CZ293065B6

CZ293065B6 - Indolové deriváty, jejich použití a farmaceutický prostředek

Info

Publication number: CZ293065B6
Application number: CZ19971176A
Authority: CZ
Inventors: Chris Paul Miller; Michael David Collini; Bach Dinh Tran
Original assignee: Wyeth
Priority date: 1996-04-19
Filing date: 1997-04-17
Publication date: 2004-02-18
Also published as: JPH1036347A; EP0802184B1; IL120699A0; KR970069986A; ATE219485T1; DE69713441D1; EA000815B1; AU718888B2; HK1002862A1; NO308214B1; HU9700779D0; NO971814D0; DK0802184T3; AR006705A1; EA199700043A1; HUP9700779A1; EP0802184A1; NO971814L; CO4950540A1; CN1168373A

Abstract

Řešení se týká nových indolových derivátů, které jsou použitelné jako estrogenní látky. Součást řešení tvoří také farmaceutické prostředky, které tyto látky obsahují a používají se k prevenci ztráty kostní tkáně, náhradě estrogenů a prevenci srdečních a cévních onemocnění po menopauze.ŕ

Description

Vynález se týká nových indolových derivátů, které jsou použitelné jako estrogenní látky. Součást vynálezu tvoří také farmaceutické prostředky, které tyto látky obsahují a používají se k prevenci ztráty kostní tkáně, náhradě estrogenů a prevenci srdečních a cévních onemocnění po menopauze. Součást řešení tvoří také použití popsaných indolových derivátů pro výrobu farmaceutických prostředků.

Dosavadní stav techniky

Použití hormonové substituční terapie při prevenci úbytku kostní hmoty u post-menopauzálních žen je dobře známé. Normální protokol uvádí pro estrogenové doplnění použití takových přípravků, které obsahují estron, estriol, ethinylestradiol nebo konjugované estrogeny izolované z přírodních zdrojů (Premarin od Wyeth-Ayerst). U některých pacientů může být terapie kontraindikována proliferativními účinky estrogenů bez protikandidáta (estrogeny nejsou podávány v kombinaci s progestiny) na děložní tkáň. Tato proliferace je spojena se zvýšeným rizikem endometriozní a/nebo endometriální rakoviny. Působení estrogenů bez protikandidáta na tkáň prsu je méně jasné, ale je poněkud rakovinotvomé. Potřeba estrogenů, které si mohou udržovat vliv šetření kostního úbytku za minimalizace proliferativních účinků v děloze a prsu je zřejmá. Určité nesteroidní antiestrogeny byly shledány jako udržující kostní hmotu v modelu ovarektomizovaných krys jakož i v klinických zkouškách na lidech. Tamoxifen například je paliativně vhodný pro léčbu rakoviny prsu. Bylo demonstrováno, že vykazuje vliv podobný vlivu estrogen agonisty na kosti u lidí. Nicméně je také parciální agonista v děloze a toto je příklad hodný zájmu. Raloxifen, benzothiofenový antiestrogen, byl shledán jako stimulující děložní růst u ovariektomizované krysy v menším rozsahu než tamoxifen při zachování schopnosti šetřit kosti. Vhodný přehled tkáňově selektivních estrogenů poskytuje: Tissue-selective Actions Of Estrogen Abalogs, Bone vol. 17, č. 4, říjen 1995, 181S-190S.

Použití indolů jako estrogen antagonistů bylo popsáno von Angererem, Chemical Abstract, vol. 99, č. 7 (1983), abstrakt č. 53886u. Viz také J. Med. Chem. 1990, 33, 2635-2640; J. Med. Chem. 1987, 30, 131-136. Viz také zveřejněný spis DE 3821148 Al 891228 a WO 96/03375. Dále viz WO 93/23374 (Otsuka Pharmaceutical Factory, lne.). Von Angererova práce je omezena na alifatické řetězce připojené k indolovému dusíku a pak připojené k bazickému aminu (nebo amidu) nebo benzylovým skupinám nevykazujícím bazický amin. Dokument Otsuky (Japonsko) zahrnuje sloučeniny týkající se předloženého vynálezu s výjimkou že R₃ (jak je uvedeno ve vzorci I) je definováno jako -SR, kde R je alkyl. Dále v těchto nejsou žádné řetězce z indolového dusíku se stejnou strukturou jako je uvedena v předloženém vynálezu, buď v nárocích nebo příkladech. Příbuzný spis WO A 93 10741 popisuje 5-hydroxyindoly. WO A 95 1783 (Kar Bio AB) popisuje sloučeniny s alifatickým řetězcem.

WO A 95 17383 (Káro Bio AB) popisuje indolové antiestrogeny s dlouhými přímými řetězci. Jiný dokument WO A 93 10741 popisuje 5-hydroxyindoly se širokým rozsahem postranních řetězců. WO 93/23374 (Otsuka Pharmaceuticals, Japonsko) popisuje sloučeniny velmi podobné struktury jako mají sloučeniny podle předloženého vynálezu s výjimkou struktury označené jako R₃ v předložených vzorcích I a II dále, definované jako thioalkyl a tato práce nepopisuje žádné sloučeniny, mající řetězce z indolového dusíku, mající stejnou strukturu jako mají sloučeniny poskytnuté předloženým vynálezem.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří indolové deriváty obecného vzorce I a II

Ri je vybrán z H, OH nebo jejich C]-C₄esterů nebo jejich alkyletherů nebo atomů halogenu,

R₂, R₃, Rt, R_s a Ré jsou nezávisle vybrány z H, OH nebo jejich Ci-C₄esterů nebo jejich alkyletherů, halogenu, kyano, Ci-C₆alkylu nebo trifluormethylu s tou podmínkou, že je-li Ri atom vodíku, není R₂ skupina OH, n je 2 nebo 3,

X je vybrán z H, Cj-Cealkylu, kyano, nitro, trifluormethylu, halogenu,

Z je vybrán z ne'o° __c==_cHCH2)(rY.

0 — CH=CH-C—Y

Y je vybrán ze

a) skupiny kde R₇ a R_g jsou nezávisle vybrány ze skupiny, zahrnující H, Ci-C₆alkyl, fenyl nebo společně tvoří -(CH₂)p-, kde p je celé číslo od 2 do 6, takže tvoří kruh, který je popřípadě substituován až třemi substituenty vybranými ze skupiny, zahrnující hydroxyl, halogen, Ci-C₄alkyl, trihalogenmethyl, Ci-C₄alkoxy, trihalogenmethoxy, Ci-C₄alkylthio, Ci-C₄alkylsulfínyl, Ci-C₄alkylsulfonyl, hydroxy(Ci-C₄)alkyl, -CO₂H, -CN, -CONH(Ci-C₄)alkyl, -NH₂, Ci-C₄alkylamino, di(Ci-C₄)alkylamino, -NHSO₂(Cj-C₄)alkyl, -NHCO(C₍-C₄)alkyl a-NO₂.

b) pěti-, šesti- nebo sedmičlenného nasyceného, nenasyceného nebo částečně nenasyceného heterocyklu, obsahujícího až dvě heteroatomy vybrané ze skupiny, zahrnující -Ο-, -NH-, -N(Ct-C₄alkyl), -N= a -S(O)_m-, kde m je celé číslo od 0 do 2, popřípadě substituovaného 1 až 3 substituenty nezávisle vybranými ze skupiny, zahrnující hydroxyl, halogen, Ct-C₄alkyl, trihalogenmethyl, C]-C₄alkoxy, trihalogenmethoxy, C]-C₄acyloxy, C_l-C₄alkylthio, Cj-C₄alkylsulfinyl, Ci~C₄alkylsulfonyl, hydroxy(C]-C₄)alkyl, -CO₂H-, -CN, -CONHRi, -NH₂, (C_t-C₄)

-2CZ 293065 B6 alkylamino, di(Ci-C₄)alkylamino, -NHSO₂R|, -NHCOR_b -NO₂; fenyl substituovaný 1 až 3 (Ci-C₄)alkylskupinami,

c) bicyklického kruhového systému, zahrnujícího pěti- nebo šestičlenný heterocyklický kruh kondenzovaný k fenylovému kruhu, kde uvedený heterocyklický kruh obsahuje až dva heteroatomy vybrané ze skupiny, zahrnující -Ο-, -NH-, -N(Ci-C₄alkyl)- a -S(O)_m-, kde m je celé číslo od 0 do 2, popřípadě substituovaného 1 až 3 substituenty nezávisle vybranými ze skupiny, zahrnující hydroxyl, halogen, Ci-C₄alkyl, trihalogenmethyl, Ci-C₄alkoxy, trihalogenmethoxy, Ci-C₄acyloxy, C]-C₄alkylthio, Ci-C₄alkylsulfmyl, Ci~C₄alkylsulfonyl, hydroxy(Ci-C₄)alkyl, fenyl substituovaný 1 až 3 (C]-C₄)alkylskupinami, -C0₂H, -CN, -CONHRi, -NH₂, (Ci-C₄)alkylamino, di(Ci-C₄)alkylamino, -NHSO₂Ri, -NHCORi, -NO₂, a fenyl popřípadě substituovaný 1 až 3 (C|-C₄)alkylskupinami;

a jejich farmaceuticky přijatelné soli.

