CN104338129B

CN104338129B - 雷帕霉素作为疫苗佐剂的用途及制备方法

Info

Publication number: CN104338129B
Application number: CN201310320670.7A
Authority: CN
Inventors: 肖晖; 袁川评; 臧爱萍; 杜旻
Original assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Current assignee: Shanghai Institute Of Immunology And Infection Chinese Academy Of Sciences
Priority date: 2013-07-26
Filing date: 2013-07-26
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2033-07-26
Also published as: WO2015010659A1; EP3028715A1; US20160279236A1; CN104338129A

Abstract

本发明涉及雷帕霉素作为疫苗佐剂的用途及制备方法。本发明首次揭示雷帕霉素具有佐剂活性，能够促进一些免疫因子的生成，并且，其与单磷酸脂质A共同应用，可发挥增效的效果，极大地增强机体对于抗原的免疫反应。

Description

雷帕霉素作为疫苗佐剂的用途及制备方法

技术领域

本发明属于免疫学以及药学领域；更具体地，本发明涉及雷帕霉素作为疫苗佐剂的用途及制备方法。

背景技术

应用佐剂是优化抗原免疫效果的重要手段，佐剂不仅可以从量方面增强疫苗诱导的免疫反应，提高中和性抗体的滴度；还可以从质方面优化免疫反应，比如增强记忆性B细胞和T细胞的数量并延长它们的存活时间，达到比“自然感染”本身诱导的免疫反应更优越的保护效果。迄今为止，人用佐剂只有三种，分别为铝佐剂、MF59和单磷酸脂质A(MPL)，远远不能满足众多疫苗研发的需要，因此研发佐剂势在必行。铝佐剂主要是能够加强Th2型抗体反应，这对于清除胞外病原菌和寄生虫感染有效，但对于治疗胞内病毒感染疗效甚微。MPL也仅在针对人乳头瘤病毒HPV和乙型肝炎病毒HBV的疫苗策略中有效。研究表明，MPL刺激树突细胞仅能诱导有限的IL-12，使得它在增强Th1反应方面的能力有限。而T细胞介导的免疫反应和IFNγ的分泌已被证明在清除HIV，HCV和TB感染，以及治疗癌症中起关键作用。因此，研发能够成功诱导T细胞反应的疫苗佐剂策略就尤为迫切。

mTOR信号通路是调控细胞生长与增殖的一个关键通路，该通路将从营养分子、能量状态以及生长因子传来的信号整合在一起，调控大量的生命过程。该通路的失调与多种人类疾病相关，包括癌症、糖尿病与心血管疾病。最近的研究表明mTOR也参与调节天然免疫和适应性免疫，因此是一个具有多种功能的调节分子。雷帕霉素(Rapamycin)是一种能够特异性抑制mTOR的小分子化合物，它在1999年已被美国FAD批准用于肾移植的抗排异治疗，目前也正被研究用于治疗癌症等疾病。

发明内容

本发明的目的在于提供雷帕霉素作为疫苗佐剂的用途及制备方法。

在本发明的第一方面，提供一种免疫增强剂组合物，该组合物包括雷帕霉素或其衍生物和单磷酸脂质A(MPL)。

在另一优选例中，所述的免疫增强剂组合物中，雷帕霉素或其衍生物与单磷酸脂质A按照重量比为(0.2～20):1；较佳地为(0.5～15):1；更佳地为(2～12):1。

