CZ299825B6 - Molekuly nukleové kyseliny kódující protein s enzymatickou aktivitou fruktosyltransferázy, vektor, hostitelská bunka, zpusob prípravy FFT, FFT kódovaná molekulou nukleové kyseliny, zpusob prípravy transformovaných hostitelských bunek, transformovaná - Google Patents

Abstract

Molekuly nukleové kyseliny kódující proteiny s enzymatickou aktivitou fruktosyltransferázy (FFT) vedoucí k syntéze vysokomolekulárních fruktanových polymeru, jejichž molekuly obsahují v prumeru více než 20 fruktosylových zbytku, pricemž molekuly nukleové kyseliny jsou vybrány ze skupiny definované v popisu. Dále se toto rešení týká vektoru obsahujících tyto molekuly nukleové kyseliny, hostitelských bunek transformovaných temito molekulami nukleové kyseliny, zejména transgenních rostlinných bunek, rostlinných pletiv a rostlin, dále množitelského materiálu a skliznových produktu, a zpusobu prípravy techto transformovaných hostitelských bunek. Krome toho se týká zpusobu prípravy FFT a FFT kódované molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu, výroby transgenních rostlin, které syntetizují inulin s dlouhým retezcem díky zavedení molekul DNA kódujících FFT; zpusobu výroby vysokomolekulárního inulinu, jehož zbytky obsahují v prumeru více než 20 fruktosylových zbytku, v ruzných hostitelských organismech, zejména rostlinách, a také zpusobu in vitro výroby vysokomolekulárního inulinu, jehož zbytky obsahují v prumeru více než 20 fruktosylovýchzbytku, pomocí FFT, a použití tohoto inulinu.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká molekul nukleové kyseliny kódujících proteiny, které mají enzymatickou fruktosyl-transferázovou (FFT) aktivitu. Dále se tento vynález týká vektorů obsahujících tyto molekuly nukleové kyseliny, hostitelských buněk transformovaných těmito molekulami nukleové kyseliny, zejména Iransgenních rostlinných buněk, rostlinných pletiv a rostlin, dále množitelského materiálu a sklizňových produktů, a dále způsobu přípravy těchto transformovai> ných hostitelských buněk. Kromě toho se vynález týká způsobu přípravy FFT a FFT kódované molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu. Dále sc předmětný vynález týká produkce transgenních rostlin, kterc syntetizují inulin s dlouhým řetězcem díky zavedení molekul DNA kódujících FFT. Předkládaný vynález se také týká způsobu výroby vysokomolekulárního inulinu, jehož zbytky obsahují v průměru více než 20 fruktosylových zbytků, v různých hostitelských organis20 mech, zejména rostlinách, způsobu in vifro výroby tohoto vysokomolekulárního inulinu pomocí FFT podle vynálezu, a použití tohoto vysokomolekulárního inulinu.

Dosavadní stav techniky

Lineární, ve vodě rozpustné polymery mají velmi široké spektrum aplikací, například jich lze užít ke zvýšeni viskozity vodných systémů, jako detergentů. jako suspendačních činidel nebo pro urychlení sedimentačního procesu a pro kom plexo vání. ale také pro vázání vody. Polymery na bázi sacharidů, například fruktosylovc póly sacharidy, jsou obzvláště zajímavé materiály, protože to jsou biologicky odbouratelnc (biodegradovatclné).

Kromě jejich využití jako obnovitelné suroviny pro průmyslovou produkci a zpracování, jsou fruktosylovc polymery také zajímavé jako potravinová aditiva, například jako umělá sladidla. Pro různé aplikace jsou potřeba polymery s různou délkou řetězce. Zatímco polymery s krátkým nebo středně dlouhým řetězcem jsou výhodné v potravinářském průmyslu, polymery s vysokým stupněm polymerizace (DP) jsou užitečné pro technické účely, jakoje například výroba surfaklantů (povrchově aktivních látek).

Doposud by ly popsány pouze způsoby produkce fruktanových polysacharidů s dlouhým řetězcem v rostlinách pomocí exprese enzymů fruktosyltransferáz bakteriálního původu. Většina bakteriálních fruktosyltransferáz syntetizuje levan, fruktosylový polymer vázaný β-2.6 vazbou, který má četná β-2,1 větvení. Toto větvení představuje z technického hlediska značnou nevýhodu a proto je levan jakožto technický materiál podstatně měně významný než inulin.

Dosud je znám pouze jeden bakteriální gen. jehož produkt se účastní syntézy inulinu, a sice gen ftf ze Strepfoeoccus mutans. V principu je možné exprimovat gen v rostlinách, pokud by byl získán a upraven metodami genového inženýrství. Avšak výtěžek inulinu z transgenních rostlin je tak nízký, že ekonomicky výhodné vy užití takových transgenních rostlin nepřipadá v úvahu.

Dále je také znám způsob přípravy transgenních rostlin exprimu j ících íruktosyltransferázy z řie litin (hus tuberosus. Exprese těchto genů v iransgenních rostlinách vede k tvorbě inulinu s průměrným stupněm polymerizace DP - 6 až DP = 10. Polymery s tímto stupněm polymerizace nelze považovat za inulin s dlouhým řetězcem. Inulin s průměrným stupněm polymerizace DP - ó až DP - 10 však není vhodný pro většinu technických aplikací.

- 1 CZ 299825 B6

Způsoby produkce inulinu s dlouhým řetězcem v rostlinách nebo způsoby přípravy vhodných enzymů pro syntézu inulinu nejsou dosud známy.

Patentová přihláška PCT/US89/02729 popisuje možnost tvořit cukerné polymery, zejména dextran nebo polyfruktózu, v transgenních rostlinách, obzvláště v plodech transgenních rostlin. Pro přípravu takových modifikovaných rostlin se navrhovalo použití levansacharózy z mikroorganismů, konkrétně ?. Aerobacíer levanicum, Streptococcus safivarius a Bacillus subtiiis, nebo dextransacharózy z Leuconostoc wesenleroides. Avšak nikde nebyla popsána ani produkce aktivních enzymů, ani levanu či dextranu a ani příprava transgenních rostlin. Patentová přihláška io PCT/EP93/02110 popisuje způsob produkce transgenních rostlin cxprimujících gen Ise levansacharázy z gram negativní bakterie Erwinia amylovora. V patentové přihlášce PCT/NL93/00279 je popsána transformace rostlin majících chimérické geny. kterc obsahují gen sacB zBacittus snbíilis nebo gen ftf ze Streptococcus mutans. Transgenní rostliny exprimující gen SacB tvoří rozvětvený levan. Transgenní rostliny exprimující gen ftf syntetizují vysokomolekulúrní inu lin, avšak výnos je tak nízký, že ekonomické využití nepřichází v úvahu.

Patentová přihláška PCT/NE96/00012 popisuje sekvence DNA kódující enzymy syntetizující cukerné polymery a produkci transgenních rostlin s pomoct těchto sekvencí DNA. Popisované sekvence pocházejí z Helianthus tuberosus. Podle dokumentu PCT/NL96/00012 jsou popsané sekvence vhodné nejenom k modifikaci fruktanovcho profilu například petúnie a brambory, ale také samotné Helianthus tuberosus. Když se v transgenní rostlině exprimuje gen SST a EET. může se tvořit inulin. Průměrný stupeň polymerizace inulinu je však v rozmezí PL) “ 6 až PD = 10. Produkce vysokomolekulárního inulinu není možná způsoby, které byly popsány v PCT/NE96/00012. Přihláška PCT/EP97/02195 popisuje způsob přípravy transgenních rostlin tvořících inulin pomocí genu ftf ze Streptococcus mutans. Výtěžek vysokomolekulárního inulinu je však nízký, jak tomu bylo i u rostlin popsaných v přihlášce PCT/N E93/00279. Přihláška DE 19708 744.4 popisuje produkci inulinu s krátkým řetězcem pomocí enzymu, který vykazuje fruktosylpolymerázovou aktivitu. Inulin s krátkým řetězcem lze připravit v transgenních rostlinách. Výtěžek inulinu s krátkým řetězcem je velký a u brambor odpovídá buněčnému obsahu

5(i sacharózy. Produkce inulinu s dlouhým řetězcem však nebyla popsána.

Podle dosavadního stavu techniky byla syntéza inulinu u rostlin důkladně zkoumána (Pollock a Chatteron. Fructans, The biochemistry of Planíš, Vol. 14, J 988, Academie Press, str. 109 140). Avšak přirozeně se v rostlinách vyskytující inulin je inulin s krátkým řetězcem s maximálním

5? stupněm polymerizace přibližně DP = 35 (viz výše publikace Pollock a Chatteron). Syntéza a metabolismus fruktanu v rostlinách vyžadují aktivitu alespoň třech enzymu: sacharózofruktosyltransferázy závislé na sacharóze (SST). která tvoří trisacharidovou kestózu. fruklanfruktosyltransferázy závislé na fruktanu (EET). která přenáší fruktosylový zbytek z fruktanových molekul s nej menším stupněm polymerizace DP = 3 (kestóza) na sacharózu a vy šší fruktany, a fruktan40 exohydrolázy (FEH). která odstraňuje fruktózové zbytky z fruktanových molekul. Není známo, zda rozdíly v průměrné molekulově hmotnosti inulinu z různých rostlinných druhů, např. 2 x 10' v případě AUiumcepa a 5 x 10' v případě Helium t uber ošum. vycházejí z rozdílných vlastností jejich SST, EET a ΓΕΗ, /tohoto důvodu není možně vzhledem k současným znalostem týkajícím sc syntézy inulinu u rostlin identifikovat vhodné DNA sekvence, jejichž pomocí by mohl být syntetizován vysokomotekulární inulin v rostlinách v ekonomicky zajímavých množstvích.

Proto je cílem předkládaného vy nálezu poskytnout molekulu nukleové ky seliny a způsoby, které umožní připravit geneticky modifikované organismy, zejména rostliny, schopné tvořit inulin s dlouhým řetězcem.

Výše zmíněný problém je řešen předkládaným vynálezem, který je popsán pomocí následujících příkladů provedení a de linován patentovými nároky.

Pod stata vynálezu

Podstatu předmětného vynálezu tvoří molekuly nukleové kyseliny kódující protein senzymatic5 kou aktivitou fruktosyltransferázy (FFT) vedoucí k syntéze vysokomolckulámích fruktanových polymerů, jejichž molekuly obsahují v průměrů více než 20 fruktosylových zbytků, přičemž molekuly nukleové kyseliny jsou vybrány ze skupiny zahrnující:

(a) molekuly nukleové kyseliny kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedeni nou jako id. č. 2 a id. č. 4:

(b) molekuly nukleové kyseliny obsahující kódující sekvenci uvedenou jako id. č. 1 nebo id. č. 3, nebo odpovídající ribonukleotidovou sekvenci;

i? (c) molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci přinejmenším z 80 % identickou s kódující sekvencí uvedenou v id. č. 1;

(d) molekuly nukleové kyseliny kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci přinejmenším z 85 % identickou s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v id. č. 2; a (e) molekuly nukleové kyseliny obsahující fragment nukleotidové sekvence zčásti (a), (b), (c) nebo (d).

Výhodná je podle vynálezu molekula nukleové kyseliny, která obsahuje nukleotidovou sekvenci zvíce než 90% identickou s kódující sekvencí uvedenou v id, é. I. Dále je výhodná molekula nukleové kyseliny, kde aminokyselinová sekvence kódovaného proteinu je z více než 90 % identická s aminokyselinovou sekvencí id č. 2, podle ještě výhodnějšího provedení zvíce než 95 % identická s aminokyselinovou sekvencí id ě. 2, podle ještě výhodnějšího provedení zvíce než 97% identická s aminokyselinovou sekvencí id č. 2, a podle nejvýhodnějšího provedení zvíce w než 99 % identická s aminokyselinovou sekvencí id č. 2. Výhodně jc molekulou nukleové kyseliny molekula DNA, nej výhodněji molekula cDNA, nebo molekula RNA. Molekula nukleové kyseliny nejlépe pochází z artyčoku.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží vektor obsahující libovolnou výše specifikova?5 nou molekulu nukleové kyseliny. Výhodný je vektor, kde molekula nukleové kyseliny je operativně spojena s regulačními prvky, které zajišťují transkripci a syntézu translatovatelné RNA v prokaryotických a/nebo eukaryotických buňkách, výhodně jsou tyto regulační prvky odvozeny / promotoru B33 genu pa tat inu nebo promotoru 35S CaMV.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží hostitelská buňka transformovaná libovolnou výše specifikovanou molekulou nukleové kyseliny nebo libovolným výše specifikovaným vektorem. nebo buňka, která je odvozena z takové buňky, kde tyto odvozené buňky obsahují uvedenou molekulu nukleové kyseliny nebo uvedený vektor. Výhodně tato hostitelská buňka navíc obsahuje gen kódující sacharózofruktosyltransferázu (SST) závislou na sacliaróze.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob přípravy FFT. jehož podstata spočívá v tom. že se výše specifikované hostitelské buňky kultivují v podmínkách, které umožňují syntézu FFT a pak sc FFT izoluje z kultivovaných buněk a/nebo kultivačního média.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží FFT kódovaná libovolnou výše specifikovanou molekulou nukleové kyseliny nebo připravená výše definovaným způsobem.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob přípravy transformovaných hostitelských buněk, zejména transgenních rostlinných buněk, transgenních rostlinných pletiva transgen5? nich rostlin, jehož podstata spočívá vtom. že obsahuje krok, kdy se vnese molekula libovolné výše specifikované nukíeové kyseliny nebo výše specifikovaný vektor do hostitelské buňky, rostlinné buňky, rostlinného pletiva nebo rostliny.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží transformovaná hostitelská buňka, transgenní rostlinná buňka, rostlinné pletivo nebo rostlina, které obsahují libovolnou výše specifikovanou molekulu nukíeové kyseliny nebo vektor nebo které jsou připravitelná výše uvedeným způsobem nebo které jsou odvozeny z takových buněk, pletiv nebo rostlin, kde uvedená odvozená buňka, pletivo nebo rostlina obsahuje uvedenou molekulu nukíeové kyseliny nebo uvedený vektor.

