CZ301405B6 - Peptidové inhibitory viru hepatitidy typu C - Google Patents

Abstract

Slouceniny obecného vzorce I, kde a je 0 nebo 1, b je 0 nebo 1, Y je atom vodíku nebo C.sub.1-6.n.alkyl, B je atom vodíku, acylový derivát nebo sulfonylový derivát, W je hydroxyskupina nebo N-substituovaná aminoskupina nebo jejich farmaceuticky vhodné soli nebo estery, které jsou vhodné k terapii virové hepatitidy typu C.

Description

Oblast techniky

Současný vynález se týká sloučenin, přípravků a postupů terapie virové hepatitidy typu C. Vynález se především týká nových peptidů, jejich analogů a meziproduktů, a dále farmaceutických přípravků obsahujících tyto peptidy a postupu jejich použití při terapii virové hepatitidy typu C.

Dosavadní stav techniky

Virus způsobující hepatitidu typu C (HCV) je hlavním etiologickým agens post-transfúzní nebo nenozokomiální non-A, non-B-hepatitidy. Přibližně 150 milionů lidí na světě je tímto virem (5 infikováno. Vysoké procento nosičů v populaci je chronicky infikováno a přechází do chronického stadia onemocnění, tzv. chronické hepatitidy typu C. Tato skupina pacientů je ohrožena vážným až smrtelným onemocněním jater, jakými jsou jatemí cirhóza, hepatocelulární karcinom ajatemí selhání.

Mechanismus vzniku perzistence a příčina Častého přechodu do chronického onemocnění jater nejsou přesně vysvětleny. Není známé jak HCV napadá a poškozuje imunitní systém hostitele. Není ani objasněna role buněčné a humorální imunitní odpovědi proti infekci virem HCV. K profylaxi posttransfúzní virové hepatitidy jsou doporučovány imunoglobuliny, ačkoli the Centre for Disease Control (Ústav pro kontrolu infekčních chorob) v současné době použití imunoglobulinů k tomuto účelu nedoporučuje.

Nedokonale účinná obranná imunitní odpověď znemožňuje vývoj vakcíny nebo zavedení profylaktických opatření po expozici nákaze. Jedinou možností řešení v blízké budoucnosti jsou intervence namířené proti virům samotným.

Ke zjištění účinných farmaceutických činidel vhodných k terapii infekcí virem HCV u pacientů s chronickou hepatitidou typu C se již provedlo mnoho rozličných klinických studií. Během těchto studií se sledovalo užití interferonu alfa samotného nebo v kombinaci s ostatními antivirovými léčivy. Studie prokázaly, že u podstatné části sledovaných pacientů je tato terapie neúčinná, a pokud účinná je, pak ve velkém procentu případů dochází po ukončení terapie k relapsu onemocnění.

Jedinou a podle klinických studií prokazatelně vhodnou terapií chronické virové hepatitidy C bylo donedávna podávání interferonu (IFN). Taková terapie však vede jen u malého procenta případů k podstatnému zlepšení a navíc terapie interferonem má závažné vedlejší účinky (retinopatie, thyroiditis, akutní panktreatitida, deprese), které snižují kvalitu života takto léčených pacientů. Kombinace s ribavirinem má pozitivní účinek u pacientů neodpovídajících na léčbu samotným interferonem, tato kombinace však nesnižuje výskyt vedlejších nežádoucích účinků způsobených interferonem samostatně podaným.

Z uvedeného vyplývá nutnost účinného antivirového činidla k terapii infekce HCV, které překoná současné omezení farmakologické terapie tohoto závažného onemocnění,

HCV patří do skupiny jednořetězových RNA virů s pozitivní polaritou a lipidovou obálkou, čeleď Flaviviridae. Jediný řetězec RNA genomu HCV tvoří podélně přibližně 9500 nukleotidů s jednoduchým otevřeným čtecím rámcem (open reading frame ORF) kódujícím jediný velký polyprotein o přibližně 3000 aminokyselinách. V infikovaných buňkách je tento polyprotein mnohočetně štěpen buněčnými a virovými proteázami za vzniku strukturálních a nestrukturálních (NS) proteinů. V případě HCV je tvorba zralých nestrukturálních proteinů (NS2, NS3, NS4A,

NS4B, NS5A, a NS5B) způsobená dvěmi vírovými proteázami. První z nich, velmi špatně

- 1 CZ 301405 B6 popsaná, štěpí místo spojení NS2NS3. Druhá, serinová proteáza je v N-terminální oblasti molekuly NS3 (proto označovaná jako NS3 proteáza) zprostředkovává všechna štěpení za NS3 dolů, v cis pro NS3-NS4 štěpení a v trans pro štěpení ve zbývajících místech, tedy NS4A-NS4B,

NS4B-NS5A, NS5A-NS5B. Protein NS4A má zřejmě několik funkcí, je kofaktorem NS3 proteázy a pravděpodobně napomáhá membránové lokalizaci NS3 a ostatních virových replikových komponent. Komplex tvořící NS3 protein a NS4A je zřejmě důležitým mezičlánkem ovlivňujícím proteolytické pochody na popsaných místech štěpení proteinu. NS3 protein vykazuje nukleosidtrifosfatázovou a RNA-helikázovou aktivitu. Protein NS5B je RNA-dependentní RNA polymeráza ovlivňující replikaci viru HCV.

Při výzkumu a vývoji antivirového činidla se hlavním cílem stala taková látka, která inaktívuje virem kódované enzymy, které jsou esenciální pro replikaci viru. Zveřejněná přihláška WO 97/06804 popisuje (-)-enantiomer nukleosidového analoga cytosin-l,3-oxathiolanu (3TC), který je účinný proti HCV viru. Tato sloučenina, která byla označena předchozími klinickými i? studiemi za bezpečnou, je prokazatelně účinná proti virům HIV a HBV. Stále ještě zbývá klinicky doložit její účinnost proti HCV a popsat mechanismus antivirového účinku.

Rozsáhlé úsilí objevit sloučeniny, které inhibují NS3-proteázu nebo RNA-helikázu viru HCV vedlo k následujícím odhalením:

US patent 5 633 388 popisuje heterocykly substituované karboxamidy a jejich analoga účinné proti viru HCV. Účinek těchto sloučenin je namířen proti helikázovému účinku proteinu NS3. Výsledky klinických testů nejsou zatím k dispozici.

Podle studie vedené Chu a spol. (Tet. Lett., 1996, str. 7229-7232) je fenantren-chinon in vitro účinný proti proteáze NS3 proteinu. Výsledky dalšího výzkumu této sloučeniny nebyly zatím zveřejněny.

Studie prezentovaná na deváté mezinárodní konferenci o antivirovém výzkumu (Urabaai, Fuky30 shima, Japonsko 1996, Antiviral Research, 30. 1. 1996, A23 (článek 19)) popisuje thiazolidinové deriváty jako inhibitory HCV proteázy.

Několik studií se zabývalo sloučeninami inhibujícími jiné serinové proteázy, především lidskou leukocytámí elastázu. Jedna skupina z těchto sloučenin je popsána ve zveřejněné přihlášce

WO 95/33764 (Hoechst Marion Rousse, 1995). Peptidy popisované v této přihlášce jsou strukturálně odlišné od peptidů podle současného vynálezu.

Zveřejněná přihláška WO 98/17679 (Vertex Pharmaceuticals lne.) se týká inhibitorů serinové proteázy, především proteázy NS3 proteinu HCV viru. Tyto inhibitory jsou analoga peptidů io odvozená od NS5A/5B. Všechny tyto peptidy obsahují jako svoji základní vlastnost C-konec peptidů aktivovaný karbonylovou funkční skupinou. Tyto peptidy jsou podle popisu účinné proti jiným serinovým proteázám a nejsou tudíž specificky účinné proti proteáze NS3 proteinu viru

HCV.

Hoffman LaRoche také popisuje hexapeptidy jako antivirová činidla působící jako inhibitory proteináz vhodná k terapii infekcí HCV virem. Tyto peptidy obsahují na svém C-konci aldehyd nebo kyselinu boritou.

Steinkiihler a spol. a [ngallinella a spol. popisují inhibici produkty štěpení na N-konci (Bioche50 mistry 1998, 37, 8899-8905 a 8906-8914). Tyto peptidy ajejich analoga nijak nepřipomínají peptidy podle současného vynálezu.

Zveřejněná přihláška WO 98/46597 (Emory University) se týká inhibitorů serinové proteázy, především proteázy viru hepatitidy typu C. Všechny popisované sloučeniny jsou strukturálně odlišné od peptidů podle současného vynálezu.

-2CZ 301405 B6

Zveřejněná přihláška WO 98/46630 (Peptide Terapeuticals Ltd.) se týká inhibitorů proteázy NS3 proteinu viru HCV. Žádný z popisovaných peptidů se nepodobá peptidům podle současného vynálezu.

JP 10298151 (Japan Energy Corp.) se týká N-{2.3-dihvdroxybenzoyl)-substituovaných serinových derivátů jako inhibitorů serinové proteázy, zvláště jako inhibitorů virové proteázy hepatitidy typuC. I tyto sloučeniny jsou strukturálně odlišné od peptidových analogů podle současného vynálezu.

Předností současného vynálezu je, že se týká peptidů inhibujících NS3 proteázu viru HCV.

Jinou předností současného vynálezu je, že se týká peptidů, které specificky inhibují NS3 proteázu a které nemají do 300 pmol signifikantní inhibiční účinek na ostatní serinové proteázy, jakými jsou lidská leukocytámí elastáza (HLE), prasečí pankreatická elastáza (PPE) nebo hovězí pankreatický chymotrypsin nebo na cysteinové proteázy (lidský jatemí katepsin B (Cat B)).

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu jsou racemáty, diastereoizomery a optické izomery sloučeniny obecného vzorce I:

kde a je 0 nebo 1, b je 0 nebo 1,

Y je H nebo Ci_₆alkyl,

B je H derivát acylu vzorce R₇-C(O)- nebo sulfonyl vzorce R^SO?, kde R₇je:

i) Ci__]Oalkyl eventuálně substituovaný karboxylem, Ci_6 alkanyl-oxy nebo C^alkoxy nebo ii) C₃_₇cykloalkyl eventuálně substituovaný karboxylem, (C₁₆alkoxy)-karbonyl nebo fenylmetoxykarbonyl nebo iii)C₆ nebo Cioaryl nebo C₇_i₆aralkyl eventuálně substituovaný C,^alkylem, hydroxyskupina nebo aminoskupina eventuálně substituovaná C ,.^1 kýlem nebo ív) heterocyklus eventuálně substituovaný C,^alkylem, hydroxyskupina, aminoskupina eventuálně substituovaná Ci_$alkylem nebo amidoskupina eventuálně substituovaná

Ci^alkylem.

-3CZ 301405 B6 {<„ pokud je přítomen, označuje C] ₆alkyI substituovaný karboxylem,

Rj, pokud je přítomen, znamená C ₍_₆alky 1 eventuálně substituovaný karboxylem,

R4 je C|_|_OaIkyí, C₃_7cykloalkyl nebo C₄-io(alky(cykloalkyl),

R₃ je C1 _malkyl, C3-^cykloalkyl nebo C₄-io(alkylcykloalkyl),

R? je CH3-R20, NH—R?o, O—R₂q nebo S—R₂o, kde R?o znamená nasycený nebo nenasycený C3_₇cykloalkyl nebo C₄. io(atkylcykloa!kyl) eventuálně mono-, di- nebo tri- substituovaný pomocí R₂| nebo

R₂q znamená C₆ nebo Cioaryl nebo C₇ |₆aralkyl eventuálně mono-, di- nebo tri- substituovaný R₂₁ nebo

R?o je heterocyklus nebo (nižší alkyl)—het eventuálně mono-, di- nebo tri- substituovaný pomocí R₂i, kde každý R₂j nezávisle znamená C| ^alkyl, Ci_6alkoxy, aminoskupinu eventuálně mononebo di- substituovanou Cj._ba Iky lem, sulfonylovou skupinu, nitroskupínu, hydroxyskupinu, merkaptoskupinu, halogen, halogenalkyl, amidoskupinu eventuálně mono20 substituovanou C] ^alkylem, C₆ nebo Cioarylem, C7_ióaralkyletn, heterocyklem nebo (nižší alkyl)~heterocyklem, dále karboxyl, karboxy-(nižší alkyl), C₆ nebo Cioaryl, C₇.it,aralkyl nebo heterocyklus, resp. aryl, aralkyl nebo het eventuálně substituovaný R₂₂, kde R₂₂ je C^alkyl, C, <,alkoxy, aminoskupina eventuálně mono- nebo di- substi25 tuovaná C,^alkylem, sulfonyl, nítroskupina, hydroxyskupina, merkaptoskupina, halogen, halogenalkyl, karboxyl, amid nebo (nižší alkyl)-amid,

R_t je Ci ₆alkyl nebo C_{2 6}alkenyl eventuálně substituovaný halogenem,

W je hydroxyskupina nebo -NH-(S)CH(Me)-fenyl nebo její farmaceuticky vhodná sůl nebo ester.

Podstatou vynálezu je farmaceutický přípravek obsahující účinné množství sloučeniny obecného vzorce 1, které působí proti viru HCV, nebo její terapeuticky vhodné soli nebo esteru, vadiční směsi s farmaceuticky vhodným nosičem nebo pomocnou látkou.

Důležitou podstatou vynálezu je způsob terapie virové hepatitidy typu C savců, která spočívá v podání specificky anti-HCV působícího účinného množství sloučeniny obecného vzorce I nebo její terapeuticky vhodné soli nebo esteru nebo shora uvedeného přípravku.

Jinou podstatou vynálezu je způsob inhibice replikace viru hepatitidy typu C působením takovým množstvím sloučeniny obecného vzorce I nebo její terapeuticky vhodné soli nebo esteru nebo shora uvedeného přípravku, které způsobí inhibici virové proteázy NS3 proteinu viru HCV.

Další podstatou vynálezu je způsob terapie virové hepatitidy C u savců podáním specificky proti HCV viru působícího účinného množství kombinace sloučeniny obecného vzorce I nebo její terapeuticky vhodné soli nebo esteru a interferonu. Podstatou vynálezu je i přípravek obsahující uvedenou kombinaci v adiční směsi s farmaceuticky vhodnými nosiči nebo pomocnými látkami.

-4QZ 301405 B6

Podstata vynálezu

Radikály označené R a S, popisují konfiguraci radikálu ve vztahu ke sloučenině (například R4 5 sloučeniny obecného vzorce I). Jde o vztah radikálu ke sloučenině.

Přirozeně se vyskytující aminokyseliny kromě glycinu obsahují chirální atom uhlíku. Pokud není dále uvedeno jinak, pak preferujeme aminokyseliny v L-konfiguraci. V případech blíže určených předkladatelé předpokládají, že některé aminokyseliny obecného vzorce I mohou mít konfiguraci buď D- nebo L- nebo se mohou vyskytovat ve směsi D- a L- izomerů, včetně racemických směsí.

Výrazy „PÍ, P2, P3,.,“ se používají k označení pozice zbytku aminokyseliny od C-konce peptidů směrem k N-konci (PÍ označuje pozici 1 od C-konce, P2 označuje druhou pozici od C-konce,

Literatura: A. Berger &1. Schechter, Transactions of the Royal Society London series B257, 249264(1970)).

Zkratky pro α-aminokyseliny jsou uvedeny v následující tabulce A:

aminokyselina	symbol
Atanin	Ala
Aspartová kyselina	Asp
Cystein	Cys
Cyklohexylglycin (2-amino-2-cyklohexyloctová kyselina)	Chg
Glutamová kyselina	Glu
Izoteucin	He
Leucin	Leu
Fenylalanin	Phe
Prolin	Pro
tercřbutylglycin	Tbg
Valin	Val

Termín „1-aminocyklopropyt-karboxylová kyselina“ (Acca) znamená sloučeninu obecného vzorce:

-5CZ 301405 B6

H₂N

OH

Termín „terc-butyl glycin“ (Tbg) znamená sloučeninu obecného vzorce:

h₂n

OH /

Termín „zbytek“ aminokyseliny nebo derivátu aminokyseliny znamená radikál odvozený od odpovídající α-aminokyseliny odštěpením hydroxylu karboxylové skupiny a jednoho vodíkového atomu α-aminoskupiny. Například termíny Gin, Ala, Gly, Ile, Arg, Asp, Fe, Ser, Leu, Cys,

Asn, Sar a Tyr znamenají „zbytky“ L-glutaminu, L-aíaninu, glycinu, L-izoleucinu, L-argininu, L-aspartové kyseliny, L-fenylalaninu, L-serinu, L-leucinu, L-cysteinu, L-asparaginu, sarkosinu a L-tyrosinu.

Jako „vedlejší řetězec“ aminokyseliny nebo zbytku aminokyseliny znamená skupinu vázanou na atom α-uhlíku a-aminokyseliny. Například, R-vedlejší řetězec u glycinu je atom vodíku, u alaninu je to metyl, u val i nu je to izopropyl. Specifické R-skupiny nebo vedlejší řetězce a-aminokyselin jsou uvedeny v učebnici A. L. Lehninger's text on Biochemistry (kapitola 4).

Jako „halogen“ označujeme radikál halogenu, a to radikál brómu, chlóru, fluóru nebo jódu.

Termín „Ci^alkyl“ nebo „(nižší) alkyl“, použitý samostatně nebo v kombinaci s jiným zbytkem, znamená přímý nebo větvený řetězec alkylových zbytků obsahující až šest atomů uhlíku včetně, například metyl, etyl, propyl, butyl, hexyl, 1-metyletyl, 1-metylpropyl, 2-metyl propyl, 1,1— dimetyletyl (tj. terc-butyl).

Termín „C ^cykloalkyl“, použitý samostatně nebo v kombinaci s jiným zbytkem, znamená zbytek cykloalkylu obsahující od tří do sedmi atomů uhlíku a zahrnuje cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl a cykloheptyl.

Termín „nenasycený cykloalkyl“ například označuje cyklohexenyl:

Termín „C₄_i₀ (alkylcykloalkyl)“ -znamená zbytek cykloalkylu obsahující od čtyř do deseti 35 atomů uhlíku vázaný na zbytek alkylu. Vázané zbytky obsahují až deset atomů uhlíku, například cyklopropylmetyl, cyklopentyl etyl, cyklohexylmetyl, cyklohexyletyl nebo cykloheptyletyl.

Termín ,,C₂-io alkenyl“ použitý samostatně nebo v kombinaci s jiným zbytkem, znamená zbytek alkylu obsahující od 2 do 10 atomů uhlíku a dále obsahující nejméně jednu dvojnou vazbu. Jde například o alkenyl včetně alylu a vinylu.

Termín „C_{; 6} alkanoyl“, použitý samostatně nebo v kombinaci s jiným zbytkem, znamená přímý nebo větvený zbytek 1-oxoalkylu obsahující jeden až šest atomů uhlíku. Mezi takové alkanyly patří formyl, acetyl, 1-oxopropyl (propionyl), 2-metyl-l-oxopropyl, 1-oxohexyl.

-6CZ 301405 B6

Termín „C_t_óalkoxy“, použitý samostatně nebo v kombinaci s jiným radikálem, znamená zbytek -O(C,_₆alkyl), kde shora definovaný alkyl obsahuje až šest atomů uhlíku, Alkoxy znamená metoxv, etoxy, propoxy, 1-metyl-etoxy, butoxy a 1,1-dimetyl-etoxy (známý jako terc-butoxy).

Termín „C₃_₇cykloalkoxy“ použitý samostatně nebo v kombinaci s jiným, zbytkem, znamená Ci^cykloalkylovou skupinu vázanou na atom kyslíku, například:

io

Termín „C₆ nebo Cioaryl“ použitý samostatně nebo v kombinaci s jiným zbytkem, znamená buď aromatickou monocyklíckou skupinu obsahující 6 atomů uhlíku nebo aromatickou bicyklickou skupinu obsahující 10 atomů uhlíku. Například aryl znamená fenyl, 1-naftyl nebo 2-naftyl.

Termín „C₇_^aralkyl“ použitý samostatně nebo v kombinaci s jiným zbytkem, znamená C₆ nebo Cio aryl vázaný na alkylovou skupinu, kde shora definovaný alkyl obsahuje od 1 do 6 atomů uhlíku. Mezi C₇_]₆aralkyly patří například butylfenyl a 1-naftylmetyl.

Termín „amino-araikyl“, použitý samostatně nebo v kombinaci s jiným zbytkem, znamená aminoskupiny substituované s C₇_i₆aralkylovou skupinu. Jde například o amino aralkyl:

Termín „karboxy-(nižší)alkyl“ použitý samostatně nebo v kombinaci s jiným zbytkem, znamená karboxylovou skupinu (COOH) vázanou na (nižší) alkylovou skupinu, Jde například o kyselinu máselnou.

Termín „heterocyklus“ nebo „Het“ použitý samostatně nebo v kombinaci s jiným zbytkem, znamená monovalentní zbytek odvozený odštěpením atomu vodíku z pěti- šesti- nebo sedmi30 četného nasyceného nebo nenasyceného (včetně aromatického) heterocyklu obsahujícího od jednoho do čtyř heteroatomů, a to atomu dusíku, kyslíku a síry. Navíc výraz „Het“, znamená shora definovaný heterocyklus fúzovaný do jednoho nebo více jiných cyklů za vzniku heterocyklu nebo jiného dalšího cyklu. Příkladem vhodných heterocyklu jsou: pyrolidin, tetrahydrofuran, thiazolidin, pyrol, thíofen, diazepin, IH-imidazol, izoxazol, thiazol, tetrazol, piperídin, 1,4— dioxan, 4-morfolin, pyridin, pyrimidin, thiazol-[4,5-b]-pyridin, chinolin nebo indol nebo následující heterocykly:

_ZN /N S

W . Í-N ^net”Ai

Termín „(nižší alkyl)-Het“, zde uváděný, znamená heterocyklický zbytek vázaný na řetězec nebo větvenou alkylovou skupinu, kde shora definovaný alkyl obsahuje od 1 do 6 atomů uhlíku. Příkladem „(nižší alkyl)-Het“ je:

-7CZ 301405 B6

Termín „farmaceuticky vhodný ester použitý samostatně nebo v kombinaci s jiným zbytkem, znamená estery sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém jakákoli karboxy lová funkční skupina, ale především karboxy-konec, je nahrazena alkoxy karbony lovou funkční skupinou:

nebo

O

OR ve které R skupina esteru nezávisle znamená alkyl (metyl, etyl, n-propyl, t—butyl, n-butyl), ío alkoxyalkyl (metoxymetyl), alkoxyacyl (acetoxymetyl), aralkyl (benzyl), aryloxyalkyl (fenoxymetyl) nebo aryl (fenyl) eventuálně substituovaný halogenem, C|_₄alkylem nebo zbytkem

C_Malkoxy. Ostatní vhodné farmaceuticky vhodné estery lze nalézt v publikaci „Design of prodrugs” Bundgaard, H. Ed. Elsevier (1985). Takové farmaceuticky vhodné estery jsou hydrolyzovány in vivo po injekční aplikací savcům a přeměněny na kyselinu sloučeniny obecného vzorce I,

S odkazem na shora popsané estery a pokud není uvedeno jinak, obsahuje každá alkylová skupina od jednoho do Šestnácti atomů uhlíku, především od jednoho do šesti atomů uhlíku. Je vhodné, když každá arylová skupina přítomná v takových esterech obsahuje fenylovou skupinu.

Především jde o tyto estery: C|_i₆alkylester, nesubstituovaný benzylester nebo benzylester substituovaný nejméně jedním atomem halogenu, C,_₆alkylem, zbytkem C|_6alkoxy, nitroskupinou nebo trifluormetylem.

Termín „farmaceuticky vhodné soli“ znamená soli odvozené od farmaceuticky vhodných zásad.

Příkladem vhodných zásad jsou cholin, etanolamin a etylendiamin. Podstata tohoto vynálezu se týká i sodných, draselných a vápenatých solí. Literatura: „Pharmaceutical salts“, S. M. Birge a spol., J. Pharm. Sci. (1977), 66, 1-19).

Podstata současného vynálezu se především týká sloučeniny obecného vzorce I, kde B je přede30 vším R7-SO2 kde R? je především C₆ nebo C10 aryl, C₇_iGaralkyl nebo Het, vždy eventuálně substituovaný Ci^alkylem.

Podstatou vynálezu je sloučenina obecného vzorce I, kde B je především atom vodíku nebo acylderivát vzorce R₇C(O)-, kde R₇ je především C| ₆alkyl, C₁ ^alkoxy, C₃_₇cykloalkyl eventuálně substituovaný hydroxyskupinou, amidoskupina eventuálně substituovaná Ci-₆a1kylem nebo heterocyklem,

Cg nebo Ci_Oaryl, C₇__i6aralkyl nebo heterocyklus, všechny eventuálně substituované Cj ^alkylem nebo hydroxyskupinou.

Vynález se především týká sloučeniny obecného vzorce I, kde B je atom vodíku nebo R₇C(O)-, kde R₇ je především alkyl nebo heterocyklus:

-8CZ 301405 B6

Preferujeme, když B je atom vodíku nebo acetyl.

Nejvíce preferujeme, když B je acetyl.

Vynález se týká sloučeniny obecného vzorce I, kde R, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec Asp nebo Glu. Preferujeme, když R$, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec Asp. Především je vhodné, když a je 0 a R* není přítomen.

Vynález se týká sloučeniny obecného vzorce I, kde R₃, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec aminokyseliny, a to: D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-GIu, D-Val, L-Val, D-terc-butylglycinu (Tbg) a L-Tbg. Preferujeme především, když R₅, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec D-Asp, D-Val, nebo D-Glu. Nejvíce preferujeme když R_;, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec D-Glu. Jinou a preferovanou podstatou vynálezu je, že a je 0 a b je 0, a pak oba R^ a R₅ nejsou přítomny.

Vynález se především týká sloučeniny obecného vzorce I, kde R₄ je vedlejší řetězec aminokyseliny, a to: Val, cyklohexylglycinu (Chg), Tbg, Ile nebo Leu. Preferujeme, když R, je vedlejší řetězec Chg nebo Ile. Nejvíce preferujeme, když R4 je vedlejší řetězec Chg.

Vynález se týká sloučeniny obecného vzorce I, kde Y je atom vodíku nebo metyl. Nejvíce preferujeme, když Y je atom vodíku.

Vynález se týká sloučeniny obecného vzorce I, kde R; je vedlejší řetězec aminokyseliny, a to: Ile, 25 Chg, Val nebo Tbg. Preferujeme, když R₃ je vedlejší řetězec Val, Chg nebo Tbg. Nejvíce preferujeme, když R₃ je vedlejší řetězec Val nebo Tbg.

Vynález se především týká sloučeniny obecného vzorce I, kde R? je S_R₂₀ nebo 0-R₂o, kde R₂₀ je především C₆ nebo C10 aryl, C₇ i€,aralkyI, Het nebo -CH₂-Het, vždy eventuálně mono-, di- nebo tri-substituované R₂₁.

