CZ285440B6 - Způsob výroby cizích proteinů v streptomycetách - Google Patents
Způsob výroby cizích proteinů v streptomycetách Download PDFInfo
- Publication number
- CZ285440B6 CZ285440B6 CS911101A CS110191A CZ285440B6 CZ 285440 B6 CZ285440 B6 CZ 285440B6 CS 911101 A CS911101 A CS 911101A CS 110191 A CS110191 A CS 110191A CZ 285440 B6 CZ285440 B6 CZ 285440B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- fusion protein
- tendamistate
- gene
- protein
- amino acids
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 65
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 49
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 15
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 title abstract 2
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 35
- 108010037401 tendamistate Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 24
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 10
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 26
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Substances N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010013359 miniproinsulin Proteins 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- RSMZEHCMIOKNMW-GSSVUCPTSA-N Asp-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RSMZEHCMIOKNMW-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 101500021084 Locusta migratoria 5 kDa peptide Proteins 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N Ser-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N Ala-Gly Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- DCVYRWFAMZFSDA-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DCVYRWFAMZFSDA-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 101710171801 Alpha-amylase inhibitor Proteins 0.000 description 2
- HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N Arg-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N Cys-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MFEVVAXTBZELLL-GGVZMXCHSA-N Tyr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 MFEVVAXTBZELLL-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N Ala-Ser Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- SJPZTWAYTJPPBI-GUBZILKMSA-N Asn-Gln-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N SJPZTWAYTJPPBI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XTMZYFMTYJNABC-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N XTMZYFMTYJNABC-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- REQUGIWGOGSOEZ-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Asn Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)C(=O)N REQUGIWGOGSOEZ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 101100275473 Caenorhabditis elegans ctc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 description 1
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- WTXCNOPZMQRTNN-BWBBJGPYSA-N Cys-Thr-Ser Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O WTXCNOPZMQRTNN-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- XMVLTPMCUJTJQP-FXQIFTODSA-N Glu-Gln-Cys Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N XMVLTPMCUJTJQP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- MHZXESQPPXOING-KBPBESRZSA-N Gly-Lys-Phe Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O MHZXESQPPXOING-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LJUIEESLIAZSFR-SRVKXCTJSA-N His-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N LJUIEESLIAZSFR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- DURWCDDDAWVPOP-JBDRJPRFSA-N Ile-Cys-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N DURWCDDDAWVPOP-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- IASQBRJGRVXNJI-YUMQZZPRSA-N Leu-Cys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O IASQBRJGRVXNJI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- VHTIZYYHIUHMCA-JYJNAYRXSA-N Leu-Tyr-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O VHTIZYYHIUHMCA-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N Lys-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- YKBSXQFZWFXFIB-VOAKCMCISA-N Lys-Thr-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O YKBSXQFZWFXFIB-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- 229920000877 Melamine resin Polymers 0.000 description 1
- 101100205189 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 1
- 241000828254 Streptomyces lividans TK24 Species 0.000 description 1
- NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N Thiostrepton B Natural products N1C(=O)C(C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(C(C)CC)NC(C(C2=N3)O)C=CC2=C(C(C)O)C=C3C(=O)OC(C)C(C=2SC=C(N=2)C2N=3)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C(C(C)(O)C(C)O)NC(=O)C(N=4)CSC=4C(=CC)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C21CCC=3C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- XBWKCYFGRXKWGO-SRVKXCTJSA-N Tyr-Cys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XBWKCYFGRXKWGO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000003392 amylase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- JDSHMPZPIAZGSV-UHFFFAOYSA-N melamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(N)=N1 JDSHMPZPIAZGSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229950001790 tendamistat Drugs 0.000 description 1
- 229930188070 thiostrepton Natural products 0.000 description 1
- NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N thiostrepton Chemical compound C([C@]12C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C(=O)NC(/C=3SC[C@@H](N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)[C@H]1N=1)[C@@H](C)OC(=O)C3=CC(=C4C=C[C@H]([C@@H](C4=N3)O)N[C@H](C(N[C@@H](C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)=O)[C@@H](C)CC)[C@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)=C\C)[C@@H](C)O)CC=1C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N 0.000 description 1
- 229940063214 thiostrepton Drugs 0.000 description 1
- NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N thiostrepton A Natural products CC[C@H](C)[C@@H]1N[C@@H]2C=Cc3c(cc(nc3[C@H]2O)C(=O)O[C@H](C)[C@@H]4NC(=O)c5csc(n5)[C@@H](NC(=O)[C@H]6CSC(=N6)C(=CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)c7csc(n7)[C@]8(CCC(=N[C@@H]8c9csc4n9)c%10nc(cs%10)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(=O)N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC1=O)[C@@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)[C@H](C)O NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Řešení se týká genových struktur, kodujících signální sekvenci a asi prvních deset aminokyselin tendamistátu, jakož i požadovaný protein, exprimují se ve vysokých výtěžcích v hostitelských buňkách streptomycet a sekretují fúzní proteiny do prostředí.ŕ
Description
Fúzní protein, způsob jeho výroby, genová struktura pro jeho výrobu, vektor tuto genovou strukturu obsahující, streptomycetová buňka, obsahující tento vektor a použití tohoto fúzního proteinu
Oblast techniky
Vynález se týká fuzních proteinů, způsobu jejich výroby, genové struktury pro jejich výrobu, vektoru tuto genovou strukturu obsahující, streptomycetové buňky, obsahující tento vektor jeho použití tohoto fuzního proteinu.
Dosavadní stav techniky
Z evropské patentové přihlášky s číslem zveřejnění (EP-A) 0 289 936 je známo, že se fúzní proteiny vyrobí tak, že se strukturní gen pro požadovaný protein připojí na 3'-konec kódujícího řetězce popřípadě modifikovaného tendamistát-genu, tato genová struktura se přivede v hostitelské buňce bakterií Streptomyces k expresi a sekretovaný fuzní protein se izoluje z média. Při výhodné formě provedení se tendamistát-gen na 3'-konci zkrátí. Pro zkrácení se používají štěpná místa pro restrikční enzymy BstEII v oblasti tripletů 31 a 32, Stul v oblasti tripletů 43 a 44, jakož i Sau3A v oblasti tripletů 52 a 53.
Při dalším vývoji této vynálezecké myšlenky bylo již navrženo, vyrobit fúzní protein, ve kterém po podílu tendamistátu následuje zkrácený proinsulin, jehož C-řetězec sestává pouze z jednoho nebo dvou lysinových zbytků (miniproinsulin). Jako další pokračování vývoje bylo navrhováno, aby se v takovýchto fúzních proteinech zkrátil i podíl tendamistátu (evropská přihláška EP-A 0 367 163 zveřejněná 9. 5. 1990).
Nyní bylo s překvapením zjištěno, že fuzní proteiny s velmi krátkým podílem tendamistátu jsou v buňce streptomycet stálé a vyplavují se do média. Takto získané fúzní proteiny se chovají v důsledku velmi krátkého řetězce tendamistátu jako zralé proteiny a existují všeobecně v médiu ve správné terciární struktuře.
Z EP-A 0 177 827 je známá syntetická signální sekvence pro přenos proteinů do expresních systémů, která je charakteristická tím, že DNA odpovídá v podstatě přirozené signální sekvenci, avšak vykazuje jedno nebo více štěpných míst pro endonukleázy, která nejsou v přirozené DNA obsažena. Když se připojí gen pro protein, který se má přenést, na takovou sekvenci DNA, zabuduje se tento fuzní gen do vektoru a tím se transformuje hostitelská buňka, která transportuje exprimovaný protein z cytoplasmy, mohou se tak v prokaryotických a eukaryotických buňkách vyrobit prokaryotické nebo virální proteiny. Na příkladu periplasmatického proteinu alkalické fosfatázy se ukazuje, že pří expresi v E. coli je výhodné, když se v návaznosti na pre-sekvenci dosadí kodony pro asi prvních 40 aminokyselin alkalické fosfatázy před strukturní gen pro požadovaný protein. V mnoha případech však postačí také méně přídavných aminokyselin, například asi 10, s výhodou asi 5. Odpovídající fúzní protein s opičím proinsulinem byl transportován asi z 90 % do periplasmatického prostoru.