Kruhy vytvořené spojením R? a R₈ uvedené výše mohou zahrnovat, ale nejsou tak omezeny, aziridin, azetidin, pyrrolidin, piperidin nebo hexamethylenaminový kruh.

Dále je výhodné, když R? a R₈ jsou vzájemně spojeny jako -(CH₂)_P~, tak vytvořený kruh je popřípadě substituován 1 až 3 substituenty vybranými ze skupiny, zahrnující Ci-C₃alkyl, trifluormethyl, halogen, fenyl, nitro, -CN.

Nejvíce jsou ze sloučenin podle předloženého vynálezu preferovány ty, které mají strukturní vzorce 1 nebo II uvedené výše, kde R! je OH; R₂-R« mají výše definovaný význam; X je vybrán ze skupiny, zahrnující Cl, NO₂, CN, CF₃ nebo CH₃; a Y je skupina

I fy a R₇ a R₈ jsou spolu vzájemně spojeny a znamenají -fCH₂)_p-, kde p je celé číslo od 4 do 6, za vzniku kruhu popřípadě substituovaného až třemi substituenty vybranými ze skupiny, zahrnující hydroxyl, halogen, Ci-C₄alkyl, trihalogenmethyl, Ci-C₄alkoxy, trihalogenmethoxy, C]-C₄alkylthio, Ci-C₄alkylsulfinyl, C]-C₄alkylsulfonyl, hydroxy(Ci-C₄)alkyl, -CO₂H-, -CN-, -CONH(C]—C₄)alkyl, -NH₂, (C]-C₄)alkylamino, di(Ci-C₄)alkylamino, -NHSO₂(Cj-C₄), -NHCO(C!-C₄)alkyl a -NO₂ a jejich farmaceuticky přijatelné soli.

Vynález zahrnuje přijatelné soli vytvořené adiční reakcí s buď anorganickými nebo organickými kyselinami. Jsou vhodné jak anorganické kyseliny, jako je kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina jodovodíková, kyselina sírová, kyselina fosforečná, kyselina dusičná, tak organické kyseliny, jako je kyselina octová, kyselina propionová, kyselina citrónová, kyselina maleinová, kyselina jablečná, kyselina vinná, kyselina fialová, kyselina jantarová, kyselina methansulfonová, kyselina toluensulfonová, kyselina naftalensulfonová, kyselina kafrsulfonová, kyselina benzensulfonová. Je známo, že sloučeniny, obsahující bazický dusík, mohou být komplexovány s mnoha různými kyselinami (jak protickými tak neprotickými) a obvykle je preferováno podávat sloučeninu podle vynálezu ve formě adiční soli s kyselinami.

Sloučeniny podle vynálezu jsou parciální estrogen agonisté a vykazují vysokou afinitu kestrogenu receptoru. Na rozdíl od mnoha estrogenů nepůsobí tyto sloučeniny zvýšení vlhké hmotnosti dělohy. Tyto sloučeniny jsou antiestrogenní v děloze a mohou plně antagonizovat trofické účinky estrogen agonistů ve tkáni dělohy. Tyto sloučeniny jsou antiestrogenní v děloze a mohou plně antagonizovat trofické účinky estrogen agonistů ve tkáni dělohy. Tyto sloučeniny jsou vhodné

-3 CZ 293065 B6 pro léčení nebo prevenci savčích chorobných stavů nebo syndromů, které jsou způsobeny nebo spojeny s deficiencí estrogenu.

Předložené sloučeniny mají schopnost se chovat podobně jako estrogen agonisté pro snižování cholesterolu a bránění kostní ztráty. Proto jsou tyto sloučeniny vhodné pro léčení mnoha chorob, zahrnujících osteoporózu, prostatickou hypertrofii, infertilitu, rakovinu prsu, endometriální rakovinu, kardiovaskulární choroby, antikoncepci, Alzheimerovu chorobu a melanom. Dále mohou být tyto sloučeniny použity pro hormonovou substituční terapii u post-menopauzálních žen nebo jiné estrogen deficientní stavy, kde by doplnění estrogenu mohlo být přínosem.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu mohou být také použity v metodách léčení kostního úbytku, který může vznikat u jednotlivce z nerovnováhy ve tvorbě nové kostní tkáně a resorpce starších tkání, vedoucí k čistému úbytku kosti. Taková kostní deplece vzniká v okruhu jednotlivců, zejména u post-menopauzálních žen, žen, které byly podrobeny hysterektomii, u těch, které dostávaly nebo se očekává, že budou dostávat kortikosteroidní terapie, s gonadální dysgenezí a u těch, které jsou postiženy Cushingovým syndromem. Speciální potřeba kostního doplnění může být také směrována použitím těchto sloučenin k jednotlivcům s kostními frakturami, defektivními kostními strukturami a těm, kteří byli podrobeni kostní chirurgii a/nebo implantaci protézy. Navíc kvýše popsaným potížím mohou tyto sloučeniny být použity při léčeních osteoartritidy, Pagetovy choroby, osteomalacie, osteohalisterézy, endometriální rakoviny, mnohotného myelomu a jiných forem rakoviny, majících škodlivý vliv na kostní tkáně. Metody léčení chorob zde uvedených zahrnují podání jednotlivci v případě potřeby takového léčení, farmaceuticky účinného množství jedné nebo více sloučenin podle tohoto vynálezu nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli. Tento vynález také zahrnuje farmaceutické kompozice, využívající jednu nebo více sloučenin podle předloženého vynálezu a/nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí, společně s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči, přísadami atd.

Je třeba vzít na vědomí, že dávka, režim a způsob podání těchto sloučenin se budou měnit podle léčení nemoci a individuálního léčeného stavu a budou zcela v rozhodnutí ošetřujícího lékaře. Je preferováno, že podání jedné nebo více sloučenin začíná v nízké dávce a zvyšuje se až do dosažení požadovaného účinku.

Účinné podání těchto sloučenin může být dosaženo dávkou od asi 0,1 mg/den do asi 1000 mg/den. Výhodně bude podání od asi 50 mg/den do asi 600 mg/den v jediné dávce nebo ve dvou nebo více rozdělených dávkách. Takové dávky budou podávány jakýmkoliv způsobem vhodným při směrování účinných sloučenin do příjemcova krevního proudu, zahrnujícím orální, parenterální (zahrnující intravenózní, intraperitoneální a subkutánní injekce) a transdermální způsob podání. Pro účel tohoto popisu se transdermálním podáním rozumí všechna podání přes povrch těla a vnitřní výstelky tělesných částí, zahrnujících epiteliální a mukosální tkáně. Taková podání mohou být provedena za použití předložených sloučenin nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí, v lotionech, krémech, pěnách, náplastích, suspenzích, roztocích a čípcích (rektálních a vaginálních).

Orální formulace, obsahující aktivní sloučeniny podle tohoto vynálezu, mohou být v jakýchkoliv obvykle používaných orálních formách, zahrnujících tablety, kapsle, bukální formy, trocheje, lozengy a orální kapaliny, suspenze nebo roztoky. Kapsle mohou obsahovat směsi aktivní sloučeniny(nin) s inertními plnivy a/nebo ředidly, jako jsou farmaceuticky přijatelné škroby (např. kukuřičný, bramborový nebo tapiokový škrob), cukry, umělá sladící činidla, práškované celulózy jako jsou krystalické a mikrokrystalické celulózy, moučky, želatiny, gumy atd. Vhodné tabletové formulace mohou být vyrobeny běžným slisováním, metodami mokré granulace nebo suché granulace a za použití farmaceuticky přijatelných ředidel, pojiv, lubrikantů, dezintegrantů, suspendačních nebo stabilizačních činidle, zahrnujících, ale neomezených takto, stearát hořečnatý, kyselinu stearovou, talek, laurylsulfát sodný, mikrokrystalickou celulózu, vápenatou karboxymethylcelulózu, polyvinylpyrrolidon, želatinu, kyselinu alginovou, akaciovou gumu, xanthanovou gumu, citrát sodný, komplexní silikáty, uhličitan vápenatý, glycin, dextrin, sacharózu,

-4CZ 293065 B6 sorbitol, fosforečnan dvojvápenatý, síran vápenatý, laktózu, kaolin, mannitol, chlorid sodný, talek, suché škroby a práškovaný cukr. Orální formulace mohou využívat standardní uvolnění nebo to mohou být přípravky uvolňující s časem pro úpravu absorpce aktivní sloučeniny(nin). Cípkové formulace mohou být vyrobeny z tradičních materiálů, zahrnujících kakaové máslo, s nebo bez přídavku vosků pro úpravu teploty tání čípků a glycerin. Ve vodě rozpustné čípkové báze, jako jsou polyethylenglykoly různých molekulových hmotností, mohou být také použity.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu mohou být syntetizovány obecně podle schémat 1 a 2 uvedených dále.