Preferujeme, když R₂₎ je Ci^alkyI, Ci^alkoxy, aminoskupina, mono- nebo di—(nižší alkyl)— aminoskupina, amidoskupina eventuálně mono-substituovaná Chatky lem, C₆ nebo C|_Oarylem, C₇_i₆aralkylem, heterocyklem nebo (nižší alkyl)-Het, dále nitroskupina, hydroxyskupi35 na, halogen, trífluormetyl, karboxylová skupina, C₆ nebo C_toaryl, C₇_i<saralkyl nebo heterocyklus, resp. aryl, aralkyl nebo heterocyklus eventuálně substituovaný pomocí R₂₂.

-9CZ 301405 B6

Především preferujeme, když R?i je C^alkyl, C,._ň Ikoxy, aminoskupina, di—(nižší alkyl)— aminoskupina, (nižší alkyl}-amid, C₆ nebo C|_Oaryl nebo Het, resp. aryl nebo Het eventuálně substituovaný pomocí R₂₂.

Preferujeme, když R₂₂ je C| 6 alkyl, Ikoxy, aminoskupina, mono- nebo di-fnižší alkyl)-aminoskupina, (nižší alkyl)-amid. nitroskupina. hydroxyskupina. halogen, trifluormetyl nebo karboxylová skupina.

Především preferujeme, když R₂₂ je C| _ňalkoxy,aminoskupina, di—(nižší alkyl)-amtnoio skupina, (nižší alkyl}-amid, halogen nebo trifluormetyl.

Preferujeme, když R₂ je 1 -naftyImetoxy-, 2-naftylmetoxy-, benzyloxy-, 1-nafty loxy-, 2-naftyloxy- nebo chinolinoxy- nesubstituovaný, mono- nebo disubstituovaný R_2]. Nejvíce preferujeme, když R₂ je 1-naftylmetoxy- nebo chinolinoxy, nesubstituovaný, mono- nebo di™substituovaný

R₂i (shora definovaný).

Nejvíce preferujeme, když R₂ je:

Preferujeme, když R_2]A je amidoskupina eventuálně monosubstituovaná Ci..₆alkylem, C₆ nebo Cioarylem, C₇ ^aralkylem nebo heterocyklem, nebo dále Cf, nebo Cjoaryl nebo heterocyklus eventuálně substituovaný R₂₂.

Nejvíce preferujeme, když R₂i_A je C* nebo C_i0 aryl nebo heterocyklus, vždy eventuálně substituovaný pomocí R₂₂.

Preferujeme, když R₂₂ je aminoskupina, di—(nižší alkyl)-aminoskupina nebo (nižší alkyl)-amíd.

Především preferujeme, když R₂₂ je aminoskupina, dimetyl-amino-skupina nebo acetamidoskupina.

Nejvíce preferujeme, když R_nA je C₆ nebo Ci_Oaryl nebo Het, vždy nesubstituované.

Preferujeme, když R₂ib je alkyl, C|_₆ alkoxy, aminoskupina, di—{nižší alkyl)-aminoskupina, (nižší alkyl)-amid, nitroskupina, hydroxyskupina, halogen, trifluormetyl nebo karboxyl. Především preferujeme, když R_2)b je C, _óalkoxy nebo di—(nižší afkyl)-aminoskupina.

Nejvíce preferujeme, když R₂ib je metoxy.

Vynález se především tyká sloučeniny obecného vzorce I kde, R| je metyl, etyl, propyl nebo vinyl vždy eventuálně substituované halogenem.

Preferujeme, když R| je etyl, vinyl nebo bromvinyk Nejvíce preferujeme, když R] je vinyl.

Vynález se především týká sloučeniny obecného vzorce I kde, W je hydroxyskupina nebo její farmaceuticky vhodná sůl nebo ester, nebo (nižší alkyl)-aminoskupina, di—(nižší alkyl)-amino-10CZ 301405 B6 skupina nebo amino-aralkyl. Preferujeme, když W je hydroxyskupina nebo sloučenina vzorce N(R_]3a) R|_3b, kde R]_3a a R|₃b jsou nezávisle atom vodíku, aryl nebo Cj^ alkyl eventuálně substituovaný hydroxyskupinou nebo fenylem, nebo její farmaceuticky vhodná sůl.

Především preferujeme, když W je hydroxyskupina, -NH-benzyl- nebo -NHCH(Me)Ph.

Nejvíce preferujeme, když W je hydroxyskupina nebo -NH-(S)CH(Me)-fenyl.

Pokud W znamená ester, je takový ester především C|^alkoxy-, fenoxy- nebo aryl-(Ci ₆alkoxy), io Preferujeme, když ester je metoxy-, etoxy- fenoxy- benzyloxy- nebo PhCH(Me}-*0-.

Pl segment sloučeniny obecného vzorce I znamená cyklopropylový kruh vzorce:

kde Ci a C₂ nezávisle každý znamenají asymetrický atom uhlíku v pozicích 1 a 2 cyklopropylového kruhu. Nezávisle na přítomnosti možných center asymetrie v jiných segmentech sloučeniny obecného vzorce 1, přítomnost těchto dvou center asymetrie znamená, že sloučenina obecného vzorce I může být racemickou směsí diastereoizomerů. Racemické směsi lze připravit podle postupu příkladů provedení vynálezu a následně je oddělit na jednotlivé optické izomery nebo se připraví chirální syntézou.

Sloučenina obecného vzorce I se může vyskytovat jako racemická směs diastereoizomerů, kde Ri v pozici 2 je orientováno do syn pozice ke karbonylu na pozici 1, a zbytek je charakterizován následujícím vzorcem:

nebo sloučenina obecného vzorce I, může být racemickou směsí diastereoizomerů, kde Ri v pozi30 ci 2 je orientováno do anti pozice ke karbonylu na pozici 1, a zbytek je charakterizován následujícím vzorcem:

Racemické směsi lze separovat na individuální optické izomery.

-11 CZ 301405 B6

NejzajímavějŠí vlastnost současného vynálezu spočívá v prostorovém uspořádání PÍ segmentu, respektive konfigurace asymetrického atomu uhlíku v pozici 1. Podstata vynálezu se týká asymetrického atomu uhlíku na pozici 1, který má konfiguraci R.

Pokud atom uhlíku I má R konfiguraci, pak inhibice proteázy NS3 viru HCV je dále zvýšena pozicí substituenta R| (alkylu nebo alky lénu) na uhlíku 2 cyklopropylového kruhu.

Nejvíce preferovanou sloučeninou podle současného vynálezu je optický izomer s Ri substituentem a karbony lem v orientaci syn v následující absolutní konfiguraci:

V případě, že například R| je etyl, pak asymetrické atomy uhlíky pozicích 1 a 2 mají R,R konfiguraci.

Pro ilustraci vlivu absolutní stereochemieké konfigurace substituentů na velikosti účinku slouče20 niny lze porovnat sloučeninu 112 (tabulka 1) s absolutní konfigurací 1R,2R, která má hodnotu IC₅₍₎ 1,6 pmol, zatímco odpovídající 1 S,2S izomer (sloučenina 113) má hodnotu IC₅₀ 27,5 pmol. Z uvedeného vyplývá, že izomer lR,2Rje 25krát účinnější než odpovídající 1 S,2S izomer.

Vynález se dále týká sloučeniny obecného vzorce I, kde:

B je atom vodíku, nižší alkyl-C(O)- nebo Het-C(O)-,

Ra, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec Asp nebo Glu,

R₅, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec D- nebo L-: Asp, Glu, Val, nebo Tbg,

Y je atom vodíku nebo metyl,

Ri je vedlejší řetězec Val, Chg, Tbg, Ile nebo Leu,

R₃ je vedlejší řetězec Ile, Chg, Val nebo Tbg,

R? je l-naftylmetoxy, 2-naftyImetoxy, O-Bn,

-12CZ 301405 B6

R₂₂ je aminoskupina, di—(nižší aikyl)-aminoskupina, (nižší alkyl)-amidová skupina, nitroskupina, hydroxyskupina, halogen, CF₃ nebo karboxyskupina,

Pi znamená cyklopropylový kruh vzorce:

kde Ri je etyl, vinyl nebo bromvinyl a

W je hydroxyskupina nebo zbytek sloučeniny vzorce N(Ri_3a)Ri3_b, kde R_)3a a R_t3b jsou nezávisle atom vodíku, aryl nebo C_{l ó}alky 1 eventuálně substituovaný hydroxyskupinou nebo fenylem nebo její farmaceuticky vhodné soli nebo estery.

Další preferovanou skupinou sloučenin obecného vzorce I je sloučenina, kde:

-13CZ 301405 B6

B jc atom vodíku, acetyl nebo Het-C(O)-,

R_ň, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec Asp,

R5, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec D-Asp, D-GIu nebo D-Val, Y je atom vodíku,

R, je vedlejší řetězec Chg nebo Ile,

R₃ je vedlejší řetězec Val, Chg nebo Tbg,

R? je 1-naftylmetoxy, benzyloxy, 4-chinolinoxy nebo

Pl znamená cyklopropylový kruh vzorce:

kde Ri je etyl nebo -CH^CH? nebo-CH=CHBr, a W je hydroxyskupina nebo sloučenina vzorce -NH-(S)CH(Me)Ph nebo její farmaceuticky vhodné soli nebo estery.

Především preferovanou skupinou sloučenin obecného vzorce I jsou sloučeniny, kde

B je acetyl,

Ré, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec Asp, R₅, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec D~Glu, Y je atom vodíku,

R4 je vedlejší řetězec Chg,

R₃ je vedlejší řetězec Val nebo Tbg,

R₂ je:

- 14CZ 301405 B6

Pl je:

a W je hydroxyskupina nebo její farmaceuticky vhodné soli nebo estery.

io Podstatou současného vynálezu je každá sloučenina obecného vzorce I, která je uvedená v tabulkách 1-5.

Podstatou vynálezu je farmaceutický přípravek, který obsahuje další anti-HCV činidla. Příkladem takových látek jsou a- nebo β-interferon, ribavirin a amantadin.

Podstatou současného vynálezu je farmaceutický přípravek podle současného vynálezu, který také obsahuje jiné inhibitory HCV proteázy.

Další podstatou současného vynálezu je farmaceutický přípravek podle současného vynálezu, který obsahuje jiná inhibiční činidla zasahující jiným způsobem do biologických pochodů viru HCV, včetně například helikázy, polymerázy, metaloproteázy nebo IRES ribozomu.

Farmaceutický přípravek podle současného vynálezu lze podat orálně, parenterálně nebo cestou implantovaného zásobníku. Preferujeme podání orální nebo injekční. Součástí farmaceutického přípravku podle současného vynálezu mohou být obvyklé netoxické farmaceuticky vhodné nosiče, pomocné látky a jiné přísady. Ke zvýšení stability některých sloučenin nebo jejich lékových forem, je v některých případech nutná úprava pH přípravku přidáním farmaceuticky vhodných kyselin, zásad nebo pufrů.

Jako parenterální podání označujeme podání subkutánní, intrakutánní, intravenózní, intramuskulámí, intraartikulámí, intrasynoviální, intrastemální, intrathékální, injekční aplikace do leze nebo ínfuzní formou.

Jednou z vhodných forem farmaceutického přípravku podle současného vynálezu je sterilní injekční přípravek, respektive sterilní injekční přípravek ve formě vodné nebo olejová suspenze. Tuto suspenzi lze připravit obecně známými postupy za použití vhodných disperzních činidel nebo smáčedel (Tween 80) a suspenzních činidel.

Farmaceutický přípravek podle současného vynálezu lze orálně podat ve formě kapslí, tablet, vodných suspenzí a roztoků. Tablety pro orální podání obsahují nosiče obecně používané pro orální podání, včetně laktózy a kukuřičného škrobu. Obvykle se přidají i lubrikační Činidla (stearát hořečnatý). Při výrobě kapslí pro orální podání se použijí ředidla (laktóza) a sušený kukuřičný škrob. V případě vodných suspenzí podávaných orálně se účinná látka sloučí s emulzifikačními a suspenzními činidly. Do přípravku lze přidat i určitá sladidla a/nebo látky pro úpravu chuti a/nebo látky pro úpravu barvy.

Ostatní vhodné přísady a nosiče pro přípravu farmaceutického přípravku podle současného vynálezu jsou uvedeny ve farmaceutické literatuře: „Remingtonů Pharmaceutical Sciences“, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed. Mack Publishing Company, Easton, Penn, (1995).

- 15CZ 301405 B6

V případě použití sloučenin podle současného vynálezu jako inhibitorů proteázy HCV k prevenci a k léčbě onemocnění způsobených virem HCV, pak je dávkování v rozmezí od přibližně 0,01 do přibližně 100 ing/kg tělesné hmotnosti a den, především v rozmezí od přibližně 0,5 do přibližně mg/kg tělesné hmotnosti a den. Farmaceutické přípravky podle současného vynálezu se podá5 vají jedenkrát až pětkrát denně nebo eventuálně jako kontinuální infúze. Tuto formu podání lze použít při léčbě chronického nebo akutního onemocnění. Velikost jediné dávky lékové formy, která obsahuje účinnou složky eventuálně $ materiálem nosiče, se liší podle stavu pacienta a způsobu podání léčiva. Obvykle obsahuje od přibližně 5 % hmotnostních do přibližně 95 % hmotnostních účinné složky. Preferujeme, když tyto přípravky obsahují od přibližně 20 % do přibližně io 80 % účinné sloučeniny.

Velikost jednotlivých dávek účinné sloučeniny ovlivňuje mnoho v oboru známých okolností. Dávkování a režimy dávkování se u jednotlivých pacientů liší podle věku, tělesné hmotnosti, celkového zdravotního stavu, pohlaví, dietních návyků, době podání a míře vylučování. Závisí také na použité lékové kombinaci, závažnosti a průběhu infekčního onemocnění, a dále na dispozici pacienta k infekčním onemocněním a také na terapeutické zkušenosti lékaře.

Terapie obvykle začíná podáváním malých dávek, podstatně nižších než je optimální dávka peptidů. Dávkování se pak postupně pomalu zvyšuje přidáváním malých množství účinné látky do nastavení optimálního dávkování s požadovaným účinkem. Je důležité, aby dávkování bylo stanoveno tak, aby nezpůsobovalo pacientovi vážné a kvalitu života omezující vedlejší účinky.

Pokud přípravek podle současného vynálezu obsahuje kombinaci sloučeniny obecného vzorce I a jedno nebo více dalších terapeutických nebo profýlaktických činidel, pak by jednotlivá dávka sloučeniny podle současného vynálezu spolu s dalším činidlem .měla být přítomna v množství od 10 do 100 %. Preferujeme množství účinné látky a dalších terapeutických nebo profýlaktických činidel podávaných jako monoterapeutikum v rozmezí od přibližně 10 do 80 %.

Pokud se sloučeniny podle současného vynálezu nebo jejich farmaceuticky vhodné soli podávají společně s farmaceuticky vhodným nosičem k inhíbici proteáz NS3 viru HCV nebo k terapii nebo prevenci infekce virem HCV, pak lze vytvořený přípravek podávat in vivo savcům (člověku). Tuto terapii lze provést podáním sloučeniny podle současného vynálezu v kombinaci s činidly, mezi které také patří:imunomodulační činidla (α-, β-, nebo γ-interferony), jiná antivirová činidla (ribavirin, amantadin), další inhibitory proteáz NS3 viru HCV, inhibitory dalších životně důleži35 tých biologických procesů viru HCV (inhibitory helikázy, polymerázy, metaloproteázy, IRES nebo kombinace těchto činidel). Tyto další terapeutická a profylakční činidla lze sloučit se sloučeninami podle současného vynálezu za vzniku jediné účinné dávky. Tyto další složky lze také savcům podat odděleně jako součást mnohočetných jednotlivých dávek.

Podstata současného vynálezu se týká způsobu inhibice NS3 proteázy viru HCV u savců podáním sloučeniny obecného vzorce I, substituované podle shora uvedených definic.

Preferovaná podstata současného vynálezu se týká způsobu snížení proteázové aktivity NS3 viru HCV u savců. Pokud farmaceutický přípravek obsahuje pouze sloučeninu podle současného vynálezu jako účinnou složku, pak tento způsob navíc zahrnuje následné podání imunomodulaČních činidel, antivirových činidel, inhibitorů HCV proteáz nebo inhibitoru jiných životně důležitých funkcí viru HCV (inhibitoru helikázy, polymerázy, metaloproteázy nebo IRES). Tyto činidla lze podat savcům před, současně nebo následně po podání přípravku podle současného vynálezu.

Jiná podstata současného vynálezu se týká inhibice virové replikace u savců. Tento postup je významný v terapii a prevenci infekčních onemocnění způsobených virem HCV. Pokud farmaceutický přípravek obsahuje pouze sloučeninu podle současného vynálezu jako účinnou složku, pak tento způsob navíc zahrnuje následné podání imunomodulaČních činidel, antivirových činidel, inhibitorů HCV proteáz nebo inhibitoru jiných životně důležitých funkcí viru HCV (inhibito- 16CZ 301405 B6 ru helikázy, polymerázy, metaloproteázy nebo IRES). Tyto Činidla lze podat savcům před, současně nebo následně po podání přípravku podle současného vynálezu.

Sloučeniny podle současného vynálezu lze použít jako laboratorní reakční činidla. Sloučeniny podle současného vynálezu lze také použít k terapii nebo prevenci virové kontaminace materiálu, a tak snížit riziko virové infekce laboratorního nebo lékařského personálu, pacientů nebo osob, které jsou vystaveny styku s infekčním materiálem (krev, tkáně, chirurgické a laboratorní nástroje a prádlo, zásobníky krve a transfúzních zařízení).

Sloučeniny podle současného vynálezu lze použít jako reakční činidla pro výzkum. Sloučeniny podle současného vynálezu lze také použít jako pozitivní kontrolu při stanoveních za použití náhradních buněk (surrogate cellbased assay) nebo při replikaČnícb in vitro nebo in vivo stanoveních.

Přehled postupu přípravy

Sloučeniny podle současného vynálezu se připraví podle postupu popsaného schématem 1 (kde CPG znamená ochrannou skupinu karboxylu a APG znamená ochrannou skupinu aminoskupiny):

Schéma I a

apg-P2’P1-(w nebo CPG)

P1 1- P1-(W nebo CPG) *· APG-P2

P2-P1-(w nebo CPG) + APG-P3 _b_

APG-P3-P2-P^V(^W nebo CPG)

APG-P3-P2-Pi-(w nebo CPQ) c

+ APG-P4 d

+ APG-PS

APG-P6

APG-P5-P4-P3-P2-PHW nebo CPG)

APG-PS-P5-P4.P3-P2-P1 -(w nebo CPG) _f

--- B.R6-P5-P4-P3-P2-M-W

Vzorec t

Zbytky Pl, P2, P3, P4 a eventuálně P5 a P6 lze navázat obecně známými technikami pro vazbu peptidů. Skupiny Pl, P2, P3, P4, a P5 a P6 lze společně spojit jakýmkoli způsobem tak, aby výsledné peptidy odpovídaly sloučenině uvedeného vzorce I. Například, skupinu P6 lze navázat ke skupině P5 za vzniku řetězce P5-P6, který lze dále spojit s řetězcem P4-P3-P2-P1. Jiným způsobem může být vazba skupiny P6 na řetězec P5-P4-P3-P2, a následná vazba na peptid Pl, který je chráněný vazbou ochranné skupiny na C-konci.

Peptidy se obvykle prodlouží odštěpením ochranné skupiny z α-aminoskupiny N-konce peptidu a následnou vazbou na nechráněnou karboxylovou skupinu aminokyseliny s chráněným N-kon- 17CZ 301405 B6 cem, a to peptidovou vazbou popsaným způsobem. Tato deprotekce a následná vazba se opakuje do vzniku požadované sekvence. Vazebná reakce se provede metodou postupné syntézy (schéma I) nebo kondenzací fragmentů (o dvou nebo několika aminokyselinách) nebo kombinací obou metod. Peptidy lze připravit syntézou peptidů na pevné fázi podle popsaného postupu Merrifielda uveřejněného v J, Am. Chem., Soc. (1963), 85, 2149-2154.

Vazbu dvou aminokyselin, aminokyseliny a peptidu nebo dvou zbytků peptidů lze provést standardními vazebnými postupy-azidovou metodou, metodou směsných anhydridů kyseliny karbonylové a karboxylové (izobutyl chlormravenčan), metodou karbodiimidovou (dicyklohexylio karbodiimid, diizopropylkarbodiimid nebo ve vodě rozpustný karbodiimid), metodou aktivovaného esteru (p-nitrofenylesteru, imidoester kyseliny N-hydroxysukcinové), K-metodou Woodwardým činidlem, metodou karbonyldiimidazolovou, metodou s Činidly fosforu nebo oxidačněredukčnímí metodami. Některé uvedené metody (především karbodiimidovou metodu) lze pozitivně ovlivnit přidáním 1-hydroxybenzotriazolu. Uvedené vazebné reakce lze provést buď v rozi5 toku (kapalná fáze) nebo na pevné fázi.

Vazebná reakce, která vede ke vzniku amidové vazby, zahrnuje vazbu volného karboxylu jednoho reakčního činidla s volnou aminoskupinou druhého reakčního činidla za přítomnosti vazebného činidla. Popisem vazebných činidel se zabývá učebnice chemie peptidů (M. Bodanszky, „Peptide Chemistry“, druhé upravené vydání, Springer-Verlag, Berlin, Germany, (1993)).

Příkladem vhodných vazebných činidel je Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimid, 1-hydroxybenzotrÍazol za přítomnosti Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimidu nebo N-etyl-N '-[(3-dimetylamino)propylj-karbodiimidu. Velmi praktická a použitelná jsou komerčně dostupná vazebná činidla (benzotriazol-l-yl-oxy)tris-(dimetylamino)-fosfonium-hexafluorfosfát, a to buď samostatný nebo za přítomnosti 1-hydroxybenzotriazolu, Jiným komerčně dostupným činidlem je 2-(lHbenzotriazol-l-yl)-N,N,N',N'-tetrametyl-uronium-tetrafluorborát. Dalším komerčně dostupným činidlem je O-(7-azabenzotriazol-l-yl)-N,N,N',N'-tetrametyluronium-hexafluorfosfát.

Vazebná reakce se provede v inertním rozpouštědle (dichlormetanu, acetonitrilu nebo dimetylformamidu). Do reakční směsi se v přebytku přidá terciární amin (diizopropy lety lamin, Nmetylmorfolin nebo N-metylpyrolidin) k pH reakční směsi přibližně 8. Teplota reakční směsi je v rozmezí 0 a 50 °C a reakční doba je v rozmezí 15 minut až 24 hodin.

Pokud se peptid připravuje metodou na pevné fázi, pak karboxylová skupina na C-konci je připevněna na nerozpustný nosič (obvykle polystyren). Tento nerozpustný nosič obsahuje skupinu, která vstoupí do reakce s karboxy lovou skupinou za vzniku vazby, která je vůči elongaci stabilní, aleje později štěpena. Lze použít: chlor- nebo brom-mety lovou pryskyřici, hydroxymetylovou pryskyřici a aminometylovou pryskyřici. Většina těchto pryskyřic sjiž inkorporovaným C40 koncem aminokyseliny je na trhu dostupná. Aminokyseliny lze eventuálně inkorporovat do pevné fáze obecně známými postupy (S.S. Wang, J. Am. Chem. Soc, (1973), 95, 1 328, E, Atherton, R. C. Shepard „Solid-phase peptide synthesis, a practical approach“ IRL PressOxford, (1989), 131-148.

Dalšími postupy syntézy peptidů se zabývají následující publikace: Stewart a Young „Solid— Phase Peptide Syntéz“, druhé vydání, Pierce Chemical Co, Rockford, IL (1984),

Gross, Meienhofer, Udenfriend, Eds., „The Peptides: Analysis, Syntéz, Biology“, sv. 1,2,3,5, a 9, Academie Press, New-York, (1980-1987), Bodansky a spol., „The Practice of Peptide

Synthesis“ Springer-Verlag, NewYork (1984).

Funkční skupiny jednotlivých aminokyselin vstupujících do vazebné reakce musí být chráněny, tak aby se zabránilo vzniku nežádoucích vazeb. Popisem ochranných skupin se zabývají publikace:

- 18CZ 301405 B6

Green-„Protective Groups in Organic Chemistry“, John Wiley & Sons, New York (1981) a „The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology“, sv. 3, Academie Press, New York (1981).

Karboxylové skupiny vázané na α-uhlíkový atom C-konce peptidu jsou obvykle chráněny estery (CPG), jejichž oddělením vznikne kyselina karboxylová. Takovými ochrannými skupinami, které lze použít jsou:

1) alkylestery (metylu, trimetyIsilyletylu a t-butylu), io

2) aralkylestery (benzylestery a estery substituovaného benzylu) nebo

3) estery, které lze Štěpit mírným působením zásadou nebo mírným redukčním činidlem (trich lorety lem a fenacylestery).

Aminoskupina vázaná na a uhlíkový atom každé aminokyseliny musí být pro uvedení do vazebné reakce na narůstajícím peptidovém řetězci chráněna ochrannou skupinou aminokyselin (APG). Lze použít jakoukoli v oboru známou ochrannou skupinu. Příkladem takových skupin jsou:

1) acylové skupiny (formyl, trifluoracetyl, ftaly 1, a p-toluensulťony 1),

2) aromatické karbamátové skupiny (benzyloxykarbonylová skupina (Cbz nebo Z), substituované benzy loxykarbony lovy skupiny a 9-fluorfenylmety loxykarbony 1 (Fmoc),

3) alifatické karbamátové skupiny (terc-butyloxykarbonyl (Boc), etoxykarbony 1, diizopropylmetoxykarbonyl a alyloxykarbonyl),

4) cyklické alkylkarbamátové skupiny (cy klopenty loxykarbony 1 a adamantyloxykarbonyl),

5) alkylové skupiny (trifenylmetyí a benzyí),

6) triaikyl—silyI (trimetyIsilyl) a

7) thiol obsahující skupiny (fenylthiokarbonyl a dithiasukcinoyl),

Preferovanou ochrannou skupinou aminoskupiny vázané na a uhlíkovém atomu aminokyseliny je buď Boc nebo Fmoc. Na trhu je pro syntézu peptidů k dispozici mnoho eventuálně chráněných derivátů aminokyselin,

Před uvedením do reakce s další aminokyselinou je nutné odštěpení ochranné skupiny z aaminoskupiny. Pokud je ochrannou skupinou Boc, pak k odštěpení ochranné skupiny lze zvolit čistou kyselinu trifluoroctovou nebo její roztok v díchlormetanu, dále kyselinu chlorovodíkovou v dioxanu nebo v etylacetátu. Vytvořená amoniová sůl se pak neutralizuje buď před vazebnou reakcí nebo in sítu přidáním zásaditých roztoků (vodných roztoků pufrů, terciárních aminů v díchlormetanu, acetonitrilu nebo dimetylformamidu). Pokud se použije skupina Fmoc, pak činidlem volby je piperidín nebo substituovaný piperidin v dimetylformamidu, ale lze také zvolit některý sekundární amin. Odštěpení ochranných skupin se provede při teplotě v rozmezí od 0 °C do teploty místnosti (RT), obvykle 20 až 22 °C.

Každá funkční skupina vedlejšího řetězce aminokyseliny se během přípravy peptidu musí chránit shora uvedenými ochrannými skupinami. Výběr a použití vhodných ochranných skupin těchto funkčních skupin závisí na druhu aminokyseliny a přítomnosti jiných ochranných skupin v peptidu. Výběr ochranných skupin se řídí také tím, že se tyto skupiny nesmí odstranit během deprotekce a vazebných reakcí a-amínoskupin.