Bylo již také navrhováno (W0 91/03 550 z 21. 3. 1991) vyrábět fuzní proteiny tak, že se konstruuje směsný oligonukleotid, který kóduje balastní podíl fuzního protein, tento oligonukleotid se vnese do vektoru tak, že je funkčně připojen na regulační region a strukturní gen pro požadovaný protein, s takto získanou populací plasmidu se transformují vhodné hostitelské buňky a ty klony, které vykazují vysoký výtěžek fuzního proteinu, se selektují.
Oligonukleotid sestává při tom s výhodou ze 4 až 12, zejména pak 4 až 8 tripletů.
- 1 CZ 285440 B6
Zkoušelo se rovněž vyrobit fuzní proteiny s krátkým balastním podílem. Tak byla například vyrobena genová fuze, která kóduje fuzní protein z prvních 10 aminokyselin β-galaktosidázy a somatostatinu. Ukázalo se však, že tento krátký fragment β-galaktosidázy nepostačí k tomu, aby chránil fuzní protein před odbouráváním proteázami, vlastními hostiteli (US 4 366 246, 15, odstavec 2). V souladu s tím byly v EP-A 0 290 005 a 0 292 763 popsány fuzní proteiny, jejichž balastní podíl sestává z fragmentu β-galaktosidázy s více než 250 aminokyselinami.
Podstata vynálezu
Neočekávaně bylo nyní zjištěno, že fuzní proteiny, sestávající z prvních sedmi až deseti aminoterminálních aminokyselin tendamistátu a požadovaného proteinu, například proinsulinu, jsou v hostitelských buňkách streptomycet stabilní a jsou sekretovány do média, ze kterého se mohou získat ve vysokých výtěžcích. Je překvapující, že to platí i pro relativně malé proteiny jako jsou mini-proinsuliny.
Předmětem předloženého vynálezu tedy jsou fuzní proteiny, vyrobitelné tak, že se strukturní gen pro požadovaný protein připojí na kodony pro signální sekvence a na prvních sedm až deset aminoterminálních aminokyselin tendamistátu, tato genová struktura se přivede ve streptomycetové hostitelské buňce k expresi a sekretovaný fuzní protein se izoluje z média, přičemž tendamistátové genové sekvence mohou být v oblasti sedmé až desáté aminokyseliny modifikované výměnou aminokyseliny.
Výhodný je fuzní protein, ve kterém je podíl N-terminálních prvních sedmi až deseti aminokyselin tendamistátu připojen, popřípadě přes můstkovou sekvenci, na požadovaný protein. Předmětem předloženého vynálezu je dále způsob výroby fůzních proteinů, jehož podstata spočívá vtom, že se strukturní gen pro požadovaný protein připojí na kodony pro signální sekvence a na prvních sedm až deset aminoterminálních aminokyselin tendamistátu, tato genová struktura se přivede ve streptomycetové hostitelské buňce k expresi a sekretovaný fuzní protein se izoluje z média, přičemž tendamistátové genové sekvence mohou být v oblasti sedmé až desáté aminokyseliny modifikované výměnou aminokyseliny.
Dále je předmětem vynálezu genová struktura, u které jsou signální sekvence a prvních sedm až deset kodonů pro tendamistát připojeny na strukturní gen pro jiný protein.
