CZ29299A3

CZ29299A3 - Vakcína

Info

Publication number: CZ29299A3
Application number: CZ99292A
Authority: CZ
Inventors: Joseph Dr. Cohen
Original assignee: Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Priority date: 1996-08-02
Filing date: 1997-07-31
Publication date: 1999-06-16
Also published as: US20020172692A1; CZ290826B6; MY116128A; CO4650186A1; JP2000517295A; ID17860A; PL188741B1; EP1623720A3; AU706303B2; ATE394119T1; EP0957933A1; MA24291A1; EA199900069A1; UY24654A1; AU4204097A; NO990464L; NO319844B1; WO1998005355A1; EP1623720A2; EA002167B1

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nové vakciny a jejího použití v lékařství, zvláště pro prevenci infekce malárie.

Dosavadní stav techniky

Malárie je jedním z hlavních světových zdravotních problémů, kdy na tuto nemoc umírají každý rok 2 až 4 miliony lidí. Jedna z nejakutnějších forem tohoto onemocnění je způsobena parazitickým

4O^pr-V-okem_Plas.mo-djjim falciparum, který je odpovědný za většinu úmrtí, která je možno připsat malárii.

Životní cyklus P. falciparum je komplexní, vyžadující dva hostitele, člověka a moskyta pro ukončení. Infekce člověka je započata naočkováním sporozoitů ve slině infikovaného moskyta.

Sporozoity migrují do jater a tam infikují hepatocyty, které se tím diferencují přes exoerytrocytický intracelulární krok do stadia merozoitů, které infikují červené krvinky (RBC) pro iniciaci cyklické replikace v asexuálním krevním stupni. Cyklus je ukončen diferenciací velkého počtu merozoitů v červených krvinkách na gametocyty sexuálního stupně, které jsou nasáty moskytem a v něm se vyvíjejí přes řadu stupňů ve střední části střeva za vytvoření sporozoitů, které migrují do stinných žláz.

Stadium sporozoitů P. falciparum bylo identifikováno jako potenciální cíl vakciny proti malárii. Hlavní povrchový protein sporozoita je znám jako cirkumsporozoitální protein (protein CS).

Tento protein z kmene 7G8 byl klonován, exprimován a sekvenován (Dáme a další, Science 225 (1984), str. 593). Forma proteinu kmene

7G8 je charakterizována přítomností centrální imunodominantní ··.·· · · !♦ / · · ί ·'· • · ,· · 4· ·♦ * Γ t* ⁹ t * • tV ·· .1 ·/» ·Χ · * · · • * · · · * * .·<♦·'· ♦ ··( ···

9 9 · '· ’♦ ♦ · · ·

- ···· ·· · ·· «· opakující se oblasti obsahující tetrapeptid Asn-Ala-Asn-Pro opakovaný 37 krát, ale přerušený čtyřmi menšími opakujícími se úseky Asn-ValAsp-Pro. U jiných kmenů se počet hlavních a vedlejších opakujících se úseků liší stejně jako jejich relativní poloha. Tato centrální část je obklopena N a C-koncovou částí složenou z neopakujících se aminokyselinových sekvencí označovaných jako část „repeatless“ proteinu CS.

Bylo ukázáno, že ozářené sporozoity mohou poskytnout významnou ochranu proti experimentální malárii člověka (Am. J. Trop. io Med. Hyg. 24: 297 - 402, 1975). Avšak nesnáze při výrobě způsobují nepraktičnost použití ozářených sporozoitů z hlediska výroby vakciny.

Několik výzkumných skupin navrhovalo podjednotkové vakciny založené na cirkumsporozoitálním proteinu. U některých z těchto vakcín se provádělo klinické testování; jedna z nich byla syntetický peptid a druhá rekombinantní protein (Ballou a další, Lancet: i 1277 (1987) a Herrington a další, Nátuře 328: 257 (1987).

Tyto vakciny měly úspěch při stimulaci antisporozoitální odpovědi. Nicméně velikost této odpovědi byla zklamáním, přičemž některé vakciny nevyvolávaly odpověď vůbec. Navíc nepřítomnost „zesilování“ („boosting“) hladin protilátek při následujících injekcích a výsledky testů proliferace lymfocytů in vitro naznačovaly, že T-buňky většiny těchto dobrovolníků nerozpoznaly imunodominantní opakující se sekvenci. Nicméně u jedné vakciny v každé studii se parazitemie nevyvinula.