- 19CZ 301405 B6

Pokud je Boc ochrannou skupinou α-aminoskupiny, pak jako ochrannou skupinu vedlejšího řetězce lze použít následující skupiny: p-toluensulfonylovou (tosylovou) skupinu lze použít k ochraně aminoskupiny vedlejšího řetězce lysinu a argininu. Acetamido mety lovou, benzylovou nebo t-butylsulfonylovou skupinu lze použít k ochraně sulfidové skupiny vedlejšího řetězce cysteinu. Benzyl {Bn> étery jsou vhodné k ochraně hydroxyskupiny vedlejšího řetězce šeřinu, threoninu nebo hydroxyprolinu. Benzylestery se používají k ochraně karboxyskupiny vedlejšího řetězce aspartové kyseliny a giutamové kyseliny.

Pokud jako ochranou skupinu α-aminoskupiny použijeme Fmoc, pak lze vedlejší řetězce amíno10 kyselin chránit vazbou s ochranných skupin založených na terc-butylu. Pro lysin a arginin lze použít terc-buty loxykarbonyl (Boc), terc-butyléter pro serin, threonin a hydroxyprolin a terc butyl-ester pro kyseliny aspartovou a glutamovou. Tri feny Imety lovou (trity lovou) skupinu lze použít k ochraně sulfidové skupiny vedlejšího řetězce cysteinu.

Pokud W znamená amid (w), pak PÍ je před vazbou na P2 vázáno na vhodný amin. Tato aminace je v oboru běžná.

Po elongaci peptidů se všechny ochranně skupiny odstraní. Pokud jsme zvolili metodu syntézy peptidů v roztoku, pak se ochranné skupiny odštěpí sloučeninami typickými pro jednotlivé ochranné skupiny.

Pokud se peptidy připravují metodou syntézy na pevné fází, pak je vytvořený peptid odštěpen z pryskyřice se současným odstraněním ochranných skupin. V případě použití ochranné tercbuty loxy karbony lové skupiny (Boc), pak preferovaným způsobem odštěpení peptidů z pryskyřice je působení bezvodým roztokem fluorovodíku obsahujícího přísady (dimetylsulfid, anizol, thioanizol nebo p-kresol) při teplotě 0 °C. Odštěpení peptidů lze dosáhnout i jinými kyselými reakčním i činidly (směsí tri fluormetansu lionové kyseliny a kyseliny trifluoroctové). Při použití Fmoc ochranných skupin, pak skupina Fmoc na N-konci peptidů se odštěpí činidly shora popsanými. Ostatní ochranné skupiny a peptidy se z pryskyřice odštěpí za použití roztoku kyseliny trifluor30 octové a různých přísad (anizolu atd.).

Syntéza ochranné skupiny B a skupin P6, P5, P4 a P3

Různé ochranné skupiny B se umístí na chráněné řetězce skupin P4, P5 nebo Pó nebo na jakýkoli peptidový segment za použití vhodného acylchloridu nebo sulfonylchloridu, který je komerčně dostupný nebo je jeho výroba obecně známá.

Rozdílné skupiny P6 až P3 jsou komerčně dostupné nebo je jejich výroba obecně známá.

1. Syntéza skupin P2

1.1 Příprava prekurzorů:

A) Syntéza haloarylmetanových derivátů

Příprava halometyl-8-chinolinu lid se provede podle postupu K. N. Campbella a spol., J. Amer. Chem. Soc, (1946), 68, 1844.

-20CZ 301405 B6

Schéma II

Kyselina 8-chinolin-karboxylová Ha se přemění na odpovídající alkohol líc redukcí odpovídajícího acylhalogenidu lib redukčním Činidlem (lithiumaluminiumhydrid). Působením odpovídající halogenvodíkovou kyselinou vznikne lid. Podrobný popis této podstaty vynálezu je uveden v příkladě 1 A.

B) Syntéza arylalkoholových derivátů:

2-fenyl-4-hydroxychinolinové deriváty IIIc se připraví podle Giardina a spol. (J. Med. Chem, (1997),40, 1794-1807).

Schéma III

R-22 & R-21B = alkyl, hydroxyskupina, merkaptoskupina, atom halogenu, aminoskupina, nitroskupi na.

Kondenzací benzoylacetamidu lila s vhodným anilinem 111b vznikne imin, který se cyklizuje 25 působením kyseliny polyfosforečné za vzniku odpovídajícího 2 fenyM-hydroxychinolin IIIc.

Podrobný popis této podstaty vynálezu je uveden v příkladě 1B a 1C.

1.2. Syntéza P2:

A) Syntéza 4-substituovaného prolinu, kde R₂ je s uhlíkovým cyklem spojeno atomem uhlíku podle znázorněného prostorového uspořádání:

-21 CZ 301405 B6

Sloučenina se připraví podle schématu IV a podle postupů J. Ezquerra a spol. (Tetrahedron, 1993,

38, 8665-8678) a C, Pedregal a spol. (Tetrahedron Lett, 1994, 35, 2053-2056).

Schéma IV

Boc-pyroglutamová kyselina je chráněna za vzniku jejího benzylesteru. Působením silnou zásaio dou (diizopropylamidem lithným), a následným přidáním alkylačního činidla (Br-R²⁰ nebo IR²⁰) se po redukci amidem a odštěpením benzytesterové ochranné skupiny vytvoří požadovaná sloučenina IVe.

B) Syntéza O-aralkyl ováného 4-(R)-hydroxy prolinu:

Pokud je R²⁰ aryl, heterocyklus, aralkyl nebo (nižší alkyl)-heterocyklus, pak je postup přípravy popsán E. M. Smithem a spol. (J. Med. Chem. (1988), 31, 875-885). Na komerčně dostupný Boc~4(R)-hydroxyprolin se působí zásadou (hydridem sodným nebo terc-butyloxidem draselným K-tBuO) a vytvořený alkoxid se uvede do reakce s halogen-R²⁰ (Br-R²⁰, I-R²⁰, atd.) za

2« vzniku požadovaných sloučenin. Podrobný popis této podstaty vynálezu je uveden v příkladech 2, 3 a 4B.

C) Alternativní způsob syntézy O-aralkylovaného 4-(R)-hydroxyprolinu:

Pokud R²⁰ je aryl nebo heterocyklus, pak lze sloučeniny také připravit Mitsunobovou reakcí (Mitsunobu 1981, Synthesis, January, 1-28; Ráno a spol., 1995, Tet. Lett. 36 (22), 3779-3792; Krchňák a spol., 1995, Tet. Lett. 36 (5), 62 193-62 196; Richter a spol., (1994), Tet. Lett. 35 (27), 4705-4706). Na komerčně dostupný Boc^l(S)-hydroxyprolinmetylester se působí vhodným arylalkoholem nebo thiolem za přítomnosti trifenylfosfínu a dietylazodikarboxylátu (DEAD). Vytvořený ester se hydrolýzuje na kyselinu. Podrobný popis této podstaty vynálezu je uveden v příkladě 4A.

-22CZ 301405 B6

Schéma V
OH Λ	Ar-OH M	χ-ΧΞ) ! X = Onabo S <n v.
yv	nebo Ar-SH
0		0
Va		Vb

Mitsunobovu reakci lze provést na pevné fázi (Schéma V). Na desku s 96 prohlubněmi pro model 396 syntetizátoru (advanced ChemTech) vybavené alikvoty pryskyřici vázající sloučeniny Va se přidají arylalkoholy nebo thioly a vhodná reakční činidla. Po inkubaci, se produkt Vb vázaný na pryskyřici promyje, suší a odštěpí z pryskyřice.

Reakcí podle Suzuki (Míyaura a spol., 1981, Synth. Comm. 11, 513, Sáto a spol, 1989, Chem. Lett, 1405, Watanabe a spol., 1992, Synlett, 207, Takayuki a spol., 1993, J. Org. Chem. 58, 2201, Frenette a spol., 1994, Tet. Lett. 35 (49), 9177-9180, Guiles a spol., (1996), J. Org. Chem. 61, 5169-5171) lze k arylovému substituentu vázat další funkční skupiny.

2. Syntéza skupin Pl (2-substituovaných 1-aminocyklopropylkarboxylových kyselin).

Syntéza se provede podle schématu VI.

-23CZ 301405 B6

Schéma VI .R¹ halo γ

a) Di-chráněný malonátVIa a 1,2-dihaloalkan VIb nebo cyklický sulfát Víc (připravený podle

K. Burgess a Chun-Yen KE (Synthesis, 1996. 1 463-1 467) se uvedou do reakce při zásaditém pH za vzniku diesteru Vid.

io b) Místně selektivní hydrolýzou méně blokovaného esteru vznikne kyselina Vle.

c) Reakcí podle Curtise se kyselina Vle uspořádá za vzniku racemické směsi derivátů 1aminocyklopropylkarboxylové kyseliny Vlf. kde R¹ je syn ke karboxylové skupině. Podrobný popis této podstaty vynálezu je uveden v příkladě 5.

d) e) Alternativním způsobem přípravy je vytvoření selektivního esteru z kyseliny Vle za použití vhodného halogenidu (P*C1) nebo alkoholu (P*OH) za vzniku diesteru Vlg, kde P* ester se odštěpí selektivní hydrolýzou. Hydrolýzou P esteru vznikne kyselina Vlh,

-24CZ 301405 B6

f) Uspořádáním podle Curtiuse kyseliny Vlh se vytvoří racemická směs derivátů 1aminocyklopropylkarboxylové kyseliny Vii, kde R¹ je v anti ke karboxylové skupině. Podrobný popis této podstaty vynálezuje uveden v příkladě 10.

Alternativní syntéza přípravy derivátů Vlf, kde R) je vinyl syn ke karboxylové skupině, je popsána dále.

Schéma VII

Ph

N + --CO₂P

Ph „>_N' 'COjP

Ph viic vila

Na komerčně dostupný imin Vila se působí 1,4-dihalobutenem Vllb při zásaditém pH. Po hydrolýze vytvořeného iminu Vile vznikne Vild s alylovým substituentem syn ke karboxy15 lové skupině. Podrobný popis této podstaty vynálezuje uveden v příkladě 11.

Rozdělení shora uvedených směsí enantiomerů s asymetrickým atomem uhlíku v poloze 1 (Vle a Vild) lze provést:

1) enzymatickou separací (příklady 9 a 13),

2) krystalizací s chirální kyselinou (příklad 14) nebo

3) chemickou derivatizací (příklad 6).

Po rozdělení lze absolutní stereochemií izomerů určit postupem podle příkladu 7.

Rozdělení a následné určení absolutní stereochemie izomerů, kde substituent na atomu uhlíku v poloze 2 je v poloze anti ke karboxylové skupině (Vii), lze provést způsobem uvedeným pro směsi enantiomerů na asymetrickém uhlíku v poloze 1.

Další podstatou vynálezu je postup přípravy peptidového analoga obecného vzorce I, kde PÍ je substituovaný zbytek aminocyklopropylkarboxylové kyseliny, který má tyto části:

vazebná reakce APG-P6-P5-P4-P3-P2, APG-P5-P4-P3-P2, APG-P4-P3-P2 APG-P3-P2 aAPG-P2 s PÍ meziproduktem vzorce:

-25CZ 301405 B6 kde Ri je C] ₆alkyl nebo C_{2 6}alkenyl eventuálně substituovaný halogenem, CPG znamená karboxylovou ochrannou skupinu a APG znamená ochrannou aminoskupinu a P6 až P2 jsou shora popsány.

Podstata vynálezu se týká použití meziproduktu vzorce:

kde Ri je C| ₆alkyl nebo C? ňalkenyl eventuálně substituovaný halogenem, pro přípravu sloučeniny shora uvedeného obecného vzorce 1.

is Příklady provedení vynálezu

Sloučeniny podle současného vynálezu jsou podrobněji popsány následnými nelimitujícími příklady.

Teplota je uvedena ve stupních Celsia. Roztoky jsou vyjádřeny ve hmotnostně objemových procentech, poměry roztoků jsou vyjádřeny ve vztahu objemů, pokud není uvedeno jinak. Hodnoty spektra NMR se odečítají na spektrometru Bruker 400 MHz, hodnoty chemického posunu se udávají v částicích na milion (ppm). Rychlá chromatografie se provede na silikagelu (SiO₂) podle Stillovy techniky rychlé chromatografie (W. C. Still a spol., J. Org. Chem., 1978,43, 2 923).

Použité zkratky:

Bn

Boc

BSA CHAPS DBU

CH₂C1₂ = DCM DEAD

DIAD DIPEA DMAP DCC DME

DMF DMSO DTT DPPA EDTA benzyl terc-butyloxykarbonyl {Me₃COC(O)} hovězí sérový albumin —[(3—c ho lam i do-propyl)d i mety l-amonio]-l -propan sulfonát

1,8-diazabicvklo-[5.4.0 j-undec-7-en metylenchlorid diety lazodikarboxylát d i izopropy lazod i karboxy lát d i i zopropy lety 1 am i n dimetylaminopyridin

1,3-dicykfohexy Ikarbodiimid

1,2-dimety loxy etan dimetylformamid dimetylsulfoxid dithiothreitol nebo threo-l,4-dimerkapto-2,3-butandiol difenylfosforyl-azid etylendiamintetraoctová kyselina

-26CZ 301405 Bó

	Et	etyl
	EtOH	etanol
	EtOAc	etylacetát
	Et2O	dietyléter
5	HATU	[0-7-azabenzotriazol-l-yl)-l, 1,3,3-tetrametyluroniumhexafluorfosfát]
	HPLC	kapalinová chromatografie s vysokou rozlišovací schopností
	MS	hmotnostní spektrometrie
	MALDI-TOF	hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF
	FAB	bombardování rychlými atomy
10	LAH	lithiumaluminiumhydrid
	Me	metyl
	MeOH	metanol
	MES	(2-{N-morfolino}-etansulfonová kyselina)
	NaHMDS	bis—<trimetylsilyl)—amid sodný
15	NMM	N-metylmorfolin
	NMP	N-metylpyroIidin
	Pr	propyl
	Succ	3-karboxypropanoyl
	PNA	4-nitrofenylamino- nebo p-nitroanilin
20	TBAF	tetra-n-butylammoniumfluorid
	TBTU	2-( 1 H-benzotriazol-l~yl)-l, 1,3,3-tetrametyluronium-tetrafluorborát
	TCEP	tris-(2-karboxyetyl)-fosfinhydrochIorid
	TFA	kyselina trifluoroctová
	THF	tetrahydrofuran
25	TIS	triizopropylsilan
	TLC	chromatografie na tenké vrstvě
	TMSE	trimetylsilyletyl
	Tris/HCl	tris-{hydroxymetyl)-aminometan-hydrochlorid.
30	Stavební jednotky P2

Příklad 1A

Do 2,5 g (14,4 mmol) komerčně dostupné 8~ch ino lin-karboxy lové kyseliny se přidá 10 ml 40 (144 mmol) čistého thionylchloridu. Tato směs se 1 hodinu zahřívá na teplotu 80 °C, a pak se přebytek thionylchloridu odstraní destilací za sníženého tlaku. Do vytvořené nahnědlé pevné lát-27CZ 301405 B6 ky se přidá 15 ml absolutního etanolu, směs se 1 hodinu zahřívá na teplotu 80 °C, a pak se zahustí ve vakuu. Vytvořený zbytek se rozdělí mezi etylacetát a nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného. Organický podíl se suší nad síranem hořečnatým, filtruje se a zahustí za vzniku

2,8 g hnědého oleje. Tento materiál (přibližně 14,4 mmol) se po kapkách přidá během 35 minut do suspenze 0,76 g (20,2 mmol) lithiumaluminiumhydrídu v dietyletéru, která se zchladí na teplotu -60 °C. Reakční směs se během 1,5 hodiny pomalu zahřeje -35 °C. Reakce se ukončí pomalým přidáním během 30 minut vodného roztoku síranu hořeěnatého (MgSO₄. 10H?O), a pak vodného roztoku tetrahydrofuranu. Směs se rozdělí mezi dietyléter a 10% vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného. Organický podíl se suší nad síranem hořečnatým, filtruje se a zahustí za ío vzniku 2,31 g (výtěžek 80%) nažloutlé pevné látky odpovídajícího alkoholu. Ve 20 ml 30% roztoku kyseliny octové v bromovodíku (Aldrich) se rozpustí 2,3 g (11,44 mmol) tohoto alkoholu a reakční směs se 2,5 hodiny zahřívá na teplotu 70 °C. Směs se zahustí ve vakuu do sucha, rozdělí se mezi 100 ml etylacetátu a nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, produkt se suší nad síranem hořečnatým, filtruje se a zahustí za vzniku 2,54 g požadované sloučeni15 ny 1A jako nahnědlé pevné látky s výtěžkem 100%,

Příklad 1B

Syntéza 2-fenyl-4-hydroxychinolinu 1B:

V uzavřené trubici se na teplotu 85 °C 2 hodiny zahřívá roztok 6,00 g (31,2 mmol) komerčně dostupného etyl benzy lacetátu v 75 ml 30% roztoku hydroxidu amonného. Pevný produkt získaný zchlazením reakční směsi se filtruje a 2 hodiny zahřívá pod refluxem ve vodě. Roztok se třikrát extrahuje metylenchloridem. Organické podíly se sloučí, suší se nad síranem hořečnatým, filtrují se a zahustí. Vytvořený žlutý zbytek se čistí rychlou chromatografií na koloně silikagelu při eluci směsí etylacetátu a hexanu v poměru 3:7 za vzniku 1,60 g odpovídajícího amidu jako bílé pevné látky s výtěžkem 31 %.

Směs 250 mg (1,53 mmol) tohoto amidu, 143 mg (1,53 mmol) anilinu a 10 mg (0,08 mmol) anilin-hydrochloridu v 10 ml toluenu se 16 hodin zahřívá pod refluxem za použití Dean-Starkova zařízení. Roztok se zahustí za vzniku hnědého oleje, který se smísí se 2 g fosforečné kyseliny a směs se 20 minut zahřívá na teplotu 135 °C. Reakční směs se vlije do vody a přivede se k pH 8 přidáním 5 M roztoku hydroxidu sodného. Vodná suspenze se dvakrát extrahuje etylacetátem. Organické podíly se sloučí, promyjí se nasyceným roztokem chloridu sodného, suší se nad síranem hořečnatým, filtrují se a zahustí. Vytvořený zbytek se po absorpci na kolonu silikagelu čistí rychlou chromatografií při eluci 3% roztokem metanolu v etylacetátu za vzniku 67 mg (20% výtěžek) 2-fěnyM-hydroxychinolinu (1B).

'H NMR(DMSO-dí): δ 8,11 (d, J = 7 Hz, 1H), 7,86-7,83 (m, 2H), 7,77 (d, J = 8 Hz, IH), 7,68 (dd, J = 8,7 Hz, IH), 7,61-7,58 (tn, 3H), 7,35 (dd, J = 8,7 Hz, IH), 6,34 (s, IH).

-28CZ 301405 B6

Příklad ÍC

Syntéza 4-hydroxy-2-fenyl-7-metoxychinolinu (ÍC)

d

4-hydroxy-2-fenyl-7-metoxychinolin (e):

io Roztok 100,0 g (0,52 mol) etylbenzylacetátu (b), 128,1 g (1,04 mol) m-anisidinu (a) a 5,2 ml 4N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu v 1,0 1 toluenu se 6,25 hodin zahřívá pod refluxem za použití Dean-Starkova zařízení. Zchlazený toluenový roztok se postupně promyje dvakrát 300 ml 10% vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, dvakrát 300 ml 1 N roztoku hydroxidu sodného, jedenkrát 300 ml vody a jedenkrát 150 ml nasyceného roztoku chloridu sodného. Toluenový podíl se suší nad síranem hořečnatým, filtruje se a zahustí za sníženého tlaku za vzniku 144,6 g směsi esteru c a amidu d (45% / 38% surový výtěžek) v poměru 1,2:1,0 jako tmavě hnědého oleje. Surový olej se 80 minut zahřívá na teplotu 280 °C, přičemž se destilací odstraní etanol. Zchlazením vytvořená tmavá pevná látka se rozetře s 200 ml metylenchloridu. Suspenze se filtruje a vytvořená pevná látka se promyje metylenchloridem za vzniku 22,6 g (17% z produktu a) produktu e jako béžové pevné látky.

'HNMR(DMSO-Λ): δ 8,00 (d, J = 9,0 Hz, IH), 7,81-7,82 (m, 2H), 7,57-7,59 (m, 3H), 7,20 (d, J - 2,2Hz, IH), 6,94 (dd, J = 9,0,2,2Hz, IH), 6,26 (s, IH), 3,87 (s, 3H).

4-chloro-2-feny l-7-metoxychinolin (1C)

Suspenze 8,31 g (33,1 mmol) produktu e v 90 ml chloridu fosforylu (POC1₃) se 2 hodiny zahřívá pod refluxem. Zahříváním vznikne čilý roztok, kteiý se zahustí za sníženého tlaku. Vytvořený zbytek se rozdělí mezi l N roztok hydroxidu sodného (exotermní reakce, přidá se 10N roztok hydroxidu sodného k vysoké hodnotě pH) a 500 ml etylacetátu. Organický podíl se promyje 100 ml vody a 100 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, suší se nad síranem hořečnatým, filtruje se a zahustí za sníženého tlaku za vzniku 8,60 g (96%) 4-chloro-2-fenyl-7-metoxychinolinu ÍC jako světle žluté pevné látky.

Ή NMR(DMSO-d₆): δ 8,28-8,30 (m, 2H), 8,20 (s, IH), 8,10 (d, J - 9,1 Hz, IH), 7,54-7,58 (m, 3H), 7,52 (d, J = 2,5 Hz, IH), 7,38 (dd, J = 9,1, 2,5 Hz, IH), 3,98 (s, 3H).

Tato reakce se opakuje třikrát s 96-98% výtěžkem, který je významně vyšší než 68% výtěžek podle J. Med. Chem. 1997,40, 1794.

-29CZ 301405 B6

Příklad 2

Syntéza Boc-4(R)naftalen-l-yl-metoxy)prolinu 2: 5

COOH φ

Ve 100 ml tetrahydrofuranu se rozpustí 5,00 g (21,6 mmol) komerčně dostupného Boc-4(R)hydroxyprolinu a roztok se zchladí na teplotu 0 °C. Po částech se během 10 minut přidá 1,85 g to (45,4 mmol) 60% disperze hydridu sodného v oleji a suspenze se 1 hodinu míchá při teplotě místnosti. Následně se přidá 8,00 g (36,2 mmol) l-(brommetyl)naftalenu, jehož příprava je popsána v E. A. Dixon a spol. Can. J. Chem, (1981), 59, 2629-2641. Směs se 18 hodin zahřívá na teplotu refluxu, vlije se do 300 ml vody a promyje se hexanem. Vodný podíl se okyselí přidáním 10% vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové a dvakrát se extrahuje se etylacetátem, Organické podíly se sloučí a promyjí nasyceným roztokem chloridu sodného, suší se nad síranem hořečnatým, filtrují se a zahustí. Vytvořený zbytek se čistí rychlou chromatografií při eluci směsí hexanu, etylacetátu a kyseliny octové v poměru 49:49:2 za poskytnutí v názvu uvedené sloučeniny jako 4,51 g (56% výtěžek) bezbarvého oleje.

^]H NMR (DMSO-dé) zjistila přítomnost dvou rotamerů: 6 8,05 (m, 1H), 7,94 (m, IH), 7,29 (d, J = 14 Hz, 1H), 7,55-7,45 (m, 4H), 4,96 (m, 2H), 4,26 (br s, 1Η), 4,12 (dd, J = J = 8 Hz, 1H), 3,54-3,42 (m, 2H), 2,45-2,34 (m, IH), 2,07-1,98 (m, IH) 1,36 (s, (3/9) 9H), 1,34 (s, (6/9) 9H).

Příklad 3

Syntéza Boc-4(R)-{8--chinolin-metoxy)prolinu (3):

Do suspenze 1,4 g (34 mmol) 60% disperze hydridu sodného v oleji ve 100 mi tetrahydrofuranu se přidá 1,96 g (8,5 mmol) Boc-4(R)-hydroxyprolinu v 20 ml bezvodého tetrahydrofuranu. Tato reakční směs se nejprve 30 minut míchá, a pak se přidá roztok 2,54 g (11,44 mmol) brommetyl8-chinolinu (příklad 1A) v 30 ml tetrahydrofuranu, Reakční směs se s hodin zahřívá na teplotu

70 °C, přebytek hydridu sodného se opatrně odstraní vodným roztokem tetrahydrofuranu.

Reakční směs se zahustí ve vakuu a vytvořený materiál se rozpustí v etylacetátu a vodě. Zásaditý vodný podíl se oddělí a okyselí k pH přibližně s přidáním 10% vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, a následně se extrahuje 150 ml etylacetátu. Organický podíl se suší nad síranem hořeč-30CZ 301405 B6 natým, filtruje se a zahustí za vzniku hnědého oleje. Čištění rychlou chromatografii při eluci 10% roztokem metanolu v chloroformu se získá 2,73 g (86 %) požadované sloučeniny jako světle žluté pevné látky.

HPLC (97,5%) 'H-NMR (DMSO-dJ prokázala rotamery v poměru 6:4: δ 12-11,4 (bs, IH), 8,92 (dvakrát d, J = 4,14 a 4,14 Hz, IH), 8,38 (dvakrát d, J - 8,27 a 8,27 Hz, IH), 7,91 (d, J = 7,94 Hz, IH), 7,77 (d, J = 7,0 Hz, IH), 7,63-7,54 (m, 2H), 5,14 (dvakrát s, 2H), 4,32-4,29 (m, IH), 4,14^1,07 (m, ίο IH), 3,52-3,44 (m, 2H), 2,43-2,27 (m, IH), 2,13-2,04 (m, IH), 1,36 a 1,34 (dvakrát s, 9H).

Příklad 4A

Příprava Boc-4(R)-(7 chlorchinolin—4-oxo)prolinu (4a):

Směs 500 mg (2,04 mmol) komerčně dostupného metylesteru Boc^4(S)-hydroxyprolinu a 440 mg (2,45 mmol) 7-chlor-4-hydroxychínolinu se umístí do 10 ml bezvodého tetrahydrofuranu při teplotě 0^ůC, Nejprve se přidá 641 mg (2,95 mmol) trifenylfosfinu, a následně se pomalu přidá 426 mg (2,45 mmol) d i izopropytazod i karboxy latu DIAD. Směs se 20 hodin míchá při teplotě místnosti. Reakční směs se pak zahustí, zpracuje etylacetátem a extrahuje se třikrát 1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové. Vodný podíl se převede na zásadité pH přidáním uhliči25 tanu sodného a dvakrát se extrahuje etylacetátem. Organické podíly se sloučí, suší se nad síranem hořečnatým, filtruje se a zahustí za vzniku zbytku jako žlutého oleje, který se čistí rychlou chromatografií za vzniku 498 mg metylesteru výsledné sloučeniny 4A jako bílé pevné látky s 58% výtěžkem.