在另一优选例中，所述免疫增强剂组合物中还包括：药学上可接受的载体(如PBS或生理盐水)。

在另一优选例中，雷帕霉素或其衍生物和单磷酸脂质A在所述的组合物中的含量是有效量的，例如在组合物中占0.01-80%(w/w)；较佳地0.1-20%(w/w)。

在另一优选例中，所述免疫增强剂组合物中还包括：抗原；较佳地，所述抗原包括(但不限于)：灭活或减毒的病毒颗粒、假病毒颗粒(VLP)或者多肽抗原、蛋白质抗原。

在另一优选例中，所述的抗原与单磷酸脂质A按照重量比为(0.2～20):1；较佳地为(0.5～10):1；如1:1，2:1，1:2。

在另一优选例中，抗原在所述的组合物中的含量是有效量的，例如在组合物中占0.01-80%(w/w)；较佳地0.1-20%(w/w)。

在另一优选例中，所述的抗原包括(但不限于)：乙型肝炎病毒的表面抗原，丙型肝炎病毒抗原、艾滋病毒抗原、肿瘤抗原或卵清蛋白。

在另一优选例中，所述的雷帕霉素的衍生物包括(但不限于)：替西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)、Deforolimus(AP23573)，Zotarolimus，Ridaforolimus，CCI-779，RAD001，ABT-578，SDZ RAD，SAR943，1139-52Biolimus A9或其它类型的mTOR抑制剂，包括(但不限于)Ku0063794，PP242，PI-103，AZD8055，Palomid529，AZD2014，Torin1，SNS-032。

在本发明的另一方面，提供了一种药盒，所述药盒中含有所述的免疫增强剂组合物；或所述药盒中含有分别独立包装的雷帕霉素或其衍生物和单磷酸脂质A。

在另一优选例中，所述的药盒中还包含有抗原。

在本发明的另一方面，提供雷帕霉素或其衍生物的用途，用于制备增强单磷酸脂质A的佐剂活性的制剂。

在本发明的另一方面，提供一种制备所述的免疫增强剂组合物的方法，所述方法包括：将雷帕霉素或其衍生物和单磷酸脂质A(MPL)进行混合，获得免疫增强剂组合物。

在一个优选例中，雷帕霉素或其衍生物和单磷酸脂质A按照重量比为(0.2～20):1；较佳地为(0.5～15):1；更佳地为(2～12):1进行混合。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、雷帕霉素增强LPS诱导BMDC产生IL-12和IL-23，而抑制IL-10的产生。

图2、雷帕霉素对BMDM中LPS诱导基因表达的影响。

(a)雷帕霉素对BMDM中LPS诱导的细胞因子转录表达的影响；

(b)雷帕霉素对BMDM中LPS诱导的共刺激分子转录表达的影响；

(c)雷帕霉素对BMDM中LPS诱导的促炎因子和趋化因子转录表达的影响。

图3、雷帕霉素增强OVA特异性T细胞反应和抗体反应。

(a)雷帕霉素促进OVA特异性Th1和CD8+细胞反应；

(b)雷帕霉素促进OVA特异性IgG2b和IgG2c抗体滴度。

图4、雷帕霉素能显著增强MPL的佐剂活性。

(a)雷帕霉素提高MPL增强的HBsAg特异性抗体反应；

(b)雷帕霉素提高MPL增强的HBsAg特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞反应；

(c)雷帕霉素提高MPL增强的HBsAg特异性Th2细胞反应；

(d)雷帕霉素提高MPL增强的HBsAg特异性Th17细胞反应。

图5、不同剂量的雷帕霉素都能显著增强MPL的佐剂活性。

(a)不同剂量的雷帕霉素提高MPL增强的HBsAg特异性抗体反应；

(b)不同剂量的雷帕霉素提高MPL增强的HBsAg特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞反应。

图6、在同源性初免-增强的免疫方案中，雷帕霉素能显著增强MPL的佐剂活性。

具体实施方式

本发明人经过长期而广泛的研究，意外地发现雷帕霉素具有佐剂活性，能够促进一些免疫因子的生成。并且，所述的雷帕霉素与单磷酸脂质A(MPL)共同应用，可发挥增效的效果，极大地增强机体对于抗原的免疫反应。基于此完成了本发明。

