před jakoukoliv terapií ozářením. Alternativně se PKC inhibitory mohou podávat během chemoterapií a terapií ozářením. Pokud se podávají po chemoterapii a terapii ozářením, měly by se PKC inhibitory podávat během 1 až 14 dnů po primárním ošetření.

Odborník pozná množství PKC inhibitoru, které by se mělo podávat v souladu s tímto vynálezem v kombinaci s jinými antineoplastickými látkami nebo terapiemi. Je to množství dostatečné k zvýšení anti-neoplastatických účinků onkolytických činidel nebo terapie ozářením, nebo množství dostatečné k apoptózy nebo buněčné smrti. Takové množství se může inter aha měnit v závislosti na velikosti a typu novotvaru, koncentraci sloučeniny v terapeutické formulaci, specifických použitých antineoplastických látek, časování podávání PKC inhibitorů vzhledem k jiným terapiím a věku, velikosti a stavu pacienta.

Aby se zjistilo množství sloučenin potřebné pro zavedení apoptózy, lze použít jak in vivo tak in vitro testy. Například lze vystavit lidské leukemické buňky in vitro různým koncentracím onkolytických činidel, například Ara-c, nebo ozáření, v přítomnosti nebo nepřítomnosti PKC inhibičních sloučenin použitých ve vynálezu. Lze vybrat vhodné typy neoplastických buněk pro různá onkolytická činidla. Lze též použít pro srovnání jiné selektivní inhibitory C proteinové kinázy. V různých časových bodech by se buňky prozkoumaly na životnost konvenčními způsoby nebo dosažitelnými prostředky. Apoptózu nebo buněčnou smrt lze stanovit a kvantifikovat vylučováním trypanové modři a sníženou klonogenicitou v měkkém agaru. Jak • · • ·

odborníci dobře znají, apoptóza je specifický způsob buněčné smrti, rozlišitelný charakteristickým vzorem morfologických, chemických a molekulárních změn, zahrnující, ale ne omezeně, endonukleolýzu (matečná kolej DNA), abnormální zlomy DNA a kondenzaci chromatinu a cytoplasmu (kondenzovaná a prasklá jádra). Tyto změny lze snadno zjistit jakýmikoliv prostředky známými v oboru, například mikroskopicky, průtokovými cytometrickými metodami založenými na zvýšené citlivosti DNA k denaturaci nebo změněnými vlastnostmi rozptylu světla, fragmentace se zjistí elektroforézou na agarózovém gelu, testem terminální transferázy DNA (TdT test) a testem posunu jednořetězového zlomu (NT test).

Studie in vivo lze provádět pomocí xenograftů tumoru očkovaných do zvířat zbavených imunity nebo synegických zvířat. Po očkování a růstu primárního implantu by se zvířata ošetřila sloučeninami podle vynálezu před vystavením žádanému onkolytickému činidlu nebo ošetření ozářením. Velikost implantovaného tumoru před a po každém ošetření v přítomnosti nebo nepřítomnosti sloučenin podle vynálezu lze použít jako indikátor terapeutické účinnosti ošetření.

Množství inhibitoru proteinkinázy C, které by se mělo podávat v kombinaci s jinými antineoplastickými terapiemi obecně určí na základě případu ošetřující lékař. Jako vodítko se bude posuzovat při stanovení vhodné dávky vedle jiných faktorů rozsah neoplazie, hmotnost těla a věk pacienta. Normálně se očekává, že PCK inhibitory podle vynálezu budou zvyšovat antineoplastatické účinky onkolytických činidel a terapie ozářením asi od 2 krát do 10 krát.

Vhodná dávka je obecně taková, která vede ke koncentraci inhibitoru proteinkinázy C na místě buňky tumoru v rozmezí 0,5 nM do 0,200 μΜ a pravidelněji od 20 nM do 80 nM. Očekává se, že koncentrace v séru od 40 nM do 150 nM by byly ve většině situací dostatečné.