Za použití 1,7 ml (1,7 mmol) 1 M vodného roztoku hydroxidu sodného ve 4 ml metanolu se při teplotě 0 °C 3 hodiny hydrolyzuje 400 mg (0,986 mmol) shora vyrobeného metylesteru sloučeniny 4A. Roztok se zahustí k odstranění metanolu a neutralizuje se i M vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové. Suspenze se zahustí do sucha a zpracuje ve 20 ml metanolu, soli se odstraní filtrací a filtrát se zahustí za vzniku 387 mg (kvantitativní výtěžek) požadované sloučeniny 4A jako bílé pevné látky.

’HNMR(DMSO-d₆) (směs rotamerů v poměru 1:1): 5 8,74 (d, J - 5 Hz, IH), 8,13-8,09 (m, 1H), (s, 1H), 7,58 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 5 Hz, 1H), 5,26-5,20 (m, 1H), (m, 1H), 3,813,72 (m, IH), 3,59 (dd, J = 12,10 Hz, IH), 2,41-2,31 (m,2H), 1,34 a 1,31 (s, 9H).

-31 cz 301405 B6

Příklad 4B

Syntéza Boc-4(R)-(2-feny l-7metoxvehinolin—4-cxof-prol inu (4B):

l-[( 1 ,l-dimetyletoxy)karbonyl]-4(R)-[(7-metoxy-2-fenyl-4-chinolinyl)oxy]-l“prolin (4B):

io Do roztoku 6,73 g (29,1 mmol) komerčně dostupného 4-(S)~hydroxyprolinu v 83 ml DMSO se při teplotě 25 °C po malých částech během 15 minut přidá 8,16 g (72,7 mmol) terc-butoxidu draselného. Směs se míchá při teplotě 25 °C. Do vytvořené reakční směsi se během 15 minut přidá ve čtyřech částech 8,61 g (32,0 mmol) chlor-2-fenyl-7-metoxychinolinu IC. Reakční směs se 19 hodin míchá při teplotě 25 °C. Vytvořená suspenze se vlije do 650 ml vody a směs se třikrát promyje 150 ml dietyléteru k odstranění přebytku chlorchinolinu (účinnější byl následně shledán etylacetát). Vodný podíl se okyselí k pH 4-5 přidáním 1 N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové (vypočteno 38 ml 1,5 ekv., požadováno 43,6 ml). Bílá pevná látka jako sraženina se oddělí filtrací. Vlhká pevná látka se suší za sníženého tlaku nad oxidem fosforečným za vzniku 12,6 g (výtěžek 91 %, obsahuje 2,3 % hmotnostních DMSO) prolinového derivátu 4B jako béžo20 vé pevné látky.

’H NMR (DMSO-d₆) (směs rotamerů v poměru 2:1): δ 8,27 (d, J - 7,0 Hz, 2H), 8,00, 7,98 (2d, J = Hz, IH), 7,48-7,56 (m, 3H), 7,45, 7,43 (2s, IH), 7,39 (d, J = 2,5Hz, IH), 7,17 (dd, J = 9,2,2,5 Hz, IH), 5,53-5,59 (m, IH), 4,34-4,41 (m, IH), 3,93 (s, 3H), 3,76 (široké s, 2H), 2,6325 2,73 (m, IH), 2,32-2,43 (m, IH), 1,36, 1,33 (2s, 9H).

-32CZ 301405 B6

Stavební jednotky Pl

Příklad 5

Syntéza směsi (1R,2R) / (1S,2R) l-amino-2-etylcyklopropylkarboxylové kyseliny

ButO₂C' 'CO₂tBu

Br

a) 50% vodný roztok hydroxidu sodného

BnEt)NCl

BlltQ,C^z CO,tBu

5a

5b

c) Et3N. DPPA, benzen, a pak 2-trimetyl-siiyi-etanol raltec

COJBu

d) 1.QMTBAF

THF teplota místnosti až teplota refluxu

5C

H₂N CO₂tBu 5í etyl v poloze syn vzhledem k esteru směsi (RR)/(SR)

a) Do suspenze 21,0 g (92, 19 mmol) chloridu benzyl-trietyl-amonného v 50% vodného roztoku 92,4 g hydroxidu sodného v 185 ml vody se postupně přidá 20,0 g (92,47 mmol) ditercbutylmalonátu a 30,0 g (138,93 mmol) 1,2-dibrombutanu. Reakční směs se energicky míchá přes noc při teplotě místnosti, pak se přidá směs ledu a vody. Surový produkt se třikrát extrahuje metylenchloridem, a postupně se třikrát promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného. Organický podíl se suší nad síranem hořečnatým, filtruje se a zahustí. Vytvořený zbytek se čistí rychlou chromatografii (7 cm, 2 až 4 % roztok dietyléteru v hexanu) za vzniku 19,1 g (70,7 mmol, výtěžek 76%) požadovaného cyklopropanového derivátu 5C.

’H NMR (CDCI₃): δ 1,78-1,70 (m, IH), 1,47 (s, 9H), 1,46 (s, 9H), 1,44-1,39 (m, IH), 1,26-1,64 (m,3H), 1,02 (t, 3H, J = 7,6 Hz).

b) Do suspenze 6,71 g (59,79 mmol, 4,4 ekv.) terc-butoxidu draselného v 100 ml bezvodého éteru se při teplotě 0 °C přidá 270 μΙ (15,00 mmol, 1,1 ekv.) vody. Po 5 minutách se do suspenze přidá 3,675 g (13,59 mmol) diesteru 5c v 10 ml éteru. Reakční směs se míchá přes noc při teplotě místnosti, a pak se vlije do směsi ledu a vody a třikrát se promyje éterem. Vodný podíl se při teplotě 0 °C okyselí přidáním 10% vodného roztoku kyseliny citrónové a třikrát se extrahuje etylacetátem. Sloučený organický podíl se postupně dvakrát promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného. Po obvyklém zpracování (sušení nad síranem sodným, filtrací a zahuštění) vznikne 1,86 g (8,68 mmol, 64% výtěžek) požadované kyseliny 5d jako světle žlutého oleje.

'HNMR(CDCh): δ2,09-2,01 (m, IH), 1,98 (dd, J = 3,8, 9,2Hz, IH), 1,81-1,70 (m, IH), 1,66 (dd, J - 3,0, J = 8,2Hz, IH), l,63-l,56(m, IH), 1,51 (s,9H), 1,0 (t, J = 7,3Hz, 3H).

c) Směsi 2,017 g (9,414 mmol) kyseliny 5d v 32 ml bezvodého benzenu se postupně přidá 1,50 ml (10,76 mmol, 1,14 ekv.) trietylnitritu a 2,20 ml (10,21 mmol, 1,08 ekv.) DPPA. Reakční směs se zahřívá pod refluxem 3,5 hodiny, pak se přidá 2,70 ml (18,84 mmol (2,0 ekv.) 2-trimetylsilyletanolu. Reakční směs se pod refluxem přes noc zahřívá, pak se reakční směs zředí dietyléterem a postupně se promyje 10 % vodným roztokem citrónové kyseliny, vodou, nasyce40 ným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, dvakrát vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného. Po obvyklém zpracování (sušení nad síranem hořečnatým, filtraci a zahuštění) se

-33CZ 301405 B6 zbytek čistí rychlou chromatografií (5 cm, 10% roztok etylacetátu v hexanu) za vzniku 2,60 g (7,88 mmol, 84% výtěžek) požadovaného karbamátu 5ejako světle žlutého oleje.

Hmotnostní spektrometrie (FAB) 330 (MH+), 'HNMR(CDCb): δ5,1 (bs, IH), 4,18^,13 (m, 2H), 1,68-1,38 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 1,24-1,18 (m, IH), 1,00-0,96 (m, 5H), 0,03 (s, 9H).

d) Do 258 mg (0,783 mmol) karbamátu 5e se přidá roztok 940 μΐ (0,94 mmol, 1,2 ekv.) ío 1,0 M roztoku fluoridu tetra-n-butylamonného (TBAF) v tetrahydrofuranu. Po 4,5 hodině se přidá dalších 626 μΐ (0,63 mmol, 0,8 ekv.) 1,0 M roztoku TBAF. Reakční směs se míchá přes noc při teplotě místnosti, 30 minut se refluxuje, a pak se zředí etylacetátem, Roztok se postupně promyje dvakrát vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného. Po obvyklém zpracování (sušení nad síranem hořečnatým. filtraci a zahuštění) se získá 84 mg (0,453 mmol, 58 % výtěžek) poža15 dováného aminu 5f jako světle žluté kapaliny.

^lH NMR(CDCb): δ 1,96 (bs, 2H), 1,60-1,40 (m, 2H), 1,47 (s,9H), 1,31-1,20 (m, IH), 1,14 (dd, J - 4,1, 7,3Hz, IH), 1,02 (dd, J = 4,1,9,2Hz, 1H), 0,94 (t, J = 7,3Hz, 3H).

Příklad 6

Chemické rozdělení t-butyl-(lR,2R)/(lS,2R)-l-amino-2-etylcykIopropylkarboxylátu (výsledné sloučeniny příkladu 5):

směs (R,R)/(S.R)

6a 6b izomery oddělené chromatografií na koloně RR Izomer SR izomer

Na 8,50 g (25,86 mmol) sloučeniny 5e (příklad 5) se při teplotě refluxu 45 minut působí 26 ml 1 M roztoku fluoridu tetra-n-butylamonného (TBAF) v tetrahydrofuranu. Zchlazená reakční směs se zředí etylacetátem, třikrát se promyje vodou a jedenkrát nasyceným roztokem chloridu sodného, a pak se suší nad síranem horečnatým, filtruje se a odpařuje za vzniku volného aminu jako světle žlutého oleje. Volný amin se rozpustí ve 120 ml bezvodého metylenchloridu a do roztoku se postupně přidá 8,5 ml (77,57 mmol) roztoku N-metylmorfolinu, 10,08 g (27,15 mmol) sloučeniny 2 (příklad 2) a 11,79 g (31,03 mmol) HATU. Reakční směs se přes noc míchá pří teplotě místnosti, a pak zpracuje podle shora uvedeného postupu. Surová diastereomerická směs se rozdělí rychlou chromatografií při eluci směsí hexanu a d i etyl éteru v poměru 25:75 za vzniku dipeptidu 6a (méně polární eluční skvrna) jako 4,42 g bílé pěny (64 % teoretického výtěžku) a 6b (méně polární eluční skvrna) jako 4 g nažloutlé pěny (57 % teoretického výtěžku). V tomto případě jsou odděleny oba izomery, i když jejich stereochemické vlastnosti stále nejsou známé.

-34CZ 301405 B6

Příklad 7

Zjištění stereochemické konfigurace sloučeniny 6a a 6b korelací se známou konfigurací t—buty I— 5 (1 R-amino-2R-etylcyktopropy Ikarboxylátu

přímé srovnání pomoci TLC, HPLC a NMR

Prof. A. Charette z University of Montreal popsal přípravu sloučeniny 7a, jejíž stereochemickou io konfigurací popsal rentgenovou krystalografií (J. Am. Chem. Soc., 1995,117, 12 721). Ve 240 μΐ

1M roztoku kyseliny chlorovodíkové vetylacetátu se rozpustí 13,2 mg (0,046 mmol) sloučeniny 7a a směs se míchá přibližně 48 hodin. Směs se odpařuje do sucha za vzniku sloučeniny 7b jako světle žluté pasty, která se sloučí se 18 mg (0,049 mmol) sloučeniny 2 (příklad 6) za použití

20,3 μί (0,185 mmol) N-metylmorfolínu a 21,1 mg (0,056 mmol) HATU v metylenchloridu.

Surový materiál se čistí rychlou chromatografií při eluci směsí hexanu vdietyléteru v poměru 50:50 za vzniku dipeptidu 7c jako 7,7 mg oleje (výtěžek 31 %). TLC, HPLC a NMR analýzou dipeptidu 7c se zjistilo, že jde o identickou sloučeninu s méně polární sloučeninou 6a (příklad 6) s konfigurací (IR, 2R).

Příklad 8 (1 R,2R) / (1 S,2R) l-Boc-amino-2-etylcyklopropylkarboxylová kyselina (8a)

UTFA,0’C

Me₃SÍ—/~O

5e

N CO₂tBu 2. vodný roztok NaOH. THF H (Boc)₂O

8a

Roztok 2,6 g (7,88 mmol) karbamátu 5e (příklad 5) v TFA se 40 minut míchá při teplotě 0 °C. Směs se pak zahustí a zředí 10 ml tetrahydrofuranu. Přidá se 700 mg (17,5 mmol) vodného roztoku hydroxidu sodného v 8,8 ml vody, a následně roztoku 2,06 g (9,44 mmol, 1,2 ekv.) (Boc)₂0 v 13 ml tetrahydrofuranu. Reakční směs se míchá přes noc při teplotě místnosti při udržování

-35CZ 301405 B6 pH 8 eventuálním přidáváním 10 % vodného roztoku hydroxidu sodného, zředí se vodou, třikrát se promyje dietyléterem a při teplotě 0 °C se okyselí přidáním 10% vodného roztoku kyseliny citrónové. Vodný podíl se třikrát extrahuje etylacetátem a postupně se dvakrát promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného. Po sušení nad síranem hořečnatým, filtraci a zahuštění vznikne 788 mg (3,44 mmol, 44% výtěžek) požadované Boc-chráněné aminokyseliny (8a).

'HNMR(CDCh): 5 5,18 (bs, IH), 1,64-1,58 (m, 2H), 1,55-1,42 (m, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,321,25 (m, IH), 0,99 (t, 3H, J = 7,3Hz).

io Příprava metylesteru (1R,2R)/(lS,2R)-l-Boc-amino-2-etylcyklopropylkarboxylové kyseliny (8b)

CH^g/EtjjO

EL,0

0^eC

V 10 ml dietyléteru se rozpustí 0,30 g (1,31 mmol) Boc-derivátu 8a a na reakční roztok se působí čerstvě připraveným roztokem diazometanu v dietyléteru při teplotě 0 °C, za vzniku žlutého zabarvení roztoku, způsobeného mírným přebytkem roztoku diazometanu. Po 20 minutách míchání při teplotě místnosti se reakční směs zahustí do sucha za vzniku sloučeniny 8b jako 0,32 g (100%) čirého bezbarvého oleje.

'HNMR(CDCI,): δ5,1 (bs, IH), 3,71 (s, 3H), 1,62-1,57 (m, 2H), 1,55 (s, 9H), 1,53-1,43 (m, IH), 1,28-1,21 (m, 2H), 0,95 (t, J = 7,3Hz, 3H).

Příklad 9

Enzymatická rezoluce metyH 1 R,2R) / (l S,2R)-Boc-l~amino-2-etylcykIopropylkarboxylátu

^H O NaOH H í

8b .

směs / ⁹⁸ (S,R)Z(R,R) /bJCH/l,

H »

9b

*) analýza HPLC za použiti ChiraiceKBOD-H-kotony “) Možné jsou i jiné estery (Et)

a) Ve 3 ml acetonu se rozpustí 0,31 g (1,27 mmol) směsi enantiomerů metylesteru (1S,2R) / (1 R,2R)-l-Boc-amino-2-etylkarboxylové kyseliny (příklad 8), a pak se roztok za energického míchání zředí 7 ml vody. Hodnota pH roztoku se udržuje na 7,5 přidáváním 0,05 M vodného roz-36CZ 301405 B6 toku hydroxidu sodného, a následně se přidá 300 mg Alcalase® (2,4 1 extraktu vyrobeného v Novo Nordisk Industrials). Během inkubace se pH stabilizuje přidáváním hydroxidu sodného, které se monitoruje pHmetrem. Po 40 hodinách se směs zředí etylacetátem a vodou (s 5 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného) a podíly se oddělí. Vodný podíl se okyselí přidáním ? 10% vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové a extrahuje se etylacetátem, suší se nad síranem hořečnatým, filtruje se a zahustí za vzniku 48,5 mg kyseliny 9a. Stereochemická konfigurace se určí analýzou popsanou v příkladech 6 a 7.

b) Na podíl kyseliny 9a se působí roztokem diazometanu v dietyléteru za vzniku metylesteru, ío který se analyzuje HPLC za použití chirální kolony Chiralcel® OD-H při izokratické eluci 2,5% roztokem izopropanolu v hexanu. Z analýzy vyplývá, že jde o směs s přítomností (1S, 2R) izomeru 51:1.

a') Organický podíl se suší se nad síranem hořečnatým, filtruje se a zahustí za vzniku 0,248 g nehydrolyzovaných esterů. Na tento materiál se enzymaticky působí shora uvedeným postupem do stabilního pH (98 hodin). Po extrakci se oddělí 0,146 mg (100%) nehydro lyžovaného esteru. HPLC analýzou na chirální koloně se prokáže přítomnost (IR, 2R) izomerů větší než > 50:1.

b') Vodný podíl se okyselí přidáním 10% vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové a směs se extrahuje etylacetátem, suší se nad síranem hořečnatým, filtruje se a zahustí za vzniku 82 mg kyselého analogu. NA podíl tohoto materiálu se působí diazometanem, a pak se směs analyzuje HPLC za použití chirální kolony, kterou se prokáže přítomnost (IS, 2R) derivátu 65:1.

Příklad 10 (1R, 2S) / (l S, 2S)-l-amino-2-etylcyklopropylkarboxylová kyselina

C) DBU, Br^^ ho₂c ^z C0₂tBu 5d etyl syn vzhledem k esteru

RT

CH₃CN

RT allylO₂C^z CO₂tBu 10a

e) EtaN. DPPA,

teplota místnosti až teplota refluxu lOd etyl anti vzhledem ke kyselině (RS)Z(SS)

Výchozí sloučeninou přípravy je sloučenina 5d, jejíž příprava je popsána v příkladě 5:

c) Do roztoku 1,023 g (4,77 mmol) sloučeniny 5d ve 25 ml metylkyanidu se postupně přidá 860 μΐ (5,75 mmol, 1,2 ekv.) OSU a 620 μΐ (7,16 mmol, 1,5 ekv.) alylbromidu. Reakční směs se

4 hodiny míchá při teplotě místnosti, a pak se zahustí. Vytvořený zbytek se zředí dietyléterem a postupně se promyje dvakrát 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, vodou, nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, dvakrát vodou a nasyceným roztokem chloridu

-37CZ 301405 B6 sodného. Po sušení nad síranem hořečnatým, filtraci a zahuštění se získá 1,106 g (3,35 mmol) esteru sloučeniny 10a s 91% výtěžkem jako bezbarvého oleje.

Hmotnostní spektrometrie (FAB) 255 (MH+),

HNMR(CDClj): δ 5,96-5,86 (m, IH), 5,37-5,22 (m, 2H), 4,7(M,65 (m, IH), 4,57^),52 (m, IH), 1,87-1,79 (m, IH), 1,47 (s, 9H), 1,45-1,40 (m, IH), 1,33-1,24 (m, 3H), 1,03 (t, J = 7,3Hz, 3H).

io d) Do roztoku 1,106 g (4,349 mmol) esteru 10a v 5 ml bezvodého metylenchloridu se při teplotě místnosti přidá 5 ml kyseliny trifluoroctové. Reakční směs se 1,5 hodiny míchá, a pak se zahustí za vzniku 854 mg (4,308 mmol) sloučeniny 10b s 99% výtěžkem.

Hmotnostní spektrometrie (FAB) 199 (MH+), 'HNMR(CDCIj): 5 5,99-5,79 (m, IH), 5,40-5,30 (m, 2H), 4,71-4,62 (m, 2H), 2,22-2,00 (m, 2H), 1,95-1,88(m, IH), 1,84-1,57(m,2H),0,98(t, J = 7,3Hz,3H).

e) Do roztoku 853 mg (4,30 mmol) kyseliny 10b v 14,8 ml bezvodého benzenu se postupně přidá

6 84 μΐ (4,91 mmol, 1,14 ekv.) trietylnitritu a 992 μΙ (4,60 mmol, 1,07 ekv.) DPPA. Reakční směs se 4,5 hodiny zahřívá pod refluxem, a pak se přidá 1,23 ml (8,58 mmol, 2,0 ekv.) 2-trimetylsilyletanolu. Směs se pod refluxem zahřívá pres noc, a pak se zředí dietyléterem a postupně se promyje 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, vodou, nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, dvakrát vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného. Po sušení nad síra25 nem horečnatým, filtraci a zahuštění se zbytek čistí rychlou chromatografií (kolona 5 cm) při eluci 10 až 15 % roztokem etylacetátu v hexanu za vzniku 1,212 g (3,866 mmol) karbamátu 10c jako světle žlutého oleje s 90% výtěžkem.

Hmotnostní spektrometrie (FAB) 314 (MH+), 'HNMR(CDCb): 5 5,93-5,84 (m, IH), 5,32-5,20 (ni, 2H), 5,05 (bs, IH), 4,60-4,56 (m, 2H), 4,20-4,11 (m,2H), 1,71-1,60 (m, 3H), 1,39-1,22 (m, IH), 1,03 (t, J = 7,6 Hz, 3H), 0,96-0,86 (m, IH), 0,04 (s,9H).

f) Do 267 mg (0,810 mmol) karbamátu 10c se přidá 1,62 ml (1,62 mmol, 2,0 ekv.) l,0M roztoku tetra-n-butylamoniumfluoridu v tetrahydrofuranu. Reakční směs se míchá přes noc při teplotě místnosti, refluxuje se 30 minut, a pak se zředí etylacetátem. Roztok se postupně promyje dvakrát vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného. Po sušení nad síranem horečnatým, filtraci a zahuštění se připraví 122 mg (0,721 mmol) požadovaného aminu lOd s 89% výtěžkem jako světle žluté kapaliny.

'H NMR(CDC1₃): 5 5,94-5,86 (m, IH), 5,31-5,22 (m. 2H), 4,58 (d, J = 5,7 Hz, 2H), 1,75 (bs, 2H), 1,61-1,53 (m, 2H), 1,51-1,42 (m, 2H), 1,00 (t, J = 7,3Hz, 3H), 0,70-0,62 (m, IH).

-38CZ 301405 B6

Příklad 11 etyl-(H<? 2S) / (1S, 2S)-l-amino-2-vinyl-cyklopropyl-karboxylát

Ph

Λ ..

Ptl N CO,Et

11a + a)BuOK _r

THF -κ^Ν CO^t ¹¹⁶ -78“CtoOC ^pn 11c

b)1NwZHCI Et^3

c) NaHCOj

d) 4N HCI/dtoxan*

HCtHjN CO₂Et Ud vírtyl syn vzhledem k esteru

Pb

a) Do 180 ml tetrahydrofuranového roztoku 4,62 g (41,17 mmol, 1,1 ekv.) terc-butoxidu draselného se při teplotě -78 °C přidá 10,0 g (37,41 mmol) komerčně dostupného iminu 1 la ve 45 ml io tetrahydrofuranu. Reakční směs se zahřeje na teplotu 0 °C a 40 minut se míchá při této teplotě. Směs se opět zchladí na teplotu -78 °C a přidá se 8,0 g (37,40 mmol) 1,4-dibrombutenu 1 lb. Reakční směs se pak 1 hodinu míchá při teplotě 0 °C, zchladí se na teplotu -78 °C, a pak se přidá

4,62 g (41,17 mmol, 1,1 ekv.) terc-butoxidu draselného. Nakonec se reakční směs míchá další jednu hodinu při teplotě 0 °C a zahustí se za vzniku sloučeniny 11 c.

b) c) d) Sloučenina 1 lc se zpracuje 265 ml dietyléteru, a na roztok se působí 106 ml 1 N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové. Po 3,5 hodinách při teplotě místnosti se podíly oddělí a vodný podíl se promyje dvakrát díetyléterem a převede na zásadité pH přidáním nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Požadovaný amin se třikrát extrahuje díetyléterem a kombi20 novaný organický extrakt se promyje nasyceným roztokem chloridu sodného. Po sušení nad síranem hořečnatým, filtraci a zahuštění se na zbytek působí 187 ml (748 mmol) 4N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Po zahuštění se získá hydrochloríd lid jako 2,467 g (12,87 mmol) hnědé pevné látky s 34% výtěžkem.

'HNMR(CDCU): δ9,17 (bs, 3H), 5,75-5,66 (m, IH), 5,39 (d, J = 17,2 Hz, IH), 5,21 (d, J = 10,2 Hz, IH), 4,35-4,21 (m, 2H), 2,77-2,70 (m, IH), 2,05 (dd, J = 6,4, 10,2 Hz, IH), 1,75 (dd, J = 6,4, 8,3Hz, IH), 1,33 (t, J = 7,0 Hz, 3H).

-39CZ 301405 B6

Příklad 12 etylester(lR,2S / 1 S,2S)-l-Boc-amino-2~vÍnylcyklopropylkarboxylové kyseliny 5 (Boc)₂O

C1'H₃N+

CO₂Et

11d

DIPEA

DMAP

THF

12a vinyl syn k esteru

Ve 30 ml tetrahydrofuranu se rozpustí l,0 g (5,2 mmol) hydrochloridu l Id a l,2 g (5,7 mmol) (Boc)₂O a na směs se působí 0,l3g (l,04 mmol, 0,2 ekv.) dimetylaminopyridinu a 2,8 ml io (15,6 mmol) diizopropy lety laminu. Reakční směs se 24 hodin míchá, a následně se zředí 40 ml etylacetátu a postupně promyje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, 5% vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a nasyceným roztokem chloridu sodného. Organický podíl se suší nad síranem horečnatým, filtruje se a zahustí. Zbytek se čistí rychlou chromatografií při eluci 15% roztokem etylacetátu v hexanu za vzniku 0,29 g výsledné sloučeniny I2a s výtěžI5 kem 23 %.

’HNMR(CDCb): δ 5,80-5,72 (m, IH), 5,29-5,25 (dd, J = 17,2 Hz, IH), 5,24-5,1 (bs, IH), 5,10 (dd, J = 9,2, 9,2 Hz, IH), 4,22-4,13 (m, 2H), 2,15-2,04 (m, IH), 1,85-1,73 (bs, IH), 1,55-1,5 (m, IH), 1,49 (s,9H), 1,26 (t, J = 7,3 Hz, 3H).

Příklad 13

Enzymatické rozdělení etyl—(1 R,2S) / (1 S,2S)-l-amino-2-vinylcyk!opropylkarboxylátu

12a

a) alkaláza

NaOH vinyl syn vzhledem k esteru

O

13a (S,S)

analýza HPLC na. koloně Chiracel®OD-H

a) V 5 ml acetonu se rozpustí 0,29 g (1,14 mmol) racemického derivátu I2a a směs se zředí 10 ml vody. Hodnota pH se upraví přidáním 0,2N vodného roztoku hydroxidu sodného na pH 7,2, a následně se přidá 300 mg Alcalase®. Po dobu 9 dní inkubace se roztok hydroxidu sodného přidává pH/stat titrátorem, přičemž se během této doby přidá teoreticky vypočítané množství zásady. Následná extrakce je popsána v příkladě 9 za vzniku 0,15 g (l 00 %) nehydrolyzovaného esteru a 0,139 g (95 %) hydrolyzovaného materiálu. Analýzou nehydrolyzovaného esteru pomocí HPLC za použití chirální kolony se prokázala přítomnost požadované sloučeniny 13c v poměru

43:1.

