BG63290B1

BG63290B1 - Ваксина против малария

Info

Publication number: BG63290B1
Application number: BG103141A
Authority: BG
Inventors: Joseph Cohen
Original assignee: Smithkline Beecham Biologicals S.A.
Priority date: 1996-08-02
Filing date: 1999-02-02
Publication date: 2001-09-28
Also published as: US20020172692A1; CZ290826B6; MY116128A; CO4650186A1; JP2000517295A; ID17860A; PL188741B1; EP1623720A3; AU706303B2; ATE394119T1; EP0957933A1; MA24291A1; EA199900069A1; UY24654A1; AU4204097A; NO990464L; NO319844B1; WO1998005355A1; EP1623720A2; EA002167B1

Abstract

Съставът се прилага при предотвратяване или лечение на малария. Той съдържа множество маларийни антигени в комбинация с адювант, който е преференциален стимулатор на ТН1 клетъчния отговор.

Description

Област на техниката

Настоящото изобретение се отнася до състав на ваксина и до неговото използване в медицината, по-специално за предотвратяване на инфекции от малария.

Предшестващо състояние на техниката

Маларията е един от главните световни проблеми с 2 до 4 милиона души, умиращи от тази болест всяка година. Една от най-острите форми на болестта се причинява от протозойния паразит Plasmodium falciparum, на когото се дължат болшинството от смъртните случаи, приписвани на маларията.

Жизненият цикъл на Р. falciparum е сложен, изискващ два гостоприемника - човек и комар, за завършване на цикъла. Инфекцията у човека започва с вкарване на спорозоити от слюнка на инфектиран комар. Спорозоитите мигрират в черния дроб и там инфектират хепатоцитите, когато те се диференцират през екзоеритроцитния интрацелуларен стадий в мерозоитния стадий, което инфектира червените кръвни клетки (RBC) да започнат циклична репликация в безполовия кръвен стадий. Цикълът се завършва чрез диференциация на множество мерозоити в RBC в половия стадий гаметоцити, които се поглъщат от комара, където се развиват през серия от етапи в средните черва, като продуцират спорозоити, мигриращи в слюнчените жлези.

Спорозоитният стадий на Р. falciparum е идентифициран като потенциална цел за маларийна ваксина. Главният повърхностен протеин на спорозоита е известен като периферноспорозоитен протеин (CS-протеин). Този протеин от щам 7G8 е клониран, експресиран и секвенциониран (Dame et al., Science 225 (1984), p. 593). Протеинът от щам 7G8 се характеризира с това, че има централна имунодоминантна повтаряща се област, съдържаща тетрапептид Asn-Ala-AsnРго, повтарящ се 37 пъти, но разнообразен с четири по-малки повторения Asn-Val-Asp

Рго. В други щамове броят на главните и малките повторения варира, както и тяхното относително местоположение. Тази централна част е разклонена с N- и С-крайни части, съставени от неповтарящи се аминокиселинни последователности, означавани като неповтаряща се част на CS-протеина.

Показано е, че облъчени спорозоити могат да осигурят значителна защита против експериментална човешка малария (Ат. J. Trop. Med. Hyg., 24, 297-402, 1975). Обаче производствени трудности правят използването на облъчени спорозоити непрактично от гледна точка на производството на ваксина.

Няколко групи са предложили подединици ваксини на база на периферния протеин. С няколко от тези ваксини е проведено клинично изпитание; едната е синтетичен пептид, другата е рекомбинантен протеин (Ballou et al., Lancet: i 1277 (1987) и Herrington et al., Nature, 328: 257 (1987).

Тези ваксини са успешни за стимулирането на антиспорозоитния отговор. Независимо от това, величината на отговора е незадоволителна, като някои ваксини не предизвикват отговор изобщо. Освен това отсъствието на “реваксинация” на ниво антитела при последователно инжектиране и резултатите от in vitro анализ на пролиферацията на лимфоцитите подсказват, че Т-клетките на болшинството от тези доброволци не разпознават имунодоминантните повторения. Независимо от това един ваксиниран при всяко изследване не развива паразитемия.