Počátek indolové syntézy podle schématu 1 se provede zahříváním vhodně substituovaného anilinu (1) se vhodně substituovaným alfa-bromfenylpropriofenonem (2) ve vhodném vysokovroucím rozpouštědle jako je DMF. Produkt se pak alkyluje se 4-brombenzylbromidem za získání substituovaného indolu (3). V tomto bodě se provádí deprotekce fenolu (je-li přítomna chránící skupina). Normálně jsou fenoly chráněny jako benzylethery a mohou být běžně štěpeny pomocí TMSI. Akrylamidy jsou kondenzovány za použití podmínek Heckovy reakce buď v čistém Et₃n nebo Et₃N/CH₃CN.

-5CZ 293065 B6

Schéma 2

^r7^^N'_Rb 2- PdCl2(PPh3)2 piperidin ,ⁿ?

==—(CH^n—N, Re

Počátek indolové syntézy podle schématu 2 může být proveden zahříváním vhodně substituovaného anilinu (1) se vhodně substituovaným alfa-bromfenylalkyl-fenonem (2) ve vhodném 5 vysokovroucím rozpouštědle jako je DMF. Produkt se pak alkyluje se 4-jodbenzylbromidem za získání substituovaného indolu (3). V tomto bodě je provádí deprotekce fenolu (je-li přítomna chránicí skupina). Normálně jsou fenoly chráněny jako benzylethery a mohou být vhodně štěpeny pomocí TMSI. Propargylaminy mohou pak být kondenzovány k fenyljodidu. Propargylaminy jsou typicky připraveny z alkinylbromidu nebo alkinyltosylátu substitucí se vhodným ío aminem. Substituční reakce probíhá in šitu, bez izolace propargylaminu. Sloučeniny substituované v poloze 3 se skupinami jinými než alkyl mohou být připraveny nejprve připravením indolu substituovaného v poloze 3 -H. Indol pak může být elektrofilně halogenován, formylován atd. za získání jiných 3-substituovaných sloučenin.

Rozpouštědla použitá zde pro reakce jsou bezvodá Aldrich Sure Seal™ bez dalšího čištění. Činidla jsou typicky Aldrich a použitá bez dalšího čištění. Všechna reakce se provádějí pod atmosférou dusíku. Chromatografie se provádí za použití silikagelu 230 až 400 mesh (Měrek Grade 60, Aldrich Chemical Company). Chromatografie na tenké vrstvě se provádí pomocí Silica Gel F254 ploten od EM Science. *H NMR spektra byla získána na přístroji Bruker AM-400 20 v DMSO a chemické posuny jsou uváděny v ppm. Teploty tání byly stanoveny na přístroji Thomas-Hoover a jsou nekorigovány. IR spektra byla zaznamenána na Perkin-Elmer difrakčních mřížkových nebo Perkin-Elmer 784 spektrofotometrech. Hotová spektra byla zaznamenána na spektrometrech Kratos MS 50 nebo Finnigan 8230. Elementární analýzy byly získány s Perkin-Elmer 2400 elementárním analyzátorem. Hodnota analýzy jsou v 0,4 % teorie.

Předložený vynález je dále ilustrován následujícími neomezujícími příklady.

-6CZ 293065 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

5-Benzyloxy-2-(4-benzyloxy-fenyl)-3-methyl-lH-indol

Baňka se naplní 4-benzyloxyanilinem (45 g, 0,23 mol), 4'-benzyloxy-2-bromfenylpropiofenonem (21 g, 0,066 mol) a DMF (50 ml). Reakční směs se zahřívá pod refluxem 30 min a pak se ochladí na teplotu místnosti a pak se rozdělí mezi EtOAc (250 ml) a IN HC1 (vod.) (100 ml). EtOAc se promyje NaHCO₃ (vod.) a solankou, suší se nad MgSO₄. Roztok se zahustí a zbytek se vyjme do CH₂C1₂ a hexany se přidají pro vysrážení 25 g surové pevné látky. Pevná látka se rozpustí v CH₂C1₂ a odpaří a chromatografuje na silikagelu za použití CH₂Cl₂/hexany (1:5) a získá se 9,2 g rezavé pevné látky (33 %): t.t. 150 až 152 °C.

’H NMR (DMSO) 10,88 (s, 1H), 7,56 (d, 2H, J=8,8 Hz), 7,48 (d, 4H, J= 7,9 Hz), 7,42-7,29 (m, 6H), 7,21 (d, 1H, J = 7,0 Hz), 7,13 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 7,08 (d, 1H, J = 2,2 Hz), 6,94 (dd, 1H, J = 8,8, 2,4 Hz), 5,16 (s, 2H), 5,11 (s, 2H), 2,33 (s, 3H); IR (KBr) 3470, 2880, 2820, 1620 cm¹; MS el m/z 419.

Příklad 2 5-Benzyloxy-2-(4-fluor-fenyl)-3-methyl-lH-indol

Titulní sloučenina se připraví podobně jako (3):

t.t. = 132 °C; ’H NMR (DMSO) 11,0 (s, 1H), 7,68-7,64 (m, 2H), 7,49-7,47 (m, 2H), 7,41-7,31 (m, 5H), 7,23 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 7,10 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 6,82 (dd, 1H, J = 8,8, 2,4 Hz), 5,11 (s, 2H), 2,34 (s, 3H); MS El m/z 331;

CHN vypočteno pro C₂₂H]₈FNO.

Příklad 3 5-Benzyloxy-2-(4-benzyloxy-fenyl)-3-methyl)-l-ylmethyl-(4-fenylbromid)-indol

Roztok 60% NaH (0,17 g, 7,1 mmol) v DMF (20 ml) se ochladí na 0 °C a zpracuje se po kapkách s přídavkem benzyloxyindolu 1 (2,5 g, 5,94 mmol) v DMF (10 ml). Po 15 min se přikape 4'-brombenzylbromid (1,63 g, 6,53 mmol) v DMF (10 ml). Reakční směs se míchá 5 min při 0 °C a pak při teplotě místnosti dalších 20 min. Reakční směs se zředí etherem (300 ml) a promyje se NH₄C1 (2 x 25 ml), potom NaHCO₃ (1 x 25 ml) a solankou (25 ml). Organické extrakty se suší nad MgSO₄ a zahustí. Zbytek se krystaluje z THF/hexanů za získání 2,7 g (77 %) 2: t.t. 144 až 146 °C; *H NMR (CDC1₃) 7,51-7,36 (m, 8 H), 7,34 (d, 4H, J = 8,6 Hz), 7,20 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 7,15 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,03-7,00 (m, 3H), 6,89 (dd, 1H, J = 8,8, 2,4 Hz), 6,80 (d, 2H, J = 8,6 Hz), 5,14 (s, 2H), 5,12 (s, 2H), 5,09 (s, 2H), 2,25 (s, 3H); IR (KBr) 3400, 3020, 1600 cm'¹; MS el m/z 587.

Příklad 4 5-benzyloxy-2-(4-fluor-fenyl)-3-methyl)-l-ylmethyl-(4-fenylbromid)-indol

Titulní sloučenina se připraví podobně jako sloučenina 5.

T.t. 139 až 139,5 °C; 1H NMR (DMSO) 7,49-7,46 (m, 2H), 7,41-7,37 (m, 6H), 7,33-7,27 (m, 4H), 7,24 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 7,16 (d, 1H, J = 2,2 Hz), 6,84 (dd, 1H, J = 8,8, 2,4 Hz), 6,73

-7CZ 293065 B6 (d, IH, J = 8,6 Hz), 5,2 (s, 2H), 5,12 (s, 2H), 2,15 (s, 3H); IR (KBr) 2920, 1630 cm’¹; MS e I m/z (499/501, Br přítomen); CHN vypočteno pro C₂9H₂₃BrFNO.

Příklad 5

2-(4-Hydroxyfenyl)-3-methyl)-l-ylmethyl-(4-fenylbromid)indol-5-ol

Roztok, obsahující 5 (0,5 g, 0,85 mmol) v CH₂C1₂ (10 ml) se zpracuje přídavkem po kapkách 3,5 ekv TMSI (0,47 ml, 3,0 mmol) při teplotě místnosti. Po pár hodinách se reakce ukončí tak, že se přidají další 2,2 ekv. TMSI a reakční směs se zahřívá pod refluxem 5 h. Reakční směs se ochladí na 0 °C a pro přerušení rekce se přidá pomalu methanol. Směs se zředí etherem (25 ml) a promyje se NaHCO₃ (25 ml), 10% Na₂SO₃ (25 ml) a solankou. Etherová vrstva se suší nad síranem hořečnatým a zahustí a nanese na silikagel. Chromatografii s EtOAc/hexany (1:4 až 1:1) se získá 0,25 g 3 (71 %): t.t. 83 až 86 °C; 'H NMR (CDC1₃) 2 H z fenolů široká (> 10), s 7,35 (d, 2H, J = 9,0 Hz), 7,15 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 7,01 (dd, IH, J = 8,6 Hz), 6,72 (dd, IH, J = 8,6, 2,4 Hz), 5,10 (s, 2H), 4,88 (s, IH), 4,50 (s, IH), 2,21 (s, 3H); MS el m/z 407/409 obsahuje Br; IR 3390, 2900, 1600 cm’¹; CHN vypočteno pro C₂₂Hi₈BrNO₂ + 25 EtOAc.