Za přítomnosti přibližně 1 ml 20% roztoku hydroxidu paladnatého se při tlaku vodíku 101,326 kPa 45 minut hydrogenuje roztok 10,8 mg (0,015 mmol) sloučeniny 206 (kde Ri je vinyl, tabulka 2) v 1 ml etanolu za vzniku sloučeniny 214 (kde R₍ je etyl, tabulka 2). Podle

-40CZ 301405 B6 chemických korelací popsaných v příkladech 6 a 7 se prokázalo, že sloučenina 214 je (1R,2R)enantiomer, kteiý má stejnou absolutní konfiguraci se sloučeninou 206 (Ri = vinyl) znázorněné vzorce sloučeniny 13c (i když 1R, 2S, protože Ri = vinyl).

Podmínky HPLC analýzy:kolona Chiralcel® OD-H (4,6 mm x 25 cm), izokratické podmínky za použití mobilní fáze: 2,5% roztok izopropanolu v hexanu.

Příklad 14 io

Rozdělení (IR, 2S)/(1S, 2S)-l-amino-2-vinylcyklopropylkarboxylátu krystalizací sdibenzylD-vinnou kyselinou

Do roztoku surového racemického (1S,2S a lR,2S)-etyl-l-amino-2“VÍnylcyklopropylkarboxylátu (získaného z 25,0 g (93,5 mol) etylesteru N-(difenylmetylen)-glycinu podle postupu příkladu 13) v 800 ml etylacetátu se přidá 33,5 g (93,5 mol) dibertzoyl-D-vinné kyseliny. Směs se zahřívá pod refluxem, nechá se 15 minut při teplotě místnosti, a pak se zchladí na teplotu 0 °C.

Po 30 minutách se získá bílá pevná látka. Pevný produkt se filtruje, promyje se 100 ml etylacetátu a suší se na vzduchu. Pevný produkt se uvede do suspenze v 70 ml acetonu, a po působením ultrazvukem se třikrát filtruje. Pevný produkt se nechá krystalizovat dvakrát z horkého acetonu (získaná část A). Matečný louh se zahustí a zbytek se třikrát krystalizuje z horkého acetonu (získaná část B). Získané amorfní bílé produkty části A a B jako soli kyseliny dibenzyl-D-vinné se sloučí (5,53 g) a produkt se uvede do suspenze ve směsi 250 ml dietyléteru a 150 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Organický podíl se promyje nasyceným roztokem chloridu sodného, suší se nad síranem hořečnatým a filtruje se. Filtrát se zředí 100 ml 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dietyleteru a zahustí se za sníženého tlaku. Olejovitý zbytek se odpařuje s tetrachlórmetanem za vzniku 940 mg etyl-l(R^amino-2(S)-vinylcyklopropan30 karboxy lát-hydrochloridu s 11 % výtěžkem jako bílou hygroskopickou pevnou látkou, jejíž absolutní stereochemická konfigurace se určí korelací se sloučeninou 13c příkladu 13, [u]²⁵D +39.5 °C (c 1,14 metanol), ³⁵ [α]% +88,5 °C (c 1,14 metanol), 'HNMR(DMSO-d₆): 59,07 (široké s, 2H), 5,64 (ddd, J = 17,2, 10,4, 8,7 Hz, IH), 5,36 (dd, J = 17,2, 1,6 Hz, IH), 5,19 (dd, J = 10,4, 1,6 Hz, IH), 4,24-4,16 (m, 2H), 2,51-2,45 (m, vrcholy bráněné DMSO, IH), 1,84 (dd, J = 10,0, 6,0 Hz, IH), 1,64 (dd, J = 8,3, 6,0Hz, IH), 1,23 (t,

J = 7, 1 Hz, 3H).

Hmotnostní spektrometrie (ESI) m/z 156 (MH)+, čistota enantiomerů: 91 % přebytek enantiomerů HPLC analýzou (kolona CHIRALPAK AS®, směs hexanu a izopropanolu) Boc derivátu. (Příklad 13)

-41 CZ 301405 B6

Stavební jednotky P4-P2

Příklad 15

Syntéza segmentu:Ac^Chg-Chg-Pro (4(R)-naftalen-l-yl-metoxy)-OH (15 g)

15a

15e

V 60 ml bezvodého metylkyanidu se rozpustí 4,45 g (l l ,98 mmol) sloučeniny 15a (stejná jako sloučenina 2 příkladu 2) a postupně se přidá 2,2 ml (14,38 mmol) DBU a 1,1 ml (13,18 mmol) alylbromidu. Reakční směs se 24 hodin míchá při teplotě místnosti. Směs se zahustí, vytvořený olej se zředí etylacetátem a vodou a postupně se promyje dvakrát vodou a jedenkrát nasyceným roztokem chloridu sodného. Etylacetátový podíl se suší nad síranem hořečnatým, filtruje se a odpařuje do sucha. Žlutý olej se čistí rychlou chromatografií při eluci gradientem poměrů směsi hexanu a etylacetátu od 90:10 do 85:15 za vzniku produktu 15b jako 4,17 g žlutého oleje (2) s 85% výtěžkem.

Hmotnostní spektrometrie (FAB) 412 MH+.

-42CZ 301405 B6 ¹H NMR (CDC1,), směs rotamerů asi 1:2, δ (d, J = 8Hz, 1H), 7,87 (d, J = 8Hz, 1H), 7,82 (d, J = 8Hz, IH), 7,55-7,41 (m, 4H), 5,95-5,85 (m, IH), 5,34-5,21 (m, 2H), 5,03^,88 (m, 2H), 4,704,56 (m, 2H), 4,48 & 4,39 (t, J = 8,15Hz, IH), 4,28-4,23 (m, IH), 3,81-3,55 (m, 2H), 2,46-2,36 (m, IH), 2,13-2,05 (m, IH), 1,44 & 1,41 (s, 9H).

Na 2,08 g (5,05 mmol) sloučeniny 15b se 30 minut působí při teplotě místnosti 4N roztokem kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Odpařováním do sucha vznikne odpovídající aminhydrochloridjako olej.

io Aminhydrochlorid 15c se rozpustí ve 25 ml bezvodého roztoku dichlormetanu a postupně se přidá 2,2 ml (20,22 mmol) N-metylmorfclinu, 1,53 g (5,56 mmol) Boc-Chg-OH. H₂O a 1,95 g (6,07 mmol) TBTU. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti přes noc, a pak se zředí etylacetátem a postupně se promyje dvakrát 10% vodným roztokem citrónové kyseliny, dvakrát nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, dvakrát vodou a jedenkrát nasyce15 ným roztokem chloridu sodného. Etylacetátový podíl se suší nad síranem hořečnatým, filtruje se a odpařuje do sucha za vzniku surového produktu 15djako přibližně 2,78 g nažloutlé bílé pěny se 100% výtěžkem.

Hmotnostní spektrometrie (FAB) 551,4 MH+.

¹H NMR(CDCI3): 8 8,03 (d, J - 8Hz, IH), 7,86 (b d, J = 8,5 Hz, IH), 7,84 (d, J = 8Hz, IH), 7,56-7,40 (m, 4H), 5,92-5,85 (m, IH), 5,31 (dd, J = 1,17 Hz, IH), 5,22 (dd, J = 1,10 Hz, IH), 5,17 (d, J = 9Hz, IH), 5,05 (d, J= 12Hz, IH), 4,91 (d, J-12Hz, IH), 4,67-4,60 (m,3H),4,314,27 (m, 2H), 4,16 (b d, J = 11Hz, IH), 3,71 (dd, J = 4,11 Hz, IH), 2,47-2,41 (m, IH), 2,08-1,99 (m, IH), 1,85-1,63 (m, 5H), l,44-l,40(m, IH), l,36(s,9H), 1,28-1,00(m, 5H).

Na přibližně 5,05 mmol surového dipeptidu 15d se působí 25 ml 4N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu podle postupu syntézy sloučeniny 15c. Surový hydrochlorid se naváže na 1,53 g (5,55 mmol) Boc-Chg-ΌΗ. H₂O pomocí roztoku 2,22 ml (20,22 mmol) N-metylmorfolinu a 1,95 g (6,07 mmol) TBTU v 25 ml metylenchloridu podle postupu syntézy sloučeniny 15d za vzniku surového tripeptidu 15e jako žluté olejovité pěny. Surový materiál se čistí rychlou chromatografií při eluci gradientem poměrů směsi hexanu a etylacetátu od 80:20 do 75:25 za vzniku 2,75 g tripeptidu 15e jako bílé pěny (s 79% výtěžkem).

Hmotnostní spektrometrie (FAB) 690,5 MH+.

‘HNMRÍCDCb), převážně jeden rotamer, δ 8,06 (d, J = 8Hz, IH), 7,87 (bd, J = 8,5 Hz, IH), 7,82 (d, J = 8Hz, IH), 7,57-7,40 (m, 4H), 6,41 (d, J = 8,5Hz, IH), 5,92-5,84 (m, IH), 5,31 (dd, J - 1,17 Hz, IH), 5,23 (dd, J = 1, 10,5 Hz, IH), 5,04 (d, J = 12Hz, IH), 4,98 (bd, J = 7Hz, IH),

4,93 (d, J = 12Hz, IH), 4,63-4,58 (m, 4H), 4,29—4,25 (m, IH), 4,1(M,07 (m, 1H), 3,90-3,84 (m,

IH), 3,72 (dd, J = 4,1 i Hz, IH), 2,48-2,40(m, IH), 2,07-I,99(m, IH), 1,83-1,55 (m, 12H), 1,43 (s, 9H), 1,23-0,89 (m, 10H).

Na 2,75 g (3,99 mmol) tripeptidu 15e se působí 20 ml 4N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu podle postupu syntézy sloučeniny 15c. Surový hydrochlorid se rozpustí ve 20 ml roztoku bezvodého metylenchloridu. Postupně se přidá 1,75 ml (15,94 mmol) N-metylmorfolinu a 752 μί (7,97 mmol) anhydridu kyseliny octové. Reakční směs se míchá přes noc při teplotě místnosti, a pak se zředí etylacetátem. Organický podíl se promyje postupně dvakrát 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, dvakrát nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu

5ú sodného, dvakrát vodou a jedenkrát nasyceným roztokem chloridu sodného, suší se nad síranem horečnatým, filtruje se a odpařuje do sucha za vzniku surového tripeptidu 15f jako 2,48 g bílé pěny s 98% výtěžkem.

Hmotnostní spektrometrie (FAB) 632,4 MH+.

-43CZ 301405 B6 'HNMR (CDCIa). převážně jeden rotamer: δ 8,06 (b d, J = 8Hz, IH), 7,87 (b d, J = 8Hz, IH),

7,83 (d, J = 8Hz, 1H), 7,58-7,40 (m, 4H), 6,36 (d, J = 9Hz, IH), 6,01 (d, J = 9Hz, 1H), 5,94-5,83 (m, IH), 5,34-5,28 (m, IH), 5,25-5,21 (m, IH), 5,05 (d, J = 12Hz, IH), 4,94 (d, J = 12Hz, IH),

4,64-4,57 (m, 4H), 4,30—4,23 (m, 2H), 4,12-4,08 (m, IH), 3,73 (dd, J = 4,11 Hz, IH), 2,49-2,42 s (m, IH), 2,08-2,01 (m, I Η), 1,99 (s, 3 Η), 1,85-1,53 (m, 11 Η), 1,25-0,88 (m, 11H).

V 20 ml bezvodé směsi metylkyanidu a metylenchloridu se rozpustí 2,48 g (3,93 mmol) surového tripeptidu 15f. Postupně se přidá 53,5 mg (0,200 mmol) trifenylfosfínu a 117,9 mg (0,102 mmol) tetrakis-{trifenylfosfm)-paladia (0) jako katalyzátoru, a následně se přidá 353,9 μΐ (4,24 mmol) io pyrolidinu. Reakční směs se míchá 18 hodin při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odpaří a vytvořený zbytek se rozpustí v etylacetátu a 10% vodném roztoku citrónové kyseliny. Směs se dále ještě dvakrát promyje 10% vodným roztokem citrónové kyseliny, dvakrát vodou a jedenkrát nasyceným roztokem chloridu sodného. Organický podíl se suší nad síranem hořečnatým, filtruje se a odpařuje. Surový produkt se rozetře ve směsi dietyléteru a metylenchloridu v poměru 85:15.

Po filtraci vznikne tripeptid 15 gjako 2,09 g bílé pevné látky s 90% výtěžkem.

Hmotnostní spektrometrie (FAB) 592,4 MH+ 614,3 (M+Na)+.

'HNMR (CDCb), převážně jeden rotamer, δ 8,08 (d, J = 8Hz, 1H), 7,93 (b d, J = 9Hz, 1H), 7,88 Μ (bd, J = 8Hz, 1H), 7,82 (d, J = 8Hz, 1H), 7,57-7,41 (m, 4H), 6,47 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,05 (d, J =

12,5 Hz, IH), 4,94 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 4,73 (t, J = 9,5, 19Hz, IH), 4,44-4,35 (m, 2H), 4,26 (b s, IH), 4,19 (d, J = 11,5 Hz, IH), 3,75 (dd, J = 4, 11Hz, IH), 2,47 (b dd, J = 7,5, 13,5 Hz, IH), 2,20-2,11 (m, IH), 2,04 (s, 3H), 1,88-1,41 (m, I1H), 1,30-0,80 (I IH).

Příklad 16

Syntéza segmentu Ac-Chg-Val-Pro(4(R)-naftalen-l-yl-metoxy)-OH (16e)

-44CZ 301405 B6

Na 2,89 g (7,02 mmol) sloučeniny 16a se působí 30 ml 4N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu podle postupu syntézy sloučeniny 15c. Surový hydrochlorid se během 3,5 hodiny naváže na 1,53 g (7,73 mmol) Boc-Val-OH za použití 3,1 ml (28,09 mmol) N-metylmorfolinu a 2,71 g (8,43 mmol) TBTU v 35 ml metylenchloridu podle postupu syntézy sloučeniny 15d za vzniku surového dipeptidu 16b jako 3,60 g smetanově bílé olejovité pěny se 100% výtěžkem.

Hmotnostní spektrometrie (FAB) 509,3 MH-, 511,3 MH+, 533,2 (M+Na)+. io 'HNMR(CDClj): δ 8,04 (bd, J = 8Hz, IH), 7,87 (bd, J = 7Hz, IH), 7,82 (d, J = 8Hz, IH), 7,567,40 (m, 4H), 5,93-5,85 (m, IH), 5,34-5,28 (m, IH), 5,24-5,19 (m, 2H), 5,04 (d, J = 12Hz, IH), 4,92 (d, J = 12Hz, IH), 4,67-4,60 (m, 3H), 4,3M,26 (m, 2H), 4,11-4,09 (m, IH), 3,72 (dd, J = 4,11 Hz, IH), 2,48-2,41 (m, IH), 2,07-1,99 (m, IH), 1,44-1,36 (m, IH), 1,37 (s, 9H), 1,01 (d,

J = 7Hz, 3H), 0,93 (d,J = 7Hz, 3H).

Na přibližně 7,02 mmol surového dipeptidu 16b se podle postupu syntézy sloučeniny 15c působí 30 ml 4N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Surový hydrochlorid se naváže na 2,13 g (7,73 mmol) Boc-Chg-ΌΗ, H₂O za použití 3,1 ml (28,09 mmol) N-metylmorfolinu a 2,71 g (8,43 mmol) TBTU ve 35 ml metylenchloridu podle postupu syntézy sloučenin 15d za vzniku surového tripeptidu 16e jako přibližně 4,6 g pěny s 100% výtěžkem. Hmotnostní spektrometrie (FAB): 648,5 MH- 672,4 (M+Na)+.

‘H NMR (CDCb): δ 8,06 (b d, J - 8Hz, 1H), 7,87 (b d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,82 (b d, J = 8Hz, 1H),

7,57-7,40 (m, 4H), 6,46 (b d, J = 8,5 Hz, IH), 5,94-5,84 (m, IH), 5,31 (dd, J = 1,17 Hz, IH),

5,23 (dd, J = 1, 10,5 Hz, IH), 5,03 (d, J = 12Hz, 1H), 5,0(M,97 (m, IH), 4,93 (d, J = 12Hz, IH), 4,63—4,59 (m, 4H), 4,29-4,27 (m, IH), 4,KM,07 (m, IH), 3,92-3,86 (m, IH), 3,72 (dd, J = 5,11Hz, IH), 2,48-2,41 (m, IH), 2,10-1,99 (m, IH), 1,76-1,57 (m, 6 H), 1,43 (s, 9H), 1,20-0,92 (m, 6H), 1,00 (d, J = 7Hz, 3H), 0,93 (d, J = 7Hz, 3H).

Na přibližně 7,02 mmol surového tripeptidu 16c se podle postupu syntézy sloučeniny 15c působí 30 ml 4N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Na surový hydrochlorid se podle postupu syntézy sloučeniny 15d dále působí 1,33 ml (14,05 mmol) anhydridu kyseliny octové a 3,1 ml (28,09 mmol) N-metylmorfolinu v 35 ml metylenchloridu. Surový produkt se čistí rychlou chro35 matografií při eluci směsí hexanu a etylacetátu v poměru 30:70 za vzniku acetylovaného chráněného tripeptidu 16d jako 3,39 g bílé pěny s 81 % výtěžkem.

Hmotnostní spektrometrie (FAB) 590,3 MH- 592,4 MH+, 614,4 (M+Na)+.

'HNMR (CDCh), převážně jeden rotamer, δ 8,06 (d, J = 8Hz, IH), 7,88 (bd, J = 8Hz, IH), 7,83 (d, J - 8Hz, IH), 7,58-7,41 (m, 4H), 6,37 (d, J = 9Hz, IH), 5,97 (d, J = 8,5 Hz, IH), 5,94-5,84 (m, IH), 5,31 (dd, J = 1,17 Hz, IH), 5,24 (dd, J = 1, 10,5 Hz, IH), 5,05 (d, J = 12Hz, IH), 4,94 (d, J = 12Hz, IH), 4,66-4,57 (m, 4H), 4,3M,22 (m, 2H), 4,1 M,05 (m, 1H), 3,73 (dd, J = 4,5, 11 Hz, IH), 2,50-2,43 (m, IH), 2,09-2,01 (m, 2H), 2,00 (s, 3H), 1,68-1,55 (m, 5H), 1,15-0,89 (m, 6H), 0,99 (d, J = 7Hz, 3H), 0,91 (d, J = 7Hz, 3H).

-45CZ 301405 B6

Deprotekce 3,39 g (5,73 mmol) acetylovaného tripeptidu 16d se provede podle postupu syntézy sloučeniny 15g za přítomnosti 172,1 mg (0,149 mmol) tetrakis (trifenylfosfin)-paladia (0),

78.1 mg (0,298 mmol) trifenylfosfinu a 516 μΐ (6,19 mmol) pyrolidinu ve 30 ml směsi bezvodého metylkyanidu a metylenchloridu v poměru 1:1. Surový produkt jako světle žlutá pěna se rozetře ve směsi dietyléteru a metylenchloridu v poměru 85:15. Po filtraci vznikne 3,0 g tripeptidu 16e jako špinavé bílé pevné látky s 95% výtěžkem.

Hmotnostní spektrometrie (FAB) 550,3 MH.

io 'Η NMR(CDC1₃): δ 8,08 (d, J = 8Hz, IH), 8,04 (b d, J = 9Hz, 1H), 7,88 (bd, J = 7,5 Hz, IH), 7,82 (d, J = 8Hz, IH), 7,58-7,37 (m, 5H), 5,05 (d, J = 12Hz, IH), 4,94 (d, J = 12Hz, IH), 4,61 (t, J = 9,5, 19,5 Hz, 1H), 4,46-4,37 (m, 2H), 4,27 (bs, 1H), 4,17 (d, J = 11 Hz, 1H), 3,74 (dd, J - 4, 11Hz, IH), 2,49 (bdd, J = 7,5, 13Hz, IH), 2,17-2,09 (m, IH), 2,04 (s, 3H), 2,03-1,94 (m, IH), 1,79 (bd, J = 12,5 Hz, IH), 1,62-1,43 (m, 5H), 1,08-0,85 (m, 5H), 1,00 (d, J = 7Hz, 3H), 0,90 (d,

J = 7Hz,3H).

Sloučeniny tabulek 1 až 4

Příklad 17

Syntéza sloučeniny 104 (tabulka 1)

-46CZ 301405 B6

Na 4,27 g (7,93 mmol) sloučeniny 17a (popsáno jako sloučenina 6a v příkladě 6) se 5 hodin působí 40 ml 4N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu podle postupu přípravy sloučeni5 ny 15c. Surový hydrochlorid se rozpustí v 10 ml tetrahydrofuranu a přidá se roztok 348,7 mg (8,72 mmol) hydroxidu sodného v 5 ml vody. Po přidání po kapkách roztoku 1,73 g (7,93 mmol) (Boc)₂O v 13 ml tetrahydrofuranu se pH upraví na hodnotu 8 přidáváním 10% vodného roztoku hydroxidu sodného. Reakční směs se energicky míchá, a pak se zředí dietyléterem a vodou a ještě jednou se extrahuje dietyléterem. Vodný podíl se okyselí k pH 3 přidáním 10% vodného roztoku ío kyseliny citrónové. Směs se třikrát extrahuje etylacetátem a sloučené etylacetátové extrakty se promyjí dvakrát vodou, jedenkrát nasyceným roztokem chloridu sodného, suší se nad síranem hořečnatým, filtrují se a odpařují do sucha za vzniku přibližně 7,93 mmol surové sloučeniny 17b jako smetanově bílé pěny.

Hmotnostní spektrometrie (FAB) 481,3 MH'HNMR (CDC1₃)₅ směs rotamerů v poměru přibližně 1:1: δ 8,04 (bd, J = 7,5 Hz, 1H), 7,87 (b d, J = 7,5 Hz, IH), 7,82 (d, J = 7,5 Hz, IH), 7,56-7,40 (m, 5H), 4,96 (b s, 2H), 4,33 (t, J = 7,5,

14.5 Hz, IH), 4,209 (m, 0,5H), 3,99-3,84 (m, 0,5H), 3,78-3,75 (m, 0,5H), 3,68-3,62 (m,

0,5H), 3,61-3,42 (m, IH), 2,55-2,41 (m, IH), 2,22-2,11 (m, IH), 1,61-1,52 (m, 3H), 1,43 (s,

9H), 1,40-1,31 (m, IH), 1,25-1,19 (m, IH), 0,99 (t, J = 7,5, 14,5 Hz, 3H).

Na 7,93 mmol sloučeniny 17b se 48 hodin působí 1,18 ml (93 mmol) DBU a 4,12 ml (47,61 mmol) alylbromidu ve 40 ml bezvodého metylkyanidu podle postupu přípravy sloučeni25 ny 15b za vzniku alylovaného dipeptidu 17c jako 3,54 g smetanově bílé pěny s 86% výtěžkem. Hmotnostní spektrometrie (FAB) 521,3 MH- 545,2 (M+Na)+.

’HNMR (CDCb), směs rotamerů v poměru přibližně 1:1: δ 8,05 (b d, J = 8Hz, IH), 7,86 (b d,

J = 7,5 Hz, IH), 7,82 (d, J = 8Hz, IH), 7,55-7,40 (m, 5H), 5,88-5,79 (m, IH), 5,27 (b d, J =

17.5 Hz, IH), 5,18 (b d, J = 10Hz, IH), 5,03-4,89 (m, 2H), 4,63-4,50 (m, 2H), 4,44-4,19 (m, 2H), 4,00-3,40 (m, 2H), 2,70-2,02 (m, 2H), 1,66-1,35 (m, 5H), 1,44 (s, 9H), 0,95 (t, J = 7,5,

14.5 Hz,3H).

Na 1,18 g (2,26 mmol) surového dipeptidu 17c se podle postupu přípravy sloučeniny 15c působí 35 ml 4N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Surový hydrochlorid se naváže na 684 mg (2,48 mmol) Boc-Chg-OH. H₂O za použití roztoku 993 μΐ (9,03 mmol) N-metylmorfolinu a 870 mg (2,71 mmol) TBTU v 11 ml metylenchloridu podle postupu přípravy sloučeniny 15d za vzniku 1,41 g surového tripeptidu 17d jako smetanově bílé pěny s výtěžkem 95 %.

Hmotnostní spektrometrie (FAB) 660,4 MH-, 662,3 MH+.

'H NMR (CDCIa), převážné jeden rotamer: δ 8,03 (b d, 3 = 8Hz, IH), 7,85 (b d, 3 = 8Hz, IH), 7,81 (d, J = 8Hz, IH), 7,56-7,39 (m, 5H), 5,88-5,77 (m, IH), 5,26 (dd, J = 1,5, 17 Hz, IH), 5,15 (dd, J = 1,5, 10,5 Hz, IH), 5,12 (s, IH), 5,02-4,92 (m, 2H), 4,72-4,59 (m, IH), 4,57-4,46 (m.

-47CZ 301405 B6

IH), 4,42-4,35 (m, IH), 4,33-1,20 (m, IH), 4,02-3,90 (m, IH), 3,78-3,70 (m, IH), 3,67-3,51 (m, IH), 2,71-2,61 (m, IH), 2,12-2,02 (m, IH), 1,79-1,48 (m, Ι0Η), 1,45-1,39 (m, IH), 1,38 (s,

9H), 1,25-1,01 (m, 5H), 0,94 (t, 3H).

Na 265 mg (0,400 mmol) surového tripeptidu 17d se podle postupu přípravy sloučeniny 15c působí 3 ml 4N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Surový hydrochlorid se naváže na

143,3 mg (0,521 mmol) Boc-ChgOH. H?O za použití roztoku 176 μΐ (1,60 mmol) N-metylmorfolinu a 154,3 mg (0,481 mmol) TBTU v 3 ml metylenchloridu podle postupu přípravy sloučeniny 15d za vzniku přibližně 0,400 mmol surového tetrapeptidu 17e jako bílé pěny s výtěžkem io 100%.

Hmotnostní spektrometrie (FAB) 799,5 MH-, 801,5 MH+, 823 (M+Na)+.

'H NMR (CDC1₃), směs rotamerů v poměru přibližně 1:1:5 8,05 (b d, J = 8,5 Hz, IH), 7,87 (b d,

J = 7,5 Hz, IH), 7,81 (d, J = 8,5 Hz, IH), 7,55-7,40 (m, 4H), 7,37 (s, IH), 6,58-6,41 (m, IH), 5,89-5,78 (m, IH), 5,26 (b, dd, J - 1,5, 17 Hz, IH), 5,16 (b, dd, J = 1,5, 10,5 Hz, IH), 5,20-4,92 (m, 3H), 4,68-4,58 (m, 2H), 4,57-4,47 (m, IH), 4,43-1,26 (m, IH), 3,99-3,81 (m, 2H), 3,783,60 (m, 2H), 2,67-2,60 (m, IH), 2,11-2,02 (m, IH), 1,78-1,42 (m, 14H), (s, 9H), 1,25-0,91 (m, 13H), 0,95 (t, J-7,5, 15Hz, 3H).

Na přibližně 0,400 mmol surového tetrapeptidu 17e se podle postupu přípravy sloučeniny 15c působí 3 ml 4N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Na surový hydrochlorid se dále působí roztokem 83 μΐ (0,884 mmol) anhydridu kyseliny octové a 194 μΐ (1,77 mmol) N-metylmorfolinu v 3 ml metylenchloridu podle postupu přípravy sloučeniny 15f za vzniku přibližně

0,400 mmol surového acetylovaného tetrapeptidu 17f jako bílé pěny.