В WO 93/10152 се описва и се претендира за хибриден протеин, съдържащ по същество всички С-крайни части на CSпротеина, четири или повече тандема от повтарящи се единици от имунодоминантната област и повърхностния антиген от вируса на хепатит В (HBsAg). За предпочитане хибридният протеин съдържа последователност, която съдържа най-малко 160 аминокиселини, която е по същество хомоложна на Скрайната част на CS-протеина. CS-протеинът може да бъде лишен от последните 12 аминокиселини от С-края.

В частност там е описан протеин, който съдържа част от CS-протеина на Р. falciparum, по същество отговаряща на аминокиселини те 210-398 на Р. falciparum 7G8, свързана в рамка през линеен линкер до N-края на HBsAg. Линкерът може да обхваща част от preS2 от HBsAg.

Едно специфично изпълнение, описано в WO 93/10152, е хибридният протеин, означен RTS. Този хибрид се състои от:

- метионинов остатък, кодиран чрез нуклеотиди 1059 до 1061, произлезли от Saccharomyces cerevisiae TDH3 генна последователност (нуклеотиди 1-1058 в тази четяща рамка изработва самият TDH3 промотор) (Musti А. М. et al., Gene 1983, 25, 133134);

- три аминокиселини, Met Ala Pro, произлезли от нуклеотидна последователност (1062 до 1070), създадена чрез метод на клониране, използван за конструиране на хибридния ген;

- интервал от 189 аминокиселини, кодирани чрез нуклеотиди 1071 до 1637, представлява аминокиселини 210 до 398 от периферния протеин (CSP) на Plasmodium falciparum щам 7G8 (Dame et al., supra);

- аминокиселина (Arg), кодирана чрез нуклеотиди 1638 до 1640, създадени чрез метод за клониране, използван за конструиране на хибридния ген;

- четири аминокиселини Pro Val Thr Asn, кодирани от нуклеотиди 1641 до 1652 и представляващи четирите крайни карбоксиостатъци на вируса на хепатит В (adw серотип) preS2 протеин (9);

- интервал от 226 аминокиселини, кодирани чрез нуклеотиди 1653 до 2330 и определящи S-протеина на вируса на хепатит В (adw серотип).

В WO 93/10152 освен това се описва експресията на хибридния протеин в приемник щам дрожди, който вече носи в неговия геном няколко интегрирани копия на хепатит В S експресионна касета. Полученият щам синтезира два полипептида, S и RTS (или друг хибриден протеин от изобретението), които спонтанно се комплектуват в смесени (например RTS, S) липопротеинови частици. Тези частици благоприятно представят CSP-последователностите на хибрида на техните повърхности.

Техническа същност на изобретението

Предмет на настоящото изобретение е придаване имунитет срещу инфекции, с Р. falciparum и/или Р. vivax чрез имунизиране със състав, съдържащ множество антигени в комбинация с адювант, който е изгоден стимулатор на ТН1 клетъчния отговор.

Съобразно това настоящото изобретение осигурява състав на ваксина за предотвратяване или лечение на малария, съдържащ множество маларийни антигени в комбинация с адювант, който е изгоден стимулатор на ТН1 клетъчен отговор.

За предпочитане най-малко един от антигените е хибриден протеин, както е дефиниран по-горе, като RTS, повече за предпочитане под формата на смесени частици, както са дефинирани по-горе, като RTS, S.

Друг аспект на изобретението е осигуряване на състав на ваксина за предотвратяване или лечение на малария, съдържащ множество маларийни антигени, характеризиращ се с това, че най-малко един от антигените е хибриден протеин, както е дефиниран погоре, като RTS, повече за предпочитане под формата на смесени частици, както са дефинирани по-горе, като RTS, S.