Aby se získaly tyto léčebné koncentrace, bude se pacientovi, který potřebuje léčení, podávat mezi asi 0,1 mg na den na kg hmotnosti těla a 1,5 mg na den na kg. Obvykle by nemělo být potřeba víc než asi 1,0 mg na den na kg inhibitoru protein- kinázy C. Jak bylo uvedeno výše, množství výše se mohou měnit na základě případu.

Sloučeniny obecného vzorce I a výhodné sloučeniny obecných vzorců la a lb se s výhodou před podáváním formulují. Vhodné farmaceutické formulace se připraví dobře známými postupy s použitím dobře známých a snadno dostupných složek. Při přípravě formulací vhodných pro použití způsobu podle vynálezu se aktivní složka obvykle smíchá s nosičem, nebo se zředí nosičem, nebo se uzavře v nosiči, který může být ve formě kapsle, sáčku papíru nebo jiného obalu. Když nosič slouží jako ředidlo, může to být pevný, polotuhý nebo kapalný materiál, který působí jako vehikulum, excipient nebo medium pro aktivní složku. Tak kompozice mohou být ve formě tablet, pilulek, prášků, kostek, sáčků, elixírů, suspenzí, emulzí, • · .:. .:. ..........

roztoků, sirupů, aerosolů (jako pevné látky nebo v kapalném mediu), tvrdých a měkkých želatinových kapslí, čípků, sterilních injekčních roztoků a sterilních balených prášků jak pro orální tak topickou aplikaci.

Některé příklady vhodných nosičů, excipientů a ředidel zahrnují laktózu, dextrózu, sacharózu, sorbitol, manitol, škroby, akáciovou gumu, fosforečnan vápenatý, alginát, tragakant, želatinu, křemičitan vápenatý, mikrokrystalickou celulózu, polyvinylpyrrolidin, celulózu, vodný sirup, methylcelulózu, methyl a propylhydroxybenzoáty, mastek, stearát hořečnatý a minerální olej. Formulace mohou dále obsahovat maziva, smáčedla, emulgátory a suspendující činidla, stabilizátory, sladidla nebo ochucovadla. Kompozice podle vynálezu se mohou formulovat tak, aby zajistily rychlé, trvalé nebo opožděné uvolňování aktivní složky po podání pacientovi. Kompozice se formulují s výhodou v jednotkových dávkových formách obsahujících asi od 0,05 mg do 3 g, obvykleji asi 64 mg aktivní složky. Rozumí se však, že podávanou terapeutickou dávku stanoví lékař ve světle platných okolností zahrnující závažnost stavu, který se má léčit, výběr sloučeniny, která se má podávat a vybranou cestu podávání. Tedy shora uvedené dávkové rozmezí není zamýšleno, aby jakkoliv omezovalo rozsah vynálezu. Termín jednotková dávková forma se týká fyzicky diskrétních jednotek vhodných jako jednotkové dávky pro lidské subjekty a jiné savce, každá jednotka obsahující předem stanovené množství aktivního materiálu vypočteného pro dosažení žádaného terapeutického účinku ve spojení s vhodným farmaceutickým nosičem.

Mimo shora uvedené formulace, z nichž většina se může podávat orálně, sloučeniny užité při způsobu podle vynálezu se také mohou podávat topicky. Topické formulace zahrnují masti, krémy a gely.

Masti se obecně připraví (1) buď s použitím olejovité báze, například složené ze stabilizovaných olejů nebo uhlovodíků, jako je bílý petrolát nebo minerální olej, nebo (2) absorpční báze, například složené z bezvodé látky nebo látek, které mohou absorbovat vodu, například bezvodého lanolinu. Obvykle po formaci báze, ať olejovité nebo absorpční, se přidá aktivní složka (sloučenina) v množství dávajícím žádanou koncentraci.

Krémy jsou emulze olej/voda. Skládají se z olejové fáze (vnitřní fáze), obsahující typicky stabilizované oleje, uhlovodíky a podobně, jako jsou vosky, a vodné fáze (spojité fáze), obsahující vodu a jakékoliv látky rozpustné ve vodě, jako jsou adiční soli. Obě fáze se stabilizují s použitím emulgátoru, například povrchově aktivní látky, například laurylsulfát sodný, hydrofilní koloidy, jako jsou koloidní akaciové hlinky, vee guma a podobně. Po vzniku emulze se obvykle přidá aktivní složka (sloučenina) v množství dávajícím žádanou koncentraci.