雷帕霉素及其用途

雷帕霉素的分子式为C₅₁H₇₉NO₁₃，其结构式为式(I)：

雷帕霉素的衍生物也可被包含在本发明中。所述的雷帕霉素的衍生物包括但不限于：替西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)、Deforolimus(AP23573)，Zotarolimus，Ridaforolimus，CCI-779，RAD001，ABT-578，SDZ RAD，SAR943，1139-52Biolimus A9，以及其它类型的mTOR抑制剂，包括但不限于：Ku0063794，PP242，PI-103，AZD8055，Palomid529，AZD2014，Torin1，SNS-032。这些衍生物与雷帕霉素具有类似的结构(如母核结构相同)或相同的作用机制，从而也可被应用于本发明中。例如，Koichi Araki1等；Nature.2009July2;460(7251):108–112.doi:10.1038/nature08155.mTOR regulatesmemory CD8T cell differentiation和Amiel E等，J Immunol.2012Sep1;189(5):2151-8.doi:10.4049/jimmunol.1103741.Epub2012Jul23.Inhibition of mechanistic targetof rapamycin promotes dendritic cell activation and enhances therapeuticautologous vaccination in mice，证明了mTOR抑制剂的具有类似的作用机制。

一些雷帕霉素衍生物的结构及分子式列举如下：

替(坦)西罗莫司分子式为C₅₆H₈₇NO₁₆，其结构式为式(II)：

替(坦)西莫司分子式为C₅₆H₈₇NO₁₆，其结构式为式(III)：

依维莫司分子式为C₅₃H₈₃NO₁₄，其结构式为式(IV)：

42-(二甲基亚膦酰)雷帕霉素分子式为C₅₃H₈₄NO₁₄P，其结构式为式(V)：

42-(二甲基亚膦酰)雷帕霉素分子式为C₅₃H₈₄NO₁₄P，其结构式为式(VI)：

唑他莫司分子式为C₅₂H₇₉N₅O₁₂，其结构式为式(VII)：

Olcorolimus分子式为C₅₁H₈₁NO₁₂，其结构式为式(VIII)：

Umirolimus分子式为C₅₅H₈₇NO₁₄，其结构式为式(VIIII)：

Ku0063794分子式为C₂₅H₃₁N₅O₄，其结构式为式(X)：

PP242分子式为C₁₆H₁₆N₆O，其结构式为式(XI)：

PI-103分子式为C₁₉H₁₆N₄O₃，其结构式为式(XII)：

AZD8055分子式为C₂₅H₃₁N₅O₄，其结构式为式(XIII)：

Palomid529分子式为C₂₄H₂₂O₆，其结构式为式(XIIII)：

AZD2014分子式为C₂₅H₃₀N₆O₃，其结构式为式(XV)：

Torin1分子式为C₃₅H₂₈F₃N₅O₂，其结构式为式(XVI)：

SNS-032分子式为C₁₇H₂₄N₄O₂S₂，其结构式为式(XVII)：

目前现有技术中将雷帕霉素或其衍生物用作免疫抑制药物。通过与相应免疫嗜素RMBP结合抑制细胞周期G0期和G1期，阻断G1进入S期而发挥作用，其效应为：①抑制T和B细胞增殖；②抑制IL-1、IL-2、IL-6和IFN-γ诱导的淋巴细胞增殖；③抑制IgG和供者特异性抗体(细胞毒抗体)产生；④抑制单核细胞增殖。可用于抗移植排斥反应和治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮等自身免疫病。

本发明中，发现雷帕霉素或其衍生物可以作为一种免疫佐剂，由于其已经在病人中广泛使用，因此在安全性方面表现出较强的可行性。并且，本发明还证实，雷帕霉素或其衍生物能够显著优化MPL佐剂活性，尤其能够增强MPL诱导的T细胞反应。

所述的雷帕霉素或其衍生物已经是一种商品化的产品，本领域技术人员可以通过商购途径获得。此外，其也可通过化学合成的方式获得。

本发明提供了雷帕霉素或其衍生物或其药学上可接受的盐的用途，用于制备免疫增强剂。较佳地，用于制备增强单磷酸脂质A的佐剂活性的制剂。

为了论证雷帕霉素的上述用途，本发明人通过体外细胞试验，证实了雷帕霉素可促进树突状细胞产生IL-12和IL-23，抑制产生IL-10；促进IL-12a、IL-12b和IL-23a的转录表达，抑制IL-10和PD-L1的表达。进而，通过动物试验，证实了雷帕霉素可增强单磷酸脂质A(MPL)的佐剂活性。