Příklad 6

2-(4-Fluor-fenyl)-3-methyl)-l-ylmethyl-(4-fenylbromid)-indol-5-ol

Titulní sloučenina se připraví podobně jako sloučenina 7 a izoluje se jako pěna. *H NMR (DMSO) 8,79 (s, IH), 7,39-7,34 (m, 4H), 7,32-7,30 (m, 3H), 7,11 (d, IH, J = 8,8 Hz), 6,85 (d, IH, J = 2,2 Hz), 6,74 (d, IH, J = 2,4 Hz), 6,63 (dd. IH, J = 8,6, 2,2 Hz), 5,16 (d, 2H), 2,11 (s, 3H); IR (KBr) 3400, 2900, 1630 cm’¹; MS el m/z 409/411 obsahuje Br.

Obecný postup pro indolakrylamidyRoztok z příkladu 3 vEt₃N se zpracuje se tri-o-tolylfosfonem (10% mol), a akrylamidem (1,25 ekv.), profoukne se N₂ a přidá se Pd(OAc)₂ (2,5 % mol). Reakční směs se zahřívá na 100 až 110 °C v zatavené truce až pod TLC je reakce úplná. Surový reakční produkt se zahustí a bud’ přímo krystaluje nebo se chromatografuje na silikagelu.

Příklad 7 (E)-N,N-Diethyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-fenyl)-3-methyl)indol-l-ylmethyl]fenyl }-akrylamid

T.t. 160 až 165 °C; ’H NMR 9,67 (s, IH), 8,72 (s, IH), 7,50 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,37 (d, IH, J = 15,4 Hz), 7,17 (d, 2H J = 8,3 Hz), 7,06 (d, 1 H, J = 8,8 Hz), 6,97 (d, 2 H, J = 15,4 Hz), 6,86-6,82 (m, 5H), 6,58 (dd, 1 H, J = 8,6,2,2 Hz), 5,19 (br s, 2 H), 3,47-3,42 (m, 2H), 3,34-3,30 (m, 2H), 2,09 (s, 3H), 1,10 (t, 3H, J = 7,0 Hz); IR (KBr) 3300, 2950, 1660, 1580 cm'¹; MS (el) m/z 454; CHN vypočteno pro C₂9H₃₀N₂O₃+0,15 CH₂Cl₂+0,30 H₂O.

Příklad 8 l(E)-N-terc.Butyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-fenyl)-3-methyl)-indol-l-ylmethyl]fenyl}-akrylamid.

T.t. = 168 až 170 °C; ’H NMR 9,66 (s, IH), 8,71 (s, IH), 7,66 (s, IH), 7,34 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 7,24 (d, IH, J = 15,8 Hz), 7,15 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 7,05, (d, IH, J = 8,6 Hz), 6,85-6,82 (m, 5H, 6,59-6,56 (m, IH), 6,55 (d, IH, J = 16,0 Hz), 5,18 (s, 2H), 2,11 (s, 3H), 1,28 (s, 9 H); IR (KBr) 3350, 2950,1660, 1620; MS (el) m/z; CHN vypočteno pro C₂₉H₃₀N₂O₃+0,4 H₂O.

-8CZ 293065 B6

Příklad 9 (E)-pyrrolidino-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-fenyl}-3-methyl)-indol-l-ylmethyl]-fenyl}akrylamid

T.t. = 170 až 175 °C; *H NMR 9,67 (s, IH), 8,71 (s, IH), 7,49 (d, 2 H, J = 8,1 Hz), 7,35 (d, 1 H, J = 15,4 Hz), 7,16 (d, 2 H, J = 8,6 Hz), 7,05 (d, 1 H, J = 8,8 Hz), 6,88-6,81 (m, 6H), 6,57 (dd, 1 H, J = 8,6, 2,2 Hz), 5,19 (br s, 2H), 3,56 (t, 2 H, J = 6,6 Hz), 3,35 (m, 2H), 2,11 (s, 3H), 1,87 (p, 2H, J = 7,0 Hz), 1,77 (p, 2 H, J=7,0 Hz); MS m/z 452; CHN vypočteno pro C₂₉H₂₈N₂O₃+0,l NeOH+ 1,3 H₂O.

Příklad 10 (E)-N,N-Dimethyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-fenyl)-3-methyl)-indol-l-ylmethyl]fenyl }-akrylamid

T.t. = 278 až 280 °C; 'H NMR (DMSO) 9,65 (s, IH), 8,70 (s, IH), 7,50 (d, 2 H, J = 8,1 Hz), 7,33 (d, 1 H, J = 15,4 Hz), 7,15 (d, 2H, J = 8,6 Hz), 7,07 (d, 1 H, J = 15,6 Hz), 7,05 (d, 1 H, J = 8,8 Hz), 6,85-6,80 (m, 5 H), 6,57 (dd, 1 H, J = 8,6, 2,4 Hz), 5,19 (s, 2H), 3,09 (s, 3 H), 2,88 (s, 3H), 2,11 (s, 3H); MS el m/z 426; IR (KBr) 3410, 3220, 1650, 1580 cm’¹; CHN vypočteno pro C₂₇H₂₆N₂O₃+0,5 H₂O.

Příklad 11 (E)-N,N-Dibutyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-fenyl-3-methyl)-indol-l-ylmethyl]fenyl [-akrylamid

T.t. = 126 až 128 °C; ^]H NMR (DMSO) 9,65 (s, IH), 8,70 (s, IH), 7,48 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 7,36 (d, 1 H, J = 15,2 Hz), 7,16 (d, 2H, J = 8,6 Hz), 7,05 (d, IH, J = 8,6 Hz), 6,97 (d, IH, J = 15,2 Hz), 6,86-6,81 (m, 5H), 6,57 (dd, IH, J = 8,8, 2,4 Hz), 5,19 (s, 2H), 3,39 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 3,29 (t, 2 H, J = 7,2 Hz), 2,11 (S, 3 H), 1,48-1,43 (M, 4 H), 1,29-1,20 (m, 4H), 0,87 (t, 6 H, J = 7,2 Hz); MS el m/z 510; IR (KBr) 3300, 2920, 2900, 2850, 1650, 1625, 1580 cm'¹; CHN vypočteno pro C₃₃H₃₈N₂O₃.

Příklad 12 (E)-N-Butyl, N'-methyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-fenyl)-3-methyl)-indol-l-ylmethyl]-fenyl }-akrylamid

T.t. = 240 až 242 °C; *H NMR (DMSO) 9,66 (s, IH), 8,70 (s, IH), 7,50 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,387,32 (m, IH), 7,16 (d, J = 6,8 Hz), 7,06-7,01 (m, 2H), 6,85-6,81 (m, 5 H), 6,57 (dd, 1 H, J = 8,6, 2,2 Hz), 5,19 (s, 2H), 3,44, 3,33 (2 t, 2 H, J = 7,2 Hz), 3,06, 2,87 (2 s, 3H), 2,11 (s, 3H), 1,45 (m, 2H), 1,24 (p, 2 H, J = 7,5 Hz), 0,87 (t, 3 H, J = 7,2 Hz); Ms el m/z 468; IR (KBr) 3300 1660, 1590 cm’¹; CHN vypočteno pro C₃₀H₃₂N₂O₃+0,2 H₂O.

Příklad 13 (E)-Morfolino-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-fenyl)-3-methyl)indol-l-ylmethyl]-fenyl}akrylamid

T.t. = 165 až 167 °C; *H NMR (DMSO) 9,66 (s, IH), 8,71 (s, IH), 7,52 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,39 (d, 1 H, J = 15,4 Hz); 7,15 (d, 2 H, J = 8,6 Hz), 7,12 (d, 1 H, J = 15,4 Hz), 7,06 (d, IH, J = 8,6 Hz), 6,85-6,81 (m, 5 H), 6,57 (dd, IH, J = 8,6, 2,2 Hz), 5,19 (s, 2H), 3,65-3,64 (m, 2H),

-9CZ 293065 B6

3,59-3,53 (m, 6H), 2,11 (s, 3H); IR (KBr) 3330, 1650, 1620, 1580 cm’¹; MS (FAB) m/z 469 (M+H⁺); CHN vypočteno pro C₂9H₂gN₂O₄ + 0,5 H₂O.

Příklad 14 (E)-3-{4-[5-Hydroxy-2-(4-hydroxy-fenyl)-3-methyl)indol-I-ylmethyl]-fenyl}akrylamid

T.t. = 161 až 163 °C, 'H NMR (DMSO) 9,65 (s, IH), 8,70 (s, IH), 7,48 (s, IH), 7,37 (d, 2H, J = 8,35 Hz), 7,30 (d, 1 H, J = 15,8 Hz), 7,14 (d, 2 H, J = 8,35 Hz), 7,04 (d, 2H, J = 8,6 Hz), 6,85-6,81 (m, 5H), 6,57 (dd, 1 H, J = 8,8, 2,4 Hz), 6,48 (d, 1 H, J = 15,8 Hz), 5,18 (s, 2H), 2,10 (s, 3 H); IR (KBr) 3320, 3180, 1660, 1580 cm’; MS (FAB) m/z 399 (M+H)⁺; CHN vypočteno pro C25H22N2O3+1,1 H₂O.