• · c «

Gel obsahuje bázi vybranou z olejové báze, vody nebo emulzně-suspenzní báze. K bázi se přidá gelovací činidlo, které tvoří matrici v bázi zvyšováním viskozity. Příklad gelovacích činidel jsou hydroxypropylcelulóza, polymery kyseliny akrylové a podobně. Obvykle se přidá k formulaci aktivní složka (sloučeniny) v žádané koncentraci v okamžiku předcházejícím přidání gelovacího činidla.

Množství sloučeniny zamíchané do topické formulace není kritické, koncentrace by měla být v rozmezí dostatečném, aby dovolilo snadnou aplikaci formulace na oblast zasažené tkáně v množství, které dodá žádané množství sloučeniny na žádané místo ošetření.

Obvyklé množství topické formulace, které se má aplikovat na zasaženou tkáň bude závislé na rozsahu zasažené tkáně a koncentraci sloučeniny ve formulaci. Obecně se formulace aplikuje na zasaženou tkáň v množství asi od 1 do 500 mikrogramů sloučeniny na cm² zasažené tkáně. S výhodou aplikované množství bude v rozmezí asi od 30 do 300 mikrogramů na cm², s výhodou asi od 50 do 200 mikrogramů na cm² a nejlépe asi od 60 do 100 mikrogramů na cm².

Následující příklady formulací jsou ilustrativní a nejsou zamyšleny jako jakékoliv omezení vynálezu.

Formulace 1

Tvrdé želatinové kapsle se připraví s použitím následujících složek:

Množství (mg/kapsli)

Aktivní složka 250

Škrob, sušený 200

Stearát hořečnatý 10

Celkem 460 mg

Výše uvedené složky se smíchají a plní se do tvrdých želatino vých kapslí v množství 460 • · ·· · · · ······ • · 4 · · · · • 44 · · · 44 ···· « · ··

Formulace 2

Tablety se připraví s použitím následujících složek:

Množství (mg/kapsli)

Aktivní složka 250

Mikrokrystalická celulóza 400

Oxid křemičitý, dýmový 10

Stearová kyselina 5

Celkem 665 mg

Výše uvedené složky se smíchají a slisují se do tvaru tablet, každá vážící 665 mg.

Formulace 3

Tablety, každá obsahující 60 mg aktivní složky se připraví následovně:

Aktivní složka	Množství (mg/kapsli) 60
Škrob	45
Mikrokrystalická celulóza	35
Polyvinylpyrrolidin (jako 10 % roztok ve vodě)	4
Karboxymethylovaný škrob sodný	4,5
Stearát hořečnatý	0,5
Mastek	1

Celkem 150 mg

Aktivní složka, škrob a celulóza se protlačí sítem U.S. mesh číslo 45 a pečlivě se smíchají. Roztok polyvinylpyrrolidinu se smíchá se vzniklým práškem a pak se vše protlačí sítem U.S.

mesh číslo 14. Takto vzniklé granule se suší při 50 °C a protlačí se sítem U.S. mesh číslo 18.

Karboxymethylovaný škrob sodný, stearát hořečnatý a mastek, předem proseté sítem U.S. mesh číslo 60 se pak přidají ke granulím, které se po smíchání slisují v tabletovacím stroji, což dá tablety, každá vážící 150 mg.

Krátký popis obrázků

Obrázek 1 ukazuje dávkový účinek bryostatinu 1 na PKC isoformy

Obrázek 2 demonstruje účinek inkubační doby bryostatinu 1 na PKC isoformy

Obrázek 3 demonstruje, že snížení PKC-beta zvyšuje účinky gama-ozáření

Obrázek 4 ukazuje, že zvýšená exprese PKC-beta vykazuje odolnost k smrti buněk stimulovanou ozářením.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Účinek bryostatinu na PKC isoformy

Tento pokus demonstruje dávkový a časový účinek bryostatinu na PKC isoformy.