Количеството антиген, съдържащо се във всяка доза ваксина, се избира като количество, което предизвиква имунозащитен отговор без значителните нежелани странични действия на типичните ваксини. Това количество варира в зависимост от това кой специфичен имуноген е използван. Най-общо, очаквано е всяка доза да съдържа общо 11000 pg протеин, за предпочитане l-2000pg, особено за предпочитане 10-100pg. Оптималното количество за дадена ваксина може да се определи чрез стандартни изследвания, включващи наблюдение на имунния отговор на субектите. След първоначалното ваксиниране субектите за предпочитане получават повторна ваксинация след около 4 седмици, последвана от повтаряща се реваксинация на всеки шест месеца, докато съществува риск От инфекция.

Друг аспект на изобретението е метод за лечение на пациент, податлив на инфекции с плазмодия, чрез прилагане на ефек тивно количество от ваксината, както е описана тук по-горе.

Адюванти, които са способни да стимулират изгодно ТН1 клетъчен отговор, са описани в WO 94/00153 и WO 95/17209. 5

Специално предпочитан адювант съдържа QS21, пречистена чрез HPLC нетоксична фракция, получена от кората на Quillaja saponaria Molina, и З-де-О-ацилиран монофосфориллипид А (3 D-MPL), в даден слу- 10 чай заедно с емулсия масло във вода.

З-де-О-ацилираният монофосфориллипид А е известен от GB 2220211 (Ribi). Химически той е смес от З-де-О-ацилиран монофосфориллипид А с 4, 5 или 6 ацилирани 15 вериги и е произвеждан от Ribi Immunochem Montana. Предпочитана форма на З-де-О-ацилиран монофосфориллипид А е описан в WP 92/116556.

QS21 е пречистена чрез HPLC неток- 20 сична фракция на сапонин от кората на южноамериканското дърво Quillaja saponaria Molina и методът за производството й е описан (като QA21) в US 5 057 540.

Предпочитаната емулсия масло във вода 25 съдържа масло, което може да се метаболизира, като сквален, α - токоферол и Tween 80. В допълнение емулсията масло във вода може да съдържа Span 85 и/или лецитин.

Съотношението QS21:3D-MPL обикно- 30 вено е в порядъка 1:10 до 10:1; за предпочитане 1:5 до 5:1 и често по същество 1:1. Предпочитаният порядък за оптимален синергизъм е 2,5:1 до 1:1 3D MPL:QS21. Обикновено за приложение на човек QS21 и 3D MPL се 35 съдържат във ваксината в порядъка 1 gg 200μ g, като 1-100 pg, за предпочитане lQjg 50 pg за доза. Обикновено емулсията масло във вода съдържа от 2 до 10% сквален, от 2 до 10% а- токоферол и от 0,3 до 3% Tween 40 80. За предпочитане съотношението на сквалена и α-токоферола е равно или по-малко от 1, тъй като това осигурява по-стабилна емулсия. Може също да се съдържа Span 85 в концентрация от 1%. В някои случаи може 45 да бъде изгодно ваксините съгласно настоящото изобретение да съдържат още стабилизатор.

Приготвянето на ваксината най-общо е описано в New Trends and Developments in 50 Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A., 1978. Кап сулиране c липозоми например е описано от Fullerton, US 4 235 877. Конюгация на протеини c макромолекули е описано например от Likhite, US 4 372 945 и Armor et al., US 4 474 757.