因此，雷帕霉素或其衍生物是一个能有效增强抗原特异性T细胞和抗体反应的佐剂，而且雷帕霉素或其衍生物与MPL的组合比现阶段最好的MPL和铝佐剂更好。

组合物

基于本发明的新发现，提供了一种免疫增强剂组合物，其包括雷帕霉素或其衍生物和单磷酸脂质A(MPL)。所述的雷帕霉素或其衍生物和MPL在组合物中的含量均是安全有效量的。作为本发明的优选方式，所述的组合物中，雷帕霉素或其衍生物与单磷酸脂质A按照重量比为(0.2～20):1；较佳地为(0.5～15):1；更佳地为(2～12):1。所述的组合物中，还可含有药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明中，所述的“免疫增强剂”是非特异性免疫增强剂，也称为“佐剂”。所述的佐剂当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。

本发明中，术语“含有”或“包括”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。

本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的雷帕霉素或其衍生物或其生理上可接受的盐传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。

本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自：溶液、悬浮液、粉末、颗粒、片剂、胶囊、糖浆或气雾剂。其中雷帕霉素或其衍生物和/或MPL可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中。

本发明的雷帕霉素或其衍生物和/或MPL及其组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。

雷帕霉素或其衍生物和/或MPL的给药剂量和模式可以变化，MPL可以用0.03-150mg/60kg体重，较佳地3-60mg/60kg体重给药；雷帕霉素或其衍生物可以用0.03-900mg/60kg体重；较佳地0.3-600mg/60kg体重。通常，本发明的化合物与抗原处理一次即可诱导较好的免疫反应，在一个月后重复免疫一次，可以达到更好的效果。由于需要，也可以每相隔1-3个月重复加免一次，重复2-3次以达到最佳的免疫效果。

所述的雷帕霉素或其衍生物和/或MPL可被包含在疫苗组合物中。所述的疫苗组合物中还包括抗原，构成完整的可诱导机体产生免疫应答的疫苗组合物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1、雷帕霉素(Rapamycin)能够显著增加树突状细胞诱导产生IL-12和IL-23

树突细胞分泌的细胞因子IL-12是诱导Th1和CD8的主要调节因子。而MPL作为TLR4的一种配体，刺激树突细胞仅能诱导有限的IL-12。本发明人首先在体外实验中测试雷帕霉素是否能够增强树突细胞中TLR4信号激活诱导的IL-12。

取6-8周龄C57BL/6小鼠骨髓干细胞，用氯化铵裂解液(0.15M NH₄Cl，1mM KHCIO₃，0.1mM Na₂EDTA，pH7.3)去除红细胞，按10⁶个/毫升的细胞密度悬浮培养在树突状细胞(bone-marrow derived dendritic cell，BMDC)分化培养基中(培养基配方为：RPMI1640完全培养基(含5%(v/v)FBS和1%(v/v)pen/strep)，加20ng/ml GM-CSF，10ng/ml IL-4，2mM L-谷氨酰胺和200μMβ-巯基乙醇)，分化7天后利用CD11c磁珠纯化得到BMDC。将纯化的BMDC重悬于新鲜树突状细胞培养基(10⁶个/ml)，接种到24孔板中，每孔接种500微升，用100nM雷帕霉素或DMSO(对照)预处理细胞1小时，接着用100ng/ml LPS刺激细胞24小时。取上清，酶联免疫法测IL-12的量。

结果如图1，雷帕霉素预处理后，IL-12较对照组有3倍多的升高。而且，本发明人还发现，雷帕霉素能显著增加BMDC诱导分泌IL-23的能力，相反却抑制IL-10的产生。