Mezinárodní patentová přihláška No. WO 93/10152 (SmithKline

Beecham Biólogicals) popisuje a nárokuje hybridní protein obsahující v podstatě veškerou C-koncovou část proteinu CS, čtyři nebo vícetandemové opakující se sekvence imunodominantní oblasti a povrchová antigen viru hepatitidy B (HBsAg). Hybridní protein 30 s výhodou obsahuje sekvenci, která obsahuje alespoň 160 aminokyselin a která je v podstatě homologní s C-koncovou části proteinu CS. Proteinu CS může chybět alespoň 12 aminokyselin od Ckonce.

Konkrétně se popisuje protein obsahující část proteinu CS R falciparum v podstatě odpovídající aminokyselinám 210 až 398 R falciparum 7G8 fúzovaný ve čtecím rámci prostřednictvím lineárního linkeru k N-konci HBsAg. Linker může obsahovat část preS2 z HBsAg.

Konkrétní provedení popisované ve WO 93/10152 je hybridní protein pojmenovaný RTS. Hybrid se skládá z:

- Methioninového zbytku kódovaného nukleotidy 1059 - 1061, ío odvozeného z genové sekvence TDH3 Saccharomyces cerevisiae (nukleotidy 1-1058 v tomto čtecím rámci tvoří samotný promotor TDH3). (Musti A. M. a další, Gene 1983 25 144 - 143)

- Tří aminokyselirRMef/AlsrPro, odvozených^-z^—nukíeotidovésekvence 1062 až 1070 vytvořené klonovacím postupem použitým pro konstrukci hybridního genu

- Sledu 189 aminokyselin kódovaných nukleotidy 1071 až 1637 reprezentujících aminokyseliny 210 až 398 cirkumsporozoitálního proteinu (CSP) Plasmodium falciparum kmen 7G8 (Dáme a další, výše)

- Aminokyseliny (Arg) kódované nukleotidy 1638 - 1640 vytvořené klonovacím postupem použitým pro konstrukci hybridního genu

- Čtyř aminokyselin Pro Val Thr Asn kódovaných nukleotidy 1641 - 1652 a představujících čtyři karboxykoncové zbytky viru hepatitidy B (sérotyp adw) proteinu preS2 (9)

- Oblast 226 aminokyselin kódovaných nukleotidy 1653 až 2330 a specifikujících protein S viru hepatitidy B (sérotyp adw).

WO 93/10152 dále popisuje expresi hybridního proteinu v hostitelském kvasinkovém kmenu, který již nesl ve svém genomu několik integrovaných kopií expresní kazety hepatitidy B. Získaný ·· >...

• 1 β ·.

• ft ·· • I · · • · · i ? ♦ · i · * ·

kmen syntetizuje dva polypeptidy, S a RTS (nebo jiný hybridní protein podle vynálezu), které se spontánně uspořádají do směsných (například RTS, S) lipoproteinových částic. Tyto částice výhodně prezentují sekvence CSP hybridu na svém povrchu.

Předmětem předkládaného vynálezu je vyvolat imunitu proti napadení P. falciparum a/nebo P. vivax imunizací prostředkem obsahujícím větší množství antigenů v kombinaci s adjuvans, kterým je preferenční stimulátor odpovědi buněk TH1.

io Podstata vynálezu

Předkládaný vynález tedy poskytuje vakcinu pro použití při

-prevencLneb-oJéčení malárie, která obsahuje větší množství antigenů odvozených z malárie v kombinaci s adjuvans, kterým je preferenční stimulátor odpovědi buněk TH1.

S výhodou alespoň jeden z antigenů je hybridní protein, jak definováno výše, jako například RTS, výhodněji ve formě směsných částic jak je definováno výše, jako například RTS,S.

Další hledisko vynálezu poskytuje vakcinu pro použití při prevenci nebo léčení malárie obsahující větší množství z malárie

2o odvozených antigenů, která se vyznačuje tím, že alespoň jeden z antigenů je hybridní protein jak definováno výše, jako RTS, výhodněji ve formě směsných částic jak definováno výše, jako RTS,S.

Množství antigenu přítomného v každé dávce vakciny je zvoleno jako množství, které indukuje imunoprotektivní odpověď bez významných nepříznivých vedlejších účinků u typických vakcin. Toto množství bude kolísat v závislosti na tom, kterých specifických imunogenů se použije. Obecně se očekává, že každá dávka bude obsahovat celkem 1 až 1000 pg proteinu, s výhodou 1 až 200 pg, nejvýhodněji 10 až 100 pg. Optimální množství pro konkrétní vakcinu je možno určit standardními studiemi zahrnujícími . pozorování

imunitních odpovědí u pacientů. Po počáteční vakcinaci budou dostávat pacienti s výhodou zesilující dávku přibližně po čtyřech týdnech následovanou opakovanými zesilujícími dávkami každých šest měsíců, dokud trvá riziko infekce.