Výhodně jsou v tendamistátovém podílu vyměněny kodony pro aminokyseliny v oblasti sedmé až desáté aminokyseliny. Mezi genem tendamistátu a strukturním genem pro požadovaný protein je výhodně uspořádán fragment DNA, který je kódován pro peptidický linker se sekvencí AsnSer-Asn-Gly-Arg.
Dále je předmětem předloženého vynálezu vektor, do kterého je ligována výše uvedená genová struktura.
Předmětem předloženého vynálezu je rovněž streptomycetová buňka, obsahující výše uvedený vektor.
Konečně je předmětem vynálezu použití výše uvedeného fiizního proteinu, popřípadě fůzního proteinu, získatelného výše uvedeným způsobem, pro výrobu požadovaného proteinu.
Výhodné jsou fuzní proteiny, v jejichž podílu tendamistátu je v poloze 7 a/nebo 9 prolin (jako v přírodní sekvenci).
-2CZ 285440 B6
Samozřejmě je ale také možné, zvolit v souladu sjiž známými nebo navrženými formami provedení větší balastní podíl tendamistátu, přičemž se ale přirozeně stále více a více ztrácí výhoda malého balastu.
Je možné a dokonce výhodné, když se přirozený sled aminokyselin podílu tendamistatu mění, tedy, když se aminokyseliny vymění nebo se zavedou takové které se v přirozeném sledu aminokyselin nevyskytují. Dále je možné měnit sled aminokyselin v signálním peptidů.
Obzvláště výhodné fúzní konstrukce se mohou snadno zjistit na základě vynálezecké myšlenky jednoduchými předběžnými pokusy.
Dále je také možné uskutečnit vynálezeckou myšlenku i v jiných grampozitivních bakteriálních buňkách, například v buňkách bacilů nebo stafylokoků, za použití signálních sekvencí, které tito hostitelé rozeznají.
Fůzní proteiny, získané podle vynálezu, se vyskytují v médiu v rozpuštěné formě, což poskytuje řadu výhod při dalším zpracování a čištění. Tak se může provádět například další enzymatické zpracování za odštěpení balastního podílu bezprostředně s produktem sekrece, aniž by bylo nutné provádět postupy zpracování, které jsou nezbytné u nerozpustných fuzních proteinů. Je také možné provést před dalším zpracováním nejdříve zakoncentrování nebo čištění, například pomocí afinitní chromatografie, ale také ultrafiltrací, srážením, iontoměničovou chromatografií, adsorpční chromatografií, gelovou filtrací nebo vysokotlakou kapalinovou chromatografií.
Příklady provedení vynálezu
Vynález je blíže vysvětlen v následujících příkladech
Výchozím materiálem pro plasmidové konstrukce je plasmid pKK500, který byl navržen v EP-A 0 367 163. Tento plasmid se liší od plasmidu pKK400, známého z EP-A 0 289 936, náhradou genu proinsulinu analogickým genem, který kóduje namísto C-řetězce pouze aminokyselinu lysin, jakož i zavedením terminátorové sekvence, připojující se k tomuto genu mini-proinsulinu. V následující tabulce 1 a 2 je znázorněn gen mini-proinsulinu a sekvence terminátoru.