实施例2、雷帕霉素选择性影响调节适应性免疫的相关基因，而不影响促炎症因子的表达

取6-8周龄的C57BL/6小鼠骨髓干细胞，将细胞按10⁶个/ml的密度培养在骨髓起源的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)分化培养基中(配方为：RPMI1640完全培养基，外加30%(v/v)L929条件培养基和1%(v/v)pen/strep)分化4天后，去除旧培养基(含悬浮细胞)，加入新鲜的BMDM分化培养基，在分化的第7天，收集贴壁的BMDM，用于细胞实验。

用100nM雷帕霉素或DMSO分别预处理BMDM1小时，接着用100ng/ml LPS刺激细胞，分别在1、2、4、8小时收集细胞，冻存在-80℃冰箱，用于RNA抽提制备。

利用TRIZOL(Invitrogen)方法提取BMDM的RNA，并用SuperScript^TMIII ReverseTranscriptase Kit(Invitrogen)分别反转录1μg RNA合成第一链cDNA，用于实时定量PCR检测基因表达水平。实时定量PCR引物详见表1。运用ΔΔct方法计算所测基因相对于GAPDH的相对表达量。

表1、实时定量PCR引物序列

实时定量PCR结果如图2，显示在LPS刺激的4小时内，雷帕霉素能够增强IL-12a、IL-12b和IL-23a的转录表达，但抑制IL-10的表达(图2a)。

此外，本发明人还发现，参与适应性免疫反应的一些共刺激分子、细胞因子也受到雷帕霉素的影响，并且在处理的时间范围内呈现不同的表达模式。图2显示，LPS刺激后，雷帕霉素能够显著增加抑制PD-L1的表达，却对CD80、CD86和CD40并没有明显影响。

而且，雷帕霉素并不影响促炎因子或趋化因子如TNFα和CXCL2的转录表达(图2c)，表明将雷帕霉素作为佐剂使用时引起非特异性炎症反应的可能性极低。

实施例3、雷帕霉素能够显著增强MPL的佐剂活性

在树突细胞和巨噬细胞中，雷帕霉素均能显著增强LPS诱导产生IL-12(p70)，那么它对于调节抗原特异性的适应性免疫反应能力又如何呢？本发明人运用腹腔注射方法，以卵清蛋白(Ovalbumin，10μg/只)为抗原来免疫6-8周龄小鼠，分别以PBS(阴性对照)，MPL(10μg/只，阳性对照)，雷帕霉素(100μg/只)，雷帕霉素(100μg/只)+MPL(10μg/只)为佐剂，进行初次免疫，3周用卵清蛋白(10μg/只，不含佐剂)免疫一次，二免1周后杀小鼠，取血测量OVA特异性IgG1，IgG2b，IgG2c含量；同时用10μg/ml的OVA-1(SIINFEKL)或OVA-II(ISQAVHAAHAEINEAGR，Invitrogen)来刺激脾脏细胞(5×10⁵个)，48小时后，用酶联免疫法(ELISA)测定上清中的IFNγ含量。

结果显示(图3)，MPL作为佐剂能够显著增强分泌IFNγ的OVA特异性CD4+和CD8+T细胞反应和IgG2b，IgG2c和IgG1抗体滴度。与阴性对照相比，雷帕霉素单独作用能产生相对适中的OVA特异性CD4+和CD8+T细胞反应和IgG2b，IgG2c和IgG1抗体滴度。重要的是雷帕霉素与MPL共同作用较之MPL单独作用，OVA特异性CD4+和CD8+T细胞反应有近2倍增强，而且OVA特异性IgG2b，IgG2c抗体滴度也有极显著地增强。OVA特异性IgG1抗体滴度在MPL或MPL+雷帕霉素分别作为佐剂条件下没有明显差异。这些结果表明，雷帕霉素能够有效加强MPL的佐剂效果。