Получените маларийни антигени, полезни за настоящото изобретение, могат да бъдат избрани от следните:

1. Хибриден протеин, както е дефиниран по-горе, като RTS, повече за предпочитане под формата на смесени частици, както са дефинирани по-горе, като RTS, S;

2. TRAP на клониран изолат от Р. falciparum от Тайланд, известен като Т/9/ 96, и протеини, имащи най-малко 80% хомология със същия, и имуногенни производни, включително фрагменти от същия (описани в WO 90/01496 и WO 91/11516 (3i Exploitation Limited) и WO 92/11868 (US Navy);

3. Протеина 16 KD, описан в WO91/ 18922, и протеини, имащи най-малко 80% хомология със същия, и имуногенни производни, включително фрагменти от тях;

4. Апликалния мембранен антиген-1 (АМА-1) от Р. falciparum или Р. vivax и про-*· теини, имащи най-малко 80% хомология със’ същия, и имуногенни производни, включи-*’ телно фрагменти от тях;

5. Периферноспорозоитен протеин (csp) от Р.falciparum или Р. vivax и протеини, имащи най-малко 80% хомология със същия, и имуногенни производни, включително фрагменти от тях;

6. MSP-1 от Р. falciparum или Р. vivax (US 4 837 016) и протеини, имащи най-малко 80% хомология със същия, и имуногенни производни, включително фрагменти от тях;

7. Други протеини от екзоеритроцитния стадий и имуногенни прозиводни, включително фрагменти от тях;

8. В даден случай протеини от кръвния стадий и имуногенни производни, включително фрагменти от тях.

Терминът “имуногенно производно” се отнася до всяка молекула, като отрязан или друго производно на протеин, което запазва способността да възбужда имунен отговор към протеина след вътрешно прилагане на човек. Такива други производни могат да се получат чрез добавяне, изпускане, заместване или прегрупиране на аминокиселини или чрез химическа модификация на същите.

Имуногенни фрагменти на протеина, които могат да бъдат полезни при приготвянето на подединици ваксини, могат да се приготвят чрез експресиране на подходящи гении фрагменти или чрез пептиден синтез, например като се използва Merrifield-синтез (The Peptides, vol. 2, Academic Press, NY, p. 3).

Имуногенното производно може да бъде хибрид, т.е. слят полипептид, съдържащ допълнителни последователности, които могат да носят един или повече епитопи за други имуногени Plasmodium или други имуногени не-Plasmodium. Алтернативно, имуногенните производни съгласно изобретението могат да бъдат слети с носещ полипептид като антиген от повърхността или сърцевината на хепатит В, или с друг носител, който има имуностимулиращи свойства, както в случая на адювант, или който по друг начин усилва имунния отговор към протеина или неговото производно, или който може да се използва за експресиране, пречистване или приготвяне на готова форма с протеина или неговото производно.

Протеините или техните имуногенни производни, които са полезни съгласно изобретението, могат да бъдат химически конюгирани с макромолекула, като се използва обичайно свързващо средства като глутаралдехид (Geerlings et al., (1988) J. Immunol. Methods, 106, 239-244).

Примери за изпълнение на изобретението

Следващият пример илюстрира изобретението.

Пример. Конструиране и експресия на рекомбинантен TRAP

Приготвя се, както е описано в WO 90/01496.

Конструиране и експресия на RTS, S

Приготвя се, както е описано в WO 93/10152.

Приготвяне на адювант

Приготвят се две готови форми на адюванти, като всяка съдържа следния масло във вода емулсионен компонент:

SB 26: 5% сквален, 5% токоферол, 0,4% Tween 80; размерът на частиците е 500 nm.

SB62: 5% сквален, 5% токоферол, 2,0% Tween 80; размерът на частиците е 180 nm.

Приготвяне на емулсията SB62 (2-кратен концентрат)

Разтваря се Tween 80 в буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS), като се получава 2% разтвор в PBS. За да се приготвят 100 ml двукратен концентрат на емулсията, 5 g DL а токоферол и 5 ml сквален се разбъркват чрез завихряне, за да се смесят напълно. Прибавя се 90 ml от разтвора PBS/ Tween и се разбърква пълно. Получената емулсия след това се прокарва през шприц и накрая се микрофлуидизира чрез използване на апарат за микрофлуидизиране M110S. Получените маслени капки имат размер приблизително 180 nm.

Приготвяне на емулсията SB26.