Tabulka 1
B1 10
| ASN | SER | ASN | GLY | LYS | PHE | VAL | ASN | GLN | HIS | LEU | CYS | GLY | SER | HIS |
| AAT | TCG | AAC | GGC | AAG | TTC | GTC | AAC | CAG | CAC | CTG | TGC | GGC | TCG | CAC |
| GC | TTG | CCG | TTC | AAG | CAG | TTG | GTC | GTG | GAC | ACG | CCG | AGC | GTG | |
| (EcoRI) | ||||||||||||||
| 20 | 30 | |||||||||||||
| LEU | VAL | GLU | ALA | LEU | TYR | LEU | VAL | CYS | GLY | GLU | ARG | GLY | PHE | PHE |
| CTC | GTG | GAG | GCC | CTC | TAC | CTG | GTG | TGC | GGG | GAG | CGC | GGC | TTC | TTC |
| GAG | CAC | CTC | CGG | GAG | ATG | GAC | CAC | ACG | CCC | CTC | GCG | CCG | AAG | AAG |
| c | A1 | 40 | ||||||||||||
| TYR | THR | PRO | LYS | THR | LYS | GLY | ILE | VAL | GLU | GLN | CYS | CYS | THR | SER |
| TAC | ACC | CCC | AAG | ACC | AAG | GGC | ATC | GTG | GAG | CAG | TGC | TGT | ACG | TCC |
| ATG | TGG | GGG | TTC | TGG | TTC | CCG | TAG | CAC | CTC | GTC | ACG | ACA | TGC | AGG |
-3CZ 285440 B6
Tabulka 1 - pokračování
| ILE | CYS | SER | LEU | TYR | GLN | LEU | GLU | ASN | TYR | CYS | ASN | STP | STO |
| ATC | TGC | TCC | CTC | TAC | CAG | CTC | GAG | AAC | TAC | TGC | AAC | TAG | TAA |
| TAG | ACG | AGG | GAG | ATG | GTC | GGA | CTC | TTG | ATG | ACG | TTG | ATC | ATT |
| GTC | GAC | CTG | CAG | CCA | |||||||||
| CAG | CTG | GAC | GTC | GGT | TCG | A |
Sáli (HindUI)
Tabulka 2 t
GCTATTTGGCTATGTTAATTTCCGAGAAAACCTCGAAAAAAAAACCTCTAAAAGTTGCACCTAG-5'
Plasmidy pKK400 a pKK.500 obsahují v signální sekvenci genu inhibitoru α-amylázy štěpné místo XmalII (v oblasti tripletů -5 až -7).
Příklad 1
Plasmid pKK500 se otevře restrikčními enzymy EcoRI a XmalII a oddělí se velký fragment na 0,8 % agarosovém gelu gelovou elektroforézou a izoluje se elektroelucí. Tento fragment se liguje fragmentem DNA (1) (SEQ ID N0:l) syntetizovaným fosforamiditovou metodou
-5 -1
| Ala | Gly | Pro | Ala | Ser | Ala | ||
| 5'G | GCG | GGG | CCG | GCC | TCC | GCC | |
| 3' | CCC | GGC | CGG | AGG | CGG | ||
| (XmalII) | |||||||
| Asp | Thr | Thr | Val | Ser | Glu | Pro | |
| GAC | ACG | ACC | GTC | TCC | GAG | CCG | 3' |
| GTG | TGC | TGG | CAG | AGG | CTC | GGC TTA A | 5' |
(EcoRI) a ligační směs se transformuje do E. coli. Získá se plasmid pKK510. Tento kóduje preproinsulin, ve kterém na signální sekvenci tendamistátu navazuje prvních 7 aminokyselin tendamistátu a potom řetězec mini-proinsulinu.
Příklad 2
Analogicky jako u způsobu převedení plasmidu pHH400 na expresní plasmid pGFI, který je popsán v EP-A 0 289 936, se plasmid pKK510 převede v expresní plasmid pKFI:
Izolovaná DNA plasmidu pKK510 se štěpí restrikčními enzymy SpHI a Sstl a izoluje se malý fragment s fuzním genem. Na trhu obvyklý expresní plasmid pIJ 702 /získatelný u firmy John Innes Foundation, Norwich, Anglie/ se štěpí stejnými enzymy a izoluje se velký fragment. Tyto oba izolované fragmenty se ligují, ligační směs se transformuje do S. lividans TK24 a z thiostrepton-resistentních bílých transformantů (to znamená neschopných tvořit melanin), se
-4CZ 285440 B6 izoluje plasmid. Klony, které nesou vloženou informaci, se zkouší v třepané kultuře, zda jsou schopny tvořit fuzní proteiny.