Dalším hlediskem vynálezu je způsob léčení pacienta vnímavého na infekci plasmodiem podáváním účinného množství vakcíny, jak bylo popsáno výše.

Adjuvans schopná preferenčně stimulovat odpověď buněk TH1 se popisují v mezinárodních patentových přihláškách No. WO 94/00153 a WO 95/17209.

Zvláště výhodné adjuvans obsahuje QS21, netoxickou frakci čištěnou HPLC odvozenou z kůry Quillaja Saponaria Molina a 3 De-Oaeylovaný-mQnofosfor-V-lljpjd-A_C3_D-MPL)· popřípadě společně v emulzi_ typu olej ve vodě.

De-O-acylovaný monofosforyllipid A je znám z GB 2220211 (Ribi). Chemicky jde o směs 3 De-O-acylovaného monofosforyllipisu A s 4, 5 nebo 6 acylovanými řetězci vyráběnou firmou Ribi Immunochem Montana. Výhodná forma 3 De-O-acylovaného monofosforyllipidu A se popisuje v mezinárodní patentové přihlášce No. 92/116556.

QS21 je netoxická frakce saponinu čištěná HPLC z kůry jihoamerického stromu Quillaja Saponaria Molina a způsob výroby se popisuje (jako QA21) v US patentu No. 5,057,540.

Výhodná emulze typu olej ve vodě obsahuje metabolizovatelný olej, jako je skvalen, alfa tokoferol a tween 80. Emulze typu olej ve vodě může navíc obsahovat spán 85 a/nebo lecitin.

Poměr QS21 : 3D-MPL bude typicky řádově 1 : 10 až 10 : 1; s výhodou 1 : 5 až 5 : 1 a často v podstatě 1:1. Výhodné rozmezí pro optimální synergický účinek je 2,5 : 1 až 1 : 1 3D MPL : QS21. Typicky bude pro podávání člověku QS21 a 3D MPL přítomno ve vakcíně v rozmezí 1 pg až 200 pg, například 1 až 100 pg, s výhodou 10 pg až • 9

9 9 9 9φ 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 *9 · 9 9*. · · 9 9 pg na dávku. Olej ve vodě bude typicky obsahovat od 2 do 10 % skvalenu, od 2 do 10 % alfa tokoferolu a od 0,3 do 3 % látky tween 80. S výhodou je poměr skvalen : alfa tokoferol roven nebo menší než 1, protože se tak dosáhne stabilnější emulze. V koncentraci 1 % může být také přítomen spán 85. V některých případech může být výhodné, že vakciny podle předkládaného vynálezu dále obsahují stabilizátor.

Výroba vakcin se obecně popisuje v New Trends and Developments in Vaccines, ed. Voliér a další, University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Zapouzdření do lipozomů se například popisuje v US patentu 4,235,877 (Fullerton). Konjugace proteinů na makromolekuly se popisuje například v US patentu 4,372,945 (Likhite) a US patentu 4,474,757 (Armor a další).

_Antigeny odvozené z malárie použitelné v rámci předkládaného vynálezu mohou být zvoleny z následujících:

1. Hybridní protein jak definováno výše, jako je RTS, výhodněji ve formě směsných částic jak definováno výše, jako RTS,S.

2. TRAP klonovaného izolátu P. falciparum z Thajska známý jako T/9/96 a proteiny, které jsou s ním alespoň z 80 % homologní a imunogenní deriváty obsahující jeho fragmenty (popsané v mezinárodních patentových přihláškách No. WO 90/01496 a WO 91/11516 (3i Exploitation Limited) a WO 92/11868 (US Navy).

3. 16 kD protein popsaný v mezinárodní patentové přihlášce No. WO 91/18922 a proteiny, které s ním mají alespoň 80 % homologii a imunogenní deriváty včetně jeho fragmentů.

4. Apikální membránový antigen-1 (AMA-1) P. falciparum nebo P. vivax a proteiny, které jsou s ním alespoň z 80 % homologní a jeho imunogenní deriváty včetně fragmentů.