κι Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží transformovaná hostitelská buňka, transgenní rostlinná buňka, rostlinné pletivo nebo rostlina, které navíc obsahují gen kódující sacharózofruktosyltransferázu (SS Γ) závislou na sacharóze.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží rostlina obsahující výše specifikované rostlinné buňky nebo rostlinné pletivo.

Výhodně je touto rostlinou užitková rostlina, nejvýhodnějí se jedná o rostlinu obsahující sacharózu.

2d Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží množíte Iský materiál libovolné z výše specifikovaných rostlin obsahující libovolné z výše specifikovaných rostlinných buněk.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží sklizňovč produkty libovolných zvýše specifikovaných rostlin obsahující libovolné z výše specifikovaných rostlinných buněk.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob výroby vysokomolekulárního inu!inu, jehož molekuly obsahují v průměru více než 20 fruktosylových zbytků, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje (a) kultivaci libovolné výše specifikované transformované hostitelské buňky, transgenní rostlinné buňky nebo rostlinného pletiva nebo rostliny za podmínek, které umožňují tvorbu F F1 a přeměnu 1 -kestózy. případně dodávané zvenčí, nebo ekvivalentního substrátu, na tento vysokomolekulární inulin. a (b) izolování takto vytvořeného inulinu zkultivovaných buněk, pletiv nebo rostlin nebo z kultivačního média.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob výroby vysokomolekulárního inulinu jehož molekuly obsahují v průměru více než 20 fruktosylových zbytků, jehož podstata spočívá

4o v tom, že zahrnuje (a) přivedení l-kcstózy nebo ekvivalentního substrátu do kontaktu s FFT za podmínek, které umožňují přeměnu na tento vysokomolekulární inulin, a (b) izolování takto vytvořeného inulinu.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob in vitro výroby vysokomolekulárního inulinu. jehož molekuly obsahují v průměru více než 20 fruktosylových zbytků, jehož podstata spočívá v tom, že sc sacharóza jakožto substrát přemění na vysokomolekulární inulin působením kombinace enzymů obsahující SS 1 a FFT.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití vysokomolekulárního inulinu, jehož molekul> obsahují v průměru více než 20 fruktosylových zbytků, připravitelného z libovolné výše specifikované hostitelské buňky, rostlinné buňky nebo rostlinného pletiva, rostliny, množí55 telského materiálu nebo ze sklizňového produktu, nebo za pomoci libovolného z výše speciílko• 4 CZ 299825 B6 váných způsobů, k výrobě surfaktantú kc zvýšení viskozity vodných systémů, jako detergentu. suspendačního činidla, pro urychlení sedimentace a pro komplexování nebo vázání vody.

Ve smyslu předkládaného vynálezu znamená, že enzym mající fruktosy Itransferázovou aktiv i5 tu (FFT) je protein, který je schopný katalvzovat vznik β-2,1 glykosidické a/nebo Q-2,6-glykosidické vazby mezi fruktózovými jednotkami, Fruktosylový zbytek, který má být přenesen, může pocházet z l-kestózy nebo íruktanového polymeru.

Vysokomolekulámím fruktosylovým polymerem se ve smyslu předkládaného vynálezu rozumí ío molekula obsahující v průměru více než 20. výhodně více než 25 a ještě výhodněji nejméně fruktosy lový ch zbytků. Navíc se ve smyslu předkládaného vynálezu vysokomolekulámím fruktosy lovým polymerem rozumí molekula obsahující v průměru méně než 3000, výhodněji méně než 300 a zvláště výhodně méně než 100 fruktosy lových zbytků. Fruktosy lové zbytky jsou spojeny buď β 2.1 nebo β-2.6-glykosidiekou vazbou. V případě inulinu jsou zbytky obecně i? navázány β-2. l-glykosidickými vazbami. V malé míře se vyskytují také β—2,6—glykosidické vazby, v méně než 5 % případů, výhodně méně než ve 3 %. výhodněji méně než v 1.5 % a nej výhodněji méně než v 0,5 % případů. Fruktosylový polymer může nést na svém konci glukózový zbytek, který je spojen prostřednictvím OH skupiny na atomu C-l glukózy a OH skupiny atomu

C-2 fruktosylového zbytku. V takovém případě fruktosylový polymer obsahuje také molekulu

?.o sacharózy.

Podle vynálezu bylo překvapivě zjištěno, že během exprese molekul nukleové kyseliny podle vynálezu se v transgenních rostlinách tvořila velká množství inulinu. lnu lín tvořený v rostlinách měl průměrný stupen polymerizace zřetelně vyšší než DP = 20. 1 o bylo neočekávané, neboť podobný enzym / Helianthus tuberosus se podílí na syntéze inulinu s průměrným stupněm polymerizaee nižším než DP = 20 v transgenních rostlinách (viz PCT/N 1.96/00012).

Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být jak DNA. tak RNA molekuly. Vhodné molekuly DNA jsou například molekuly genoniové DNA nebo cDNA. Molekuly nukleové kyse5 o líny podle vynálezu mohou být izolovány z přírodních zdrojů, výhodně artyčoku. nebo mohou být syntetizovány pomoct známých metod.

Prostřednictvím obvyklých molekulárně biologických metod je možné (vč např. Sambrook et al., 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory

Press, Cold Spring Harbor, NY} zavést do molekul nukleové kyseliny podle vynálezu odlišné mutace, což vede k tomu, že takto je možné syntetizovat proteiny s modifikovanými biologickými vlastnostmi. Na jedné straně je tu možnost vytvářet deleční mutanty. kdy se tvoří molekuly nukleové kyseliny postupujícími delecemi od 5’- nebo 3'-konce kódující sekvence DNA. Tyto nukleové kyseliny pak poskytují syntézu proteinů, které jsou adekvátně zkráceny. Takovými delecemi na 5'-konei nukleotidové sekvence je například možné identifikovat aminokyselinové sekvence, které jsou odpovědné za translokaei enzymu v plaslidech (tranzitní peptidy). To umožňuje specifickou produkci enzymů, které díky odstranění příslušných sekvencí nejsou již nadále lokalizovány ve vakuoláeh, ale v cytosolu, nebo které jsou díky připojení dalších signálních sekvencí lokalizovány v jiných kompartmentech.

Na druhé straně další možností je zavedení bodové mutace na pozice, kde modifikace aminokyselinové sekvence ovlivňuje například enzymovou aktivitu nebo regulaci enzymu. Tímto způsobem mohou být například tvořeny mutanty, které mají změněnou hodnotu K_tn nebo které již nadále nepodléhají regulačním mechanismům, které normálně v buňce existují, jako jsou například

5o alosterické regulace nebo ková len tni modifikace.

Kromě toho mohou být tvořeny mutanty, které vykazují změněnou substrátovou speeifícitu nebo speeifícitu pro produkt. Mohou být také tvořeny mutanty. které vykazují změněný profil aktivita— teplota.

- 5 CZ 299825 B6

Pro manipulaci v prokaryotických buňkách metodami genetického inženýrství mohou být molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu nebo části těchto molekul zavedeny do plazmidu umožňujících mutagenezi nebo modifikaci sekvence rekombinací sekvence DNA. Prostřednictvím standardních metod (Sambrook et al., / 9S9, Molecular Clon ing, A Laboratory Manual. 2. vydáni,

Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) se mohou zaměňovat báze a mohou být přidávány přirozené nebo syntetické sekvence. Aby sc fragmenty DNA navzájem spojily, mohou knim byt přidány speciální adaptační nebo spojovací sekvence, adaptéry nebo spojky (línkery). Mimoto se mohou provádět manipulace, které poskytují vhodná štěpná místa nebo které odstraňují přebytečnou DNA nebo nadbytečná štěpná místa. Jsou-li možné inzerce, m delece nebo substituce, muže se provádět in vitro mutageneze, náhrada pomocí primerů. restrikce nebo ligace. Jako metody analýzy se obvykle používají sekvenční analýza, restrikční analýza a další biochemické nebo molekulárně biologické metody.

Termín „hy bridizace“ má ve smyslu tohoto vynálezu význam hybridizace za obvyklých hybrid i15 začních podmínek, výhodně za stringentních podmínek, jak je například popsáno v Sambrook et al., Molecular Clon ing, A Laboratory Manual, 2. vydání, (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Příkladem hybridizace ve stringentních podmínkách je hybridizace v podmínkách definovaných takto: 50% formám id. 5x SSC. 5x Denhardtňv roztok, 40 mM fosforečnan sodný pfl 6.8, 0,5% (hmot./objem) BSA, 1% (hmot./objem) SDS. 0,1 mg/ml

2o DNA ze spermatu sleďů, a to při 42 °C. Příkladem obvyklé hybridizace v non stringentních podmínkách je hybridizace v podmínkách definovaných stejně jako viz výše. s tím rozdílem, že místo 50% je užit 30% formani id. Promývací podmínky jsou v případě stringentních podmínek výhodně 0,5x SSC/0,5% SDS při 60 ^ŮC a v případě non-stringentních podmínek výhodné 2x SSC/0.5% SDS při 56 °C.

Molekuly nukleové kyseliny, které hybridizují s molekulami podle vynálezu, mohou být izolovány například zgenomových nebo eDNA knihoven, které byly připraveny zodpovídajících organismu. například zartyčoku.

.κι K identifikování a izolování takovýchto molekul nukleové kyseliny mohou být použity molekuly podle vynálezu nebo části těchto molekul nebo reverzní komplementy těchto molekul, například získané hybridizací pomocí obvyklých metod (viz například Sambrook a kol., 1989, Molecular Clotting, A Laboratory Manual, 2 vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, AT).

Jako hybridizační sonda mohou být například použity molekuly nukleové kyseliny, jejichž nukleotidová sekvence je zcela shodná nebo v podstatě podobná sekvenci uvedené zde jako sekvence id. č. 1 nebo sekvence id. č. 3, nebo části těchto sekvencí, fragmenty použité jako hybridizační sondy mohou být syntetické fragmenty, které byly vytvořeny prostřednictvím obvyklých •io způsobu syntézy, a jejichž sekvence jsou v podstatě podobné sekvencím molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu.

Molekuly hybrid i zuj íeí s molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu také zahrnují fragmenty, deriváty a alelické varianty molekul nukleové kyseliny popsaných výše kódujících protein podle vynálezu. Termínem „fragmenty se míní části molekul nukleové kyseliny, které jsou dostatečně dlouhé, aby kódovaly jeden /.proteinu podle vynálezu. Termín „derivát v tomto smyslu znamená. že se sekvence těchto molekul liší od sekvencí molekul nukleové kyseliny popsaných výše \ jedné nebo několika pozicích, avšak s těmito sekvencemi mají vysoký stupeň homologie. Homologie znamená sekvenční identitu alespoň 40 %. zejména alespoň v 60 %, výhodně více než 80% a nejvýhodnéji více než 90%. Proteiny kódované takovými molekulami nukleové kyseliny mají sekvenci identickou s aminokyselinovou sekvencí uvedenou jako sekvenci id. č. 2 alespoň v 80 %, výhodně v 85 % a zejména výhodně ve více než 90 %, 95 %, 97 % a 99 %, Odchylky od výše popsaných molekul nukleové kyseliny mohou být tvořeny delecí. substitucí, inzercí nebo rekombinací.

s

-6CZ 299825 B6

Molekuly nukleové kyseliny, které jsou homologní s výše popsanými molekulami, a které představují deriváty těchto molekul, jsou obvykle varianty těchto molekul, které představují modifikace mající tutéž biologickou funkci. Mohou to být přirozeně se vyskytující varianty, například sekvence z jiných organismu nebo mutace, které mohou vzniknout bud¹ přirozeně nebo které byly ? vneseny specifickou mutagenezí. Kromě toho mohou být tyto varianty synteticky vytvořené sekvence. Alelické varianty mohou být buď přirozeně sc vyskytující varianty nebo synteticky vytvořené varianty nebo varianty vytvořené metodami rekombinantní DNA.

Proteiny kódované různými variantami molekul nukleové kyseliny podle vynálezu vykazují určilo té společné vlastnosti, jako je enzymová aktivita, molekulová hmotnost, imunologická reaktivita nebo konformace, čí fyzikální vlastnosti, jako jc elektroforetická pohyblivost, chování při chromatografií, sedimentační koeficienty, rozpustnost, spektroskopické vlastnosti, stabilita, optimum pH. teplotní optimum.

Jak již bylo uvedeno, ve výhodném provedení jsou nukleové kyseliny podle vynálezu získány z artyčoku (C vnara sco/ymus).

Pokud se týče vektoru obsahujících molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu, výhodně se jedná o plazili idy. kosmidy, viry, bakteriofágy a další vektory obvykle používané v oboru geno20 vého inženýrství.

Ve vektoru podle vynálezu je sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu výhodně operativně spojena s regulačními prvky, což zaručuje transkripci a sy ntézu RNA v prokaryotiekýeh a/nebo eukaryotických buňkách, která může být translatována.

Expresní vektory podle vynálezu umožňují produkci inulinu s dlouhým řetězcem v různých hostitelských organismech, zejména v prokaryotickýeh nebo eukaryotických buňkách jako jsou bakterie. houby, řasy, buňky živočichů a výhodně rostlinné buňky a rostliny. Výhodné hostitelské organismy jsou zvláště kvasinky jako například 5. cerevisiac, bakterie mléčného kvašení jako so Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus lactis, S. cremoris.,

Lactobacillus acidophilus a Leuconostoc eremoris.