Hmotnostní spektrometrie (FAB) 741,5 MH-, 7434 MH+, 765,4 (M+Na)+.

Ή NMR (CDC1₃): 5 8,05 (b d, J = 8,5 Hz, IH), 7,87 (b d, J = 7,5 Hz, IH), 7,82 (d, J = 8,5 Hz,

IH), 7,55-7,41 (m, 4H), 7,39 (s, IH), 6,63-6,48 (m, IH), 6,01 (d, J = 8,5 Hz, IH), 5,90-5,79 (m, IH), 5,27 (b dd, J=l,5, 17 Hz, IH), 5,16 (b dd, J = 1,5, 10,5Hz, IH), 5,01 (d, J = 12Hz, IH), 4,96 (d, J = 12Hz, IH), 4,69-4,48 (m, 3H), 4,44-4,37 (m, IH), 4,36-4,22 (m, IH), 3,96 (dd, J = 4,11Hz, IH), 3,78-3,60 (m, 2H), 2,67-2,59 (m, IH), 2,10-2,00 (m, IH), 2,01 (s, 3H), 1,78-1,48 (m, 13H), 1,45-1,35 (m, IH), 1,26-4,89 (m, 13H), 0,95 (t, J-7,5, l5Hz,3H).

Ochranné skupiny z přibližně 0,400 mmol acetylovaného tetrapeptidu 17f se odstraní za přítomnosti 11,3 mg (0,010 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)paladia (0), 5,12 mg (0,020 mmol) trifenylfosfinu a 34 μ] (0,406 mmol) pyrolidinu ve 2 ml směsi bezvodého metylkyanidu a metylenchloridu v poměru 1:1 podle postupu přípravy sloučeniny 15g. Surový produkt se čistí rychlou chroma40 tografií při eluci: 1. etylacetátem, 2. 1,92% roztokem kyseliny octové, 3,85% roztokem metanolu v metylenchloridu. Po lyofilizaci vznikne 193,1 mg tetrapeptidu jako sloučeniny 104 tabulky 1 jako špinavě bílé pevné látky s 73% výtěžkem.

Hmotnostní spektrometrie (FAB) 701,4 MH-, 703,4 MH+, 725,4 (M+Na)+.

'HNMR (DMSO), směs rotamerů v poměru přibližně 1:5: 5 8,57 & 8,32 (s, IH), 8,04 (d, J - 7,5 Hz, IH), 7,94 (b d, J = 7,5 Hz, IH), 7,88 (d, J = 8Hz, IH), 7,83-7,78 (m, 2H), 7,58-7,30 (m, 4H), 4,99 (d, J = 12Hz, IH), 4,90 (d, J = 12Hz, IH), 4,44^1,29 (m, 2H), 4,29-4,05 (m, 3H), 3,87-3,73 (m, IH), 2,23-2,13 (m, IH), 2,05-1,95 (m, IH), 1,91 & 1,84 (s, 3H), 1,75-1,40 (m,

15H), 1,29-0,84 (m, 12H), 0,91 (t, J = 7,5, 14,5 Hz, 3H).

-48CZ 301405 B6

Příklad 18

Syntéza sloučeniny 105 tabulky 1

18a 18b sloučenina 105

Sloučenina 18b, která odpovídá sloučenině 5f příkladu 5, se naváže na předem připravený tripeptid 18a, podle postupu příkladu 15, respektive přibližně 0,521 mmol sloučeniny 18b se sloučí ío s 323,6 mg (0,547 mmol) sloučeniny 18a v 3 ml metylenchloridu a 172 μΐ (1,562 mmol) Nmetylmorfolinu, a následně se přidá 237,6 mg (0,625 mmol) HATU. Reakční směs se 18 hodin míchá pří teplotě místnosti, a pak se zpracuje podle postupu přípravy sloučeniny 15d za vzniku surového tetrapeptidu jako racemické směsi Pl. Oba izomery lze částečně oddělit rychlou chromatografií při eluci směsí toluenu a etylacetátu v poměru 40:60. Sloučením prvních elučních podílů se získá směs v poměru 9:1, ve které je analogický terc-butylester sloučeniny 17f hlavní složkou (58 mg). Střední podíly obsahují rozdílné zastoupení odpovídajících terc-butylesteru sloučeniny 17f a t-butyl esteru sloučeniny 105 (163 mg). Pozdější eluční podíl obsahuje 75,8 mg odpovídajícího terc-butylesteru sloučeniny 105 jako hlavní izomer.

Ve 2 ml 4N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu se rozpustí 74 mg (0,0975 mmol) esteru z pozdějšího elučního podílu, roztok se 5,5 hodiny míchá při teplotě místnosti, a pak se odpařuje do sucha za vzniku oleje. Čištěním rychlou chromatografií při eluci nejprve etylacetátem, a pak 1,92% roztokem kyseliny octové a 3,85% roztokem metanolu v metylenchloridu. Po lyofilizaci vznikne 38,7 mg sloučeniny 105 jako bílé pevné látky s 56% výtěžkem. Podle analýzy HPLC jde o směs sloučeniny 105 a sloučeniny 104 v poměru 3:1.

Hmotnostní spektrometrie a NMR pro sloučeninu 105:

Hmotnostní spektrometrie (FAB): 701,5 MH-, 703,5 MH+, 725,6 (M+Na)+.

'HNMR (DMSO), směs rotamerů v poměru přibližně 1:2,5: 5 8,76 & 8,34 (s, IH), 8,05 (b d, J = 7,5 Hz, IH), 7,94 (b d, J = 8Hz, IH), 7,88 (d, J = 8,5 Hz, IH), 7,85-7,78 (m, 2H), 7,59-7,43 (m, 4H), 4,99 (d, J = 12Hz, IH), 4,89 (d, J = 12Hz, IH), 4,41-4,05 (m, 5H), 3,82-3,66 (m, IH), 2,25-2,11 (m, IH), 2,11-1,98 (m, IH), 1,90 & 1,84 (s, 3H), 1,78-1,40 (m, 15h), 1,39-4),82 (m,

12H), 0,90(t, J = 7,14Hz, 3H),

Příklad 19

Syntéza sloučeniny 103 tabulky 1

Podle postupu popisujícího syntézu sloučeniny 104 v příkladě 17 se směs 1(R), 2(R) a 1(R), 2(S) izomerů meziproduktu lOd, připraveného v příkladě 10, spojí se sloučeninou 2 za vzniku směsí izomerů meziproduktu 19a a 19b.

-49CZ 301405 B6

19a 19b

Podle postupu příkladu 18 se oddělí izomemí sloučeniny 19a a 19b a přemění na odpovídající sloučeniny obecného vzorce 1 za vzniku odpovídající sloučeniny 103 tabulky 1.

Výsledky spektrální analýzy:

sloučenina 103: Přítomnost rotamerů podle NMR přibližně 1:8,7:

Hmotnostní spektrometrie (FAB) m/z:703 (MH+).

'H-NMR (DMSO-d_ó): δ 8,21-8,09 (bs, IH), 8,05 (bd, J = 7,63Hz, IH), 7,94 (bd, J = 7,0 Hz, IH), 7,91-7,83 (m, 2H), 7,83-7,76 (m, IH), 7,59-7,5 (m, 3H), 7,5-7,43 (m, IH), 4,99 (d, J =

11,8 Hz, IH), 4,89 (d, J= 11,8 Hz, IH), 4,43^1,30 (m, 3H), 4,23^1,16 (m, IH), 4,13 (bd, J =

10,8 Hz, IH), 3,71 (dd, J = i 1,1,4 Hz, IH), 2,2-2,02 (m, 2H), 1,87 a 1,84 (dvakrát s, 3H), 1,811,71 (m, 2H), 1,70-1,40 (m, 12H), 1,26-1,06 (m, 4H), 1,04-0,83 (m, 1 IH), 0,59 (m, IH).

Příklad 20

Syntéza sloučenin 108 tabulky 1

-50CZ 301405 B6

20d sloučenina 108

Na přibližně 0,963 mmol surového tripeptidu 17e příkladu 17 se podle postupu přípravy sloučeniny 15c působí 5 ml 4N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Surový hydrochiorid se naváže na 331,9 mg (1,155 mmol) Boc-(D)Glu(O-alyl)-OH podle postupu přípravy sloučeniny 15d působením 3 hodiny roztokem 423 μΐ (3,850 mmol) N-metylmorfolinu a 370,8 mg (1,155 mmol) TBTU v 5 ml metylenchloridu při teplotě místnosti. Získá se přibližně 933,9 mg (0,963 mmol) surového pentapeptidu 20b jako bílé pěny. Hmotnostní spektrometrie (FAB) 968,6 MH- 970,6 MH+, 992,5 (M+Na).

'HNMR(CDCh), směs rotamerů přibližně 1:4: 58,05 (d, J = 8,5 Hz, IH), 7,87 (b d, J = 7,5 Hz, IH), 7,81 (d, J = 8,5 Hz, IH), 7,58-7,34 (m, 5H), 6,77-6,25 (m, 2H), 5,98-5,77 (m, 2H), 5,385,21 (m, 4H), 5,16 (dd, J - 1,5, 10,5 Hz, IH), 5,06-4,89 (m, 2H), 4,68-4,13 (m, 7H), 3,96-3,52 (m, 4H), 2,69-2,38 (m, 3H), 2,23-1,87 (m, 2H), 1,78-1,37 (m, 17H), 1,46 & 1,44 (s, 9H), 1,2215 0,87 (m, 11H), 0,95 (t, J = 7, 14,5 Hz, 3H).

Na přibližně 0,963 mmol surového pentapeptidu 20b se podle postupu přípravy sloučeniny 15c působí 5 ml 4N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Surový hydrochiorid se naváže na 315,6 mg (1,155 mmol) Boc-Asp(O-alyl)-OH podle postupu přípravy sloučeniny I5d působe20 ním roztoku 423 μΐ (3,85 mmol) N-metylmorfolinu a 370,8 mg (1,155 mmol) TBTU v 5 ml metylenchloridu. Získá se přibližně 1,083 g (0,963 mmol) surového hexapeptidu 20c jako bílé pěny.

Hmotnostní spektrometrie (FAB) 1147,6 (M+Na)+.

'HNMR(CDC1₃), směs rotamerů v poměru přibližně 1:1:6 8,06 (b d, J - 8Hz, 1H), 7,86 (d, J = 8Hz, IH), 7,81 (d, J = 8Hz, IH), 7,59-7,39 (m, 5H), 7,39-6,34 (m, 4H), 5,98-5,76 (m, 3H), 5,38-5,10 (m, 6H), 5,10-4,89 (m, 2H), 4,66-4,05 (m, 10H), 3,87-3,58 (m, 4H), 3,30-2,65 (m, 2H), 2,65-1,89 (m 3H), 1,79-1,33 (m, 19H), (s, 9H), 1,334),86 (m, 14H),

Na přibližně 0,963 mmol surového hexapeptidu 20c se podle postupu přípravy sloučeniny 15c působí 5 ml 4N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Podle postupu přípravy sloučeniny 15f se surový hydrochiorid acetyluje za použití roztoku 182 μΐ (1,193 mmol) anhydridu kyseliny octové a 423,5 μΐ (3,850 mmol) N-metylmorfolinu v 5 ml metylenchloridu za vzniku suro35 vého acetylovaného tetrapeptidu. Zbytek jako pěna se čistí rychlou chromatografíi při eluci nejprve gradientem poměrů směsi hexanu a etylacetátu od 20:80 do 10:90, a pak čistým etylacetátem za vzniku 528 mg acetylovaného hexapeptidu 20d jako bílé pěny s 51% výtěžkem (během 4 kroků).

Hmotnostní spektrometrie (FAB) 1067,6 (MH+) 1089,6 (M+Na).

V 3 ml metylenchloridu se rozpustí 528 mg (0,495 mmol) acetylovaného hexapeptidu 20d a na reakční roztok se působí předem smíchaným a 15 minut míchaným roztokem 90 mg (0,078 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)paladia (0) a 134 μΐ (1,603 mmol) pyrolidinu v 3 ml metylenchloridu. Reakční směs se 48 hodin míchá při teplotě místnosti, a pak se rozpouštědlo

-51 CZ 301405 B6 odpařuje. Surový produkt se čistí částečným rozetřením ve směsí dietyléteru a metylenchloridu v poměru 85:15, a následně se ve dvou porcích čistí preparativní HPLC. Polovina částečně čistého materiálu se rozpustí v 5 ml ledové kyseliny octové, filtruje se přes 0,45 pm filtr Millipore®:

Millex®-HV filter a umístí se na ekvilibrovaný sorbent Whatman Partisil® 10-ODS-3 (2,2 x

50cm) Cl 8 reversní fáze kolony. Postup čištění:lineární gradient při průtoku rychlostí 15 ml/min,

230pm, nastříknuto při 5%A. Po eluci kyseliny octové se spustí postup čištění: 5%A 10 minut, během 70 minut se A zvýší na 58%. A: 0,06% roztok kyseliny trifluoroctové v metylkyanid, B: 0,06% roztok kyseliny trifluoroctové ve vodě. Podíly se analyzují analytickou HPLC, požadované podíly získané z obou čištění HPLC se oddělí a lyofilizují se za vzniku 218,3 mg požadovanéio ho hexapeptidu sloučeniny 108 jako bílé pevné látky s 47% výtěžkem. Hmotnostní spektrometrie (FAB) 945,5 MH- 947,4 MH+, 969,5 (M+Na)+, 985,4 (M+K)+.

'HNMR (DMSO), směs rotamerů v poměru přibližně 1:9: δ 8,55 & 8,31 (s, IH), 8,16 (d, J = 7,5 Hz, IH), 8,11 (d, J - 8Hz, IH), 8,05 (d, J = 8,5 Hz, IH), 7,97-7,85 (m, 2H), 7,88 (d, J =

8,5 Hz, IH), 7,75 (d, J = 9Hz, IH), 7,59 7,39 (m, 4H), 4,99 (d, J = 12Hz, 1H), 4,89 (d, J = 12Hz,

IH), 4,53 (dd, J - 7, 14Hz, IH), 4,08-1,45 (m, 6H), 3,77 (b dd, J = 4,11 Hz, IH), 2,64 (dd, J = 6,5, 16,5 Hz, IH), 2,48-2,41 (m, IH), 2,25-2,12 (m, 3H), 2,07 & 1,82 (s, 3H), 2,04-1,86 (m, 2H), 1,80-1,35 (m, 14H), 1,32-0,80 (m, 14H), 0,91 (t, J = 7,5, 14,5 Hz,3H).

Příklad 21

Syntéza sloučeniny 301 tabulky 3

-52CZ 301405 B6

Do roztoku 45 mg (0,185 mmol) esteru sloučeniny 21 a (shora popsané jako (R, R) izomer 9c) v 3,5 ml metanolu a 3,5 ml tetrahydrofuranu se přidá roztok 23 mg (0,56 mmol) monohydrátu hydroxidu lithného ve 4 ml vody. Vytvořený roztok se 16 hodin energicky míchá, a pak se rozdělí mezi 60 ml etylacetátu a 20 ml 10% vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové. Organický podíl se oddělí, suší se nad síranem hořečnatým, filtruje se a zahustí za vzniku odpovídající kyseliny s kvantitativním výtěžkem.

Tento materiál (přibližně 0,185 mmol) se sloučí s27 mg (0,22 mmol) (S)-(-)-a-metylbenzylaminu, 77 mg (0,20 mmol) HATU a 0,11 ml (0,65 mmol) DIPEA v 5 ml dimetylformamidu. io Po 20 hodinách se reakční směs zahustí. Vytvořený zbytek se rozpustí v etylacetátu a roztok se postupně promyje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, 10% vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a nasyceným roztokem chloridu sodného. Po sušení nad síranem hořečnatým a filtraci se produkt zahustí ve vakuu. Čištěním rychlou chromatografií při eluci 35% roztoku etylacetátu v hexanu se získá 11 mg (výtěžek 28%) produktu 21 b. Na 11 mg (0,033 mmol) tohoto materiálu se 35 minut působí 4N roztokem kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Reakční směs se zahustí do sucha za vzniku hydrochloridové soli odpovídajícího aminu. Zmíněný hydrochloríd se sloučí s 33 mg (0,036 mmol) sloučeniny vzorce:

OCH^Ph

Ac-Asp(OBn)-D-Glu(OBn)-Ue-Val-N

C(O)OH připravené podle postupu příkladu 15 a 20, za použití 14 mg (0,036 mmol) HATU a 0,116 ml (0,02 mmol) DIPEA ve 4 ml dimetylformamidu.

Reakční směs se 16 hodin míchá, a pak se směs zahustí. Vytvořený zbytek se rozpustí v etylacetátu. Roztok se postupně promyje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, 10% vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a nasyceným roztokem chloridu sodného, suší se nad síranem horečnatým, filtruje se a zahustí ve vakuu za vzniku bílé pevné látky. V 6 ml etanolu se rozpustí přibližně 0,033 tohoto materiálu a na reakční směs se v atmosféře plynného vodíku působí 7 mg (0,09 mmol) octanu amonného a 10 mg 10% paladía na aktivním uhlí. Po 3 hodinách se reakční směs filtruje přes infusiorovou hlinku. Filtrát se zahustí dosucha. Zbytek se rozpustí v DMSO, čistí se preparativní HPLC a po lyofilizaci vznikne 17,6 mg bílé pevné látky s výtěžkem 57 % během dvou kroků.

Výsledky spektrální analýzy:

MS (FAB): ES-932,6 (M-H)-, 954,5 (M-Na)-.

'HNMR(DMSO-4₆): 5 8,90 (S, IH), 8,24 (d, J = 7,95Hz, IH), 8,14 (d, J = 7,63 Hz, IH), 7,99 (d, J = 8,26 Hz, IH), 7,79 (d, J = 8,9 Hz, IH), 7,75 (d, J = 8,26 Hz, IH), 7,42-7,17 (m, 10H), 5,00 (kvintet, J = 7,63 Hz, IH), 4,7 (m, IH), 4,52 (d, J = 11,76 Hz, IH), 4,43 (d, J = 11,4 Hz, IH), 4,33-4,2 (m, 6H), 3,70 (dd, J = 11,4 a 11,1 Hz, 2H), 2,63 (dd, J- 5,7 a 5,7 Hz, IH), 2,45 (dd, J = 7,95 a 7,95 Hz, IH), 2,21-2,11 (m, 3H), 2,07-1,97 (m, IH), 1,93-1,83 (m, 2H), 1,81 (s, 3H), 1,78-1,63 (m, 2H), 1,54-1,41 (m, 2H), 1,39 (d, J = 7,0Hz, 3H), 1,29 (dd, J - 7,94 a 7,63 Hz, IH), 1,15 (kvintet J = 7,0 Hz, IH), 1,05 (m, IH), 0,90 (d, J = 6,36 Hz, 6H), 0,88-0,83 (m, IH), 0,71 (m, 9H).

-53CZ 301405 B6

Příklad 22

Sloučenina 107 tabulky 1 se připraví podle postupu syntézy popsané v příkladě 17.

Přítomnost rotamerů podle NMR = 1:7,6.

Hmotnostní spektrometrie (FAB) m/z:675 (MH+).

U) 'H-NMR (DMSO-iU): δ 8,35-8,19 (bs, IH), 8,04 (d, J = 7,63Hz, IH), 7,93 (bd, J = 7,31 Hz, IH), 7,88 (d, J = 8,27 Hz, IH), 7,86-7,79 (m, 2H), 7,59-7,49 (m. 3H), 7,46 (dd, J = 7.95. 7,95 Hz, IH), 4,98 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 4,89 (d, J = 11,8 Hz, IH), 4,40-4.34 (m, IH), 4,32 (bs, I Η), 4,29-4,24 (m, IH), 4,22-4,15 (m, III), 4,09 (d, J = 11,8 Hz, IH), 3,74 (dd, J = 11,1,4 Hz, IH), 2,20-2,12 (m, IH), 2,05-1,94 (m, 2H), 1,84 (s,3H), 1,72-1,42 (m, 7H), 1,20-1,13 (m, IH),

1,08-0,87 (m, 13H), 0,85 (d, J = 6,68 Hz, 6H).

Příklad 23

Sloučenina 114 tabulky 1 se připraví podle postupu popsaného v příkladě 17.

Přítomnost rotamerů podle NMR (l :7,5).

Hmotnostní spektrometrie (FAB) m/z: 747 (M+Na+).

'H-NMR (DMSO~d₆): δ 8,40-8,24 (bs, IH), 8,07-8,01 (m, IH), 7,96-7,91 (m, IH), 7,87 (d J = 8,26 Hz, IH), 7,85-7,78 (m, 2H), 7,58-7,49 (m, 3H), 7,46 (dd, J = 7,95, 7,95 Hz, IH), 7,30-7,21 (m, 4H), 7,20-7,14 (m, IH), 4,98 (d, J = 11,8 Hz, IH), 4,89 (d, J- 11,8 Hz, IH), 4,40-4,34 (m, IH), 4,34-4,29 (m, IH), 4,29-4,25 (m, IH), 4,22-4,15 (m, IH), 4,09 (d, J-11,8 Hz, IH), 3,74 (dd, J = 11,1, 4 Hz, IH), 2,95-2,79 (m, 2H), 2,21-2,11 (m, IH), 2,05-1,94 (m, 2H), 1,89-1,83 (dvakrát s, 3H), 1,63-1,41 (m, 7H), 1,38-1,30 (m, IH), 1,27-1,22 (m, IH), 1,12-0,94 (m, 5H), 0,89 (d, J = 6,4 Hz, 3H), 0,84 (d, J = 6,4 Hz, 3H).

Příklad 24

Sloučenina 118 tabulky 1 se připraví podle postupu popsaného v příkladě 17.

Přítomnost rotamerů podle NMR přibližně (1:6,3).

Hmotnostní spektrometrie (FAB) m/z: 677,4 (MH+).

'H-NMR (DMSO-d_ft): 8 8,58 a 8,38 (dvakrát bs, IH), 8,04 (d, J = 7,63Hz, IH), 7,93 (d, J = 7,63Hz, IH), 7,91-7,81 (m, 3H), 7,59-7,49 (m, 3H), 7,49-7,43 (m, IH), 4,98 (d, J = 12, 1Hz,

IH), 4,89 (d, J = 12, 1Hz, IH), 4,4W,29 (m, 2H), 4,29-4,14 (m, 2H), 4,1 (d, J= 10,8 Hz, IH), 3,74 (bd, J = 7,63Hz, IH), 2,21-2,12 (m, IH), 2,04-1,92 (m, 2H), 1,90 a 1,84 (dvakrát s, 3H), 1,63-1,41 (m, 9H), 1,39-1,26 (m, 3H), 1,21-1,15 (m, IH), 1,06-0,92 (m, 5H), 0,92-0,80 (m, 9H).

-54CZ 301405 B6

Příklad 25

Sloučenina 116 tabulky 1 se připraví podle postupu popsaného v příkladě 17.

IHNMR(DMSOcU): δ 8,36 (s, IH), 8,14 (d, J = 8 Hz, IH), 8,04 (d, J = 8 Hz, IH), 7,99 (d, J = 9 Hz, IH), 7,79 (d, J = 9 Hz, IH), 7,33-7,26 (m, 5H), 4,54-4,42 (m, 3H), 4,3(M,21 (m, 5H), 4,06 (d, J - 11 Hz, IH), 3,69 (dd, J = Hz, IH), 2,62 (dd, J = 16,10 Hz, IH), 2,47-2,42 (m, IH), 2,18-2,14 (m, 3H), 2,02-1,87 (m, 2H), 1,82 (s, 3H), 1,74-1,66 (m, 2H), 1,54-1,47 (m, 2H), io 1,38-1,27 (m, 2H), 1,21-1,18 (m, IH), 0,97-0,85 (m, 1 IH), 0,80-0,70 (m, 7H).

Příklad 26

Sloučenin 121 tabulky 1 se připraví podle postupu popsaného v příkladě 17.

IHNMR(DMSO-dft): δ9,12 (d, J = 6Hz, IH), 8,64 (s, IH), 8,30 (d, J = 8Hz, IH), 8,12 (d, J = 9 Hz, IH), 8,05 (dd, J - 8,7 Hz, IH), 7,97 (d, J = 8 Hz, IH), 7,80 (dd, J = 8, 7 Hz, IH), 7,66 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,54 (d, J = 6 Hz, 1H), 5,70-5,61 (m, 2H), 5,26 (d, J = 17 Hz, 1H), 5,07 (d,

J- 12Hz, IH), 4,52 (d, J = 12Hz, IH), 4,39 (dd, J - 9,8 Hz, IH), 4,23^1,12 (τη, 2H), 4,03-3,99 (m, IH), 2,66-2,54 (m, IH), 2,35-2,28 (m, IH), 2,08 (dd, J = 9,17 Hz, IH), 2,01-1,93 (m, IH), 1,83 (s, 3H), 1,65-1,46 (m, 5H), 1,41-1,38 (m, IH), 1,24-1,20 (dd, J = 9,5 Hz, IH), 1,05-0,78 (m, 12H).

Příklad 27

Sloučenina 205 tabulky 2 se připraví podle postupu popsaného v příkladě 17.

l H NMR (DMSO-Λ): δ 9,14 (d, J = 6 Hz, 1H), 8,60 (s, 1H), 8,32 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,14-8,06 (m, 2H), 7,98 (d, J - 8 Hz, IH), 7,82 (dd, J = 8,7 Hz, IH), 7,66 (d, J = 9 Hz, IH), 7,55 (d, J = 8 Hz, IH), 5,75-5,66 (m, 2H), 5,22 (d, J = 17 Hz, IH), 5,07 (d, J = 10Hz, IH), 4,50 (d, J = 12Hz, IH), 4,39 (dd, J = 9,9 Hz, IH), 4,23-4,08 (m, 3H), 2,56-2,50 (m, IH), 2,36-2,28 (m, IH), 2,041,97 (m, IH), 1,82 (s, 3H), 1,62-1,41 (tn, 7H), 1,24 (dd, J = 5,4 Hz, IH), 0,94-0,75 (m, 12H).

Příklad 28

Sloučenina 117 tabulky 1 se připraví podle postupu popsaného v příkladě 20.

1HNMR(DMSO-Λ): δ 8,36 (s, IH), 8,17 (d, J = 8 Hz, IH), 8,09 (d, J = 8 Hz, IH), 8,04 (d, J = 8 Hz, IH), 7,96-7,92 (m, 2H), 7,87 (d, J = 8 Hz, IH), 7,77 (d, J = 9 Hz, IH), 7,56-7,45 (m, 4H), 4,99 (d, J = 12Hz, IH), 4,89 (d, J = 12Hz, IH), 4,52 (dd, J = 14, 7 Hz, IH), 4,37—4,12 (m, 6H), 3,78-3,73 (m, IH), 2,63 (dd, J - 17, 6 Hz, IH), 2,47-2,42 (m, IH), 2,22-2,16 (m, 3H), 2,04-1,86 (m, 2H), 1,82 (s,3H), 1,77-1,71 (m, IH), 1,69-1,42 (m, 8H), 1,30 (kvintet, J = 8 Hz, IH), 1,20 (dd, J= 12,8 Hz, IH), 1,10-0,85 (m, 15H), 0,76-0,72 (m, IH).

Příklad 29

Sloučenina 120 tabulky 1 se připraví podle postupu popsaného v příkladě 20.