Exprese kódovaného fuzního proteinu se provádí o sobě známým způsobem, transformovaný kmen se inkubuje 4 dny při teplotě převyšující 25 °C v třepací baňce a mycelium se oddělí odstředěním od kultivačního roztoku. Vytvořený fuzní protein se může v kultivačním mediu zviditelnit po elektroforéze 20 pm filtrátu kultury v 15 % polyakrylamidovém gelu obarvením RCOOMASSIE-modří jako přídavný pás proteinu, který se při kontrolním pokusu neobjeví, na který byl kmen pouze transformován pomocí pIJ 702.
Jestliže se filtrát kultury zpracovává lysylendoproteinázou, tak se může prokázat gelovou elektroforézou Des-(B30)-Thr-insulin, který se verifikuje autentickou kontrolou.
Dále se může fuzní protein ve filtrátu kultury prokázat protilátkami insulinu buď v testu Immuno-Blot, nebo insulin-RIA.
Příklad 3
Postupuje se jako v příkladu 1 a 2, použije se ale syntetický fragment /2/ se SEQ ID NO: 2.
| Ala | -5 Gly | Pro | Ala | Ser | -1 Ala | |
| 5'G | CCG | GGG | CCG | GCC | TCC | GCC |
| 3' | CCC | GGC | CGG | AGG | CGG |
/XmalII/
| Asp | Thr | Thr | Val | Ser | Glu | Pro | Asp | Pro | |
| GAC | ACG | ACC | GTC | TCC | GAG | CCC | GAC | CCG | 3' |
| CTG | TGC | TGG | CAG | AGG | CTC | GGG | CTG | GGC TTA A | 5' |
| /EcoRI/ |
a získají se tak plasmidy pKK320 popřípadě pKF2.
Tyto plasmidy kódují fuzní protein, který se liší od proteinu podle příkladu 1 a 2 tím, že po prvních 7 aminokyselinách tendamistátu následuje asparagin (místo přirozené aminokyseliny alaninu) a potom devátá aminokyselina v tendamistátu, prolin. Výměnou alaninu za asparagin se tedy zavede do balastního podílu fuzního proteinu dodatečný kladný náboj. Překvapivě se získají asi o 20 až 30 % vyšší výtěžky než podle příkladu 2.
Příklad 4
Postupuje se podle příkladu 1 a 2, ale použije se syntetický fragment /3/ se SEQ ID NO:3
-5 -1
| Ala | Gly | Pro | Ala | Ser | Ala | |
| 5'G | GCC | GGG | CCG | GCC | TCC | GCC |
| 3' | CCC | GGG | CGG | AGG | CGG |
/XmalII/
-5CZ 285440 B6
| Asp | Thr | Thr | Val | Ser | Glu | Pro | Ala | Pro |
| GAC | ACG | ACC | GTC | TCC | GAG | CCC | GCA | CCG |
| CTG | TGC | TGG | CAG | AGG | CTC | GGG | CGT | GGC |
přičemž se získají plasmidy pKK330, popřípadě pKF3. Tyto plasmidy se liší od plasmidů podle příkladu 1 a 2 tím, že kódují prvních 9 přirozených aminokyselin tendamistátu. Ve srovnání s příkladem 2 se získají asi o 10 % vyšší výtěžky.
Příklad 5
Fúzní protein, kódovaný pKK500, obsahuje mezi podílem tendamistátu a B-řetězcem proinsulinu sekvenci linkeru, která kóduje aminokyseliny Asn-Ser-Asn-Gly-Lys. Náhrada tohoto koncového lysinu a lysinu, představujícího C-řetězec, argininem, se provádí dále popsaným způsobem. Při tom se postupuje od singulárního štěpného místa Styl v oblasti kodonu B30 až AI v sekvenci proinsulinu.