Kódované enzymy mohou být použily pro produkci inulinu s dlouhým řetězcem také mimo hostitelské organismy. Zvláště výhodné jsou rostlinné buňky.

Přehled týkající se různých expresních systémů lze najít např. v publikacích Methods in

Enzymol ogy 153, 198⁷, 385-516. Bitter a kol. Methods in Enzywology 153, 198⁷, 516-544,

Sawers a kol. Applied Microbiology and Biotechnology 465, 1996, 1-9, Bili man Jaeobe,

Current Opinion in Biotechnology 7, 1996, 500-504, llockeny, Trends in Biotechnology 12, 40 1994, 45 6 463, a Qrifflths a kol, Methods in Molecular Biology 75. /997, 427-440. Expresní systémy pro kvasinky by ly popsány v publikacích Hensinng a kol, Antonie van Leuwenhoek 67,

1995, 261-29, Bussineu a kol, Developments in Biological Standardlzation 83, 1994, 13-198, (re/lissen a kol, Antonie van Leuwenhoek 62, 1992, 79-93, Eleer, Current Opinion in

Biotechnology 3. 1992. 486-496, Vedvick, Current Opinion in Biotechnology 2, 1991, 742-⁷45: 45 a Buekholz, Biotechnology 9, 1991, 1067 1072. V publikacích podle dosavadním stavu techniky byly expresní vektory' popsány ve značném rozsahu. Kromě genu selekčního markéru a replikačního počátku, který' zajišťuje replikací ve vybraném hostiteli, obvykle expresní vektory obsahují bakteriální nebo virový promotor, a ve většině případů také term i načni signál transkripce.

Obvykle je alespoň jedno restrikční místo nebo polylinker (vícečetné klonovat í místo) mezi pro50 motorem a terminačním signálem, což dovoluje vložit kódující sekvenci DNA. Jestliže je aktivní ve vybraném hostitelském organismu, může se jako promotorova sekvence užít DNA přirozené kontrolující transkripci odpovídajícího genu. Tuto sekvenci jc možné zaměnit jinou promotorovou sekvencí. Je také možné užít promotor, který umožňuje konstitutivní expresi genu a nebo indukováte)ný promotor, který umožňuje cílenou regulaci exprese genu ležícího po směru trans55 kripce (..down stream“). Bakteriální a virové pro motorové sekvence těchto vlastností jsou z dosa-7CZ 299825 B6 vadního stavu techniky známy, přičemž byly popsány v různých publikacích. Regulační sekvence pro expresi v mikroorganismech (jako je E. coli nebo 5. cerev/.sme) byly dostatečně popsány v publikacích podle dosavadního stavu techniky. Promotory, které dovolují zvláště silnou expresi „downstream ležícího genu jsou např. T7 promotor (Studier a koí, Melhods in Enzymology 185.

? 1990, 60-89); laeuv5. trp, trp -lacUV5 (DeBoer a kol., in Rodriguez and Chemberlain,

Promotors. Struct utře and Punct ion, Praeger, New York, 1982, 462- 481; DeBoer a kol.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1983, 21-25, λρ 1. rae (Boros et aí, gene 42, 1986, 97-100). Obvykle je množství proteinu nejvyšší v úseku od středu ke konci logaritmické fáze růstového cyklu mikroorganismu. Z tohoto důvodu se výhodně užívají indukovatelné promotory při synteze proteinů, ío To často umožňuje vyšší produkci než užití konstitutivního promotoru. Použití silného konstitutivního promotoru často vede. prostřednictvím permanentní transkripce a translace klonovaného genu, ke ztrátě energie na jiné nezbytné buněčné funkce, což pak zpomaluje růst buněk (Bernard R. (Jlick, JackJ. Pusternak, Molekulare Biotechnologie, 1995, Spektrum Akademischer Yerlag (imhll, Heidelberg, Berlin, Oxford, str. 342). Aby tedy bylo dosaženo optimálního množství proteinu, často se užívá dvoufázový proces. Nejdříve se hostitelské buňky kultivují v optimálních podmínkách, dokud sc nedosáhne relativně vysoké hustoty buněk. Ve druhé fázi je indukována transkripce v závislosti na tom, jaký byl použit promotor. Zvláště vhodný je v takovém případě promotor tac indukovatelný laktózou nebo IPTG (=iz.opropyl-p-D-thiogalaktopyranosid) (DeBoer a kol.. Proč. Natí Acad. Sci. USA 80, 1983, 21-25). Terminační signály t ran skr i pce by Iy v dosa vad η í m sta vu tec h n i ky také doslat eč ně popsá ny.

Transformaci hostitelské buňky odpovídající DNA. která kóduje protein, lze provést standardním postupem, jaký je například popsán v publikaci Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratoře Manual, Cold Spring flarbor Laboratory, Cofd Spring Harhor, NY. 1989. Kultivace hostitelských buněk se provádí v živném médiu, které odpovídá nutričním požadavkům použitých hostitelských buněk, zejména pokud jde o pil, teplotu, koncentrace solí, provzdušňování média, přítomnost antibiotik, vitaminů, stopových prvků apod.

Purifíkacc enzymu produkovaného hostitelskými buňkami sc provádí obvyklými purifikačními technikami jako je precipitace, iontová výměnná chromatografie, afinitní chromatografie, gelová filtrace, HPLC s reverzní fází apod.

Modifikací DNA. která je exprimována v hostitelských buňkách, je možné v hostitelských buňkách expriinovat takový polypeptid, který se snáze izoluje z kultivačního média díky určitým vlastnostem, takže je například možné expriinovat protein jako luzní protein s další polypeptidovou sekvencí, jejíž, specifické vazebné vlastnosti dovolují izolovat fůzní protein pomocí afinitní chromatografie (víz např. Hopp a kol.. Biotechnology 6, 1988, l 204-1 210, Sassenfeld, Trend in Bioteehnol. 8, 1990, 88-93).

Pro expresi v rostlinných buňkách jsou výhodné regulační prvky promotoru 1333 patatinového genu. Dalším výhodným promotorem je promotor 35S CaMV a promotor genu pro alkoholdehydrogenázu ze Saccharomyces eerevisiae.

Vektory podle vynálezu mohou obsahovat další funkční jednotky, které stabilizují vektor v hostii? telskem organismu, například bakteriální replikační počátek nebo 2-mikron-DNA pro stabilizaci v V. eerevisiae. Kromě toho mohou obsahovat levou a pravou hraniční sekvenci T-DNA z Agrobacterium. což umožňuje stabilní integraci do genomu rostlin.

Vektory podle vynálezu mohou dále obsahovat funkční terminátory, jako je například terminátor z genu oktopinsyntázy z Agrobacterium.

Podle dalšího provedení je nukleová kyselina podle vynálezu spojena s molekulou nukleové kyseliny vektoru podle vynálezu, kdy nukleová kyselina kóduje funkční signální sekvence, aby bylo možné směrovat produkt do různých buněčných kompartmentů. Taková modifikace může například spočívat v tom. že se přidá N- koncová sekvence pro sekreci do apoplastu vyšších rost-8CZ 299825 Bó lin, ale v rozsahu vynálezu je také jakákoliv další modifikace vedoucí k fúzi signálního peptidu se sekvencí kódující FFT. Molekula nukíeové kyseliny obsažená vc vektoru podle vynálezu může zejména obsahovat sekvence kódující aminokyselinové sekvence způsobující sekreci. V této souvislosti je výhodné užití signálního peptidu α-CGTázy zKlebsiela oxytoca M5A1 (Fiedler a kol., J. Mol. Biol. 256. 1996, 279-291) nebo signálního peptidu, který'je kódován nukleotidy 11 529 až 11 618 sekvence vedené v GeneBank pod číslem X860I4.

Zvláště výhodně provedení vynálezu se týká plazmidů p35-csFFT a p33-csFFT a jejich konstrukce, která je popsána v příkladech.

V dalším provedení sc vynález týká hostitelských buněk, které přechodně nebo stabilně obsahují molekuly nukíeové kyseliny nebo vektor}' podle vynálezu nebo pocházejí z takových buněk. Hostitelskou buňkou se rozumí organismus, který je schopný vnesení in vitro rekombinantní DNA a pak je případně schopen syntetizovat proteiny kódované molekulami nukíeové kyseliny podle vynálezu. Hostitelské buňky jsou prokaryotické nebo eukaryotické buňky. Výhodně jsou to mikroorganismy. Výhodně podle vynálezu jde o bakterie a protista (jako jsou houby, zejména kvasinky a řasy), jak jsou definovány například v Schlegelově „Allgemaine Mikrobiologie (Georg Thieme Verlag, 1985, 1-2). V souvislostí s prokaryotickými hostitelskými organismy je třeba poznamenat, že byl ukázán pozitivní účinek inulinu na růst určitých mikroorganismů, jako jsou například bifidobakterie z lidského intest mál ního traktu, B i fído bakteriím se přisuzuje zdravotní účinek (viz. např, Gibson a kol, lni. SugarJ. 96, 1994, 381-386; Roberfroid a kol, J. of Nutrition 128. 1998, 11 19). Byl také diskutován inhibiční účinek na nádory (viz například publikace Reddy a kol, Carcinogenesis 18, 1982 1371 1374: Singh a kol, Carcinogenesis 18, 1997. 833-84T). Z tohoto důvodu hostitelské buňky podle vynálezu, jako jsou kvasinky (pekař25 ské) nebo bakterie mléčného kvašení (jogurt, podmáslí) jsou vhodné pro použití v potravinářském průmyslu.

Ve zvláště výhodném provedení podle vynálezu hostitelská buňka navíc obsahuje gen kódující sacharózafruktosyltransferázu (SST) závislou na sacharóze, l akové sekvence byly například izo30 továny z a rty čo ku (německá patentová přihláška Df-AI 197 08 774), Cichorium inlibus (de Ilalleux a kol. Plant Physiol. 113, 1992 1003 1013). Helianthus tuberosus (WO 96/21023 a Allium cepa (Vijn a kol. Plant Phsiol 117. 1998, 1507-1513).

Vynález se zejména týká transgcnních rostlinných buněk transformovaných nukleovými kyseli35 námi podle vynálezu nebo jejich deriváty nebo částmi. Transgenní rostlinné buňky jsou výhodně schopné syntetizovat enzymy vhodné pro produkci inulinu s dlouhým řetězcem díky faktu, že do nich byly vneseny vektorové systémy podle vynálezu, jejich deriváty nebo části. Buňky podle vynálezu jsou výhodně charakterizovány tím, že do nich zavedená molekula nukíeové kyseliny podle vynálezu je buď heterologní vzhledem k transformované buňce, tj. v těchto buňkách se při40 rozené nevyskytuje, nebo je v genomu lokalizována na jiném místě, než příslušná přirozeně se vyskytující sekvence. Navíc transgenní buňky podle vynálezu výhodně obsahují sekvenci DNA kódující SSI.

Předkládaný vynález se rovněž týká proteinů kódovaných molekulami nukíeové kyseliny podle vynálezu, a také způsobů jejich produkce, kdy sc hostitelské buňky podle vynálezu kultivují za podmínek umožňujících syntézu proteinu. Protein se pak izoluje z pěstovaných buněk a/nebo kultivačního média. Kromě toho se vynález lýka FFT. připravitelné z hostitelských buněk podle vynálezu nebo způsobem podle vynálezu.

Předkládaný vynález se dále týká molekul nukleových kyselin, které specificky hybridizují s molekulou nukíeové kyseliny podle vynálezu, s molekulou k ní komplementární nebo s její částí. Výhodně se jedná o oligonukleotidy s délkou nejméně 10, zejména nejméně 15 a výhodně nejméně 50 nukleotidů. Oligonukleotidy podle vynálezu se mohou využít jako primer} v PCR reakci. Mohou sloužit také jako složky „antisense konstruktu nebo DNA molekul, které kódují vhodné ribozymy.

-9CZ 299825 Bó

Předkládaný vynález se také týká způsobu přípravy transgenních rostlinných buněk, rostlinných pletiv a rostlin, kterýžto způsob obsahuje vnesení molekuly nukleové kyseliny nebo vektoru podle vynálezu do rostlinné buňky, rostlinného pletiva nebo rostliny.

Tím, že předkládaný vynález poskytuje nukleové kyseliny podle vynálezu, dovoluje pomocí metod rekombinantní DNA produkovat inulin s dlouhým řetězcem v různých organismech, zejména v rostlinách, což dosud klasickými šlechtitelskými metodami nebylo možné. Zvýšením aktivity PP I , například nadměrnou expresí (..overexpresíf) vhodných molekul nukleové kyseliny io podle vynálezu nebo poskytnutím rnulantů. které již nadále nepodléhají buněčné specifickým regulačním mechanismům a/nebo které mají změněné teplotní závislosti vzhledem k jejich aktivitě, je možné zvýšit výtěžek v rostlinách modifikovaných genetickým inženýrstvím.

Je tudíž také možná exprese molekul nukleové kyseliny podle vynálezu v rostlinných buňkách ke i? zvýšení aktivity příslušné FFT nebo ke vnesení FFT do buněk, které normálně tento enzym neexprimují. Nadto je možné modifikovat molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu metodami odborníkům z oboru známými, aby se získala FFT podle vynálezu, která již nadále nepodléhá buněčně specifickým regulačním mechanismům nebo která má modifikovanou teplotní závislost nebo specifičnost k substrátu či produktu.

Pro tento účel muže odborník v oboru použít řadu různých rostlinných transformačních systémů. Tak například použití T-DNA pro transformaci rostlinných buněk bylo extenzivně zkoumáno aje popsáno například v patentu EP-A-120 516 a dále v publikaci lloeketmr. The Binary Plant Vector System, Offse/drukkerij Kantem Β. V., Alblasserdam (1985). Chapter V, Fraley, Crit. Rev.