5. Cirkumsporozoitální protein (csp) P. falciparum nebo P. vivax které jsou s ním alespoň z 80 % homologní a jeho imunogenní deriváty včetně fragmentů.

- 7 ·· ·· ·· · ·· ·♦ ···· ·«· · · « · « · · · · · ♦ · · · · · • 9 9 9 9 · 9 9999 9 999 99*

9 9 9 9 9 9 · ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

6. MSP-1 P. falciparum nebo P. vivax (US patent No. 4,837,016) a proteiny které jsou s ním alespoň z 80 % homologní a jeho imunogenní deriváty včetně fragmentů.

7. Jiné proteiny exoerytrocytálního stupně a imunogenní deriváty 5 včetně fragmentů.

8. Popřípadě proteiny krevního stupně a imunogenní deriváty včetně fragmentů.

Termín „imunogenní derivát“ zahrnuje jakoukoliv molekulu jako je zkrácený nebo jiný derivát proteinu, který si zachová schopnost ío indukovat imunitní odpověď na protein po vnitřním podání člověku.

Takové ostatní deriváty mohou být připraveny adicí, delecí, substitucí nebo přeuspořádáním aminokyselin nebo jejich chemickou modifikací; --Imunogenní fragmenty proteinu, které mohou být použitelné při is přípravě podjednotkových vakcin, mohou být připraveny expresí vhodných genových fragmentů nebo peptidovou syntézou (např. použitím Merrifieldovy syntézy (The Peptides, díl 2, Academie Press,

NY, str. 3).

Imunogenní derivát může být hybrid, tj. fúzní polypeptid 2o obsahující další sekvence, které mohou nést jeden nebo více epitopů pro další imunogeny Plasmodium nebo další neplasmodiové imunogeny. Alternativně může být imunogenní derivát podle vynálezu fúzován k nosnému polypeptidu jako je povrchový antigen nebo antigen jádra hepatitidy B nebo k jinému nosiči s imunostimulačními vlastnostmi, jak je tomu v případě adjuvans, nebo k nosiči, který jinak zesiluje imunitní odpověď na protein nebo jeho derivát, nebo kde je to užitečné při expresi, čištění nebo formulaci proteinu nebo jeho derivátu.

Proteiny nebo jejich imunogenní deriváty, které jsou při vynálezu použitelné, mohou být chemicky konjugovány s makromolekulou • 44 44

4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4

44444 4 444 444

4 4 4

4 4 4 4

- 8 s použitím běžných spojovacích činidel jako je glutaraldehyd (Geerlings a další, (1988) J. Immunol. Methods, 106. 239 - 244).

Vynález ilustrují následující příklady:

Příklady provedení vynálezu

Konstrukce a exprese rekombinantního TRAP

Při přípravě se postupuje podle popisu v WO 90/01496.

Konstrukce a exprese RTS,S

Při přípravě se postupuje podle popisu v WO 93/10152.

Přídavek adjuvans

Byly připraveny dvě formulace obsahující adjuvans, každá obsahující následující emulzní složku typu olej ve vodě.

SB26: 5 % skvalen 5 % tokoferol 0,4 % tween 80; velikost částic 500 nm

SB62: 5 % skvalen 5 % tokoferol 2,0 % tween 80; velikost částic 180 nm

Příprava emulze SB62 (dvojnásobná koncentrace)

Tween 80 se rozpustí ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem (PBS) za poskytnutí 2 % roztoku v PBS. Pro získání 100 ml dvojnásobné koncentrace emulze se rozmixuje pro důkladné promíchání 5 g DL alfa tokoferolu a 5 ml skvalenu. Potom se přidá a důkladně rozmixuje 90 ml roztoku PBS/Tween. Získaná emulze se potom protlačí stříkačkou a nakonec mikrofluidizuje použitím mikrofluidizačního přístroje M110S. Získané olejové kapičky mají velikost 180 nm.

- 9 φ· ♦ · • φ · φ • · ··

Příprava emulze SB26

Tato emulze byla připravena analogickým způsobem s použitím 0,4 % tweenu 80.

Další emulze ukázané v tabulce byly vyrobeny analogickým způsobem.

Vždy ke 100 ml emulze byly přidány dva antigeny (10 mg každého antigenů, ekvivalent 50 pg na dávku) a rozmíchány. Tato io směs byla spojena s 100 pg/ml 3D-MPL a 100 pg/ml QS21 za získání konečného prostředku. Podle koncentrace soli a pH bylo použito pufru.