Lidské U937 leukemické buňky v množství 0.5 x 10^ se ošetřily různým množstvím bryostatinu 1. Potom se buňky solubilizovaly pro přípravu proteinových vzorků podle rutinního postupu. Proteinové vzorky z buněk ošetřených bryostatinem se pak použily ve Western skvrnové analýze se specifickým antisérem proti protein- kináze C-beta, dříve popsané v Ways aj., Cell Growth and Differentiation, 1994, 5: 1195-1203. Jak ukazuje Obr. 1, ošetření bryostatinem způsobilo snížení aktivity PKC-beta během jistého časového úseku, například 10 nM bryostatinu ovlivňuje PKC-beta během 2 hodin, nebo 1 nM bryostatinu ovlivňuje PKC-beta během 24 hodin. V opakovaném experimentu se získaly podobné výsledky.

Příklad 2

Zvýšené účinky gama-ozáření působené snížením PKC-beta

Tento pokus demonstruje, že snížení PKC-beta zvyšuje účinky gama-ozáření.

Lidské U937 leukemické buňky se ošetřovaly 24 hodin buď bryostatinem 1, nebo kontrolním roztokem, například vehiklem pro bryostatin 1. Buňky se ozářily buď 500 nebo 1000 rady gama-ozáření. 72 hodin po ozáření se životnost buněk prozkoumala s použitím vylučování propidium jodidu a kvantifikovala se FACS analýzou, dříve popsané v Ways aj., Cell Growth and Differentiation, 1994, 5: 1195-1203. Testy životnosti se prováděly v třech opakováních. Jak ukazuje Obr. 3, apoptóza indukovaná gama-ozářením se zvýšila za podmínek, kdy PKC-beta byla významně snížená použitím bryostatinu 1. Podobné výsledky se získaly v řadě opakovaných experimentů.

Příklad 4

Zvýšená exprese PKC-beta v buňkách ukazuje odolnost k smrti buněk stimulovanou ozářením.

Základní U937 buňky a buňky U937 PCK-ζ se zvýšenou expresí (buňky PCK-ζ) se ošetřily 0, 500 nebo 1000 rady gama-ozáření. je známo, že buňky PCK-ζ vykazují zvýšenou hladinu PKC-beta (Ways aj., Cell Growth and Differentiation, 1994, 5: 1195-1203). 72 hodin po ozáření se životnost buněk prozkoumala s použitím vylučování propidium jodidu a kvantifikovala se FACS analýzou, dříve popsané v Ways aj., Cell Growth and Differentiation, 1994, 5: 1195-1203. Testy životnosti se prováděly v třech opakováních.. Jak ukazuje Obr. 4, buňky mající zvýšenou hladinu PKC-beta vykazovaly odolnost k smrti buněk stimulovanou ozářením. Podobné výsledky se získaly v řadě opakovaných pokusů.

Principy, výhodná provedení a módy operací podle vynálezu byly popsány v předešlém popisu. Vynález, který má být zde chráněn, nemá být pokládán za omezený na popsané formy, poněvadž ty se mají pokládat za ilustrativní a ne za omezující. Odborníci mohou provádět variace a změny, aniž by se odchýlili od ducha vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití onkolytického činidla s anti-neoplastickým účinkem v kombinaci s inhibitorem proteinové kinázy C, kde^ňto^to^^roteinové kinázy C zvyšuje anti-neoplastický účinek onkolytického činidla, pro^Iečbžnovotvaru u savců.
2. Použití podle nároku 1, kde inhibitor proteinové kinázy C je inhibitorem beta-isozymu proteinové kinázy C a je bis-indolylmaleinimidem nebo makrocyklickým bisindo ly lmaleinimidem.
3. Použití podle nároku 1, kde inhibitor proteinové kinázy C je selektivní k izoenzymu a kde izoenzymová selektivita je vybraná ze skupiny sestávající z beta-1 a beta-2 izoenzymů.
4. Použití podle nároku 1, kde inhibitor proteinové kinázy C má následující obecný vzorec