Platit. Sci.. 4, 1-46 and An, EMBOJ. 4 (1985), 277-287.

Pro přenos DNA do rostlinných buněk se rostlinné exp lan táty společně kultivují (koku lti vují) s Agrobacterium tumefaciens nebo Agrobaclerium rhizogenes. Z infikovaného rostlinného materiálu (například segmentů listů, stonku nebo kořenu, ale také z protoplastů nebo suspenzní bunčč30 né kultury) lze regenerovat celou rostlinu ve vhodném médiu, které obsahuje antibiotika nebo biocidní látky vhodné pro selekci transformovaných buněk. Rostliny připravené takovým způsobem se pak musí testovat, aby se zjistilo, zdaje přítomna vnesená DNA. Jinou možností je vnesení DNA do rostlinných buněk biol i Stic kou metodou nebo transformací protoplastů. což je z dosavadního stavu techniky známo (viz například Willmitzer, L, 1993 Transgenic plants. In: Biotech35 nology, A Mul ti Volume Comprehensive Treatise (H. ,1. Rehm, G. Reed, A. Piihler, P. Stadler, editorsk Vol. 2, 62⁷-659, VCH Weinheim-New York Basel Cambridge}.

Alternativním systémem pro transformaci jcdnodčložnýcli rostlin je transformace biolistiekou metodou, elektricky nebo chemicky indukovaným příjmem DNA do protoplastů, elektroporací

3o částečně permeabilizováných buněk, makroinjckcí DNA do květří, mikroinjekcí DNA do mikrospor nebo proembrya metodou bobtnání (viz např. kusardi, Plant J. 5. 1994, 571-582; Paszkowski. Biotechnology 24, 1992. 38^ -392). Zatímco transformace dvoudčložných rostlin vektorovým systémem založeným na Ti—plazmidu prostřednictvím Agrobacterium tumefaciens je již dávno zavedenou technikou, novější studie ukazují, že transformace vektory založenými na Agrobacte45 rium tumefaciens může být úspěšně použita i v případě jednoděložných rostlin (Chán a kol., Plant Mol. Biol. 22 (1993). 491-506; Hici a kol.. Plam J. 6 (1994}, 2N -282; Bytebier a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5345 5349; Raineri a kol.. Bio/Technolog}· 8 (1990). 3338; Gould a kol., Plant Phvsiok 95 (1991), 426 434; Moonev a kol., Plant, Cell Tiss. & Org. ('ult. 25 (1991), 209-218; Li a kok, Plam Mol. Biol. 20 (1992). 'li)37 1048).

Tři z výše jmenovaných systémů pro transformaci byly úspěšně zavedeny také pro různé druhy obilovin: elekroporace rostlinného pletiva, transformace protoplastů a přenos DNA ostřelováním regenerovatclné tkáně a buněk (přehled viz Jahne a kok, Euphyt/ca85 (1995). 3544). V odborné literatuře bylo popsáno několik způsobů transformace pšenice (přehledy viz. Maheshwari a kok,

Critical Reviews in Plant Science 14 (2) (1995), 149-178).

- 10CZ 299825 B6

Jestliže jsou molekuly nukleové kyseliny exprimovány v rostlinách, může být syntetizovaný protein lokalizován v principu v jakémkoliv kompartmentu rostlinné buňky. Aby se dosáhlo lokalizace ve specifickém kompartmentu, musí být odstraněna sekvence zaručující lokalizaci ve vakuo5 le. a je li nutné, zbylá kódující oblast musí být spojena se sekvencemi DNA zaručujícími lokalizaci ve specifickém kompartmentu. Takové sekvence jsou odborníkovi známy (viz např. Braun et al, EMBOJ., IL 1992. 3219-3227; Wolter a kol.. Proč. Nati. Acad Sci, USA, 85, 1988. 846 850: Sonnewalda kol. Planil. 1. 1991, 95-106, Rocha Sasa, EMBOJ. 8, 1989. 23-29).

to Předkládaný vynález se tudíž také týká transgenních rostlinných buněk, rostlinných pletiv a rostlin, které byly transformovány jednou nebo několika molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu, a také transgenních rostlinných buněk pocházejících z takových transformovaných buněk. Takové buňky obsahují jednu nebo několik molekul nukleové kyseliny podle vynálezu, které jsou výhodné spojeny s regulačními DNA prvky zaručujícími transkripci v rostlinných buňkách, zejména s promotorem. lakové rostlinné buňky sc odlišují od přirozeně se vyskytujících rostlinných buněk tím, žc obsahují alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu, která se v těchto buňkách přirozeně nevyskytuje, nebo tím, že tato molekula je vložena do genomu buňky na místo, kde sc přirozeně nevyskytuje, tj. do jiné genomové oblasti. Jelikož 1-kestóxa je přirozeným substrátem FPT a sama je tvořena v reakci fruktosyltransferázy (SST) závislé na sacharóze sc sacharózou. je zvláště výhodné a pravděpodobné do konce nutné poskytnout, kromě molekul nukleové kyseliny, vektoru a FFT podle vynálezu, také SST, Takže výhodné provedení vynálezu se týká transgenních rostlinných buněk, rostlinných pletiv a rostlin, které navíc obsahují gen kódující fruktosyl transferázu (SST) závislou na sacharóze. To mohou být například rostliny nebo rostlinné buňky, které již přirozeně exprimují SST jako např. ěckanka, Helianthus tuberosus nebo jiřina, a nebo rostliny, do kterých byla sekvence DNA kódující SST vnesena metodami genového inženýrství. Tyto sekvence je možné vnést navzájem nezávisle nebo současně s molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu.

Z transgenních rostlinných buněk mohou být regenerovány celé rostliny použitím metod odboruísi) kum známých. Rostliny připrav itelné regenerací transgenních rostlinných buněk podle vynálezu jsou také předmětem předkládaného vynálezu. Dalším předmětem vynálezu jsou rostliny obsahující transgenní rostlinné buňky popsané výše. Transgenní rostliny mohou být v podstatě rostliny jakéhokoli rostlinného druhu. tj. jak jednoděložné, lak dvouděložné. Výhodně jsou to plodiny, zejména rostliny, které obsahují sacharózu, jako jsou rýže. kukuřice, cukrová řepa, cukrová třtina.

brambory a zelenina (rajčata, karotka, pór, čekanka apod.). krmné nebo luční trávy, sladké brambory, pšenice, ječmen, řepka a sója.

Vynález se také týká množíteIského materiálu a produktů sklizně rostlin podle vynálezu, například ovoce, semen, hlíz, podnoží, sadby, řízků, kalusu, buněčných kultur apod.

41)

Dále se vynález týká inulinu s dlouhým řetězcem, který 1/c získat z hostitelských buněk podle vynálezu, zejména z transgenních rostlinných buněk, rostlinných pletiv nebo rostlin, a takc z jejich množitelského materiálu nebo sklizňových produktů.

•ts V dalším provedení se vynález týká způsobů produkce inulinu, které byly definovány výše.

Izolace inulinu z různých zdrojů, zejména rostlinných pletiv, by la například popsána v publikacích Gibson a kol. Int. SugarJ. 96, 1994, 381 386, Baxa, Úzech J. Food Sci. 16, 1998, C-Nr a dále v FP-A-787 745, DeLeeoheer, Cyrbohydr. Org. Raw Matter IH Workshop, 1996, Meeting

5i) dáte 1994. 6~-92, Verlag VCLI Weinhehn, Gertnanv, a ruský patent RU 2001 1621 Cl.

Předkládaný vynález se dále týká způsobu in vitro produkce inulinu s dlouhým řetězcem využitím sacharózy a kombinace enzymu SST a enzymu FFT podle vynálezu. Dále sc vynález týká způsobu in vitro produkce inulinu užitím směsi obsahující fruktosylové oligomery a FPT podle vynálezu. V této souvislosti je třeba uvést, že fruktosylový oligomer je oligomer složený z fruktó-11CZ 299825 B6 zových jednotek s DP přibližně 2 až 7, který' může mít na koncích glukózové zbytky . Když se provádí způsob podle vynálezu, užívají se výhodně rekombinantně produkované proteiny, které jsou tvořeny tak, že se vloží DNA kódující příslušný protein do hostitelské buňky a tam se exprimuje. Protein je pak izolován buďto z hostitelských buněk nebo z kultivačního média. Hostitelské buňky jsou výhodně hostitelské buňky podle vynálezu definované v předchozím textu. Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu se užijí enzymy, které byly připraveny rekombinantní technologií a seeernovány z hostitelských buněk do kultivačního média, takže není nutné narušovat buňky nebo dále purifikovat protein, neboť secemovaný protein lze snadno získat ze supernatantu. Aby sc odstranila rezidua kultivačního média, užijí se obvyklé způsoby jako je dialýza, m reverzní osmóza, chromatografické metody apod. To samé platí pro koncentrování proteinu vylučovaného do média. Sekrece proteinů mikroorganismy je normálně zprostředkována N-konco* vým signálním peptídem (signální sekvence, vedoucí peptid). Proteiny se signální sekvencí mohou procházet membránou mikroorganismu. Sekrece proteinů lze dosáhnout spojením sekvence DNA kódující signální peptid s odpovídajícím úsekem kódujícím enzym. Zvláště výhodné je použití signálního peptidu α-CGTázy z Klebsiela oxyíoca M5A1 fbielder a kol., J. Mol. Biol. 256, 1996. 279-291) nebo signálního peptidu. který' jc kódován nukleotidy 1 1 529 až í t 618 sekvence uložené v GeneBank pod č. X86014.

Enzymy použité v postupu podle vynálezu mohou být alternativně připraveny nikoliv využitím

2o mikroorganismů, ale užitím in vitro transkripčních a translačních systémů, které umožňují exprimovat protein. Ve zvláště výhodném provedení vynálezu je ITT produkována v protoplastcch z listového pletiva rostlin.

Dále se vynález týká inulinu produkovaného hostitelskou buňkou, zejména rostlinnou buňkou,

2? pletivem nebo rostlinou podle vynálezu, nebo získaného z rozmnožovacího materiálu nebo produktů sklizně rostlin nebo rostlinných buněk podle vynálezu nebo získaných výše popsaným způsobem podle vynálezu. Takový inulin se může výhodně použít pro přípravu surfaktantů ke zvýšení viskozíty ve vodných systémech, jako detergent, jako suspendační činidlo nebo pro urychlení sedimentačního procesu a komplexování a pro vázání vody.

Jednotlivá provedení podle vynálezu a další provedení jsou odborníkům v oboru zřejmá. Tato provedení jsou obsažena v popisu příkladů podle vynálezu. Další odborná literatura týkající se výše popsaných postupů, prostředků nebo použití, který lze využít ve smyslu předkládaného vynálezu, je obsažena vc stavu techniky, např. ve veřejných knihovnách nebo v elektronické .3? podobě. Veřejnou databází je například databáze Mcdline, na kterou je přístup prostřednictvím i π ternetu na ad rese: http://v\w \v .nebi.nim. nih.gov/fub Med/medline.html.

Další obdobné databáze jsou odborníkům známy a jejich adresy lze získat pomocí internetu například na adrese: http://vvvv\v.lycos,com.

Přehled informačních zdrojů týkajících se biotechnologických patentu a patentových přihlášek lze nalézt v publikaci Berks, Tibtech 12, 1994, 352- 364.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek I (ukazuje analýzu celkového extraktu z protoplastu pomocí HPLC. Protoplasty byly transformovány různými vektory : A: Transformace byla provedena vektorem pA7, který' neobsahuje kódující úsek fúzovaný s promotorem cAMV .358. B: Trans formace byla provedena vekto5ti rem pA7-csFFT, který obsahuje kódující úsek fruktan:fruktosyltransferázy zartyčoku fúzovaný s promotorem cAMV 358. C: Transformace byla provedena vektorem pA7-htFPT, který obsahuji e kód uj ící úsek t r li k ta n; 1 r u k t osy 11 r a n s fe r ázy z Hel ianthus tube ros us fúzo v a 11 ý s p ro m ot o re m cAMV 35S. Před analýzou byly úplné extrakty z protoplastu inkubovány ve směsi fruktosylových oligomerú po dobu 12 hodin. Analýza byla provedena jak je popsáno v příkladu 1.

- 12CZ 299825 B6

Obrázek 2 ukazuje konstrukci plazmidu p35-esFFT.

Obrázek 3 ukazuje HPLC analýzu transgenních rostlin, které byly připraveny transformací konstruktem p35-esFFT. Analýza ukázala, že se tvořily molekul) inulinu s dlouhým řetězcem v trans5 gen nich rostlinách, které exprimovaly SST a také FF1 z artyčoku (35S-SST/FFT 22/19).

Obrázek 4 ukazuje konstrukci plazmidu p33-csFFT.

Obrázek 5 ukazuje HPLC analýzu transgenních rostlin, kterc byly připraveny transformací konslío ruktem p33 csFFT.Analýza ukázala, žc sc tvořily molekuly inulinu s dlouhým řetězcem v transgenních rostlinách, kterc exprimovaly SST a také FFT z artyčoku (35S-SST/FFT 47).