Příklad 15 (E)-N-methyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-fenyl)-3-methyl)indol-l-ylmethyl]-fenyl}akrylamid

T.t. 155 až 158 °C; ‘Η NMR (DMSO) 9,64 (s, IH), 8,70 (s, IH), 7,99 (q, IH, J = 4,4 Hz), 7,37 (d, 2 H, J = 8,1 Hz), 7,30 (d, 1 H, J = 15,8 Hz), 7,14 (d, 2 H, J = 8,6 Hz), 7,03 (d, IH, J = 8,6 Hz), 6,85-6,81 (m, 5H), 6,57 (dd, 1 H, J = 8,6, 2,4 Hz), 6,48 (d, 1 H, J = 15,8 Hz), 5,18 (s, 2H), 2,66 (d, 3 H, J = 4,6 Hz), 2,10 (s, 3H); IR (KBr), 3400, 1660, 1620 cm'¹; MS el m/z 412; CHN vypočteno pro 0₂₆Η₂₄Ν₂0₃ + 0,4 H₂O.

Příklad 16 (E)-N,N-Dibutyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-fluor-fenyl)-3-methyl)-indol-l-ylmethyl]-fenyl}akrylamid

T.t. = 180 °C; ’H NMR (DMSO) 8,77 (s, IH), 7,48 (d, 2 H, J = 8,4 Hz), 7,41 - 7,38 (m, 3H), 7,38-7,29 (m, 3H), 7,13 (d, 1 h, J = 8,8 Hz), 6,97 (d, 1 H, J = 15,4 Hz), 6,85 (d, 1 H, J = 2,4 Hz), 6,80 (d, 2 H, J = 8,1 Hz), 5,2 (s, 2H), 3,40-3,36 (m, 2H), 3,30-3,27 (m, 2H), 2,10 (s, 3 H), 1,50-1,40 (m, 4H), 1,29-1,21 (m, 4H), 0,86 (t, 6H, J = 7,2 Hz); IR (KBr) 3180, 2950, 2900, 2850,1650, 1590 cm’¹; MS el m/z 512; CHN vypočteno pro C33H3₇N₂O₂.

Příklad 17 (E)-N-Butyl,N'-methyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-fluor-fenyl)-3-methyl)-indol-l-ylmethyl]fenyl }-akrylamid

T.T. = 153 až 153,5 °C; *H NMR (DMSO) 8,77 (s, IH), 5,70 (d, 2 H, J = 8,1 Hz), 7,42-7,36 (m,2H), 7,35-7,28 (m, 3H), 7,13 (d, IH, J = 8,8 Hz), 7,03 (dd, 1 H, J = 15,4, 2,6 Hz), 6,84 (d, IH, J = 2,4 Hz), 6,80 (d, 2 H, J = 8,1 Hz), 6,62 (dd, 1 H, J = 8,8, 2,4 Hz), 5,21 (s, 2 H), 3,44, 3,41 (2 T, 2 H, J = 7,0 Hz), 3,06, 2,87 (2 s, 3 H), 2,10 (s, 3H), 1,49-1,42 (m, 2 H), 1,27-1,20 (m, 2 H), 0,86 (t, 3 H); IR (KBr) 3300, 2950, 2860, 1645, 1580 cm'¹; MS el m/z 470; CHN vypočteno pro C3oH_3IFN₂0₂.

Příklad 18

5-Benzyloxy-2-(4-benzyloxy-fenyl)-3-methy 1-1 H-indol

Do baňky se umístí 4-benzyloxyanilin (45 g, 0,23 mol) 4'-benzyloxy-2-bromfenylpropiofenon (21 g, 0,066 mol) a DMF (50 ml). Reakční směs se zahřívá pod refluxem 30 minut a pak ochladí na teplotu místnosti a pak se rozdělí mezi EtOAc (250 ml) a IN HC1 (vod.) (100 ml). EtOAc se

-10CZ 293065 B6 promyje NaHCO₃ (vod.) a solankou, suší se nad MgSO₄. Roztok se zahustí a zbytek se vyjme do CFLCba přidají se hexany pro vysrážení 25 g surové pevné látky. Pevná látka se rozpustí v CH₂C1₂ a odpaří, nanese na silikagel a chromatografuje za použití CH₂Cl₂/hexanu (1:5) a získá se 9,2 g rezavohnědé pevné látky (33 %):

t.t. 150 až 152 °C; ^]H NMR (DMSO) 10,88 (s, 1H), 7,56 (d, 2 H, J = 8,8 Hz),7,48 (d, 4 H, J = 7,9 Hz), 7,42-7,29 (m, 6H), 7,21 (d, 1 H, J = 7,0 Hz), 7,13 (d, 2 H, J = 8,8 Hz), 7,08 (d, 1 H, J = 2,2 Hz), 6,94 (dd, 1 H, J = 8,8, 2,4 Hz), 5,16 (s, 2 H), 5,11 (s, 2 H), 2,33 (s, 3 H); IR (KBr) 3470, 2880, 2820, 1620 cm'¹; MS el m/z 419.

Příklad 19 5-Benzyloxy-2-(4-benzyloxy-fenyl)-3-methyl)-l-ylmethyl-(4-fenyljodid)-indol

Roztok 4 (3,0 g, 7,4 mmol) v DMF (25 ml) se zpracuje s NaH (60% disperze, 0,21 g, 8,9 mmol) a míchá se při teplotě místnosti 15 minut. Přidá se 4-jodbrombenzylbromid (2,2 g, 7,4 mmol) a reakce se míchá 1 hodinu. Reakční směs se nalije do vody a extrahuje se EtOAc, suší se nad MgSO₄ a zahustí se. Triturací surového produktu s etherem se získá 2,2 g produktu jako bílé pevné látky:

t.t 153 až 156 °C; 'H NMR (DMSO) 7,54 (d, 2 H, J = 8,6 Hz), 7,52-7,45 (m, 4H), 7,37-7,29 (m, 6H), 7,27 (d, 2 H, J = 8,8 Hz), 7,17 (d, 1 h, J = 9,0 Hz), 7,13 (d, 1 H, J = 2,2 Hz), 7,10 (d, 2 H, J = 8,8 Hz), 6,81 (dd, 1 H, J = 8,8, 2,4 Hz), 6,60 (d, 2 H, J = 8,3 Hz); 5,18 (s, 2H), 5,12 (s, 2 H), 5,11 (s, 2 H), 2,15 (s, 3 H); MS el m/z 635.

Příklad 20

3-(4-Hydroxyfenyl)-3-methyl)-l-ylmethyl-(4-fenyljodid)indol-5-ol

Roztok 4 (2,2 g, 3,5 mmol) v CHCI3 se zpracuje s jodtrimethylsilanem (1,04 ml, 7,0 mmol) a reakce se zahřívá pod refluxem. Po 2 hodinách se přidá další 3 ekv. jodtrimethylsilanu a reakce se míchá při teplotě místnosti 18 h. Reakce se přeruší přídavkem MeOH (5 ml). Organická vrstva se promyje vodným 10% roztokem Na₂SO3, HC1 (1M) a suší se nad MgSO₄. Roztok se zahustí a chromatografuje se na silikagelu s EtOAc/hexanem (3:7), získá se 4a jako pěna (1,2 g):

'H NMR 9,65 (s, 1H), 8,71 (s, 1H), 7,54 (d, 2H, J = 8,6 Hz), 7,12 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 7,02 (d, 1 H, J = 8,6 Hz), 6,84-6,80 (m, 3H), 6,61 (d, 2 H, J = 8,3 Hz), 6,57 (dd, 1 H, J = 6,4 Hz), 5,12 (s, 2 H), 2,09 (s, 3H); MS el m/z 455.

Obecný postup pro přípravu indolpropargylaminu

Titulní sloučeniny z příkladů 21 až 23 se připraví za použití roztoku, obsahujícího lOnásobný molámí přebytek sekundárního aminu v DMF ochlazeného na 0 °C a zpracováním s propargylbromidem (3 ekv., 80% roztok v toluenu). Po 1 h při 0 °C se reakční směsi nechají ohřát na teplotu místnosti na 1 hodinu. Pak se přidá indoljodid (4a, 1 ekv.) následovaný Cul (0,1 ekv.) a Pd(pPh₃)₂Cl₂ (0,035 ekv.). Reakční směs se pak míchá 16 až 48 hodin a zpracuje se nalitím do vody a extrakcí do EtOAc. EtOAc se zahustí a chromatografuje se na silikagelu za použití EtOAc/hexanu jako elučního systému.