R² kde

W je -O-, -S-, -SO-, -SO2-, -CO-, C2-Cg alkylen, substituovaný alkylen, C2-CČ alkenylen, -aryl-, -aryl(CH2)_mO-, -heterocykl-, -heterocykl-(CH2)_mO-, kondenzovaný bicykl, kondenzovaný bicykl(CH2)_mO-, -NR^-, -NOR^-, -CONH- nebo -NHCO-,

X a Y jsou nezávisle C4-C4 alkylen, substituovaný alkylen, nebo společně X, Y a W tvoří

-(CH₂)_n-AA-, • · · * ♦ · · · · · · · • · » · · , • ···· · ·«·· • · · · · · · • · · · · φ *♦ ··· ·» ·«·

R.1 jsou vodík nebo až čtyři případné substituenty nezávisle vybrané z halogenu, C4-C4 alkylu, hydroxy, C4-C4 alkoxy, halogenalkylu, nitro, NR⁴R³, nebo -NHC0(C]-C4 alkyl),

R² j_e vodík, CH3CO-, NHg nebo hydroxy,

R³ je vodík, (CH2)maryl, C4-C4 alkyl, -COO(Cj-C4 alkyl), -CONR4r5, -(C=NH)NH2, SO(Cj-C4 alkyl), -SO2(NR⁴R⁵) nebo -SO2(Ci-C₄ alkyl),

R⁴ a R⁵ jsou nezávisle vodík, C4-C4 alkyl, fenyl, benzyl nebo spolu s dusíkem, ke kterému jsou připojeny tvoří nasycený nebo nenasycený 5 nebo 6 členný kruh,

AA je zbytek aminokyseliny, mje nezávisle 0, 1,2 nebo 3 a n je nezávisle 2, 3,4 nebo 5, nebo farmaceuticky přijatelná sůl, proléčivo nebo jejich ester.
5. Použití podle nároku 4, kde inhibitor proteinové kinázy C má následující obecný vzorec Ia kde

Z je -(CH₂)_p, nebo -(CH₂)p-O-(CH₂)p,

R⁴ je hydroxy, -SH, C4-C4 alkyl, (CH2)aryl,-NH(aryl), -N(CH3) (CF3), -NH(CF3), nebo NR⁵R⁶,

R³ je vodík nebo C4-C4 alkyl,

R6 je vodík, C4-C4 alkyl nebo benzyl, p je 0, 1 nebo 2 a m je nezávisle 2 nebo 3, nebo farmaceuticky přijatelná sůl, proléčivo nebo jejich ester.
6. Použití podle nároku 4, kde inhibitor proteinové kinázy C má následující obecný vzorec Ib kde Z je -(CH₂)_p,

R⁴ je -N(CH₃) (CF₃), -NH(CF₃), nebo -NR⁵R⁶,

R^ a r6 jsou nezávisle vodík nebo C4-C4 alkyl, m je nezávisle 2 nebo 3, nebo farmaceuticky přijatelná sůl, proléčivo nebo jejich ester.
7. Použití podle nároku 4, kde inhibitor proteinové kinázy C zahrnuje ((S)-3,4-N,N'-l,l·((2-ethoxy)-3'(O)-4'-(N,N-dimethylamino)-butan)-bis-(3,3'-indolyl)-l(H)-pyrol-2,5-dionu) nebo jeho farmaceuticky přijatelnou kyselou sůl.
8. Použití podle nároku 1, kde onkolytické činidlo je vybrané ze skupiny sestávající z Arac, VP-16, cis-platiny, adriamycinu, 2-chlor-2-deoxyadenosinu, 9-beta-D-arabinosyl-2fluoradeninum a glukokortikoidů.
9. Použití gama-záření s anti-neoplastickým účinkem v kombinaci s inhibitorem proteinové kinázy C, kde inhibitor proteinové kinázy C zvyšuje anti-neoplastický účinek gama-záření, pro léčbu novotvaru u savce.