Předkládaný vynález je dále podrobněji ilustrován pomocí následujících příkladů.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Identifikace, izolace a charakterizace cDNA kódující fruktosyltransferázu z artyčoku (Cynare scolytnus)

Celková RNA by la izolována zčešule (receptaculum) artyčoku (Sambrook et al, Molecular

Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Poly(A) mRNA se izolovala za použitím RNA izolačního systému PolyATtraet (Protnega Corporation, Madison, WL USA), Komplementární DNA (cDNA) se syntetizovala z 5 pg této RNA pomocí soupravy pro syntézu „ZAp cDNA synthesis kit“ od firmy Stratagene podle instrukci výrobce. Získalo sc 2x10^fl nezávislých rekombinantních fágů. Amplifikovaná cDNA kni3o hovna se testovala obvyklými metodami pomocí fragmentu DNA značeného P a odpovídajícího cDNA pro SST z artyčoku (Notl fragment z plazmidu pC'y21 podle DL 197 08 774.4). Sekvence SST z artyčoku bvla popsána v patentové přihlášce DE 197 08 774.4. Pozitivní klony byly sereenovány pomocí sondy SSL v silně stringentních podmínkách. Klony reagující pozitivně ve sereeningu byly vynechány, neboť se evidentně jednalo o SST cDNA. Ze zbývajících klonů byly izolovány inzerty cDNA tak, že se plazmidová DNA izolovaná standardním postupem vyštěpila restrikční ni enzymem Noll a pak byla klonována do vektoru pA7. Kohezní konce Noll fragmentu byly zaplněny užitím 14 polymerázy. Poté bvl fragment ligován do míst Smál v pA7. Vektor pA7 je derivátem pUC18 (Yanish-Perron, gene 33, 1985. 103-119), který obsahuje vložený promotor 35 S z viru mozaiky květáku. CaMV (nukleotidy 7146 až 7464, dle (lardner, Nucl. Acids

4o Res. 9. 1981.2871 2888) mezi místa EeoRl a Sael v polylinkeru. Kromě promotoru 35S obsahuje vektor pA7 polyadenylační signál genu 3 z T-DNA Ti plazmidu pTiACHS (Gielen, EMBO J. 3, 1984, 835-846). tj. nukleotidy 11 749 až 11 939). který byl izolován jako fragment PvullHindlll z plazmidu pAGV40 (llerrera-Strella, Nátuře 303, 1983, 209-213) a klonován mezi místa Sphl a HindllI polylinkeru po adici linkeru Sphl k místu Pvull.

Proloplasty tabáku byly transformovány užitím derivátů pA7 obsahujících cDNA z artyčoku. a sice metodou, kterou popsal Negrutiu, Plant Mol. Biol. 8, 1987, 363 373. Transformované protoplasty byly kultivovány v médiu K3 (Nagy a Maliga, Z. Pflanezenphysiologie 78. 1976. 453— 455) při 25 °C po dva dny ve tmě. Pak byly získány buněčné extrakty opakovaným zmrazením

5(i a roztátím. Extrakty byly inkubovány 12 hodin s oligofruktany (67,5 % l-ketóza, 28,4 % nystó7a, 3,6 % fruktosyInystóza, 0,5 % sacharóza) při 28 °C a pak analyzovány užitím HPLC. Analýzy HPLC byly provedeny na aniontové výměnné koloně CarboPAc PA 100, napojené na gradientový chromatograficky systém Dioncx DX-300 (Dionex. Sunnyvale, CA, USA). Monomery, oligomery a polymery' cukrů byly stanoveny pomocí pulzam péro metrické detekce. Nastavení detektoru pro tento účel bylo následující: 1j = 0,48 s, T- 0,12 s. Ί4 ~ 0.12 s. Ej=0,05V,

CZ 299825 Bó

E₂ = 0,65 V, E; =-0,95 V, citlivost OJ gC, integrace = 0,28 až 0,48 s, průtokové médium A0.Í5M NaOH, průtokové médium B - IM NaAc v 0J5M NaOH. gradient: 10 minut 100% A, 2 minuty lineární zvýšení z 0% B na 100% B. 2 minuty 100% B. 2 minuty lineární zvýšení z 0% A na 100% A, 5 minut A. Vzorky byly před aplikací odsoleny a filtrovány (Microcon 10. Amicon, Beverly. USA). Průtoková rychlost byla 1 ml min V několika extraktech (viz obr. I) byl nalezen vy sokorno leku lární ínulin.

Příklad 2 io

Sekvenční analýza inzertu eDNA plazmidu pCy3

Inzert eDNA / derivátu pA7 (pCy3), který byl zodpovědný za syntézu vysokomolekulárního mulinu v testu s protoplasty, byl sekvencován obvyklou dideoxynukleotidovou metodou (Sangcr i? et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 74, 1977, 5463-5467).

Inzert klonu pCy21 jc DNA velikosti 2 073 bp. Nukleotidová sekvence je zde uvedena jako sekvence id. č. I. Odpovídající aminokyselinová sekvence je uvedena jako sekvence id. č. 2. Sekvence id. č. 3 je varianta sekvence id. č. 1, která kóduje stejný protein jako sekvence id. č. 1.

Sekvenční analýza a srovnání sjiž publikovanými sekvencemi ukázaly, že sekvence uvedená jako sekvence id. č. I je nová a obsahuje kódující úsek vykazující homologii s FFT jiných organismů.

Příklad 3

Syntéza plazmidu p35-csFFT a vložení plazmidu do genomu bramboru

3(i Plazmid p35-csFFT (obr. 2) obsahuje tři fragmenty A. B a C v binárním vektoru pBin 19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res.. 12: 871 1. modifikováno podle Becker, 1990, Nucl. Acids Res., (8: 203).

Fragment A obsahuje promotor 35S z viru mozaiky květáku (CaMV). Obsahuje úsek nukleotidů 7146 až 7464 (Gardner. Nucl. Acids Res. 9, 1981, 2871-2888), který je vložen mezi štěpná místa EcoRl a Sad polylinkeru z pBin I9-Hyg.

Fragment B obsahuje nukleotidy 1 až 2073 sekvence id. č. 1. Fragment B byl získán jako fragment Not! z vektoru pBK < MV. ve kterém byl vložen do štěpného místa EcoRl prostřednictvím linkerové sekvence EcoRI/Noti.

Fragment C obsahuje po lyadeny lační signál genu 3 z 1 -DNA Ti plazmidu pTi ACII 5 (Giclen et al., 1984; EMBO .1.. 3. 835-846), nukleotidy 11 749 až 11 939, který byl izolován jako fragment Pvull-llindlll z plazmidu pAGV 40 (Herrera-Estrclla et al., 1983, Nátuře, 303, 209 213) a klonován mezí štěpná místa SphJ a HindlII polylinkeru z pBinl9-Hyg po přidání línkem Sphl ke štěpnému místu Pvull.

Plazmid p35 csSST byl vnesen do Agrobacterium (Hofgen a Willmitzcr. Nucleic Acids Res., 16. 1988, 9877) a pak byl zaveden do rostlin bramboru prostřednictvím genového přenosu zprostředkovaného Agrobacterium užitím výše popsaných v oboru známých metod. Tyto rostliny braní5o boru byly transformovány sekvencí DNA kódující SST zartyčoku (viz německá patentová přihláška DE Al 197 08 774) a exprimují sekvenci pod kontrolou promotoru 35S. Celé rostliny byly regenerovány z transformovaných buněk. Z listu regenerovaných rostlin byly získány extrakty a ty byly testovány na přítomnost fruktosylových polymerů. Analýzy se prováděly postupem popsaným v příkladu 1. Analýzy listů velkého počtu rostlin transformovaných tímto vektorem

- 14CZ 299825 B6 nepochybně prokázaly výskyt vysokomolekulárního tnulinu, který je důsledkem exprese genu FFT artvěoku obsaženém v plazmidu p35-csFFT (srov. obr. 3).

Tabulka 1

Analýza obsahu i nul i nu v hlízách t ran sgen nich rostlin bramboru exprimujících geny SST a FFT z artyčoku

Rostlina	obsah fruktanu pmol fruktózy/g čerstvé hmotnosti	proměnný stupeň polymerizace (poměr fruktóza/glukóza)
35-SST/FFT 22/26	30/81	21 (20/1)
35-SS7/FFT 3G/17	9 *7 Ί 7.	20 (19/1)

Příklad 4

Příprava plazmidu p33-csFFT a vnesení plazmidu do genomu bramboru

Plazmid p33-csFFT (obr. 4) je shodný s plazmidem p35-csFFT, s výjimkou toho, že fragment A obsahuje promotor B33 patat i nového genu b33 z bramboru místo promotoru 35 S CaMV. Obsahuje fragment Dral (pozice -1 512 až pozice +14) patatinového genu B33 (Rocha-Sosa et aL

1989, FMBOJ., 8:23-29), který byl vložen mezi štěpná místa EcoRl a Sací polylinkeru z pBinl9 Hyg.

Plazmid p33-csFFT byl vnesen do rostlin bramboru pomocí genového přenosu zprostředkovaného Agrobacterium, jak bylo již popsáno v příkladu 3. Tyto rostliny bramboru byly transfonno25 vány sekvencí DNA kódující SST z artyčoku (viz německá patentová přihláška DBA! 197 08 774) a exprimují sekvenci pod kontrolou promotoru 35S. Celé rostliny byly regenerovány 7 transformovaných buněk.

Analýzy hlíz velkého počtu rostlin transformovaných tímto vektorem nepochybně prokázaly

3o výskyt vysokomolekulárního mulinu, kterýje výsledkem exprese genu FFT z artyčoku obsaženého v p33 csFFT (srov. obr. 5).

- IS CZ 299825 B6

SEZNAM SEKVENCÍ

Í2'i INFORMACE PRO SEKVENCI 5 IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

iii CtiARÁKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 3 páru bulí (B; TYP: nukleová kyselinu [O TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TY? MOLEKULY: cDNA (ni! HYPOTETICKÁ: ne (ix) ZNAKY:

(A) iW.N0/OZNAČENÍ : CDS (3) POZICE: 21. ..1872 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 1:

TTACCTCATT TCCATCAACC ATG AGA ACG ACT GAA CCC CAA ACT GAC CTT 50

Met Arg Thr Thr Glu Pro Gin Thr Asp Leu

10

GAG CAT GCA CCC AAC CAC ACT CCA CTA CTG GAC CAC CCC GAA CCA CCA 98

Glu

His

Ala

Pro

Asn 15

His

Thr

Pro

Leu

Leu 20

Asp

His

Pro

Glu

Pro 25

Pro

CCG

GCC

GCC

GTG

AGA

AAC

CGG

TTG

TTG

ATT

AGG

C-TT

TCG

TCC

AGT

ATC

146

Pro

Ala

Ala

Val 30

Arg

Asn

Arg

Leu

Leu 35

Ile

Arg

val

Ser

Ser 40

Ser

Ile

ACA

TTG

GTC

TCT

CTG

TTT

TTT

GTT

TCA

GCA

TTC

CTA

CTC

ATT

CTC

CTG

194

Thr

Leu

Val 45

Ser

Leu

Phe

Phe

Val 50

Ser

Ala

Phe

Leu

Leu 55

Ile

Leu

Leu

TAC

CAA

CAC

GAT

TCC

ACT

TAC

ACC

GAT

GAT

AAT

TCA

GCA

CCG

TCG

GAA

242

Tyr

Gin

His

Asp

Ser

Thr

Tyr

Thr

Asp

ASp

Asn

Ser

Ala

Pro

Ser

Glu

65 70

AGT TCT Ser Ser 75

TCC Ser

CAG Gin

CAG CCC

TCC GCT GCC

GAT Asp

CGC Arg 85

CTG Leu

AGA Arg

TGG Trp

GAG Glu

AGA Arg 90

290

Gin

pro 80

Ser Ala

Ala

ACA

GCT

TTT

CAT

TTC

CAG

CCC

GCC

AAA

AAT

TTC

ATT

TAT

GAT

CCC

AAC

338

Thr

Ala

Phe

His

Phe

Gin

Pro

Ala

Lys

Asn

Phe

Ile

Tyr

Asp

Pro

Asn

100 105

GGT

CCA

TTG

TTC

CAT

ATG

GGT

TGG

TAC

CAT

CTT

TTC

TAC

CAA

TAC

AAC

386

Gly

Pro

Leu

Phe

His

Met

Gly

Trp

Tyr

His

Leu

Phe

Tyr

Gin

Tyr

Asn

110

115

120

- 1 6 CZ 299825 B6

434

CCG TAC GCA CCG Pro Tyr Ala Pro 125

TTT Phe

TGG GGC AAC ATG ACA TGG GGT CAC GCC Trp Gly Asn Met Thr Trp Gly His Ala 130 135

GTG TCC

Val

Ser

AAA

. GAC

ATG

ATC

AAC

TGG

TTC

GAG

CTT

CCG

i ATC

GCC

TTG

GCC

CCA

. ACC

Lys

Asp

Met

Ile

Asn

Trp

Phe

Glu

Leu

Pro

Ile

Ala

Leu

Ala

Pro

Thr

140

145

150

GAA

TGG

TAC

GAT

ATC

GAG

GGT

GTT

TTA

TCA

, GGC

TCA

ACC

ACG

ATC

CTC

Glu

Trp

Tyr

Asp

ile

Glu

Gly

Val

Leu

Ser

Gly

Ser

Thr

Thr

Ile

Leu

155

160

165

170

CCT

GAT

GGT

CGA

ATC

TTT

GCT

CTC

TAT

ACC

GGA

AAC

ACA

AAC

GAT

CTC

Pro

Asp

Gly

Arg

Ile

Phe

Ala

Leu

Tyr

Thr

Gly

Asn

Thr

Asn

Asp

Leu

175

180

185

GAG

CAA

CTT

CAA

TGC

AAA

GCC

GTG

CCA

GTT

AAT

GCA

TCC

GAC

CCA

CTT

Glu

Gin

Leu

Gin

Cys

Lys

Ala

Val

Pro

Val

Asn

Ala

Ser

Asp

Pro

Leu

190

195

200

CTT

GTT

GAA

TGG

GTC

AGG

TAC

GAT

GCT

AAC

CCG

ATC

CTG

TAT

GCT

CCA

Leu

Val

Glu

Trp

Val

Arg

Tyr

Asp

Ala

Asn

Prú

Ile

Leu

Tyr

Ala

Pro

205

210

215

TCA

GGG

ATC

GGG

TTA

ACA

GAT

TAC

CGG

GAC

CCG

TCA

ACA

GTT

TGG

ACG

Ser

Gly

Ile

Gly

Leu

Thr

Asp

Tyr

Arg

Asp

Pro

Ser

Thr

Val

Trp

Thr

220

225

230

GGT

CCC

GAT

GGA

AAA

CAT

CGG

ATG

ATC

ATA

GGG

ACT

AAA

CGA

AAT

ACT

Gly

Pro

Asp

Gly

Lys

His

Arg

Met

Ile

Ile

Gly

Thr

Lys

Arg

Asn

Thr

235

240

245

250

ACA

GGA

CTC

GTA

CTT

GTA

TAC

CAT

ACC

ACC

GAT

TTC

ACA

AAC

TAC

GTA

Thr

Gly

Leu

Val

Leu

Val

Tyr

His

Thr

Thr

Asp

Phe

Thr

Asn

Tyr

Val

255

260

265

ATG

TTG

GAC

GAG

CCG

TTG

CAC

TCG

GTC

CCC

AAC

ACT

GAT

ATG

TGG

GAA

Met

Leu

Asp

Glu

Pro

Leu

His

Ser

Val

Pro

Asn

Thr

Asp

Met

Trp

Glu

270

275

280

TGT

GTC

GAC

CTT

TAC

CCT

GTG

TCA

ACG

ACC

AAC

GAT

AGT

GCA

CTT

GAT

Cys

Val

Asp

Leu

Tyr

Pro

Val

Ser

Thr

Thr

Asn

Asp

Ser

Ala

Leu

Asp

285

290

295

GTT

GCG

GCC

TAT

GGT

CCG

GGT

ATC

AAG

CAT

GTG

CTT

AAA

GAA

AGT

TGG

Val

Ala

Ala

Tyr

Gly

Pro

Gly

Ile

Lys

His

Val

Leu

Lys

Glu

Ser

Trp

300

305

310

GAG

GGA

CAC

GCG

ATG

GAC

TAC

TCG

ATC

ggg

ACA

TAC

GAT

GCA

TTT

Glu

Gly

His

Ala

Met

Asp

Phe

Tyr

Ser

Ile

Gly

Thr

Tyr

Asp

Ala

Phe

315

320

325

330

4Θ2

530

578

626

674

722

770

818

866

914

962

1010

-17CZ 299825 B6

AAC GAT AAG TGG ACA CCC GAT AAT CCC GAA Asn Asp Lys Trp Thr Pro Asp Asn Pro Glu

335 340

CTA GAC GTC GGT ATC GGG Leu Asp Val Gly Ile Gly

345

1058

TTG CGG

TGC GAT TAC

GGA AGG TTC TTT GCG TCG AAG AGC CTC TAC GAC

1106

Leu

Arg

CyS

Asp 350

Tyr

Gly

Arg Phe

Phe 355

Ala

Ser

Lys

Ser

Leu 360

Tyr

Asp

CCG

TTG

AAG

AAA

CGA

AGA

GTC

ACT

TGG

GGT

TAT

GTT

GCG

GAA

TCC

GAC

1154

Pro

Leu

Lys

Lys

Arg

Arg

Val

Thr

Trp

Gly

Tyr

Val

Ala

Glu

Ser

Asp

365

370

375

AGT

TAC

GAC

CAA

GAC

GTC

TCT

AGA

GGA

TGG

GCT

ACT

ATT

TAT

AAT

GTT

1202

Ser

Tyr

Asp

Gin

Asp

Val

Ser

Arg

Gly

Trp

Ala

Thr

Ile

Tyr

Asn

Val

380

385

390

GCA

AGG

ACC

ATT

GTA

CTC

GAT

CGG

AAG

ACT

GGA

ACC

CAT

CTA

CTT

CAA

1250

Ala

Arg

Thr

Ile

Val

Leu

Asp

Arg

Lys

Thr

Gly

Thr

His

Leu

Leu

Gin

395

400

405

410

TGG

CCG

GTG

GAG

GAA

ATC

GAG

AGC

TTG

AGA

TCC

AAC

GGT

CAT

GAA

TTC

129Θ

Trp

Pro

Val

Glu

Glu

Ile

Glu

Ser

Leu

Arg

Ser

Asn

Gly

His

Glu

Phe

415

420

425

AAA

AAT

ATA

ACA

CTT

GAG

CCG

GGC

TCG

ATC

ATT

CCC

CTC

GAC

GTA

GGC

1346

Lys

Asn

Ile

Thr

Leu

Glu

Pro

Gly

Ser

Ile

Ile

Pro

Leu

Asp

Val

Gly

430

435

440

TCA

GCT

ACG

CAG

TTG

GAC

ATC

GTT

GCA

ACA

TTT

GAG

GTG

GAT

CAA

GAG

13 94

Ser

Ala

Thr

Gin

Leu

Asp

Ile

Val

Ala

Thr

Phe

Glu

Val

Asp

Gin

Glu

445

450

455

GCG

TTA

AAA

GCA

ACA

AGT

GAC

ACG

AAC

GAC

GAA

TAC

GGT

TGC

ACC

ACA

1442

Ala

Leu

LyS

Ala

Thr

Ser

Asp

Thr

Asn

Asp

Glu

Tyr

Gly

Cvs

Thr

Thr

460

465

470

AGT Ser 475

TCG Ser

GGT GCA

GCC AAA GGG GAA GTT TTG GAC CAT TCG GGG ATT

GCA Ala 490

1490

Gly

Ala

Ala LyS 480

Gly

Glu Val

Leu

Asp 485

His

Ser

Gly

Ile

GTT

CTT

GCC

CAC

GGA

ACC

CTT

TCG

GAG

TTA

ACT

CCG

GTG

TAT

TTC

TAC

1538

Val

Leu

Ala

His

Gly

Thr

Leu

Ser

Glu

Leu

Thr

Pro

Val

Tyr

Phe

Tyr

495

500

505

ATT

GCT

AAA

AAC

ACC

AAG

GGA

GGT

GTG

GAT

ACA

CAT

TTT

TGT

ACG

GAT

1556

Ile

Ala

Lys

Asn

Thr

Lys

Gly Gly

Val

Asp

Thr

His

Phe

Cys

Thr

Asp

510 515 520

- IX CZ 299825 B6

AAA CTA AGG TCA TCA TAT

GAT Asp

TAT GAT GGT GAG AAG GTG GTG TAT GGC

1634

Lys

Leu

Arg Ser S25

Ser

Tyr

Tyt 530

Asp

Gly

Glu Lys Val 535

Val

Tyr

Gly

AGC

ACC

GTC

CCA

GTG

CTC

GAC

GGC

GAA

GAA

TTC

ACA

ATG

AGG

ATA

TTG

1682

Ser

Thr

Val

Pro

Val

Leu

Asp

Gly

Glu

Glu

Phe

Thr

Met

Arg

Ile

Leu

540 545 550

GTG Val 555

GAT Asp

CAT TCG GTG

GTG GAG

GGG TTT GCA CAA GGG GGA AGG ACA GTA

1730

His

Ser

Val

Val 560

Glu

Gly

Phe

Ala

Gin 565

Gly

Gly

Arg

Thr

val 570

ATA

ACG

TCA

AGA

GTG

TAT

CCC

ACG

AAA

GCA

ATA

TAC

GAA

GCA

GCC

AAG

1773

Ile

Thr

Ser

Arg

Val

Tyr

Pro

Thr

Lys

Ala

ile

Tyr

Glu

Ala

Ala

Lys

575

5Θ0

585

CTT

TTC

GTC

TTC

AAC

AAT

GCC

ACT

ACG

ACC

AGT

GTG

AAG

GCG

ACT

CTC

1825

Leu

Phe

Val

Phe

Asn

Asn

Ala

Thr

Thr

Thr

Ser

Val

Lys

Ala

Thr

Len

590

595

600

AAG

GTC

TGG

CAA

ATG

TCT

CAA

GCC

TTT

GTC

AAG

GCT

TAT

CCG

TTT

T

1372

Lys

Val

Trp

Gin

Met

Ser

Gin

Ala

Phe

Val

Lys

Ala

Tyr

Pro

Phe

605 610 615

AGTTTTTTAT	GCATCTTTTT	AAGACATTGT	TGTTTCATAT	GATTCAAGTT	ijt1	1932
GTTATGTTAA	GACACGCAGC	TTAAAATAGC	CACATGTGAG	ATCATTTGCG	TATGGCCGTC	1992
AACTATTTTT	TAATATGCAA	CTTCAGTAAT	GCTATTTACA	GTATGTTTTA	AGGAAAAAAA	2052
AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	A				2073

INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: SIC aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

- 19 CZ 299825 B6

	(Xi) POPIS SEKVENCE	: SEKVENCE	S ID.	Č. .	2:
Met 1	Arg Thr Thr Glu Pro Gin 5	Thr Asp Leu 10	Glu Hia	Ala	Pro Asn His 15
Thr	Pro Leu Leu Asp His Pro 20	Glu Pro Pro 25	Pro Ala	Ala	Val Arg Asn 30
Arg	Leu Leu Ile Arg Val Ser 35	Ser Ser Ile 40	Thr Leu	Val 45	Ser Leu Phe
Phe	Val Ser Ala Phe Leu Leu 50 55	Ile Leu Leu	Tyr Gin 60	His	Asp Ser Thr
Tyr 65	Thr Asp Asp Asn Ser Ala 70	Pro Ser Glu	Ser Ser 75	Ser	Gin Gin Pro 80
Ser	Ala Ala Asp Arg Leu Arg 35	Trp Glu Arg 90	Thr Ala	Phe	His Phe Gin 95
Pro	Ala Lys Asn Phe Ile Tyr 100	Asp Pro Asn 105	Gly Pro	Leu	Phe His Mec 110
Gly	Trp Tyr His Leu Phe Tyr 115	Gin Tyr Asn 120	Pro Tyr	Ala 125	Pro Phe Trp
Gly	Asn Met Thr Trp Gly His 130 135	Ala Val Ser	Lys Asp 140	Met	Ile Asn Trp
Phe 145	Glu Leu Pro Ile Ala Leu 150	Ala Pro Thr	Glu Trp 155	Tyr	Asp Ile Glu 160
Gly	Val Leu Ser Gly Ser Thr 165	Thr Ile Leu 170	Pro Asp	Gly	Arg Ile Phe 175
Ala	Leu Tyr Thr Gly Asn Thr 180	Asn A.sp Leu 135	Glu Gin	Leu	Gin Cys Lys 190
Ala	Val Pro Val Asn Ala Ser 195	Asp Pro Leu 200	Leu Val	Glu 205	Trp Val Arg
Tyr	Asp Ala Asn Pro Ile Leu 210 215	Tyr Ala Pro	Ser Gly 220	Ile	Gly Leu Thr
Asp 225	Tyr Arg Asp Pro Ser Thr 230	Val Trp Thr	Gly Pro 235	Asp	Gly Lys Eis 240
Arg	Met Ile Ile Gly Thr Lys 245	Arg Asn Thr 250	Thr Gly	Leu	Val Leu Val 255
Tyr	His Thr Thr Asp Phe Thr 260	Asn Tyr Val 265	Met Leu	Asp	Glu Pro Leu 270

His Ser Val Pro Asn Thr Asp Met Trp Glu Cys Val Asp Leu Tyr Pro

275 280 285

Val Ser Thr Thr Asn Asp Ser Ala Leu Asp Val Ala Ala Tyr Gly Pro 250 295 300

Gly Ile Lys His Val Leu Lys Glu Ser Trp Glu Gly His

Ala

Met

Asp 320

305

310

315

Phe

Tyr

Ser

Ile

Gly

Thr

Tyr

Asp

Ala

Phe

Asn

Asp

Lys

Trp

Thr

Pro

325

330

335

Asp

Asn

Pro

Glu

Leu

Asp

Val

Gly

Ile

Gly

Leu

Arg

Cys

Asp

Tyr

Gly

340

345

350

Arg

Phe

Phe

Ala

Ser

Lys

Ser

Leu

Tyr

Asp

Pro

Leu

Lys

Lys

Arg

Arg

355

360

365

Val

Thr

Trp

Gly

Tyr

Val

Ala

Glu

Ser

Asp

Ser

Tyr

Asp

Gin

Asp

Val

370

375

380

Ser

Arg

Gly

Trp

Ala

Thr

Ile

Tyr

Asn

Val

Ala

Arg

Thr

Ile

Val

Leu

385

390

395

400

Asp

Arg

Lys

Thr

Gly

Thr

His

Leu

Leu

Gin

Trp

Pro

Val

Glu

Glu

Ile

405

410

415

Glu

Ser

Leu

Arg

Ser

Asn

Gly

His

Glu

Phe

Lys

Asn

Ile

Thr

Leu

Glu

420

425

430

Pro

Gly

Ser

Ile

Ile

Pro

Leu

Asp

Val

Gly

Ser

Ala

Thr

Gin

Leu

Asp

435

440

445

Ile

Val

Ala

Thr

Phe

Glu

Val

Asp

Gin

Glu

Ala

Leu

Lys

Ala

Thr

Ser

450

455

460

Asp

Thr

Asn

Asp

Glu

Tyr

Gly

Cys

Thr

Thr

Ser

Ser

Gly

Ala

Ala

Lys

465

470

475

480

Gly

Glu

Val

Leu

Asp

His

Ser

Giy

Ile

Ala

Val

Leu

Ala

His

Gly

Thr

485

490

495

Leu

Ser

Glu

Leu

Thr

Pro

Val

Tyr

Phe

Tyr

Ile

Ala

Lys

Asn

Thr

Lys

500

505

510

Gly Gly

Val

Asp

Thr

His

Phe

Cys

Thr

Asp

Lys

Leu

Arg

Ser

Ser

Tyr

515

520

525

Asp

Tyr

Asp

Gly

Glu

Lys

Val

Val

Tyr

Gly

Ser

Thr

Val

Pro

Val

Leu

535

540

530

-21 CZ 299825 B6

Asp Gly Glu Glu Phe Thr Met Arg Ile Leu Val Asp His Ser Val Val

545 550 555 560

Glu Gly Phe Ala Gin Gly Gly Arg Thr Val Ile Thr Ser Arg Val Tyr

565 570 575

Pro Thr Lys Ala Ile Tyr Glu Ala Ala Lys Leu Phe Val Phe Asn Asn 580 585 590

Ala Thr Thr Thr Ser Val Lys Ala Thr Leu Lys Val Trp Gin Met Ser 595 600 605

Gin Ala Phe Val Lys Ala Tyr Pro Phe 610 6*5

- 77 C7. 29982S Β6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

ÍA) DÉLKA: 2073párů baží fBj TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA:jednoduché ÍD) TOPOLOGIE: lineární (iii TYP MOLEKULY: cDNA ; i11) ΗΥΡΟΤΕΤΓΟΚΑ: ano (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(Aí lTMÉNC/OZNA-CENI : CDS (Bj POZICE: 21 . . 1K?2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 3