Příklad 21

2-(4-Hydroxy-fenyl)-3-methyl-l-[4-(3-N,N-dimethyl-l-yl-prop-l-inyl)-enzyl]-lH-indol5-01

T.t. = 173 až 176 °C; *H NMR (DMSO) 9,64 (s, 1H), 8,70 (s, 1H), 7,25 (d, 2 H, J = 8,1 Hz), 7,12 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 7,03 (d, 1 H, J = 8,6 Hz), 6,83-6,78 (m, 5 H), 6,57 (dd, 1 H, J = 8,8, 2,4 Hz),

-11 CZ 293065 B6

5,17 (s, 2 H) 3,39 (s, 2 H), 2,19 (s, 6 H), 2,10 (s, 3 H); IR (KBr) 3390, 1490 cm¹; MS esl 411 (M+H)\

Příklad 22

2-(4-Hydroxy-fenyl)-3-methyl-l-[4-(3-piperidin-l-yl-prop-l-inyl)-benzyl]-lH-indol-5-ol

T.t. = 118 až 123 °C; *H NMR (DMSO) 9,65 (s, IH), 8,71 (s, IH), 7,14 (d 2 H, J = 8,1 Hz), 7,12 (d, 2 H, J = 8,6 Hz), 7,02 (d, 1 H, J = 8,6 Hz), 6,83-6,80 (m, 5 Hz), 6,57 (dd, 1 H, J = 8,6, 2,2 Hz), 5,17 (s, 2 H), 3,39 (s, 2 H), 2,41 (m 4H), 2,10 (s, 3H), 1,48 (p, 4 H, J = 5,7 Hz), 1,36-1,33 (m, 2H); IR (KBr) 3400, 2920, 1620, 1420 cm’¹; MS El m/z 450; CHN vypočteno pro C₃oH₃oN₂0₂+0,25 H₂O.

Příklad 23 2-(4-Hydroxy-fenyl)-3-methyl-l-[4-(3-pyrrolidin-l-yl-prop-l-inyl}-benzyI]-lH-indol-5ol(5c)

T.t. = 174 až 176 °C; ^]H NMR (DMSO) 9,64 (s, IH), 8,70 (s, IH), 7,23 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 7,11 (d, 2 H, J = 8,6 Hz), 7,02 (d, 1 H, J = 8,8 Hz), 6,84 (m, 5 H), 6,57 (dd, 1 H, J = 8,6, 2,2 Hz), 5,17 (s, 2 H), 3,53 (s 2H), 2,53-2,51 (m, 4H), 2,09 (s, 3H), 1,69-1,66 (m, 4H); IR (KBr) 3400, 2920, 2900, 1620 cm'¹; MS el m/z 436; CHN vypočteno pro C₂₉H₂₈N₂O₂+ 0,7 H₂O.

Biologické metody

In vitro vazebný esej estrogen receptorů

Příprava receptorů

CHO buňky nadměrně exprimující estrogen receptor rostly ve 150mm² miskách v DMEM + 10% dextranem potaženým aktivním uhlím stripovaného fetálního hovězího séra. Plotny byly promyty dvakrát sPBS a jednou s 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA. Buňky byly sklizeny seškrabáním povrchu a pak byla buněčná suspenze umístěna na led. Buňky byly rozrušeny v ruce drženým motorovým tkáňovým mlýnkem za použití dvou lOsekundových impulzů. Surový přípravek byl odstřeďován při 1200 g po 20 minut s následujícím 60 minutovým otáčením při 100000 g za vzniku ribosomu prostého cytosolu. Cytosol se pak zmrazí a uchovává při -80 °C. Proteinová koncentrace cytosolu byla hodnocena za použití BCA eseje s referenčním standardním proteinem.

Podmínky vazebné eseje

Kompetiční esej byl proveden na 96-jamkové plotně (polystyren*), která váže <2,0 % celkového vstupu [³H]-17fJ-estradiolu a každý datový bod byl sejmut třikrát. Na jamku bylo rozděleno 100 pG/100 μΐ receptorového přípravku. Sytící dávka 2,5 nM [³H]17fJ-estradiolu + kompetitoru (nebo pufru) v 50 μΐ objemu byl přidána v předběžné kompetici, když byl hodnocen lOOx a 500x kompetitor, pouze byl použit 0,8 nM [³H]17|3-estradiol. Plotny byly inkubovány při teplotě místnosti po 2,5 hodiny. Na konci této inkubační periody bylo do každé jamky přidáno 150 μΐ ledově studeného dextranem potaženého dřevěného uhlí (5% aktivované dřevěné uhlí potažené s 0,05 % 69K dextranu) a plotny byly ihned odstraněny při 99 g po 5 minut při 4 °C. 200 μΐ supematantového roztoku bylo pak odebráno pro scintilační počet. Vzorky byly spočteny na 2 % absorbuje malé množství [³H]17p-estradiolu, jamky, obsahující radioaktivitu a cytosol, ale nezpracované s aktivním uhlí, byly zahrnuty do kvantity množství dostupného izotopu. Také jamky, obsahující radioaktivitu, ale ne cytosol, byly zpracovány s aktivním uhlím pro hodnocení

- 12CZ 293065 B6 neodstranitelného DPM [³H]17p-estradiolu. Změní č. 25880-96, 96-jamkové plotny byly použity protože se ukázaly jako vázající alespoň něco estradiolu.

Analýzy výsledků

Impulzy za minutu (CPM) radioaktivity byl automaticky převedeny na rozpad za minutu („disintegrated per minuté - DPm) přístrojem Beckman LS 7500 Scintillation Counter za použití sedu rozložených standardů pro generované H# pro každý vzorek. Pro výpočet % estradiolové vazby za přítomnosti 100 nebo 500násobku kompetitoru byl použit následující vzorec:

((DPM vzorek-DPM neodstraněný aktivním uhlím)/(DPM estradiol-DPM neodstraněný aktivním uhlím))x 100 % = % estradiolové vazby

Pro generování IC₅o křivek se vynesou % vazby proti sloučenině. IC₅₀ jsou generovány pro sloučeniny, které vykazují >30% kompetici při 500x koncentrace kompetitoru. Popis těchto metod viz Hulme E.C. vyd. 1992. Receptor-Ligand Interactions: A Practical Approach. IRL Press, New York (viz zejména kapitola 8).

Ishakawa buněčná alkalický fosfatázový esej

Udržení buněk a zpracování:

Ishikawa buňky byly udržovány v DMEM/F12 (50% : 50%), obsahujícím fenylovou červeň + 10% fetálního hovězího séra a médium bylo doplněné 2 mM Glutamaxem, 1 % Pen/Strap a 1 mM pyruvátu sodného. Pět dnů před začátkem každého pokusu (ošetření buněk) bylo médium vyměněno za fenolové červeni prosté DMDM/F12 + 10% dextranem potaženým aktivním uhlím stripované sérum. Den před zpracováním byly buňky sklizeny za použití 0,5 % tripsinu/EtTA a umístěny na plotnu v hustotě 5 x 10⁴ buněk/jamka do 96-jamkových tkáňových kultivačních ploten. Testované sloučeniny byly dávkovány v 10’⁶, 10'⁷ a 10'⁸M navíc k 10'⁶M 17β—estradiolu k hodnocení schopnosti sloučenin působit jako antiestrogeny. Buňky byly zpracovány 48 h před esejem. Každá 96-jamková plotna obsahuje 17[3-estradiolovou kontrolu. Vzorek populace pro každou dávku byl n=8.

Alkalická fosfatáza esej:

Na konci 48 hodin se médium odsaje a buňky se promyjí třikrát fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS). 50 μΐ lýzového pufru (0,lM Tris-HCl, pH 9,8, 0,2% Triton X-100) se přidá do každé jamky. Plotny se umístí při -80 °C na minimálně 15 minut. Plotny se nechají roztát při 37 °C s následujícím přídavkem 150 μΙ 0,1Μ Tris-HCl, pH 9,8, obsahujícího 4 mM para-nitrofenylfosfátu (pNPP) do každé jamky (konečná koncentrace, 3 mM pNPP).

Absorbance a výpočet strmosti byly provedeny za použití KineticCalc Application program (Bio-Tek Instruments, lne. Winooski, VT). Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr +/- S.D. Oblasti enzymové reakce (strmost) zprůměrované nad lineární částí kinetické reakční křivky (odečítání optické hustoty každých 5 minut po 30 minut čtení absorbance). Výsledky pro sloučeniny jsou shrnuty jako procenta odezvy vztažená k 1 nM 17[3-estradiolu.

Různé sloučeniny byly hodnoceny na estrogenní aktivitu alkalickou fosfatázovou metodou a odpovídající ED50 hodnoty (95% C.I.) byly vypočteny. Čtyři dále uvedené jsou použity jako referenční standardy:

17β—estradiol 0,03 nM 17a-estradiol 1,42 nM estradiol 0,13 nM

-13 CZ 293065 B6 estron 0,36 nM

Popis takových metod je uveden v práci Holinka C.F., Hata H., Kuramoto H. a Gurpide E. (1986) Effects of steroid hormones and antisteroid on alkaline phosphatase activity in human endometrial cancer cells (Ishikawa Line). Cence Research 46:2771-2774 a Littleifield B.A., Gurpide E., Markiewicz L., McKinley B. a Hochberg R.B. (1990) a simple and sensitive microtiter plate estrogen bioassay based on stimulation alkaline phosphatase in Ishikawa cells; Estrogen action of D5 adrenal steroids. Endocrinology 6:2757-2762.