1H NMR(DMSO-d₆): 3 8,34 (s, IH), 8,12 (d, J = 8 Hz, IH), 8,05 (d, J = 8 Hz, IH), 7,95-7,87 (m, 3H), 7,81 (d, J = 9 Hz, IH), 7,64-7,52 (m, 4H), 7,46 (dd, J = 8,7 Hz, IH), 4,99 (d, J = 12Hz,

IH), 4,89 (d, J = 12Hz, IH), 4,63 (dd, J = 14,7 Hz, IH), 4,37-4,14 (m, 4 H), 3,74 (dd, J - 11,

-554 Hz, IH), 3,41-3,35 (m, 2H), 2,61 (dd, J = 16, 7 Hz, IH), 2,44 (dd, J = 16,8 Hz, IH), 2,20-2,15 (m, IH), 2,04-1,96 (m, 3H), 1,82 (s, 3H), 1,70-1,64 (m, IH), 1,56-1,43 (m, 7H), 1,30 (kvintet,

J = 8Hz, IH), 1,20 (dd, J = 8,5 Hz, IH), 0,99-0,72 (m, 21H).

Cl 301405 B6

Příklad 30

Klonování, exprese a čištění rekombinantní proteázy NS3 viru HCV typu lb.

io Sérum virem HCV infikovaného pacienta se získá širší spoluprácí vědeckých týmů (Bernard Willems MD, Hópital St-Tuc, Montreal, Kanada a Dr. Donald Murfy, Laboratoire de Santé Publique du Québec, Ste-Anne de Bellevue, Canada), Metodami genového inženýrství se získá kopie HCV genomu, resp. cDNA v celé délce, která se získá reverzní transkripcí-polymerázovou řetězovou reakcí (RT-PCR) sérové RNA za použití specifických primerů vybraných na základě homologie mezi ostatními liniemi genotypu lb. Tento HCV izolát byl zařazen do genotypové skupiny lb (Simmonds a spol., J. Clin, Microbiol., (1993), 31, str. 1 493-1 503) na základě stanovení jeho kompletní genomické sekvence. Sekvence aminokyselin nestrukturální oblasti NS2-NS4B se ukázala z více než 93 % identická s HCV genotypem lb (BK, JK a 483 izolantů) a z (88 % identická s HCV genotypem la (HCV1 izolát). DNA fragment kódující polyproteinový prekurzor (NS3/NS4A/NS4B/NS5A/NS5B) se vyrobí pomocí PCR a zavede se do eukaryotního expresního vektoru. Po přechodné transfekci se zpracování polyproteinu zprostředkované proteázou NS3 viru HCV projeví při Western blot analýze přítomností kompletního funkčního NS3 proteinu. Tento NS3 protein se neprojevil expresí polyproteinového prekurzoru s mutací S1165A, která inaktívuje NS3 proteázu, čímž se potvrzuje funkční schopnost proteázy NS3 viru HCV.

DNA fragment kódující rekombinantní proteázu NS3 viru HCV (aminokyseliny 1027 až 1206) se klonuje v bakteriálním expresním vektoru pETl ld. Exprese NS3 proteázy v E. coli BL21 (DE3) pLysS se navodí 3 hodinovou inkubací 1 mM roztokem ÍPTG při teplotě 22 °C. Fermentací (18 I) vznikne přibližně lOOg vlhké buněčné pasty. Buňky se znovu uvedou do suspenze v 3,0 ml/g lyzátového pufru obsahujícího 25 mM roztoku fosfátu sodného o pH 7,5, 10% objemových glycerolu, 1 mM roztoku EDTA a 0,01 % NP-40 a uskladní se při teplotě -80 °C. Buňky se rozmrazí a homogenizují s následným přidáním 5 mM roztoku DTT, Přidá se chlorid hořečnatý a DNáza do konečné koncentrace homogenátu 20 mM a 20 pg/ml. Po 25 minutách inkubace při teplotě 4 °C se homogenát zpracuje působením ultrazvuku a centrifuguje se 30 minut při

15 OOOxg při teplotě 4 °C. Hodnota pH supematantu se pak upraví na 6,5 za použití 1 M roztoku fosfátu sodného,

K postupu čištění ve dvou krocích popsanému ve zveřejněné přihlášce WO 95/22985 se přidá ještě gelová filtrace. Supernatant z bakteriálního extraktu se vstříkne na sorbent kolony SP

HiTrap (Pharmacia), který se předem ekvilibruje v pufru A o rychlosti průtoku 2 ml/mín (50 mM roztoku fosfátu sodného o pH 6,5, 10% glycerol, 1 mM roztoku EDTA, 5 mM roztoku DTT, 0,01 % NP-40). Kolona se promyje pufrem A obsahujícím 0,15 M roztoku chloridu sodného a proteáza se eluuje deseti objemy kolony lineárním gradientem od 0,15 do 0,3M roztoku chloridu sodného. Podíly obsahující NS3 proteázu se spojí a zředí do konečné koncentrace 0,1 M chloridu sodného. Enzym se dále čistí na koloně HiTrap Heparin (Pharmacia), jejíž sorbent se ekvilibruje pufrem B (25 mM roztoku fosfátu sodného o pH 7,5, 10% glycerol, 5 mM roztoku DTT, 0,01 % NP-40). Vzorek nastřikuje při průtokové rychlosti 3 ml/min. Kolona se pak promyje pufrem B obsahujícím 0,15 M roztoku chloridu sodného průtokovou rychlostí 1,5 ml/min. Promytí se provede ve dvou krocích za přítomnosti pufru B obsahujícího 0,3 nebo 1 M roztoku chloridu sodného. Proteáza se promyje 0,3M roztokem chloridu sodného, trojnásobně se zředí pufrem B, a znovu se umístí na kolonu HiTrap Heparin při eluci pufrem B obsahujícím 0,4 M roztoku chloridu sodného. Podíly obsahující NS3 proteázu se umístí na kolonu Superdex 75 HiLoad 16/60 (Pharmacia) ekvilibrované pufrem s obsahujícím 0,3 M roztoku chloridu sodného. Podle SDS-PAGE a následnou denzitometrickou analýzou je čistota proteázy NS3 viru

HCV získané ze spojených podílů vyšší než 95 %.

-56CZ 301405 B6

Enzym se uskladní při teplotě -80 °C, a před použitím se rozmrazí na ledu a zředí.

Příklad 31

Radiometrické hodnocení působení komplexu rekombinantní proteázy NS3 viru HCV a NS4A peptidového kofaktoru io Enzym se klonuje, exprimuje a připraví podle postupu popsaného v příkladě 30. Enzym se uskladní při teplotě -80 °C, rozmrazí se na ledu a před zkouškou se zředí pufrem pro zkoušku obsahujícím peptidový NS4A kofaktor. Mezi cysteinovými a serinovými zbytky se enzymaticky štěpí substrát pro radiometrickou zkoušku DDIVPC-SMSYTW. Sekvence DDIVPC-SMSYTW odpovídá přirozenému místu štěpení NS5A/NS5B, kde cysteinový zbytek v segmentu P2 se nahradil prolinem. Peptidový substrát ODIVPC-SMSYTW a indikátor biotin-DDIVPCSMS[^l25I-Y]TW se inkubují s rekombinantní NS3 proteázou a NS4A peptidovým kofaktorem KKGSWIVGRIILSGRK (molámí poměr enzym : kofaktor = 1:100) bez nebo s použitím inhibitorů. Oddělení substrátu z produktu se provede přidáním kuliček avidinem obalené agarózy, a následně filtrací. Z množství SMS[^l25I-Y]TW produktu ve filtrátu lze vypočítat přeměnu substrátu v procentech a procenta inhibice.

A. Činidla

Tris a Tri$-HCl (UltraPure) vyrábí firma Gibco-BRL. Glycerol (UltraPure), MES a BSA vyrábí firma Sigma. TCEP lze získat od firmy Pierce, DMSO z Aldrich a hydroxid sodný z Anachemia.

Pufr pro zkoušku:50 mM roztok Tris HCl o pH 7,5, 30% hmotnostně/objemová glycerolu, mg/ml BSA, l mM roztoku TCEP (TCEP se přidá před použitím z l M zásobního roztoku ve vodě).

Substrát: DDIVPCSMSYTW, konečná koncentrace 25 μΜ (k zabránění oxidace se používá z 2 mM zásobního roztoku v DMSO uskladněného při teplotě -20 °C).

Indikátor: redukovaný monojodovaný substrát biotin DDIVPC SMS[¹²³I-Y]TW o výsledné koncentraci přibližně 1 nM.

Proteáza NS3 viru HCV typu lb o konečné koncentraci 25 nM (ze zásobního roztoku 50 mM fosfátu sodného o pH 7,5, 10% glycerolu, 300 mM roztoku chloridu sodného, 5 mM DTT, 0,01 %NP40).

Peptidový NS4A kofaktor: KKGSWIVGRIILSGRK, konečná koncentrace roztoku 2,5 μΜ (ze mM zásobního roztoku v DMSO uskladněného při teplotě -20 °C).

B. Protokol postupu

Zkouška se provede na polypropylenové plotně s 96 prohlubněmi firmy Costar. Každá prohlubeň obsahuje:

μΙ substrátu / indikátoru v pufru pro zkoušku

10 μΐ ± inhibitoru v 20% roztoku DMSO / pufru pro zkoušku μΐ NS3 proteázy typu 1 b / NS4 peptidový kofaktor (molámí poměr =1:100).

Slepý vzorek (žádný inhibitor a žádný enzym) a kontrolní vzorek (žádný inhibitor) se také připraví na stejné plotně zkoušky.

-57CZ 301405 B6

Enzymatická reakce se zahájí přidáním roztoku komplexu enzymu a NS4A peptidů a zkoumaná směs se 40 minut inkubuje při teplotě 23 °C při mírné agitaci. K ukončení enzymatické reakce se přidá 10 μΐ 0,5N roztoku hydroxidu sodného a 10 μΙ 1 M roztoku MES o pH 5,8.

Na filtrační desku Millipore MADP N65 se přidá 20 μΐ kuliček avidinem obalené agarózy (Pierce). Po ukončení enzymatické reakce se zkoumaná směs přenese na filtrační desku a při mírné agitaci se inkubuje 60 minut při teplotě 23 °C.

ío Desky se filtrují za použití filtračního zařízení Millipore MultiScreen Vacuum Manifold Filtration. Na neprůhlednou desku s 96 prohlubněmi obsahující 60 μΙ scintilačního kokteilu v každé prohlubni se přenese 40 μΙ filtrátu.

Radioaktivita filtrátu se měří na zařízení TopCount firmy Packard s použitím protokolu pro ^l25I15 kapalina za 1 minutu.

Procenta inhibice se vypočítají podle následující rovnice: 100-[(počet_intl-počet_si_ep)/(počet_kontr-počet_siep) X 100]

Výsledky experimentu s různými koncentracemi inhibitoru byly proloženy nelineární křivkou na základě Hillova modelu a byla určena IC₅o (koncentrace vedoucí k 50% inhibici) za použití SAS softwarového programu (Statistical Software System, SAS Institute, lne. Cary, N. C.).

Příklad 32

Sledování aktivity NS3-NS4A heterod i měrového proteinu (o celé délce)

Nekódující segment NS2-NS5B-3' se klonuje pomocí RT-PCR ve vektoru pCR®3 (Invitrogen) za použití RNA extrahované ze séra infikovaného jedince virem HCV genotypem lb (poskytnutého Dr. Bernardem Willemsem, Hópital St-Luc, Montreal, Québec, Canada). DNA oblast NS3NS4A se nejprve klonuje pomocí PCR ve vektoru exprese baculoviru pFastBac™HTa (Gibco/BRL). Vektorová sekvence obsahuje oblast kódující 28-zbytek N-terminální sekvenci o 28 zbytcích se značkou z 6 histidinů. Systém exprese baculoviru Bac-to-Bac™ (Gibco/BRL) se použije k přípravě rekombinantního baculoviru. Heterodimerový zralý protein NS3 a NS4A o plné délce (His-NS3-NS4AFL) se exprimuje 0,1-0,2 násobnou infekcí 10⁶ Sf21 buněk/ml rekombinantním baculovirem při teplotě 27 °C. Infikovaná kultura buněk se sklidí po 48 až 64 hodinách odstředěním při teplotě 4 °C.

Buněčná peleta se homogenizuje v 50 mM roztoku NaPO₄ o pH 7,5, 40 % hmotnostně objemových glycerolu a 2 mM roztoku β-merkaptoetanolu za přítomnosti směsi proteázových inhibitorů. His-NS3-NS4AFL se z buněčného lyzátu extrahuje za použití l,5%NP-40, 0,5% TritonXI00, 0,5M chloridu sodného a DNázy. Po odstředění ultracentrifugou se rozpustný extrakt čtyř45 násobně zředí a absorbuje na chelatační kolonu Pharmacia Hi-Trap Ni- kde se HÍS-NS3NS4AFL eluuje ve více než 90% formě (podle SDS-PAGE) gradientem 50 až 400 mM roztoku imidazolu. Tento produkt, His-NS3-NS4AFL se uskladní při teplotě -80 °C v 50 mM roztoku fosfátu sodného o pH 7,5, 10% (hmotnostně/objemových) glycerolu, 0,5 M roztoku chloridu sodného, 0,25 M roztoku imidazolu, 0,1 % NP-40. Produkt se před použitím rozmrazí na ledu a zředí.

Aktivita proteázy His-NS3-NS4AFL se sleduje v 50 mM roztoku Tris-HCl o pH 8,0, 0,25 M roztoku citrátu sodného, 0,01 % (hmotnostně/objemových) n-dodecyl-p-D-maltosidu a 1 mM roztoku TCEP. Roztok 1,5 nM His-NS3-NS4AFL se 45 minut inkubuje při teplotě 23 °C s 5 μΜ roztokem vnitřně zhašeného substrátu antranilyl-DDÍVPAbu[C(O)-O]-AMY(3-NO2)TW-OH

-58CZ 301405 B6 za přítomnosti různých koncentrací inhibitoru. Konečná koncentrace DMSO nepřesáhla 5,25%.

Reakce se ukončí přidáním 1 M roztoku MES o pH 5,8. Fluorescence N-terminálu produktu se odečítá florimetrem Perkin-Elmer LS-50B vybaveném čtečkou plotny s 96 prohlubněmi (vlnová délka excitačního záření: 325 nm, vlnová délka emisního záření: 423 nm). Výsledky experimentu s různými koncentracemi inhibitoru byly proloženy nelineární křivkou na základě Hillova modelu a byla určena IC₅₀ (koncentrace vedoucí k 50% inhibici) za použití SAS softwarového programu (Statistical Software System, SAS Institute, lne. Cary, N. C.).

io Příklad 33

Sledování účinku NS3 proteázy v buňkách

Sledování se provede na linii lidských buněk získaných z hepatomu označovaných jako Huh—7.

Do buněk byly současně transfekcí zavedeny 2 DNA systémy:

1. systém exprimující polyprotein obsahující nestrukturální proteiny viru HCV ve fúzi stTA v následujícím poradí:NS3-NS4A-NS4B-NS5A-tTA (označovaný jako NS3),

2. systém exprimující reporterový protein, sekreční alkalickou fosfatázu, pod kontrolou tTA (označovaný jako SEAP).

K uvolnění dokonalých proteinů se polyprotein musí štěpit NS3 proteázou. Po uvolnění zralých proteinů se předpokládá, že virové proteiny vytvoří komplex na membráně endoplazmatického retikula, zatímco tTA migruje do jádra a změní aktivitu SEAP genu. Z toho vyplývá, že by snížení NS3 proteolytické aktivity mělo vést ke snížení hladiny zralého tTA a k průvodnímu snížení SEAP aktivity.

Ke kontrole ostatních účinků sloučenin se provede paralelní transfekce, kde se systém exprimu30 jící samotný tTA (označovaný tTA) současně transfektuje systémem SEAP tak, aby aktivita SEAP byla nezávislá na NS3 proteolytické aktivitě.

Protokol postupu zkoušky:

Buňky Huh-7 se pěstují na CHO-SFMII + 10% FCS (fetální telecí sérum), transfektují se bud’ NS3 a SEAP nebo tTA a SEAP za použití protokolu FuGen (Boehringer Mannheim). Po 5 hodinách při teplotě 37 °C se buňky promyjí, natráví trypsinem se a umístí na plotnu s 96 prohlubněmi (80 000 buněk / prohlubeň) obsahující různé koncentrace zkoumaných sloučenin. Po 24 hodinách inkubace se podíl živného prostředí oddělí a aktivita SEAP v tomto podílu se měří pomocí kitu Phosfa-Light (Tropix).

Výpočet procent inhibice SEAP aktivity v závislosti na koncentraci sloučeniny se provede SAS softwarovým programem, kteiým se vypočítá hodnota EC₅₀.

Toxický účinek sloučeniny (TC₅₀) se následně hodnotí zkouškou MTT: 20 μΐ MTT roztoku (5 mg/ml živného prostředí) se přidá do každé prohlubně a 4 hodiny se inkubuje při teplotě 37 °C, živné prostředí se odstraní a přidá se 50 μΐ 0,01 N roztoku kyseliny chlorovodíkové + 10% Triton X-100. Směs se protřepává nejméně 1 hodinu při teplotě místnosti, absorbance každé prohlubně se odečítá při vlnové délce 595 nm.

Hodnota TC₅₀ se vypočítá podle stejného postupu jako při výpočtu EC₅o>

-59CZ 301405 B6

Příklad 34

Stanovení specifíty sloučenin

Specifíta zkoumaných sloučenin se stanoví porovnáním jejich účinku na několik proteáz: lidskou leukocytámí elastázu, prasečí pankreatickou e las tážu a hovězí pankreatický α-chymotrypsin a na jednu cysteinovou proteázou: lidský jatemí katepsin B. Ve všech případech se použije postup s plotnou s 96 prohlubněmi za použití kolorimetrického p-nitroanilinového (pNA) substrátu ío specifického pro každý enzym. Každá série se předem inkubuje 1 hodinu s inhibitorem enzymu při teplotě 30 °C, a následně se přidá substrát. Hydrolýza se sleduje do 30% konverze čtečkou mikroploten UV Thermomax®. Koncentrace substrátu se udržuje na nejnižší možné hodnotě vzhledem k Km k zamezení kompetice se substrátem. Koncentrace sloučenin se pohybuje od 300 do 0,06 μΜ v závislosti na jejich účinnosti.

Podmínky každé zkoušky:

mM Tris-HCI o pH 8, 0,5 M síranu sodného, 50 mM chloridu sodného, 0,1 mM EDTA, 3% DMSO, 0,01 % Tween-20 s, [100μΜ Succ-AAPF-pNA a 250 pM a-chymotiypsin], [133 μΜ Succ-AAA-pNA a 8 nM prasečí elastázy], [133 μΜ Succ-AAV-pNA a 8 nM leukocytámí elastázy], nebo [100 mM hydrogenfosforečnanu sodného o pH 6, 0,1 mM EDTA, 3% DMSO, 1 mM TCEP, 25 0,01 % Tween-20, 30 μΜ Z-FR-pNA a 5 nM katepsin B (enzym v zásobním roztoku se před použitím aktivuje v pufru obsahujícím 20 mm TCEP)].

Znázorňující příklad užití prasečí pankreatické elastázy:

Na polystyrénovou plotnu s plochým dnem a s 96 prohlubněmi se za použití pipetovacího automatu Biomek (Seckman) přidá:

μΐ pufru pro zkoušku (50 mM Tris-HCI o pH 8, 50 mM chloridu sodného, 0,1 mM EDTA),

20 μΐ roztoku enzymu (50 mM Tris-HCI o pH 8, 50 mM chloridu sodného, 0,1 mM EDTA,

0,02% Tween-20, 40 nM prasečí pankreatické elastázy) a μΙ roztoku inhibitoru (50 mM Tris-HCI o pH 8, 50 mM chloridu sodného, 0,1 mM EDTA, 0,02% Tween-20, 1,5 mM - 0,3 μΜ inhibitoru, 15 % objemových DMSO),

Po 60 minutách předběžné inkubace při teplotě 30 °C se do každé prohlubně přidá 20 μΐ roztoku substrátu (50 mM Tris/HCl o pH 8, 0,5 M síranu sodného, 50 mM chloridu sodného, OJ mM EDTA, 665 μΜ Succ-AAA-pNA) a reakční směs se dále inkubuje 60 minut při teplotě 30 °C. Hodnota absorbance se odečítá na čtečkou destiček UV Thermomax®. Na několik řad prohlubní se umístí kontrolní vzorky (bez inhibitoru) a slepé vzorky (bez inhibitoru a bez enzymu).

Následné dvojnásobné zředění roztoku inhibitoru se provede na separované plotně pipetovacím automatem za použití 50 mM Tris-HCI o pH 8, 50 mM chloridu sodného, OJ mM EDTA, 0,02% Tween-20, 15% DMSO. Všechny ostatní stanovení specifíty se provedou obdobným způsobem.

Procenta inhibice se vypočítají za použití rovnice:

[ 1—{(U V_inh—U V_slep) / (UV_kontr-UV_slep))] X 100

-60CZ 301405 B6

Výsledky experimentu s různými koncentracemi inhibitoru byly proloženy nelineární křivkou na základě Hillova modelu a byla určena IC_i0 (koncentrace vedoucí k 50% inhíbici) za použití SAS softwarového programu (Statistical Software System, SAS Institute, lne. Cary, N. C.).

Tabulky sloučenin

Sloučeniny podle současného vynálezu se podrobily stanovením podle příkladů 31 a 32. Míra jejich účinku byla rozdělena do skupin podle hodnoty IC₅o:

io skupina A-hodnota IC nižší než 50 μΜ, skupina B-hodnota 1C nižší než 5 μΜ, skupina C-hodnota IC nižší než 0,5 μΜ.

Aktivita v buňkách a specifita zkoumaných sloučenin:

Reprezentativní sloučeniny podle současného vynálezu se sledují zkouškou podle příkladu 33 a jednou nebo více zkouškami příkladu 34. Například sloučenina 233 tabulky 2 má podle zkoušky příkladu 32 hodnotu 1C_5O = 1 nM. Hodnota EC₅o - 5,4 μΜ se určí zkouškou podle příkladu 33, přičemž ostatní účinky (tTA) nebyly při koncentracích do 120 μΜ detekovatelné. Podle MTT zkoušky je hodnota TC₅₀ sloučeniny 233 vyšší než 120 μΜ, což znamená, že sloučenina není při své účinné koncentraci toxická. Stanovením specifíty podle v příkladu 34 se získají následující hodnoty pro uvedenou sloučeninu: HLE > 75 μΜ, PPE > 75 μΜ, α-chym, > 75 μΜ, kat.B > 75 μΜ.

Uvedené výsledky potvrzují, že tato skupina sloučenin je vysoce specifická pro NS3 proteázu. Seznam uvedený v tabulkách znázorňuje vlastnosti sloučenin podle současného vynálezu.

Použité zkratky:

MS výsledky hmotnostní spektrometrie,

Ac acetyl,

Bn benzyl,

Chg cyklohexy lglycin-(2-amino-2-cyklohexyloctová kyselina),

Dni dansyl,

O-Bn benzyloxy,

Pip pipekolová kyselina Tbg terc-butylglycin.

-61 CZ 301405 B6

Tabulka 1

P5

R.

. R, · O; R ·

Tab.l slopfc	B	P6	P5	P4	P3	Ri	Ri	PÍ Ci-Ci	MS (MH’)	rozsah^ aktivity 1
101	Ac	—	—	Chg	Val	OBn	Et	1fí,2R	613.4	A
102	Ac	—	—	Chg	Val	OBn	Et	JR. 2?	613.4	A
103	Ac	—		Chg	Chg	l-NpCH:O	Et	IR, 2?	703	B
104	Ac	—		Chg	Chg	l-NpCH^O	Et	1R.2R	703.4	B
105	Ac			Chg	Chg	bNpCHsO	Et	JS.2S	703.5	B
106	Ac	—	—	Chg	Val	l-NpCHnO	Me	JR. 2?	649.5	A
107	Ac	·*·		Chg	Val	l-NpCHjO	CHMe,	JRr 2?	M+Na 699	B
108	Ac	Asp	D-Glu	Chg	Chg	I-NpCHiO	Et	JR, 2R	947.4	C
109	Ac			Chg	Val	l-NpCH2O	CHiO CHiPh	JR, 2?	M+Na 777.4	A
no	Ac			Chg	Val	1-NpCHjO	čh,och2 Ph	IR, 2?	M+Na 777,4	A
111	Ac	—		Chg	Val	1-ŇpCHjO	(CHjhPh	IR. 2?	M+Na 761	A
112	Ac	•™		Chg	Val	1-NpCHjO	Et	JR.2R	M+Na 685	B
113	Ac			Chg	Val	1-NpCHjO	Et	1S.2S	Μ+Ν» 683	A
114	Ac			Chg	Val	l-NpCH2O	Bn	JR, 2?	M+Na 747	A
115	Ac	—	—	Chg	Val	l-NpCH?O	Bn	IR, 2?	M+Na	A

-62CZ 301405 B6

Tab.l sljuč,	B	P6	P5	P4	P3	R>	Ri	PÍ Q-Ci	MS (MH*)·	rozsah aktivity
									747
116	Ac	Asp	O-Glu	Ile	Val	OBn	Et	1R.2R		C
117	Ac	Asp	D-Glu	Chg	Val	l-NpCHjO	Et	JR,2R	M+Na 929.4	C
118	Ac	—	—	Chg	Val	1-NpCHjO	Pr	IR. 2?	677,4	B
119	Ac	—	—	Chg	Val	l-NpCHjO	Pr	IR, 2?	677.4	A
120	Ac	Asp	D-Val	Chg	Val	l-NpCH2O	Et	1R,2R	M+Na 899-5	C
121	Ac			Chg	Val	cp	vinyl	1S.2R	648.3	B
122	Ác			Chg	Val		ethyl	1R,2S	726.6	C
123	AC			Chg	Val	^ςο	propyl	IR, 2R	7403	C

-63CZ 301405 B6

Tabulka 2

Ρβ

P5

Tab 2 SlOUČ^	P6	PS	P4	P3	r2	Ri	MS (MH*)	rozsah aktivity
201	—	-.	Chg	Val	OBn	ch=ch3	611.3	B
202	—	***	Chg	Chg	l-NpCH2O	ch=ch3	701.3	C
203	—	***	Chg	Val	l-NpCH?O	ch=ch2	661.1	C
204	—		Chg	Val	OBn	ČHssCHBr*	687.4	B
205			Chg	Val	0 \	CH^CH?	648.4	C
206			Chg	Val	Ho	CH=CH3	724.4	C
207			Chg	Tbg	H^o	CH=CH?	738.4	c
208			Chg	Val	Ho' \	ch=ch2	7583	c
209			Chg	Val	Hco	CH=CHj	754.5	c

-64CZ 301405 B6

Tab l sloučí	P6	P5	P4	P3	Ri	Ri	MS (Mm	rozsah aktivity
210			Chg	Val		ch=ch2	754.3	C
211			Chg	Val	Yó	ch=ch2	754.3	C
212	Asp	D-Glu	Chg	Val		CH=CHj	968.4	c
213			Chg	Val		CH=CH2	7193	B
214			Chg	Val		ethyl	726.4	C
215			. Val	Chg	cp	CH=CH,	6483	C
216			Chg	Val		CH=CH2	781.6	€
217			Chg	Val	γ	CHsCHi	690.6	B