由乙肝病毒(HBV)外膜蛋白抗原组成的病毒样颗粒(virus-like particles，VLP)是目前为止少数几个用于临床的成功重组型疫苗之一。铝佐剂(Alum)仅在年长人群和肾功能障碍病人中能够增强VLP的免疫反应，但是效果也比较有限。然而，Alum与MPL一起能够显著加强HBV疫苗活性。本发明人之前的结果显示，雷帕霉素也能够显著增强MPL的佐剂效果，为了进一步分析雷帕霉素的佐剂活性，本发明人以HBsAg VLP(5μg/只)(上海叶民生物技术有限公司，货号YM-101)为抗原，分别与Alum(200μg/只)，Alum(200μg/只)+MPL(10μg/只)，MPL(10μg/只)+雷帕霉素(100μg/只)混合免疫C57BL/6小鼠，一免3周后，再用HBsAg(不含MPL或雷帕霉素)免疫一次，二免2周后杀小鼠，取血测量HBsAg特异性IgG1，IgG2b，IgG2c含量。为了测试HBsAg特异性T细胞反应，本发明人运用酶联免疫斑点法(Elispot Assay)来测定HBsAg特异性诱导的Th1，Th17和Th2反应。

具体操作如下：按每孔5×10⁵个的脾脏细胞接种到IFNγ、IL-17或IL-4的Elispot96孔板中，用HBsAg(10μg/ml)或者CD8肽段(10μg/ml，ILSPFLPLL，VWLSVIWM，ChinaPeptides Co.,LTD.,Shanghai)来处理或者不处理(对照)，37℃5%CO2孵育两天，除去细胞和上清，用PBST洗板子5遍，接着用50μl2μg/ml生物素藕合的IFNγ(ebioscience，catNo:13-7312)IL-17(ebioscience，cat No:13-7177)或IL-4(Mabtech，cat No:3311-6-250)检测抗体37℃孵育2小时，PBST洗5遍后，用100微升1000倍稀释的Streptavidin-alkalinephosphatase(Mabtech，cat No:3310-10)37℃孵育1小时，PBST洗3遍后，再用PBS洗2遍，加100μl NBT/CPIT底物(Mabtech，cat No:3650-10)，室温孵育半小时，用去离子清洗3遍，避光自然干燥，在ELISPOT READER读取斑点数量，进行统计分析。

结果(图4)显示，与MPL+Alum免疫组相比，雷帕霉素+MLP能够显著增强HBsAg特异性IgG2b，IgG2c抗体滴度(图4a)和CD4+、CD8+T细胞反应(图4b)。而且本发明人还发现，MPL+雷帕霉素免疫组还表现出比MPL+Alum免疫组更强的Th2(图4c)和Th17(图4d)细胞反应。

综合以上结果，雷帕霉素是一个能有效增强抗原特异性T细胞和抗体反应的佐剂，而且雷帕霉素与MPL的组合比现阶段最好的MPL和铝佐剂更好。

实施例4、雷帕霉素与MPL的组合物

组合物1，包含(单只小鼠的用量)：雷帕霉素5μg，MPL10μg，以及PBS0.2ml；

组合物2，包含(单只小鼠的用量)：雷帕霉素20μg，MPL10μg，以及PBS0.2ml；

组合物3，包含(单只小鼠的用量)：雷帕霉素100μg，MPL10μg，以及PBS0.2ml。

将组合物1-3分别与HBsAg(5μg，单只小鼠的用量)混合免疫小鼠，一免3周后用HBsAg(5μg/只，不含任何佐剂)加强免疫一次，一周后杀小鼠，制备血清测量HBsAg特异性IgG1，IgG2b和IgG2c的含量(图5)。同时用10μg/ml的CD8⁺T细胞表位肽段(ILSPFLPLL或VWLSVIWM)和CD4⁺T细胞表位肽段(RGLYFPAGGSSSG)分别刺激脾脏细胞(5×10⁵个)，48小时后，用酶联免疫法(ELISA)测定上清中IFNγ含量(图5b)。结果发现，5μg雷帕霉素就能显著地增强MPL诱导的抗体滴度，将IgG2b和IgG2c的分泌提升了近5倍。将雷帕霉素的剂量增加到20或100μg后，能更好地增强MPL诱导的抗体表达(图5a)。此外，在这三种浓度下，雷帕霉素都有效地增强了MPL诱导的T细胞反应，尤其是分泌IFN-γ的CD4⁺和CD8⁺T细胞的激活(图5b)。所以雷帕霉素在5-100μg范围内显现出了非常好的免疫增强效果，因此能以剂量依赖性的方式促进MPL诱导的抗体滴度和T细胞反应。这一结果表明，雷帕霉素作为佐剂的剂量范围较大，而且在一定的范围内其作用效果与剂量成正比。