2X VIT ERE transfekční esej

Udržování buněk a zpracování

Buňky vaječníku čínského křečka (CHO), které byly stabilně stransfektovány s lidským estrogenním receptorem, byly udržovány v DMEM + 10 % fetálního hovězího séra (FBS). 48 před ošetřením bylo růstové médium nahrazeno DMEM prostým fenolové červeně + 10 % fetálního hovězího séra (FBS). + 10 % dextranem potaženého aktivního uhlí stripovaného FBS (médium pro zpracování). Buňky byly umístěny na 6-jamkové plotny v hustotě 5000 buněk/jamku, obsahující 200 μΐ média/jamka.

Transfekce fosforečnanem vápenatým

Reportér DNA (Promega plazmid pGL2, obsahující dvě tandemové kopie vitellogenin ERE před minimálním thymidin kináza promotorem nesoucím luciferázový gen) byly kombinovány s B-galaktosidáza expresním plazmidem pCHHO (Pharmacia) a nosičem DNA (pTZ18U) v následujícím poměru:

pG reportér pGpCH HODNA

5pGpTZ18U pG DNA/1 ml transfekčního roztoku

DNA (20 pG) byla rozpuštěna v 500 pl 250 mM sterilního CaCl₂ a přidána po kapkách do 500 pl 2 x HeBS (0,28 M NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na₂HPO₄, pH 7,05) a inkubována při teplotě místnosti 20 minut. 20 ml této směsi bylo přidáno do každé jamky s buňkami a udržována na buňkách 16 h. Na konci této inkubace byla sraženina odstraněna, buňky byly promyty médiem, čerstvě zpracována média byla nahrazena a buňky byly zpracovány s dalším vehikulem, 1 nM 17|3-estradiolem, 1 pM sloučeniny nebo 1 pM sloučeniny + 1 nM 17p~estradiolu (testy na estrogenní antagonismus). Každé zpracování za daných podmínek bylo provedeno na 8 jamkách (n = 8), které byly inkubovány 24 hodin před luciferázovým esejem.

Luciferázový esej

Po 24hodinovém vystavení sloučeninám byla média odstraněna a každá jamka byla promyta 2 x 125 pl PBS bez Mg⁺⁺ a Ca⁺⁺. Po odstranění PBS bylo do každé jamky přidáno 25 pl Promega lýzového pufru a ponecháno stát při teplotě místnosti 15 mi s následujícími 15 min při -80 °C a 15 min při 37 °C. 20 pl lyzátu bylo přeneseno do opakní 96jamkové plotny pro hodnocení liciferázové aktivity a zbylý lyzát (5 pl) byl použit pro hodnocení β-galaktosidázové aktivity (normalizovaná transfekce). Luciferan substrát (Promega) byl přidán ve 100 pl podílech do každé jamky automaticky luminometrem a produkované světlo (relativní jednotky světla) bylo odečteno 10 sekund po přídavku.

- 14CZ 293065 B6 β-Galaktosidázový esej

Ke zbývajícím 5 μΐ lyzátu bylo přidáno 45 μΐ PBS. Potom bylo přidáno 50 μΐ Promega B-galaktosidáza 2X esejového pufru, dobře promícháno a inkubováno při 37 °C 1 hodinu. Plotny, obsahující standardní křivku (0,1 až 1,5 milijednotek trojmo) byly použity pro každý běh pokusu. Plotny byly analyzovány na Molecular Devices spektrofotometrické čtečce při 410 nm. Optické hustoty pro neznámé byly převedeny na milijednotky aktivity matematickou extrapolací ze standardní křivky.

Analýza výsledků

Luciferáza-data byla generována při relativních světelných jednotkách (RLU) akumulovaných během lOsekundového měření a automaticky přenesena do JMP (SAS lne) souboru, kde byly základní RLU odečteny. B-Galaktosidázové hodnoty byly automaticky importovány do souboru, tyto hodnoty byly děleny do RLU k normalizaci dat. Průměrné a standardní odchylky byly stanoveny zn=8 pro každé zpracování. Aktivita sloučenin byla porovnána se 17[3-estradiolem pro každou plotnu. Procenta aktivity ve srovnání se 17|3-estradiolem byla vypočtena za použití vzorce % = ((estradiol-kontrola)/(hodnota sloučeniny)) x 100. Tyto techniky jsou popsány Tzukermanem M.T., Estym A., Santiso-Merem D., Danilelianem P., Parkerem M.G., Steinem R.B., Pikem J.W. a McDonnelem D.P. (1994). Lidská estrogen receptor transaktivační kapacita byla stanovena jak v buněčném tak promotorovém kontextu a zprostředkována dvěma funkčně odlišnými intramolekulámími regiony (viz Molecular Endocrinology, 8:21-30).

Krysí uterotrofní/antiuterotrofní bioesej

Estrogenní a antiestrogenní vlastnosti sloučenin byly stanoveny v immaturovaném krysím uretotrofním eseji (4 dny) jak bylo popsáno dříve (L.J. Black a R.L. Good, Life Sciences 26, 1453 (1980)). Immaturované krysy Sprague-Dawley (samice 18 dnů staré) byly testovány ve skupinách po šesti. Zvířata byla ošetřována denně ip injekcí s 10 pG sloučeniny, 100 pg sloučeniny, (100 pg sloučeniny + 1 pg 17p-estradiolu) ke kontrole antiestrogenicity a 1 pg 173~estradilu s 50 % DMSO/50 % salinického roztoku jako injekčního vehikula. 4. den byla zvířata usmrcena CO₂ za dušením a jejich dělohy byly odebrány a oškrabáním zbaveny přebytku lipidu, odstraněna jakákoliv kapalina a stanovena vlhká hmotnost. Malý řez jednoho rohu byl podroben histologii a zbytek použit pro izolaci celkově RNA za účelem vyhodnocení kompletní složky 3 genové exprese.

Biologické výsledky

Estrogen receptorová afinita (uváděna jako RBA: 17β-estradiol=l00)

Sloučenina RBA raloxifen200 tamoxifen1,8 příklad 1020 příklad 742 příklad 840 příklad 940 příklad 12114 příklad 1180 příklad 1327 příklad 1432 příklad 1553 příklad 2153 příklad 2223

-15CZ 293065 B6

Infekční luciferázový esej

Sloučenina	% aktivace	% aktivace s 1 nM 17p-estradiolem
17[3-estradiol	100%	N/A
estradiol	38%	N/A
tamoxifen	0%	10%
raloxifen	0%	0%
příklad 10	1%	2%
příklad 7	4%	8%
příklad 8	6%	78%
příklad 9	6%	8%
příklad 12	13%	24%
příklad 11	8%	12%
příklad 13	8%	17%
příklad 14	19%	57%
příklad 15	15%	31%
příklad 21	34%	34%
příklad 22	17%	19%

Ishikawa alkalická fosfatáza esej

Sloučenina	% aktivace	% aktivace (sloučenina + 1 nM 17β—estradiol)
17p-estradiol	100%	N/A
tamoxifen	0%	45%
raloxifen	5%	5%
příklad 10	6%	19%
příklad 7	1%	9%
příklad 8	10%	22%
příklad 9	3%	11%
příklad 12	7%	16%
příklad 11	6%	11%
příklad 13	7%	9%
příklad 14	2%	14%
příklad 15	0%	5%
příklad 21	34%	34%
příklad 22	27%	23%

3-denní ovariektomizovaný krysí model

Sloučenina	10 pg	100 pg
tamoxifen	69,6 mg	71,4 mg
raloxifen	47,5 mg	43,2 mg
kontrola = 42,7 mg 1 pg 17fJ-estradiolu = 98,2 mg
Sloučenina	10 pg 100 pg	100 pg + 1 pg 17\|3-estradiolu
příklad 7	47,8 mg 64,8 mg	75,4

kontrola = 20,2 mg 1 pg 17β—estradiol = 80,2 mg

Sloučenina	10 pg	100 pg	100 pg + 1 pg 17\|3-estradiolu
příklad 12	36,9 mg	49,5 mg	63,1 mg

kontrola = 31,4 mg 1 pg 17β—estradiol = 89,0 mg

-16CZ 293065 B6

Sloučenina 10 pg 100pg příklad 11 39,3 mg 59,8 mg kontrola = 24,5 mg 1 pg 17β—estradiol = 90,8 mg

Sloučenina 10 pg 100 pg příklad 14 32,5 mg 56,4 mg příklad 15 40,4 mg 56,3 mg kontrola = 29,1 mg 1 pg 17β—estradiol = 95,5 mg

Sloučenina 10 pg 100 pg

100 pg+ 1 pg 17β—estradiolu

81,0 mg

100 pg+ 1 pg 17|3-estradiolu

79,8mg

69,3 mg

100 pg+ 1 pg 17p-estradiolu příklad 21 56,0 mg 84,0 mg 77,6 mg kontrola = 32,1 mg 1 pg 17p-estradiol = 90,2 mg příklad 22 55,6 mg 71,3 mg 66,8 mg kontrola = 21,7 mg 1 pg 17β—-estradiol = 82,8 mg

Claims

1. Indolové deriváty obecného vzorce I nebo II

Ri je vybrán z H, OH nebo jejich Ci-C₄esterů nebo jejich alkyletherů nebo atomů halogenu,