TTACCTCATT TCCATCAACC ATG AGA ACG ACT GAA CCC CAA ACT GAC CTT Met Arg Thr Thr Glu Pro Gin Thr Asp Leu

620 625

GAG

CAT

GCA

CCC

AAC

CAC

ACT

CCA

CTA

CTG

GAC

CAC

CCC

GAA

CCA

CCA

Glu

His

Ala 630

Pro

Asn

His

Thr

Pro 635

Leu

Leu

ASp

His

Pro 640

Glu

Pro

Pro

CCG

GCC

GCC

GTG

AGA

AAC

CGG

TTG

TTG

ATT

AGG

GTT

TCG

TCC

AGT

ATC

Pro

Ala 645

Ala

Val

Arg

Asn

Arg 650

Leu

Leu

Ile

Arg

Val 6 5 5

Ser

Ser

Ser

Ile

ACA

TTG

GTC

TCT

CTG

TTT

TTT

GTT

TCA

GCA

TTC

CTA

CTC

ATT

CTC

CTC-

Thr 660

Leu

Val

Ser

Leu

Phe 665

phe

Val

Ser

Ala

Phe 670

Leu

Leu

Ile

Leu

Leu 675

TAC

CAA

CAC

GAT

TCC

ACT

TAC

ACC

GAT

GAT

AAT

TCA

GCA

CCG

TCG

GAA

Tyr

Gin

His

Asp

Ser 630

Thr

Tyr

Thr

Asp

Asp 6S5

Asn

Ser

Ala

Pro

Ser 690

Glu

AGT

TCT

TCC

CAG

CAG

CCC

TCC

GCT

GCC

GAT

CGC

CTG

AGA

TGG

GAG

AGA

Ser

Ser

Ser

Gin 695

Gin

Pro

Ser

Ala

Ala 700

Asp

Arg

Leu

Arg

Trp 705

Glu

Arg

ACA

GCT

TTT

CAT

TTC

CAG

ccc

GCC

AAA

AAT

TTC

ATT

TAT

GAT

CCC

AAC

Thr

Ala

Phe 710

His

Phe

Gin

Pro

Ala 715

Lys

Asn

Phe

Ile

Tyr 720

Asp

Pro

Asn

GGT

CCA

TTG

TTC

CAT

ATG

GGT

TGG

TAC

CAT

CTT

TTC

TAC

CAA

TAC

AAC

Gly

Pro

Leu

Phe

His

Met

Gly

Trp

Tyr

His

Leu

Phe

Tyr

Gin

Tyr

Asn

725 730 735

146

194

242

290

338

386

-23CL 299825 Bó

CCG TAC GCT CCC TTT TGG GGA AAC ATG ACT TGG GGA CAT GCC GTC AGT Pro Tyr Ala Pro Phe Trp Gly Asn Met Thr Trp Gly His Ala Val Ser

434

740

745

750

755

AAG

GAT

ATG

ATA

AAT

TGG

TTT

GAA

TTA

CCG

ATA

GCC

TTA

GCG

CCA

ACT

482

Lys

Asp

Met

Ile

Asn

Trp

Phe

Glu

Leu

Pro

Ile

Ala

Leu

Ala

Pro

Thr

760

765

770

GAG

TGG

TAC

GAC

ATA

GAA

GGT

GTT

CTG

AGT

GGC

AGT

ACT

ACC

ATT

TTA

530

Glu

Trp

Tyr

Asp

Ile

Glu

Gly

Val

Leu

Ser

Gly

Ser

Thr

Thr

Ile

Leu

775

730

785

CCT

GAC

GGA

AGA

ATT

TTC

GCT

CTC

TAC

ACC

GGA

AAT

ACA

AAC

GAC

CTC

578

Pro

Asp

Gly

Arg

Ile

Phe

Ala

Leu

Tyr

Thr

Gly

Asn

Thr

Asn

Asp

Leu

790

795

800

GAG

CAG

CTC

CAG

TGT

AAG

GCC

GTG

CCA

GTT

AAT

GCT

AGT

GAT

CCA

TTA

626

Glu

Gin

Leu

Gin

Cys

Lys

Ala

Val

Pro

Val

Asn

Ala

Ser

Asp

Pro

Leu

805

810

815

TTG

GTA

GAA

TGG

GTT

CGC

TAC

GAT

GCC

AAT

CCG

ATA

TTA

TAT

GCC

CCT

674

Leu

Val

Glu

Trp

Val

Arg

Tyr

Asp

Ala

Asn

Pro

Ile

Leu

Tyr

Ala

Pro

820

825

630

835

AGT

GGC

ATC

GGC

CTC

ACA

GAT

TAC

AGA

GAT

CCT

AGT

ACT

GTG

TGG

ACG

722

Ser

Gly

Ile

Gly

Leu

Thr

Asp

Tyr

Arg

Asp

Pro

Ser

Thr

Val

Trp

Thr

840

845

850

GGC

CCT

GAC

GGT

AAA

CAC

CGT

ATG

ATA

ATC

GGG

ACG

AAG

AGG

AAT

ACG

770

Gly

Pro

Asp

Gly

Lys

His

Arg

Met

Ile

Ile

Gly

Thr

Lys

Arg

Asn

Thr

855

860

865

ACT

GGA

CTC

GTC

TTA

GTA

TAT

CAC

ACT

ACC

GAC

TTT

ACA

AAT

TAT

GTA

818

Thr

Gly

Leu

Val

Leu

Val

Tyr

His

Thr

Thr

Asp

Phe

Thr

Asn

Tyr

Val

870

875

880

ATG

TTG

GAC

GAG

CCG

TTG

CAC

TCG

GTC

CCC

AAC

ACT

GAT

ATG

TGG

GAA

866

Met

Leu

Asp

Glu

Pro

Leu

His

Ser

Val

Pro

Asn

Thr

Asp

Met

Trp

Glu

885

890

895

TGT

GTC

GAC

CTT

TAC

CCT

GTG

TCA

ACG

ACC

AAC

GAT

AGT

GCA

CTT

GAT

914

Cys

Val

Asp

Leu

Tyr

Pro

Val

Ser

Thr

Thr

Asn

Asp

Ser

Ala

Leu

Asp

900

905

910

915

GTT

GCG

GCC

TAT

GGT

CCG

GGT

ATC

AAG

CAT

GTG

CTT

AAA

GAA

AGT

TGG

962

Val

Ala

Ala

Tyr

Gly

Pro

Gly

Ile

Lys

His

Val

Leu

Lys

Glu

Ser

Trp

920

925

930

GAG

GGA

CAC

GCG

ATG

GAC

TTT

TAC

TCG

ATC

GGG

ACA

TAC

GAT

GCA

TTT

1010

Glu

Gly

His

Ala

Met

ASp

Phe

Tyr

Ser

Ile

Gly

Thr

Tyr

Asp

Ala

Phe

935 940 945

-24Cl 299825 Bó

AAC GAT AAG TGG ACA CCC GAT AAT CCC GAA CTA GAC GTC GGT ATC GGG 1058

Asn Asp Lys Trp Thr Pro Asp Asn Pro Glu Leu Asp Val Gly ile Gly

950 955 960

TTG CGG TGC GAT TAC GGA AGG TTC TTT GCG TCG AAG AGC CTC TAC GAC 1106

Leu Arg Cys Asp Tyr Gly Arg Phe Phe Ala Ser Lys Ser Leu Tyr Asp

965 970 975

CCG TTG AAG AAA CGA AGA GTC ACT TGG GGT TAT GTT GCG GAA TCC GAC 1154

Pro Leu Lys Lys Arg Arg Val Thr Trp Gly Tyr Val Ala Glu Ser Asp

980 985 990 995

AGT TAC GAC CAA GAC GTC TCT AGA GGA TGG GCT ACT ATT TAT AAT GTT 1202

Ser Tyr Asp Gin Asp Val Ser Arg Gly Trp Ala Thr Ile Tyr Asn Val

1000 1005 1010

GCA AGG	ACC ATT GTA CTC GAT CGG AAG ACT GGA ACC CAT CTA CTT CAA	1250
Ala	Arg	Thr Ile Val Leu 1015	Asp Arg	Lys Thr Gly Thr His Leu Leu	Gin
1020	1025
TGG	CCG	GTG GAG GAA ATC	GAG AGC	TTG AGA TCC AAC	GGT CAT GAA	TTC	1298
Trp	Pro	Val Glu Glu Ile	Glu Ser	Leu Arg Ser Asn	Gly His Glu	Phe
		1030	1035	1040
AAA	AAT	ATA ACA CTT GAG	CCG GGC	TCG ATC ATT CCC	CTC GAC GTA	GGC	1346
Lys	Asn	Ile Thr Leu Glu	Pro Gly	Ser Ile Ile Pro	Leu Asp Val	Giy
	1045	1050	1055
TCA	GCT	ACG CAG TTG GAC	ATC GTT	GCA ACA TTT GAG	GTG GAT CAA	GAG	1394
ser	Ala	Thr Gin Leu Asp	Ile Val	Ala Thr Phe Glu	Val Asp Gin	Glu
1060	1065	1C70		1075
GCG	TTA	AAA GCA ACA AGT	GAC ACG	AAC GAC GAA TAC	GGT TGC ACC	ACA	1442
Ala	Leu	Lys Ala Thr Ser	Asp Thr	Asn Asp Glu Tyr	Gly Cys Thr	Thr
		1080		1085	1090
AGT	TCG	GGT GCA GCC AAA	GGG GAA	GTT TTG GAC CAT	TCG GGG ATT	GCA	1490
Ser	Ser	Gly Ala Ala Lys	Giy Glu	Val Leu Asn His	Ser Gly Ile	Ala
		1095		11Q0	1105
GTT	CTT	GCC CAC GGA ACC	CTT TCG	GAG TTA ACT CCG	GTG TAT TTC	TAC	1538
Val	Leu	Ala His Gly Thr	Leu Ser	Glu Leu Thr Pro	Val Tyr Phe	Tyr
		1110	1115	1120
ATT	GCT	AAA AAC ACC AAG	GGA GGT	GTG GAT ACA CAT	TTT TGT ACG	GAT	1586
Ile	Ala	Lys Asn Thr Lys	Gly Gly Val Asp Thr His	Phe Cys Thr	Asp
	1125	1130	1135

-25 CZ 299825 B6

AAA CTA AGG TCA TCA TAT GAT TAT GAT GGT GAG AAG GTG GTG TAT GGC 16 34

Lys Leu Arg Ser Ser Tyr Asp Tyr Asp Gly Glu Lys Val Val Tyr Gly

1140 1145 1150 1155

AGC ACC GTC CCA GTG CTC GAC GGC GAA GAA. TTC ACA ATG AGG ATA TTG 1682

Ser Thr Val Pro Val Leu Asp Gly Glu Glu Phe Thr Met Arg Ile Leu

1160 1165 1170

GTG GAT CAT TCG GTG GTG GAG GGG TTT GCA CAA GGG GGA AGG ACA GTA 173 0

Val Asp His Ser Val Val Glu Gly Phe Ala Gin Gly Gly Arg Thr Val

1175 1180 1185

ATA ACG TCA AGA GTG TAT CCC ACG AAA GCA ATA TAC GAA GCA GCC AAG 1778

Ile Thr Ser Arg Val Tyr Pro Thr Lys Ala Ile Tyr Glu Ala Ala Lys

1190 1195 1200

CTT TTC GTC TTC AAC AAT GCC ACT ACG ACC AGT GTG AAG GCG ACT CTC 1826

Leu Phe Val Phe Asn Asn Ala Thr Thr Thr Ser Val Lys Ala Thr Leu

1205 1210 1215

AAG GTC TGG CAA ATG TCT CAA GCC TTT GTC AAG GCT TAT CCG TTT T 1872

Lys Val Trp Gin Met Ser Gin Ala Phe Val Lys Ala Tyr Pro Phe

1220 1225 1230

AGTTTTTTAT GCATCTTTTT AAGACATTGT TGTTTCATAT GATTCAAGTT TTATCTGTGT 1932

GTTATGTTAA GACACGCAGC TTAAAATAGC CACATGTGAG ATCATTTGCG TATGGCCGTC 1992

AACTATTTTT TAATATGCAA CTTCAGTAAT GCTATTTACA GTATGTTTTA AGGAAAAAAA 2052

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A 2 0 73 !21 INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

ÍA) DÉLKA: 617 aminokyselin ÍB) TYP: aminokyseliny (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