实施例5、利用雷帕霉素与MPL的组合物重复免疫能显著增强疫苗的效果

HBsAg(5μg/只)分别与下列佐剂或佐剂组合：雷帕霉素(100μg/只)＋MPL(10μg/只)、MPL(10μg/只)、雷帕霉素(100μg/只)或Alum(200μg/只)+MPL(10μg/只)混合后免疫(初免)C57BL6小鼠。4周后用与初免同样的方案对各组小鼠加免一次，两周后杀小鼠，制备血清测量HBsAg特异性IgG1，IgG2b和IgG2c的含量。图6表明雷帕霉素作为佐剂，两次免疫后能显著地增强HBsAg诱导的抗体滴度，其中包括IgG1，IgG2b和IgG2c的含量。雷帕霉素、Alum和MPL组合后比MPL单独作用的效果要好，表明这两种佐剂组合具有优异的协同作用效果。尤其重要的是雷帕霉素和MPL的组合要比MPL和Alum的组合更佳。

同样地，以雷帕霉素的衍生物替换雷帕霉素，与MPL进行如上组合，结果发现，雷帕霉素的衍生物同样能够显著地增强HBsAg诱导的抗体滴度，比单用MPL效果更明显。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种免疫增强剂组合物，其特征在于，该组合物包括雷帕霉素和单磷酸脂质A。

2.如权利要求1所述的免疫增强剂组合物，其特征在于，雷帕霉素与单磷酸脂质A按照重量比为(0.2～20):1。

3.如权利要求2所述的免疫增强剂组合物，其特征在于，雷帕霉素与单磷酸脂质A按照重量比为(0.5～15):1。

4.如权利要求3所述的免疫增强剂组合物，其特征在于，雷帕霉素与单磷酸脂质A按照重量比为(2～12):1。

5.如权利要求1所述的免疫增强剂组合物，其特征在于，所述免疫增强剂组合物中还包括：药学上可接受的载体。

6.如权利要求5所述的免疫增强剂组合物，其特征在于，所述免疫增强剂组合物中还包括：抗原；所述抗原选自：灭活或减毒的病毒颗粒、假病毒颗粒或者多肽抗原。

7.如权利要求6所述的免疫增强剂组合物，其特征在于，所述的抗原包括：乙型肝炎病毒的表面抗原，丙型肝炎病毒抗原、艾滋病毒抗原、肿瘤抗原或卵清蛋白。

8.一种药盒，其特征在于，所述药盒中含有权利要求1-7任一所述的免疫增强剂组合物；或

所述药盒中含有分别独立包装的雷帕霉素和单磷酸脂质A。

9.如权利要求8所述的药盒，其特征在于，所述的药盒中还包含有抗原；所述抗原选自：灭活或减毒的病毒颗粒、假病毒颗粒或者多肽抗原。

10.雷帕霉素的用途，用于制备增强单磷酸脂质A的佐剂活性的制剂。

11.一种制备权利要求1所述的免疫增强剂组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：将雷帕霉素和单磷酸脂质A进行混合，获得免疫增强剂组合物。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，雷帕霉素和单磷酸脂质A按照重量比为(0.2～20):1进行混合。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，雷帕霉素和单磷酸脂质A按照重量比为(0.5～15):1进行混合。

14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，雷帕霉素和单磷酸脂质A按照重量为(2～12):1进行混合。