-65CZ 301405 Bó

Tab 2 sloučí	P6	P5	P4	P3	Ri	Rl	MS (MW)	rozsah aktivity
218			Chg	Val		CH=CH2	776.4	C
219			Chg	Val	N— N Q í-My-jQ 0 \	ch=ch2	7593	C
220			Chg	Val	Μςο	CH=CHi	7953	c
221			Chg	Val	Ο-Υφ \	CH=CH2	7963	c
222	Asp	D-Glu	Chg	Tbg		ch=ch2	982.4	c
223			Chg	Val		ch=ch2	8253	c
224			Chg	Tbg	/ o	CH=CHi	7983	c

-66CZ 301405 B6

Tab 2 slouč. č.	F6	PS	P4	P3	Rj	Ř|	MS (MÍT)	roaah aktivity
225			Chg	Val		CH=CHj	784.2	c
226			Chg	Val	°\	ch=ch2	7512	c
227			Chg	Val	9 Νγ^Ν	ch=ch2	715.4	3
228			Chg	Tbg	/°	ch=ch2	692.2	C
229			Chg	Val	kX+o 0 1 \	ch=ch2	743.2	C
230			Chg	Val	,N'N	ch*ch2	716.3	C
231			Chg	Tbg	ςσ°	CH=CHr	738.3	C

-67CZ 30140S B6

Tah 2 slouč. č.	P6	P5	P4	P3	Rz	Ri	MS (Mm	rozsah aktivity
232			Chg	Tbg	Οφ-γγ	CH=CH?	796.4	C
233			Chg	Tbg	J \J-°/ fy	CH=CH?	768.3	c
234			Chg	Tbg		CH=CH2	739.4	c
235			Chg	Val	|Fl cVyS °\	vinyl	782.2	G
236	Asp	D-Glu	ne	Val	O-Bn	vinyl	829.3	C
237			Chg	Val	ΑνΑ^|ΑνΧ.	vinyl	768.4	B
238	Asp	D-Glu	Chg	Tbg		vinyl	1012.6	C

*Br poměr izomerů 5,5:2

-68CZ 301405 B6

Tabulka 3

TabJ slouč. č.	B	P6	P5	P4	P3	Ri	Ri	W	MS (M-H)	rozsah áktivity
301	Ac	ASp	D-Glu	fle	Val	OBn	El	NH-íS> CHMePh	932.6	C
302	Dni	ASp	D-Glu	Chg	Tbg		vinyl	OH	1203.5	C

Tabulka 4

Tab 4 slouč. 'č.	B	Y	P4	P3	Ri	Ri	MS (MH*)	rozsah aktivity
401	Ac	Me	Chg	Tbg		vinyl	782.3	C

-69CZ 301405 B6

Tabulka 5

-70CZ 301405 B6

Tab 5 sloue.	B		MS	rozsah > aktivity
507	“XOr o		871.4	C
508	co...r II 0	°\	855.4	C
509	H		726.7	c
510	OCv o	/°	901.7	c
511	Dni		959,4	c

-71 CZ 301405 B6

Claims (22)

1. 5 1. Sloučenina obecného vzorce I, včetně racemátů, diastereoizomerů a optických izomerů:

   P6 P5 P4 P3 P2 Pí

   PATENTOVÉ NÁROKY kde io a je 0 nebo 1, b je 0 nebo 1,

   Y je atom vodíku nebo C_{t 6}alkyl,

   B je atom vodíku, acylový derivát vzorce R₇-C(O)- nebo sulfonyl vzorce R₇-SO₂, kde

   R₇ je i) Cj-ioalkyl, popřípadě substituovaný karboxy lem, Ci ₆alkanoyloxyskupinou nebo C| „alkoxyskupinou, i i) C₃_₇cykloalkyl, popřípadě substituovaný karboxy lem, (Ci_₆alkoxy)karbony lovou skupinou

   20 nebo fenylmethoxykarbonylovou skupinou, iii) C₆ nebo Cio-aryl nebo C₇_i₆aralkyl, popřípadě substituovaný C|_6alkylem, hydroxyskupinou nebo aminoskupinou, popřípadě substituovanou C_!óalky lovou skupinou,

   25 i v) heterocyklus Het, popřípadě substituovaný C ^alkylem, hydroxyskupinou nebo aminoskupinou, popřípadě substituovanou C i_₆alkylovou skupinou nebo amidoskupinou, popřípadě substituovanou C, „alkylovou skupinou,

   R₆ je C_l_₆alkyl, substituovaný karboxylem,

   30 R5 je C i^alkyI, popřípadě substituovaný karboxylem,

   R4 je C] íoalkyl, C_{3 7}cykloalkyl nebo C4_io(alkylcyk Íoalkyl),

   R₃ je C]_i_Oalkyl, C₃_₇cykloalkyl nebo C₄-io(alky(cykloalky 1),

   R₂ je CH₂R2o, NH-R^o, 0-R₂o nebo S-R20, kde R20 je nasycený nebo nenasycený C₃_₇cykloalkyl

   35 nebo C₄ lo(alkylcykloalkyl), popřípadě mono-, di- nebo trisubstituovaný R₂i nebo

   R20 je C_ó nebo Ci₀-aryl nebo C₇_₁₆aralkyl, popřípadě mono-, di- nebo trisubstituovaný R₂i, nebo

   R₂₀ je Het nebo C, „alkyi-Het, popřípadě mono-, di- nebo trisubstituovaný R_2I, kde substituent

   R_2] nezávisle znamená Cíoalkyl, C, „alkoxy, aminoskupinu, popřípadě mono- nebo disubstituovanou C_t-.₆alkylem, sulfonyl, NO₂, OH, SH, halogen, halogenalkyl, amidoskupinu, popřípadě monosubstituovanou C_{t ň}alkylem, C₆ nebo Cjq arylem, C₇_i₆aralkylem, Het nebo Ci_₆ alkylem-72CZ 301405 B6

   Het, karboxyl, karboxy(Ct _balkyl), C₆ nebo Cio aryl, C₇. ^aralkyl nebo Het, přičemž C₆ nebo Cio aryl, C₇_i₆aralky I nebo Het jsou popřípadě dále substituovány R₂₂, kde

   R₂₂ znamená Ci^alkyl, C_t^alkoxy, aminoskupinu, popřípadě mono- nebo disubstituovanou 5 C) ^alkýlem, sulfonyl, NO₂, OH, SH, atom halogenu, halogenalkyl, karboxyl, amidoskupinu nebo (Ci^-alkyl)amidoskupinu,

   Ri je Ci^alky 1 nebo C₂_<>alkenyl, popřípadě substituovaný halogenem a

   W je hydroxyskupina nebo -NH-(S)CH(Me)-fenyl, io jakož i farmaceuticky přijatelné soli nebo estery těchto látek, kde Het samostatně nebo v kombi’ naci s jiným zbytkem znamená jednovazný zbytek, odvozený odstraněním vodíku z 5-, 6- nebo 7-čIenného nasyceného nebo nenasyceného (včetně aromatického) heterocyklu, obsahujícího 1 až 4 heteroatomy ze skupiny N, O a S, přičemž tento heterocyklus je popřípadě kondenzován

   15 s jedním nebo větším počtem kruhů, popřípadě heterocykl ických za předpokladu, že nejde o sloučeninu vzorce I, kde B znamená acetyl, a a b znamenají 0,

   P4 znamená cyklohexylglycin Chg,
2. 2ϋ P3 znamená Val,

   R₂ znamená benzyloxyskupinu O-Bn,

   Pl znamená racemickou skupinu vzorce a W je OH.

   2. Sloučenina podle nároku 1, kde B je acylový derivát R₇C(O)-, kde R₇ je Ci_ioalkyl, C₃_₇cykloalkyl, C₆ nebo Cio~aryl nebo C₇_i₆aralkyl nebo Het, přičemž všechny tyto skupiny jsou

   30 popřípadě substituovány C ^alkylem nebo hydroxyskupinou.
3. 3. Sloučenina podle nároku 2, kde R₇ je Ci^alkyl nebo heterocyklus.
4. 5. Sloučenina podle nároku 2, kde B je atom vodíku, acetyl nebo heterocykly vzorců:
5. 6. Sloučenina podle nároku 5, kde B je acetyl,
6. 7. Sloučenina podle nároku 1, kde B je R₇-SO₂ a R₇ je C₆ nebo C₁₍₎aryl a C_{7 16}aralkyl nebo heterocyklus, vše eventuálně substituované Ci^alkylem.

   io
7. 8. Sloučenina podle nároku 1, kde R,. pokud je přítomen, je vedlejší řetězec Asp nebo Glu.
8. 9. Sloučenina podle nároku 8, kde R$, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec Asp.

   15
9. 10. Sloučenina podle nároku 1, kde a je 0 a R_ft je nepřítomen.
10. 11. Sloučenina podle nároku 1, kde R_;, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec následujících aminokyselin: D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Val, L-Val, D-terc-butylglycin (Tbg) a LTbg.
11. 12. Sloučenina podle nároku 11, kde R₃, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec následujících aminokyselin: D-Asp, D-Glu a D-Val.
12. 13. Sloučenina podle nároku 12, kde R₃, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec D-Glu.
13. 14. Sloučenina podle nároku 1, kde R4 je vedlejší řetězec následujících aminokyselin: Val, cyklohexylglycinu (Chg), Tbg, Ile nebo Leu.
14. 15. Sloučeniny podle nároku 14, kde R4 je vedlejší řetězec Chg nebo Ile.
15. 16. Sloučenina podle nároku 15, kde R4 je vedlejší řetězec Chg.
16. 17. Sloučenina podle nároku 1, kde Y je atom vodíku nebo methyl.

    35
17. 18. Sloučenina podle nároku 17, kde Y je atom vodíku.
18. 19. Sloučenina podle nároku 1, kde R; je vedlejší řetězec následujících aminokyselin: Ile, Chg, Val nebo Tbg.

    40 20. Sloučenina podle nároku 19, kde Ri je vedlejší řetězec Val, Chg nebo Tbg.

    21. Sloučenina podle nároku 20, kde R₃ je vedlejší řetězec Val nebo Tbg.

    22. Sloučenina podle nároku 1, kde R₂ je S-R₂₀, O-R₂₀, kde R_2o je C₆ nebo C₁₀aryl, C₇_₁₆aralkyl,

    45 heterocyklus nebo -CIL-Het, vždy eventuálně mono-, di- nebo trisubstituované R₂₎, kde R₂] je C]_₆alkyl, Ci-óalkoxy, aminoskupina, mono- nebo di-(C,alkyl) aminoskupina, amidoskupina eventuálně monosubstituovanou Ci-₆alkylem, C₆ nebo Cioarylem, C₇ i₆aralkylem, heterocyklem nebo (Ci_$-alkyl)-Het, dále nitroskupina, hydroxyskupina, halogen, trifluormethyl,

    -74CZ 301405 B6 karboxylová skupina, C₆ nebo Cioaryl C₇_i₆aralkyl nebo heterocyklus, resp. aryl, aralkyl nebo heterocyklus, popřípadě dále substituovaný pomocí R22, kde R22 je C^alkyl, Ci^alkoxy, aminoskupina, mono- nebo di—(Ci_6-alkyl)aminoskupina, 5 nitroskupina, hydroxyskupina, halogen, trifluormethyl nebo karboxylová skupina.

    23. Sloučenina podle nároku 22, kde R₂i je C^alkyl, Q^alkoxy, aminoskupina, mono-(Ci-₆alkyl)aminoskupina nebo di-(C[^-alkyI)aminoskupína, C₆ nebo C_!Oaryl, heterocyklus, resp. aryl nebo heterocyklus eventuálně dále substituovaný pomocí R₂₂, kde R₂₂ je C, ₆alkoxy, aminoskupina, mono- nebo di-(Ci^-alkyl)aminoskupina, halogen nebo trifluormethyl.

    24. Sloučenina podle nároku 22, kde R₂ je 1-naftylmethoxy, 2-naftylmethoxy, benzyioxy, 115 naftyloxy, 2-naftyloxy nebo chinolinoxy nesubstituovaný, mono- nebo di-substituovaný R_2b kde R_2t je určeno nárokem 22.

    25. Sloučenina podle nároku 22, kde R₂ je 1-naftylmethoxy nebo chinolinoxy nesubstituovaný, mono- nebo disubstituovaný R₂i, kde R₂| je určeno nárokem 22.

    25 kde R>ia je amidoskupina eventuálně substituovaná Ci_óalkylem, C₆ nebo C)_Oaíylem, C₇_iéaralkylem nebo heterocyklem, dále C₆ nebo C_toaryl nebo heterocyklus eventuálně substituovaný R₂₂, kde R₂₂ je aminoskupina, di-(Ci^-alkyl)aminoskupina, (C^-alkyljamidoskupina a

    30 R₂ib je C^alkyl, C^alkoxy, aminoskupina, (Ci^-alkyl)amínoskupina nebo di—<C] ₆—alkyl)aminoskupína, nitroskupina, hydroxyskupina, halogen, trifluormethyl nebo karboxylová skupina,

    27. Sloučenina podle nároku 26, kde R₂ia je nebo C^aryl nebo heterocyklus, eventuálně substituovaný R₂₂, kde R₂₂ je aminoskupina, dimethylaminoskupina nebo acetamidoskupina.

    28. Sloučenina podle nároku 26, kde R₂ib je C₁ ^alkoxy nebo di(C]^-alkyl)aminoskupina.

    40 29. Sloučenina podle nároku 28, kde R_2tB je methoxyskupina.

    30. Sloučenina podle nároku 1, kde absolutní konfigurace na asymetrickém uhlíku v pozici 1 je R:

    -75CZ 301405 B6

    O kde R| je určeno nárokem 1.

    5 31. Sloučenina podle nároku 30, kde substituent R| na Pl segmentu je syn ke karbonylové skupině a je charakterizována následující absolutní konfigurací:

    t

    O io kde Ri je methyl, ethyl, propyl, vinyl, vždy eventuálně substituované halogenem.

    32. Sloučenina podle nároku 31, kde R| je ethyl, vinyl nebo bromvinyl.

    33. Sloučenina podle nároku 32, kde Ri je vinyl.

    34. Sloučenina podle nároku 31, kde W je následující ester:

    C[ ₆alkoxy, fenoxy nebo aryl(C|_6alkoxy).
19. 20 35. Sloučenina podle nároku 34, kde esterem je methoxy, ethoxy, fenoxy, benzyloxy nebo

    PhCH(Me)-O-.

    36. Sloučenina obecného vzorce Ϊ podle nároku 1, kde:
20. 25 B je atom vodíku, C_t-₆-alkyl-C(O)- nebo Het-C(OK fcí, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec Asp nebo Glu,

    R₅, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec D- nebo L-: Asp, Glu, Val nebo Tbg,

    Y je vodík nebo methyl,

    R4 je vedlejší řetězec Val, Chg, Tbg, Ile nebo Leu,
21. 30 R, je vodík nebo vedlejší řetězec Ile, Chg, Val nebo Tbg,

    R? je 1 naftyImethoxy, 2 -nafty!methoxy, O-Bn,

    -76CZ 301405 Bó kde R₂₂ je aminoskupina, di(Ci ₆-alkyl)aminoskupina, (C_! alkyl)amidoskupina, nitroskupina, hydroxyskupina, halogen, CF₃ nebo karboxylová skupina,

    Pl je cyklopropylový kruh vzorce io kde Ri je ethyl, vinyl nebo bromvinyl a

    W má význam, uvedený v nároku 1, nebo její farmaceuticky vhodné soli nebo estery.

    37. Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1, kde

    B je atom vodíku, acetyl nebo Het-C(O)-,

    R₆, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec Asp,

    -77CZ 301405 B6

    R₅, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec D-Asp, D-Glu nebo D-Val, Y je atom vodíku,

    R4 je vedlejší řetězec Chg nebo Ile,

    R₃ je vedlejší řetězec Chg, Val nebo Tbg,

    5 R? je 1-nafty (methoxy, benzyloxy, 4—chinolínoxy nebo

    PÍ je cyklopropylový kruh obecného vzorce 10 kde Ri je ethyl nebo ethenyl (CH=CH₂) nebo 2-bromethen-l-yl (CH-CHBr) a

    15 W je hydroxy skupina nebo NH-(S)-CHMePh nebo její farmaceuticky vhodné soli, 38, Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1, kde B je acetyl,

    20 Ra, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec Asp,

    R₅, pokud je přítomen, je vedlejší řetězec D-Glu,

    Y je atom vodíku,

    R4 je vedlejší řetězec Chg,

    R₃ je vedlejší řetězec Val nebo Tbg,

    R je

    -78CZ 301405 B6

    Pl je a W je hydroxyskupina nebo její farmaceuticky vhodné soli.

    39. Sloučenina podle nároku 36 obecného vzorce:

    P6

    P5

    Re

    P4

    H O

    Re kde B, P6, P5, P4, P3, R₂ a R| jsou následně uvedeny:

    TabJ B P6 P5 P4 P3 R₂ R. Pl sloučenina č Cr-Cx 101 Ac — Chg Val OBn Et 1R,2R 102 Ac — — Chg Val OBn Et JR,2? 103 Ac — — Chg Chg l-NpCH?O Et IR. 2? 104 Ac — — Chg Chg 1-NpCHiO Et 1R,2R 105 Ac — ... Chg Chg l-NpCH₂O Et JS.2S 106 Ac ... — Chg Val l-NfpCH₂O Me IR. 2? 107 Ac ... — Chg Val l-NpCH₂O CHMe? JR, 2? 108 Ac Asp D-Glu Chg Chg l-NpCH?O Et JR. 2R 109 Ac — — Chg Val l-NpCH?O CH?O CH?Ph IR. 2? 110 Ac — ... Chg Va) l-NpCH₂O CHOCH? Ph JR. 2? 111 Ac — — Chg Val l-NpCH?O (CH_Z), Ph IR, 2?

    -79CZ 301405 B6

    Tab.l sloučenina č. B P6 P5 P4 P3 Ri Ri PÍ C,-C 112 Ac — — Chg Val l-NpCHjO Et iR,2R 113 Ac — Chg Val 1-NpCHiO El ZS,2S 114 Ac — — Chg Val l-NpCH₂O Bn IR, 2? 115 Ac — — Chg Val l-NpCH₂O Bn IR, 2? 116 Ac Asp D-Glu Ile Val OBn Et 1R,2R 117 Ac Asp D-Glu Chg Val 1-NpCHiO El ŽR_t2R 118 Ac — — Chg Val l-NpCH?O Pr IR. 2? 119 Ac — — Chg Val I-NpCH₂O Pr IR, 2? 120 Ac Asp : D-Val Chg Val I-NpCH₂O Et !R,2R 121 Ac Chg Val QO vinyl JS,2R 122 Ac Chg Val Ho ethyl 1R_T2S 123 Ac — — Chg Vat propyl 1R,2R

    40. Sloučenina podle nároku 36 obecného vzorce:

    P1 kde P6, P5, P4, P3, R₂ a R| jsou následně uvedeny:

    -80CZ 301405 B6

    Tab 2 sloučenina č. Pó P5 P4 P3 Rz Ri 201 — — Chg Val OBn CH=CH₃ 202 — — Chg Chg l-NpCHO CH=CH> 203 — — Chg VaJ l-NpCHiO CH=CH₂ 204 — — Chg Val OBn CH^CHBr- 205 — — Chg Val ch=ch₂

    206

    Chg Val

    CH=CHi

    207

    Chg Tbg

    208

    Chg Val

    209

    Chg Val

    CH=CH₂

    CH=CH₂

    CH=CH

    -81CZ 301405 B6

    Tab 2 P<ř sloučenina č.

    210

    211

    212 Asp

    213 —

    214

    215

    216

    PS P4 P3

    Chg Val

    Chg Val

    D-Glu Chg Val

    - Chg Val

    - Chg Val

    Val Chg

    Chg Val

    Chg Val

    Ri ch=ch₂ ch=ch₂ ch=ch₂

    CH=CH?

    ethyl

    CH=CH?

    CH=CH_: ch=ch₂

    -82CZ 301405 B6

    Tab 2 P6 P5 P4 P3 r₂ sloučenina Č.

    -83CZ 301405 B6

    Tab 2 sloučenina č,

    225

    226

    P6 P5 P4 P3

    Chg Val

    Chg

    Rz Ri

    CH=CH?

    227

    - Chg

    CH=CH?

    CH=CH₂

    228

    229

    230

    231

    - Chg

    Chg

    Chg Val

    Chg Tbg

    CH=CH₂

    -84CZ 301405 Bó

    Tab 2 P6 PS P4 sloučenina č,

    232 — - Chg

    233 — - Chg

    234 — Chg

    235 -- - Chg

    236 Asp D-Gíu U_e

    237 — - Chg

    Ri

    CH=CH₂

    CH=CH₂

    CH*CH₂ vinyl vinyl vinyl vinyl

    -85CZ 301405 B6

    41. Sloučenina podle nároku 36 obecného vzorce:

    kde B. P6, P5, P4, P3, R₂, Ri a W jsou následně uvedeny:

    Tab3 B P6 P5 P4 P3 Rz Ri W sloučenina č. 301 Ac Asp D-Glu Ile Val OBn Et NH-(S>- CHMePh 302 Dni Asp D-Glu Chg Tbg ť vinyl OH

    xxx i

    \

    42. Sloučenina podle nároku 36 obecného vzorce:

    i5 kde Β, Y, P4, P3, R₂ a Ri jsou následně definovány:

    -86CZ 301405 B6

    43. Sloučenina podle nároku 36:

    kde B a R₂₀ jsou následně definovány:

    io

    Tab 5 sloučenina č.

    501

    502

    -87CZ 301405 B6

    Tab 5 sloučenina * 503

    504

    505

    506

    507

    508

    509

    B R20

    510

    -88CZ 301405 Bó

    44. Hexapeptid obecného vzorce I podle nároku 39, kterým je sloučenina ze skupiny č. 108, 116, 117 a 120.

    45. Hexapeptid obecného vzorce I podle nároku 40, kterým je sloučenina ze skupiny č. 212, 222,236 a 238.

    46. Hexapeptid obecného vzorce I podle nároku 41, kterým je sloučenina ze skupiny č. 301 a u) 302.

    47. Tetrapeptid obecného vzorce I podle nároku 39, kterým je sloučenina ze skupiny č. 122 a 123.

    15 48, Tetrapeptid obecného vzorce I podle nároku 40, kterým je sloučenina ze skupiny č. 202,

    203, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 214, 215, 216, 218, 219, 220, 221, 223, 224, 225, 226, 228,229, 230, 231, 232, 233, 234, 235.

    49. Tetrapeptid obecného vzorce I podle nároku 42, kterým je sloučenina ze skupiny č. 401.

    50. Tetrapeptid obecného vzorce Ϊ podle nároku 43, kterým je sloučenina ze skupiny č. 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511.

    51. Sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 50 pro použití jako léčivo.

    52. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 působící proti virové hepatitidě typu C nebo její terapeuticky vhodnou sůl nebo ester ve směsi s farmaceuticky vhodným nosičem nebo pomocnou látkou.

    53. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 nebo její terapeuticky vhodné soli nebo esteru pro výrobu léčiva pro léčení virové hepatitidy C.

    54. Způsob inhibice replikace viru způsobujícího virovou hepatitidu C in vitro, vyznaěu35 jící se tím, že se na virus hepatitidy C působí takovým množstvím sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1, které působí inhibičně naNS3 proteázu viru způsobujícího hepatitidu C, nebo její terapeuticky vhodné soli nebo esteru nebo se působí přípravkem podle nároku 52.

    55. Použití kombinace sloučeniny obecného vzorce l podle nároku 1 působící proti virové hepa40 titidě typu C nebo její terapeuticky vhodné soli nebo esteru a interferonu pro výrobu léčiva pro léčení virové hepatitidy C.

    56. Farmaceutický přípravek podle nároku 52, vyznačující se tím, že dále obsahuje druhé antivirové činidlo.

    57. Farmaceutický přípravek podle nároku 56, vyznačující se tím, že jako druhé antivirové činidlo obsahuje ribavirin nebo amantadin.

    -89CZ 301405 B6

    58. Farmaceutický přípravek podle nároku 52, vyznačující se tím, že dále obsahuje jiné inhibitory HCV proteázy.

    59. Farmaceutický přípravek podle nároku 52, vyznačující se tím, že obsahuje inhi5 bitor jiných životních pochodů viru HCV, především helikázy, polymerázy, metaloproteázy nebo

    1RES.

    60. Způsob přípravy peptidového analoga obecného vzorce I podle nároku 1, v němž Pl je substituovaný zbytek kyseliny aminocyklopropyl karboxy love, vyznačující se tím, že se i o uvede do reakce peptid, vybraný ze skupiny, zahrnující APG-P6P5-P4-P3-P2, APG-P5-P4P3P2. APG-P4-P3-P2, APG-P3-P2 a APG-P2, kde APG je skupina, chránící aminoskupinu a P6 až P2 mají význam, uvedený v nároku 1, s meziproduktem Pl obecného vzorce

    H₂N . ^O-CPG kde Ri je C₁₆alkyl nebo C_{2 6}alkenyl, popřípadě substituovaný halogenem a CPG je skupina, chránící karboxy 1.

    61. Způsob přípravy peptidového analoga obecného vzorce I podle nároku 1, v němž Pl je substituovaný zbytek kyseliny aminocyklopropylkarboxylové, vyznačující se tím, že se uvede do reakce peptid, vybraný ze skupiny, zahrnující APG-P6-P5-P4-P3-P2, APG-P5-P4P3-P2, APG-P4-P3-P2, APG-P3-P2 a APG-P2, kde APG je skupina, chránící aminoskupinu

    25 a P6 až P2 mají význam, uvedený v nároku 1, s meziproduktem Pl obecného vzorce

    H₂N /R nebo S 0-CPG kde R| je ethyl, vinyl nebo bromvinyl a CPG je skupina chránící karboxy 1.

    62. Způsob přípravy peptidového analoga obecného vzorce I podle nároku 1, v němž Pl je substituovaný zbytek kyseliny aminocyklopropylkarboxylové, vyznačující se tím, že se
22. 35 uvede do reakce peptid, vybraný ze skupiny, zahrnující APG-P6-P5-P4-P3-P2, APG-P5-P4P3-P2, APG-P4-P3-P2, APG-P3-P2 a APG-P2, kde APG je skupina, chránící aminoskupinu a P6 až P2 mají význam, uvedený v nároku 1, s meziproduktem Pl obecného vzorce kde CPG je skupina chránící karboxyl.

    -90CZ 301405 B6

    63. Způsob přípravy podle nároků 60, 61 a 62, vyznačující se tím, že ochranná skupina karboxylu (CPG) je vybrána z alkylesterů, aralkylesterů a esterů odštěpítelných působením mírnou zásadou nebo mírnými redukčními činidly,

    64. Použití analoga aminokyseliny obecného vzorce:

    kde Ri je Ci^alky 1 nebo C_{2 6}alkenyl eventuálně substituovaný halogenem, pro přípravu sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1.

    65. Použití analoga aminokyseliny obecného vzorce:

    kde Ri je ethyl, vinyl nebo bromvinyl, pro přípravu sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1. 66. Použití analoga aminokyseliny obecného vzorce:

    pro přípravu sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1.

    Konec dokumentu