Izolovaný plasmid DNA, pocházející zpKK500 se štěpí pomocí Styl, natráví se pro odstranění přesahujících konců Sl nukleázou a přebytečná nukleáza se extrahuje fenolickým chloroformem. Linearizovaný plasmid se potom dále štěpí pomocí EcoRI, velký fragment se oddělí elektroforeticky a izoluje elektroelucí. Tento fragment se liguje se syntetickým fragmentem/4/SEQ ID NO:4/
B1 10
| Asn AAT | Ser TCG GC /EcoRI/ | Asn AAC TTG | Gly GGC CCG | Arg CGC GCG | Phe TTC AAG | Val GTC CAG | Asn AAC TTG | Cln CAG GTC | His GAC GTG | Leu CTG GAC | Cys TGC ACG | Gly GGC GGG | Ser TCG AGC | His CAC GTG |
| 20 | 30 | |||||||||||||
| Leu | Val | Glu | Ala | Leu | Tyr | Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg | Gly | Phe | Phe |
| CTC | GTG | GAG | GCC | CTC | TAC | CTG | GTG | TGC | GGG | GAG | CGC | GGC | CTC | TTC |
| GAG | CAC | CTC | CGG | GAG | ATG | GAC | CAC | ACG | CCC | CTC | CGC | CCG | AAG | AAG |
B/30C/B31/
| Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg |
| TAC | ACC | CCC | AAG | ACC | CGC |
| ATG | TGG | GGG | TTC | TGG | GGG |
a ligační směs se transfřomuje do E. coli. Požadované klony se zkouší restrikční analýzou získaného plasmidu, přičemž se upotřebí nově vzniklé štěpné místo SstlI. Dále se celý fragment SphI-Sstl sekvencuje.
Pro expresi kódovaného fuzního proteinu se fragment přezkoušený sekvenční analýzou liguje ve vektoru pIJ 702, štěpeného stejnými enzymy, přičemž vznikne expresní vektor pGF4.
Důkaz fuzního proteinu kódovaného pGF4 a sekretovaného se může provádět jednak deskovým testem pomocí inhibitoru α-amylázy /EP A O 161629/, příklad 3/ a jednak z média třepané kultury analogicky jako v příkladu 2.
-6CZ 285440 B6
Příklad 6
Jestliže se analogicky jako v příkladu 5 zavede fragment /4/ do vektorů pKK510, 520, 530, získají se vektory pKK610, 620 a 630. Vestavba takovýchto fragmentů SphI-Sstl se sekvencí kódovanou pro fuzní proteiny do vektoru pIJ 702 poskytne expresní vektory pKFl 1, 12 a 13.
Exprese sekretovaných fuzních proteinů se přezkouší podle příkladu 2.
Příklad 7
Pro zvýšení exprese derivátů plasmidu pIJ 702 se z tohoto natrávením pomocí Pstl a Sphl odstraní promotor melaminu a nahradí se syntetickým fragmentem /5/ (SEQ ID NO:5).
Pstl Bol 1
20 30 40 50
CTGCAGTGATCAGGGGGAGCCTTGTGCGAATTTCCGTTACGGGTTTGGGTGGTAGGG GACGTCACTAGTCCCCCTGGGAACACGCTTAAAGGCAATGCCCAAACCCACCATCCC
Sphl
70 80
ACGCACCCGAAGAGGAGGCCCCAGCATGC TGCGTGGGCTTCTCCTCCGGGGTCGTACG
Tím vznikne tandemová konstrukce ze syntetického promotoru a promotoru tendamistátu. Plasmid získá označení pGRl 10.
Jestliže se v pGRllO po štěpení pomocí Sphl a Sstl použijí syntetické fragmenty /1/, /2/ /a/3/, tak rezultují expresní vektory pGR20, 210 a 220. Analogicky se získají s fragmentem /4/ expresní vektoiy pGR250, 260 a 270.