• ·

·· ··

9 9 · ♦

• 9 9

9 9 9 .9 9 9 9

9 9999 · ··· ··« • 9 9 9 9

9 9 9 9 99

Tabulka

Emulze SB	Tokoferol %	Skvalen %	Tween 80 % .. '	Spán 85 %	Lecitin %	Velikost
26	5	5	0,4	0	0	500 nm 90 - 100 % 800 nm 10 - 0 %
26,1	5	5	0,4	0	0,1	500 nm.
63	5 '	5	0.6	0	0	500 nm
64	5	5	0,8	0	0	500 nm
61	5 .	5	1	0	0	250 - 300 nm
fi?	-c-	-6-	o	n	n	1 RO nm

40	5	5	0,4 ‘	1	0	500 nm 80 100 % 800 nm 20 - 0 %
40,1	5	5	0,4	1	0,1	500 nm
60	5	5	1	1	0	300 nm
65	5	5	0,4	1,5	0	500 nm
66	5	, 5	0,4	2	0	500 nm

Referenční příklad Různé formulace s RTS,S

RTS,S se popisuje v mezinárodní patentové přihlášce No. WO 93/10152 a byl obsažen v prostředcích pro vakcinaci myší balb/c. V každé skupině bylo 5 zvířat. Sedm skupin zvířat dostalo následující vakciny:

skupina 1 RTS,S SB62 skupina 2 RTS,S QS21 3D-MPL skupina 3 RTS.S QS21 3D-MPL SB62 • · ♦

·· «

9 9 • · · ♦ skupina 4 RTS.S 3D-MPL AI(OH)₃ skupina 5 RTS,S AI(OH)₃ skupina 6 prázdná skupina 7 negativní kontrola (RTS,S - 5 pg/dávka, 3D-MPL 5 pg/dávka QS21 5 pg/dávka)

Zvířata byla očkována a byly jim odebírány vzorky krve 15 dnů po první imunizaci a 7 a 15 dnů po druhé imunizaci a byly prováděny testy na protilátky subtypu anti HBSAg. Emulze SB62 při formulaci s QS21 a 3D-MPL preferenčně a synergickým způsobem zvyšovala odpověď protilátky lgG2a ve srovnání se samotným SB62.

Zvýšená odpověď protilátky lgG2a u myší je měřítkem schopnosti adjuvantního systému stimulovat odpověď typu TH1.

Zastupuje:

- 12 ·· 9 9 99 9

9 4 · · · · • · ·» · 9 4 9 • 9 44 « · · · • 4 · ·

9 9 9 4 4 ·

94 99 · ♦ 4

4 4

PATENTOVÉ

Claims

NÁROKY

Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň dva antigeny odvozené z malárie v kombinaci s adjuvans, kterým je preferenční stimulátor odpovědi buněk * TH1 a kde alespoň dva antigeny malárie jsou zvoleny ze skupiny:

a) hybridní protein obsahující v podstatě veškerou C-koncovou část proteinu CS, čtyři nebo více tandemové opakující se sekvence imunodominantní oblasti a povrchový antigen viru hepatitidy B (HBsAg);

b) TRAP klonovaného izolátu P. falciparum z Thajška^narnéhOjako T/9/96 a proteiny, které jsou s ním z alespoň 80 % homologní a imunogenní deriváty včetně jeho fragmentů;

c) MSP-1 P. falciparum nebo P. vivax podle US patentu No. 4,837,016 a proteiny, které jsou s ním z alespoň 80 % homologní a imunogenní deriváty včetně jeho fragmentů.
2. Vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e adjuvans obsahuje MPL. „
3. Vakcína podle nároku 1 nebo 2, v y z n a č u j í c í s e tím, že adjuvans obsahuje QS21.
4. Vakcína podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že adjuvans obsahuje emulzi typu olej ve vodě.

00

0 0 0

0 0 0

000 000

0

00

- 13 Vakcína podle některého z předcházejících nároků pro použití v lékařství.

• 0 0 0

0 0 0

0 00

0 0 0 0

0 0 0 «0

0 0 0 0

0 0 0

0 0 0 0 0

0 0 «
6. Použití vakciny podle některého z nároků 1 až 5 při výrobě farmaceutického prostředku pro použití při léčení nebo prevenci malárie.
7. Způsob léčení nebo prevence malárie, který zahrnuje podávání ío účinného množství vakciny podle některého z nároků 1 až 5 pacientovi v případě potřeby.

Zastupuje:

(0