Емулсията се приготвя по аналогичен начин, като се използва 0,4% Tween 80.

Други емулсии, както са посочени в таблицата, са приготвени по аналогичен начин.

Към всеки 100 ml от емулсията се прибавят двата антигена (10 mg от всеки антиген, еквивалентни на 50 pg за доза) и се смесват. Обединяват се със 10Qig/ml 3-DMPL и 100pg/ml QS21, като се получава крайната готова форма. Буферът се нагажда съгласно съдържанието на сол и pH.

ТАБЛИЦА

Двукратно концентрирани носители

Емулсии SB	Токоферол (%)	Сквален (%)	Tween 80 (%)	Span 85 (%)	Лецитин (%)	Размер
26	5	5	0,4	0	0	500 nm 90-100 % 800 nm 10-0 %
26,1	5	5	0,4	0	0,1	500 nm
63	5	5	0,6	0	0	500 nm
64	5	5	0,8	0	0	500 nm
61	5	5	1	0	0	250-300 nm
62	5	5	2	0	0	180 nm
40	5	5	0,4	1	0	500 nm 80-100 % 800 nm 20-0 %
40,1	5	5	0,4	1	0,1	500 nm
60	5	5	1	1	0	300 nm
65	5	5	0,4	1,5	0	500 nm
66	5	5	0,4	2	0	500 nm

Сравнителен пример ^w

Различни готови форми на RTS, S

RTS, S е описан в WO 93/10152 и е приготвена форма за ваксиниране на мишки порода balb/c. Във всяка група има по 5 жи- 45 вотни, 7 групи животни получават следните готови форми:

Група 1	RTS,S SB62
Група 2	RTS,S QS21 3D-MPL
Група 3	RTS,S QS21 2D-MPL SB62
Група 4	RTS,S 3D-MPL AL(OH)j
Група 5	RTS,S AL(OH)₃

Група 6 Обикновена

Група 7 Отрицателен контрол (RTS,S - 5pg/flO3a, 3 D-MPL- 5pg/floза, QS21- 5pg/доза)

Животните се инокулират и им се взема кръв след 15 дни след първата имунизацията и в дните 7-ми и 15-и след втората имунизацията и се изследват за анти HBsAg подтип антитела. Емулсията SB62, когато е приготвена с QS21 и 3D-MPL, усилва преференциално и по синергичен начин отговора IgG2a антитяло в сравнение с SB62 самостоятелно.

Усиленият отговор IgG2a антитяло у мишки е мярка за способността на адювантната система да стимулира отговор от ТН1 тип.

Claims

5 Патентни претенции

1. Ваксина против малария, характеризираща се с това, че съдържа най-малко два маларийни антигена в комбинация с адювант, който е преференциален стимулатор на ТН1 клетъчен отговор и в чийто състав наймалко двата маларийни антигена са избрани от групата:

a) хибриден протеин, съдържащ по същество всички С-крайни части на CSпротеин, четири или повече тандемни повторения на имунодоминантната област и повърхностния антиген от вируса на хепатит В (HBsAg);

b) TRAP от клониран изолат от Р. falciparum от Тайланд, известен като Т/9/96, и протеини, имащи най-малко 80% хомология със същия, и имуногенни производни, включително фрагменти от тях;

с) MSP-1 Р. falciparum или Р. vivax и протеини, имащи най-малко 80% хомология със същия, и имуногенни производни, включително фрагменти от тях.
2. Ваксина съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че адювантът съдържа MPL.
3. Ваксина съгласно претенция 1 или 2, характеризираща се с това, че адювантът съдържа QS21.
4. Ваксина съгласно някоя от предходните претенции, характеризираща се с това, че адювантът съдържа емулсия масло във вода.
5. Метод за лечение или предотвратяване на малария, характеризиращ се с това, че на пациента се прилага ефективно количество от ваксина съгласно някоя от претенциите 1 до 4.