·· ···· • · • · · ·· • * · • · · ·· · ·» ·· ···*
10. Použití podle nároku 9, kde inhibitor proteinové kinázy C je inhibitorem betaizoenzymu proteinové kinázy C a je bis-indolylmaleinimidem nebo makrocyklickým bisindolylmaleinimidem.
11. Použití podle nároku 9, kde inhibitor proteinové kinázy C je selektivní k izoenzymu a kde izoenzymová selektivita je vybraná ze skupiny sestávající z beta-1 a beta-2 izoenzymů.
12. Použití podle nároku 11, kde inhibitor proteinové kinázy C má následující obecný vzorec I

R² kde

W je -0-, -S-, -SO-, -SOg-, -CO-, Cg-C^ alkylen, substituovaný alkylen, Cg-Cg alkenylen, -aryl-, -aryl(CH2)_mO-, -heterocykl-, -heterocykl-(CH2)_mO-, -kondenzovaný bicykl, kondenzovaný bicykl(CH2)_mO-, -NR.3-, -NOR^-, -CONH- nebo -NHCO-,

X a Y jsou nezávisle Cj-C4 alkylen, substituovaný alkylen, nebo společně X, Y a W tvoří -(CH₂)_n-AA-,

R.1 jsou vodík nebo až čtyři případné substituenty nezávisle vybrané z halogenu, C1-C4 alkylu, hydroxy, C1-C4 alkoxy, halogenalkylu, nitro, NR^R^, nebo -NHCO(Ci-C4 alkyl),

R² je vodík, CH3CO-, ΝΗ2 nebo hydroxy,

R³ je vodík, (CH2)maryl, C1-C4 alkyl, -COOfCj-C^ alkyl), -CONR⁴R⁵, -(C=NH)NH2, SOfCj^ alkyl), -SO₂(NR⁴R⁵) nebo -SO₂(Ci-C₄ alkyl),

R⁴ a R³ jsou nezávisle vodík, C4-C4 alkyl, fenyl, benzyl nebo spolu s dusíkem, ke kterému jsou připojeny tvoří nasycený nebo nenasycený 5 nebo 6 členný kruh,

AA je zbytek aminokyseliny, mje nezávisle 0, 1,2 nebo 3 a n je nezávisle 2, 3,4 nebo 5, nebo farmaceuticky přijatelná sůl, proléčivo nebo jejich ester.
13. Použití podle nároku 12, kde inhibitor proteinové kinázy C má následující obecný vzorec Ia

H kde

Z je -(CH₂)_p, nebo -(CH₂)_p-O-(CH₂)_p,

R⁴ je hydroxy, -SH, C4-C4 alkyl, (CH₂)aryl,-NH(aryl), -N(CH3) (CF3), -NH(CF3), nebo NR⁵R⁶,

R³ je vodík nebo C4-C4 alkyl, r6 je vodík, C4-C4 alkyl nebo benzyl, p je 0, 1 nebo 2 a mje nezávisle 2 nebo 3, nebo farmaceuticky přijatelná sůl, proléčivo nebo jejich ester.

• · · · · · » · ·» · · · · • · <

I
14. Použití podle nároku 12, kde inhibitor proteinové kinázy C má následující obecný vzorec Ib kde Z je -(CH₂)_p,

R⁴ je -N(CH₃) (CF₃), -NH(CF₃), nebo -NR⁵R⁶,

R^ a R^ jsou nezávisle vodík nebo C4-C4 alkyl, m je nezávisle 2 nebo 3, nebo farmaceuticky přijatelná sůl, proléčivo nebo jejich ester.
15. Použití podle nároku 12, kde inhibitor proteinové kinázy C zahrnuje ((S)-3,4-N,N'-l,l'((2-ethoxy)-3'(O)-4'-(N,N-dimethylamino)-butan)-bis-(3,3^,-indolyl)-l(H)-pyrol-2,5-dionu) nebo jeho farmaceuticky přijatelnou kyselou sůl.

Bryostatin 1 koncentrace