-26CZ 299825 B6

(	xi)	popis	SEKVENCE:	SEKVENCE S	ID	. č.	4:
Met 1	Arg	Thr Thr	Glu Pro Gin 5	Thr Asp Leu 10	Glu	His	Ala Pro Asn His 15
Thr	Pro	Leu Leu 20	Asp His Pro	Glu Pro Pro 25	Pro	Ala	Ala Val Arg Asn 30
Arg	Leu	Leu Ile 35	Arg Val Ser	Ser Ser Ile 40	Thr	Leu	Val Ser Leu Phe 45
Phe	Val 50	Ser Ala	Phe Leu Leu 55	Ile Leu Leu	Tyr	Gin 60	His Asp Ser Thr
Tyr 65	Thr	Asp Asp	Asn Ser Ala 70	Pro Ser Glu	Ser 75	Ser	Ser Gin Gin Pro 80
Ser	Ala	Ala Asp	Arg Leu Arg 85	Trp Glu Arg 90	Thr	Ala	Phe His Phe Gin 95
Pro	Ala	Lys Asn 100	Phe Ile Tyr	Asp Pro Asn 105	Gly	Pro	Leu Phe His Met 110
Gly	Trp	Tyr His 115	Leu Phe Tyr	Gin Tyr Asn 120	Pro	Tyr	Ala Pro Phe Trp 125
Gly	Asn 130	Met Thr	Trp Gly His 135	Ala Val Ser	Lys	Asp 140	Met Ile Asn Trp
Phe 145	Glu	Leu Pro	Ile Ala Leu 150	Ala Pro Thr	Glu 155	Trp	Tyr Asp Ile Glu 160
Gly	Val	Leu Ser	Gly Ser Thr 165	Thr Ile Leu 170	Pro	Asp	Gly Arg Ile Phe 175
Ala	Leu	Tyr Thr 180	Gly Asn Thr	Asn Asp Leu 185	Glu	Gin	Leu Gin Cys Lys 190
Ala	Val	Pro Val 195	Asn Ala Ser	Asp Pro Leu 200	Leu	Val	Glu Trp Val Arg 205
Tyr	Asp 210	Ala Asn	Pro Ile Leu 215	Tyr Ala Pro	Ser	Gly 220	Ile Gly Leu Thr
Asp 225	Tyr	Arg Asp	Pro Ser Thr 230	Val Trp Thr	Gly 235	Pro	Asp Gly Lys His 240
Arg	Met	Ile Ile	Gly Thr Lys 245	Arg Asn Thr 250	Thr	Gly	Leu Val Leu Val 255
Tyr	His	Thr Thr 260	Asp Phe Thr	Asn Tyr Val 265	Met	Leu	Asp Glu Pro Leu 270

-27 CZ 299825 B6

His Ser	Val 275	Pro	Asn Thr Asp Met 280	Trp Glu	Cys	Val	Asp Leu 285	Tyr Pro
Val Ser	Thr	Thr	Asn Asp Ser Ala	Leu Asp	Val	Ala	Ala Tyr	Gly Pro
290			295			300
Gly Ile	Lys	His	Val Leu Lys Glu	Ser Trp	Glu	Gly	His Ala	Met Asp
305			310		315			320
Phe Tyr	Ser	Ile	Gly Thr Tyr Asp	Ala Phe	Asn	Asp	Lys Trp	Thr Pro
			325	330				335
Asp Asn	Pro	Glu	Leu Asp Val Gly	Ile Gly	Leu	Arg	Cys Asp	Tyr Gly
		340		345			350
Arg Phe	Phe	Ala	Ser Lys Ser Leu	Tyr Asp	Pro	Leu	Lys Lys	Arg Arg
	355		360				365
Val Thr	Trp	Gly	Tyr Val Ala Glu	Ser Asp	Ser	Tyr	Asp Gin	Asp Val
370			375			380
Ser Arg	Gly	Trp	Ala Thr Ile Tyr	Asn Val	Ala	Arg	Thr Ile	Val Leu
385			390		395			400
Asp Arg	Lys	Thr	Gly Thr His Leu	Leu Gin	Trp	Pro	Val Glu	Glu Ile
			405	410				415
Glu Ser	Leu	Arg	Ser Asn Gly His	Glu Phe	Lys	Asn	Ile Thr	Leu Glu
		420		425			430
Pro Gly	Ser	Ile	Ile Pro Leu Asp	Val Gly	Ser	Ala	Thr Gin	Leu Asp
	435		440				445
Ile Val	Ala	Thr	Phe Glu Val Asp	Gin Glu	Ala	Leu	Lys Ala	Thr Ser
450			455			460
Asp Thr	Asn	Asp	Glu Tyr Gly Cys	Thr Thr	Ser	Ser	Gly Ala	Ala Lys
465			470		475			480
Gly Glu	Val	Leu	Asp His Ser Gly	Ile Ala	Val	Leu	Ala His	Gly Thr
			485	490				495
Leu Ser	Glu	Leu	Thr Pro Val Tyr	Phe Tyr	Ile	Ala	Lys Asn	Thr Lys
		500		505			510
Gly Gly	Val	Asp	Thr His Phe Cys	Thr Asp	Lys	Leu	Arg Ser	Ser Tyr
	515		520				525
Asp Tyr	Asp	Gly	Glu Lys Val Val	Tyr Gly	Ser	Thr	Val Pro	Val Leu

530 535 540

28CZ 299825 B6

Asp 545

Gly Glu Glu Phe

Thr Met Arg Ile Leu Val Asp His Ser Val Val

550

555

560

Glu

Gly

Phe

Ala

Gin 565

Gly Gly Arg

Thr

Val 570

Ile

Thr

Ser

Arg

Val 575

Tyr

Pro

Thr

Lys

Ala 530

Ile

Tyr

Glu Ala

Ala 5Θ5

Lys

Leu

Phe

Val

Phe 590

Asn

Asn

Ala

Thr

Thr 595

Thr

Ser

Val

Lys Ala 600

Thr

Leu

Lys

Val

Trp 605

Gin

Met

Ser

Gin

Ala

Phe

Val

Lys

Ala

Tyr Pro

Phe

610 615

Claims (29)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   5 1. Molekula nukleové kyseliny kódující protein s enzymatickou aktivitou fruktosyltransferázy (FFT) vedoucí k syntéze vysokomolekulárních fruktanových polymerů, jejichž molekuly obsahují v průměru více než 20 fruklosylových zbytků, přičemž molekula nukleové kyseliny je vybrána ze skupiny zahrnující:

   io (a) molekuly nukleové kyseliny kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako id. č. 2 a id, ě. 4;

   (b) molekuly nukleové kyseliny obsahující kódující sekvenci uvedenou jako id. ě. 1 nebo id. ě. 3, nebo odpovídající ribonukleotidovou sekvenci:

   (c) molekuly nukleové kyseliny obsahující nuklcotidovou sekvenci přinejmenším z 80 % identickou s kódující sekvencí uvedenou v id. č. I;

   (d) molekuly nukleové kyseliny kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci přinej20 menším z 85 % identickou s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v id. č. 2: a (e) molekuly nukleové kyseliny obsahující fragment nukleotídové sekvence zčásti (a), (b). (c) nebo (d).
2. 2? 2. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, která obsahuje nuklcotidovou sekvenci zvíce než 90 % identickou s kódující sekvencí uvedenou v id. ě. 1.
3. 3. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1. kde aminokyselinová sekvence kódovaného proteinu je z více než 90 % identická s aminokyselinovou sekvencí id. č. 2.

   3(i
4. 4. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, kde aminokyselinová sekvence kódovaného proteinu je z více než 95 % identická s aminokyselinovou sekvencí id. č. 2.
5. 5. Molekula nukleové kyseliny podle nároku I, kde aminokyselinová sekvence kódovaného

   55 proteinu je z více než 97 % identická s aminokyselinovou sekvencí id. ě. 2.
6. 6. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1. kde aminokyselinová sekvence kódovaného proteinu je z více než 99 % identická s aminokyselinovou sekvencí id. č. 2.

   40
7. 7. Molekula nukleové kyseliny podle nároků 1 až 6, kterou je molekula DNA.
8. 8. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 7, kterou je molekula cDNA.
9. 9. Molekula nukleové kyseliny podle některého z nároků 1 až 6, kterou je molekula RNA.
10. 10. Molekula nukleové kyseliny podle některého z nároků 1 až 9. která pochází z artyeoku.
11. 11. Vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků I až 10.

    so
12. 12. Vektor podle nároku 11. kde molekula nukleové kyseliny je operativně spojena s regulačními prvky, které zajišťují transkripci a syntézu translatovatelné RNA v prokaryotiekýeh a/nebo eukaryotických buňkách.
13. 13. Vektor podle nároku 12. kde regulační prvky jsou odvozeny z promotoru B33 genu patatinu

    55 nebo promotoru 35S CaMV.

    -30CZ 299825 B6
14. 14, Hostitelská buňka transformovaná molekulou nukíeové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10. nebo vektorem podle kteréhokoliv z nároků 11 až 13, nebo buňka, která je odvozena z takové buňky, kde tyto odvozené buňky obsahují uvedenou molekulu nukíeové kyseliny nebo

    5 uvedeny vektor.
15. 15. Hostitelská buňka podle nároku 14, která navíe obsahuje gen kódující sacharózofruktosyb transferázu (SST) závislou na sacharóze.

    io
16. 16. Způsob přípravy FFT, vyznačující se tím, že hostitelské buňky podle nároku 14 se kultivují v podmínkách, které umožňují syntézu FFT, a pak se FFT izoluje zkultivovaných buněk a/nebo kultivačního média.
17. 17. FFI kódovaná molekulou nukíeové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, nebo při15 pravená způsobem podle nároku 16.
18. 18. Způsob přípravy transformovaných hostitelských buněk podle nároku 14 nebo 15. zejména transgenních rostlinných buněk, transgenních rostlinných pletiv a transgenních rostlin, vyznačující se tím. žc obsahuje krok, kdy se vnese molekula nukíeové kyseliny podle

    2o kteréhokoliv z nároků 1 až 10 nebo vektor podle kteréhokoliv z nároků 11 až 13 do hostitelské buňky, rostlinné buňky, rostlinného pletiva nebo rostliny.
19. 19. Transformovaná hostitelská buňka, transgenní rostlinná buňka, rostlinné pletivo nebo rostlina, které obsahují molekulu nukíeové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků I až 10, nebo vektor

    25 podle kteréhokoliv z nároků 11 až 13, nebo které jsou připravitelné způsobem podle nároku 18, nebo které jsou odvozeny z takových buněk, pletiv nebo rostlin, kde uvedená odvozená buňka, pletivo nebo rostlina obsahuje uvedenou molekulu nukíeové kyseliny nebo uvedený vektor.
20. 20. Transformovaná hostitelská buňka, transgenní rostlinná buňka, rostlinné pletivo nebo rostli.w na podle nároku 19, které navíc obsahují gen kódující sacharózefruktosyl-transferázu (SST) závislou na sacharóze.
21. 21. Rostlina obsahující rostlinné buňky nebo rostlinné pletivo podle nároku 19 nebo 20.

    35
22. 22, Rostlina podle kteréhokoliv z nároků 19 až 21. kterou je užitková rostlina.
23. 23. Rostlina podle nároku 22. kde užitková rostlina je rostlina obsahující sacharózu.
24. 24. Množitelský materiál rostlin podle kteréhokoliv z nároku 19 až 23, obsahující rostlinné buň4íi ky podle nároku 19 nebo 20.
25. 25. Sklizňové produkty rostlin podle kteréhokoliv z nároků 19 až 23, obsahující rostlinné buňky podle nároku 19 nebo 20.

    45
26. 26. Způsob výroby vysokomolekulárního inulinu, jehož molekuly obsahují v průměru více než

    20 fruktosylových zbytků, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) kultivaci transformované hostitelské buňky, transgenní rostlinné buňky nebo rostlinného pletiva podle nároku 19 nebo 20, nebo rostliny podle kteréhokoliv z nároků 19 až 23 za podmínek,

    50 které umožňují tvorbu FF I a přeměnu I-kestózy. případně dodávané zvenčí, nebo ekvivalentního substrátu, na tento vysokomolekulární inulin. a (b) izolováni takto vytvořeného inulinu zkultivovaných buněk, pletiv nebo rostlin nebo z kultivačního média.
27. 27. Způsob výroby vysokomolekulárního inulinu. jehož molekuly obsahují v průměru více než 20 fruktosylových zbytků, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) přivedení 1-kestózy nebo ekvivalentního substrátu do kontaktu s FFT podle nároku 17 za 5 podmínek, které umožňují přeměnu na tento vysokomolekulární inulin, a (b) izolování takto vytvořeného inulinu.
28. 28. Způsob in vitro výroby vysokomolekulárního inulinu. jehož molekuly obsahují v průměru io více než 20 fruktosylových zbytků, vyznačující sc tím. žc se saeharóza, jakožto substrát, přemění na vysokomolekulární inulin působením kombinace enzymů obsahující SST a FFT podle nároku 17.
29. 29. Použití vysokomolekulárního inulinu. jehož molekuly obsahují v průměru více než 20 fruk15 losy lovýeh zbytků, připravitelného z hostitelské buňky, rostlinné buňky nebo rostlinného pletiva podle nároku 19 nebo 20, z rostliny podle kteréhokoliv z nároků 19 až 23, z množitelskcho materiálu podle nároku 24, nebo ze sklizňového produktu podle nároku 25, nebo za pomoci způsobu podle kteréhokoliv z nároku 26 až 28 k výrobě surfaktantů ke zvýšení viskozity vodných systému, jako detergentů. suspendačního činidla, pro urychlení sedimentace a pro komplexování nebo

    20 vázání vody.