R₂, R3, Ri, R5 a Ré jsou nezávisle vybrány zH, OH nebo jejich Ci-C₄esterů nebo jejich alkyletherů, halogenu, kyano, C]-C6alkylu nebo trifluormethylu s tou podmínkou, že je-li R] atom vodíku, není R₂ skupina OH, n je 2 nebo 3,

X je vybrán z H, Ci-Céalkylu, kyano, nitro, trifluormethylu, halogenu,

Z je vybrán z

-17CZ 293065 B6 —CH=CH~C— Y

Y je vybrán ze nebo __c==_c__{CH₂)rt-Y.

a) skupiny

R7 Re kde R₇ a R_g jsou nezávisle vybrány ze skupiny, zahrnující H, Ci-C₆alkyl, fenyl nebo společně tvoří -(CH₂)p-, kde p je celé číslo od 2 do 6, takže tvoří kruh, který je popřípadě substituován až třemi substituenty vybranými ze skupiny, zahrnující hydroxyl, halogen, Ci-C4alkyl, trihalogenmethyl, Ci-C^aíkoxy, trihalogenmethoxy, Ci-C4alkylthio, Ci-C^alkylsulfinyl, C]-C₄alkylsulfonyl, hydroxy(Ci-C4)alkyl, -CO₂H, -CN, -CONH(Ci-C₄)alkyl, -NH₂, C]-C₄alkylamino, di(Ci-C4)alkylamino, -NHSO₂(C]-C4)alkyl, -NHCO(C!-C4)alkyl a -NO₂.

b) pěti-, šesti- nebo sedmičlenného nasyceného, nenasyceného nebo částečně nenasyceného heterocyklu, obsahujícího až dva heteroatomy vybrané ze skupiny, zahrnující -Ο-, -NH-, -N(Ci-C₄alkyl), -N= a -S(O)_m-, kde m je celé číslo od 0 do 2, popřípadě substituovaného 1 až 3 substituenty nezávisle vybranými ze skupiny, zahrnující hydroxyl, halogen, Ci-C4alkyl, trihalogenmethyl, Ci-C₄alkoxy, trihalogenmethoxy, C]-C4acyloxy, Ci-C₄alkylthio, C₁-C₄alkylsulfinyl, C]-C4alkylsulfonyl, hydroxy(Ci-C4)alkyl, -CO₂H-, -CN, -CONHRi, -NH₂, (C]-C₄)alkylamino, di(Ci-C₄)alkylamino, -NHSO₂R|, -NHCORi, -NO₂; fenyl substituovaný 1 až 3 (C |-C4)alkylskupinami,

c) bicyklického kruhového systému, zahrnujícího pěti- nebo šestičlenný heterocyklický kruh kondenzovaný k fenylovému kruhu, kde uvedený heterocyklický kruh obsahuje až dva heteroatomy vybrané ze skupiny, zahrnující -Ο-, -NH-, -N(C]-C₄alkyl)- a -S(O)_m-, kde m je celé číslo od 0 do 2, popřípadě substituovaného 1 až 3 substituenty nezávisle vybranými ze skupiny, zahrnující hydroxyl, halogen, C]-C4alkyl, trihalogenmethyl, Ci-C₄alkoxy, trihalogenmethoxy, C!-C4acyloxy, Ci-C₄alkylthio, Ci-C₄alkylsulfinyl, Ci-C₄alkylsulfonyl, hydroxy(Ci-C₄)alkyl, fenyl substituovaný 1 až 3 (Ci-C₄)alkylskupinami, -CO₂H, -CN, -CONHRi, -NH₂, (C1-C4)alkylamino, di(Ci-C₄)alkylamino, -NHSO₂R], -NHCORi, -NO₂, a fenyl popřípadě substituovaný 1 až 3 (Ci-UJalkylskupinami;

a jejich farmaceuticky přijatelné soli.

2. Indolové deriváty podle nároku 1, kde Ri je H, OH nebo jejich Ci-C₄estery nebo jejich alkylethery nebo atom halogen;

R₂, R₃, R₄, R₅ a R₆ jsou nezávisle vybrány z H, OH nebo jejich Ci-C₄esterů nebo jejich alkyletherů, atomů halogenu, kyano, Ci-C₄alkylu nebo trifluormethylu s tou podmínkou že když Ri je atom vodíku, R₂ není OH;

X je vybrán ze skupiny, zahrnující H, Ci-C₆alkyl, kyano, nitro, trifluormethyl, halogen;

Y je skupina

I

R7 Re kde R₇ a R_g jsou nezávisle vybrány z H, C|-Céalkylu nebo spolu vzájemně spojeny a znamenají -(CH₂)_P- kde p je celé číslo od 2 do 6, za vzniku kruhu popřípadě substituovaného až třemi

-18CZ 293065 B6 substituenty vybranými ze skupiny, zahrnující hydroxyl, halogen, Ci-C₄alkyl, trihalogenmethyl, Ci-C₄alkoxy, trihalogenmethoxy, C]-C₄alkylthio, C]—C₄alkylsulfinyl, Ci-C₄alkylsulfonyl, hydroxy(C!-C₄)alkyl, -CO₂H, -CN, -CONH(Ci-C₄), -NH₂, (C]-C₄)alkylamino, di(C|-C₄)alkylamino, -NHSO₂(Ci-C₄)alkyl, -NHCO(Ci-C₄)alkyl a -NO₂.

3. Indolové deriváty podle nároku 2, kde R₇ a R₈ jsou spojeny a znamenají -(CH₂)_P- za vzniku kruhu, kde p je celé číslo od 2 do 6, kruh je popřípadě substituován 1 až 3 substituenty vybranými ze skupiny, zahrnující Ci-C₃alkyl, trifluormethyl, halogen, fenyl, nitro nebo -CN.

4. Indolový derivát podle nároku 1, kterým je (E)-N,N-diethyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4hydroxyfenyl)-3-methylindol-l-ylmethyl]-fenyl}-akrylamid.

5. Indolový derivát podle nároku 1, kterým je (E)-N-terc.-butyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4hydroxyfenyl)-3-methylindol-l-ylmethyl]-fenyl}-akrylamid.

6. Indolový derivát podle nároku 1, kterým je (E)-pyrolidino-3-{4-[5-hydroxy-2-(4hydroxyfenyl)-3-methylindol-l-ylmethyl]-fenyl}-akrylamid.

7. Indolový derivát podle nároku 1, kterým je (E)-N,N-dimethyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4hydroxyfenyl)-3-methylindol-l-ylmethyl]-fenyl}-akrylamid.

8. Indolový derivát podle nároku 1, kterým je (E)-N,N-dibutyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4hydroxyfenyl)-3-methylindol-l-ylmethyl]-fenyl}-akrylamid.

9. Indolový derivát podle nároku 1, kterým je (E)-N-butyl,N'-methyl-3-{4-[5-hydroxy-2(4-hydroxyfenyl)-3-methylindol-l-ylmethyl]-fenyl}-akrylamid.

10. Indolový derivát podle nároku 1, kterým je (E)-morfolinino-3-{4-[5-hydroxy-2-(4hydroxyfenyl)-3-methylindol-l-ylmethyl]-fenyl}-akiylamid.

11. Indolový derivát podle nároku 1, kterým je (E)-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxyfenyl)-3methylindol-l-ylmethyl]-fenyl}-akrylamid.

12. Indolový derivát podle nároku 1, kterým je (E)-N-methyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4hydroxyfenyl)-3-methylindol-l-ylmethyl]-fenyl}-akrylamid.

13. Indolový derivát podle nároku 1, kterým je (E)-N,N-dibutyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4fluorfenyl)-3-methylindol-l-ylmethyl]-fenyl}-akrylamid.

14. Indolový derivát podle nároku 1, kterým je (E)-N-butyl,N'-methyl-3-{4-[5-hydroxy-2(4-fluorfenyl)-3-methylindol-l-ylmethyl]-fenyl}-akrylamid.

15. Indolový derivát podle nároku 1, kterým je 2-(4-hydroxyfenyl)-3-methyl-l-[4-(3-N,Ndimethyl-l-yl-prop-l-inyl)-benzyl]-lH-indol-5-ol nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.

16. Indolový derivát podle nároku 1, kterým je 2-(4-hydroxyfenyl)-3-methyl-l-[4-(3piperidin-l-yl-prop-inyl)-benzyl]-lH-indol-5-ol nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.

17. Indolový derivát podle nároku 1, kterým je 2-(4-hydroxyfenyl)-3-methyl-1-(4-(3pyrrolidin-l-yl-prop-l-inyl)-benzyl]-lH-indol-5-ol nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.

-19CZ 293065 B6

18. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje indolový derivát podle nároku 1 nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl a farmaceuticky přijatelný nosič nebo pomocnou látku.

5

19. Použití indolových derivátů obecného vzorce I nebo II podle nároku 1 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení nebo prevenci ztráty kostní tkáně u savců.

20. Použití indolových derivátů obecného vzorce I nebo II podle nároku 1 nebo jejich 10 farmaceuticky přijatelných solí pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení nebo prevenci nedostatku estrogenu u savců.

21. Použití indolových derivátů obecného vzorce I nebo II podle nároku 1 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení nebo prevenci

15 srdečních a cévních onemocnění u savců.