Příklad 8
Jestliže se má zpreinsulinů vyrobit kombinací trypsinu nebo stejně působícího enzymu karboxypeptidázy B humánní insulin, je výhodné, v průběhu štěpné reakce rychle odštěpit aminoterminální balastní podíl, aby se podpořila ve směru kB31 (Arg)-insulinu. K tomu se nabízí modifikace aminokyselin před aminokyselinou Bl/Phe/:
Postupuje se podle příkladu 1 a otevře se plasmid pKK500 pomocí restrikčních enzymů EcoRi a DralII. Původní fragment se potom nahradí pomocí fragmentu DNA /6/, syntetizovaného fosforamiditovou metodou (SEQ ID NO:6)
| Asn | Ser | Ala | Arg | Bl Phe | Val | Asn | Gin | His | Leu | Cys | Gly | Ser | His Leu | |
| 5’ | AAT | TCG | GCC | CGC | TTC | GTC | AAC | CAG | CAC | CTG | TGC | GGC | TCG | CAC CTC 3' |
| 3’ | GC | CGG | GCG | AAG | CAG | TTG | GTC | GTG | GAC | ACG | CCG | AGC | GTG | 5’ |
/EcoRi/ /DralII/
Klonování vE. coli a exprese ve Streptomyces lividans se provádí podle příkladu 1, popřípadě příkladu 2. Rezultuje plasmid pKK640, popřípadě expresní plasmid pKF14.
Analogicky se může postupovat i s plasmidem, který se získá podle příkladu 5 (po vestavbě fragmentu 141). Získá se tak plasmid pKK650, popřípadě pKF15.
Claims (9)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Fúzní protein, vyrobitelný připojením strukturního genu pro požadovaný protein na kodony pro signální sekvence a na prvních sedm až deset aminoterminálních aminokyselin tendamistátu, přivedením této genové struktuiy ve streptomycetové hostitelské buňce k expresi a izolováním sekretovaného fúzního proteinu z média, přičemž tendamistátové genové sekvence mohou být v oblasti sedmé až desáté aminokyseliny modifikované výměnou aminokyseliny.
- 2. Fúzní protein podle nároku 1, ve kterém podíl N-terminálních prvních sedmi až deseti aminokyselin tendamistátu je připojen, popřípadě přes můstkovou sekvenci, na požadovaný protein.
- 3. Způsob výroby fuzních proteinů podle nároku 1, vyznačující se tím, že se strukturní gen pro požadovaný protein připojí na kodony pro signální sekvence a na prvních sedm až deset aminoterminálních aminokyselin tendamistátu, tato genová struktura se přivede ve streptomycetové hostitelské buňce k expresi a sekretovaný fuzní protein se izoluje z média, přičemž tendamistátové genové sekvence mohou být v oblasti sedmé až desáté aminokyseliny modifikované výměnou aminokyseliny.
- 4. Genová struktura pro výrobu fuzního proteinu podle nároku 1, u které jsou signální sekvence a prvních sedm až deset kodonů pro tendamistát připojeny na strukturní gen pro požadovaný protein.
- 5. Genová struktura podle nároku 4, u které jsou v tendamistátovém podílu vyměněné kodony pro aminokyseliny v oblasti sedmé až desáté aminokyseliny.
- 6. Genová struktura podle nároků 4 nebo 5, u které je mezi genem tendamistátu a strukturním genem pro požadovaný protein uspořádán fragment DNA, který kóduje peptidický linker se sekvencí Asn-Ser-Asn-Gly-Arg.
- 7. Vektor, do kterého je ligována genová struktura podle nároků 4, 5 nebo 6.
- 8. Streptomycetová buňka, obsahující vektor podle nároku 7.
- 9. Použití fuzního proteinu podle nároku 1, pro výrobu požadovaného proteinu.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4012818A DE4012818A1 (de) | 1990-04-21 | 1990-04-21 | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ110191A3 CZ110191A3 (en) | 1993-08-11 |
| CZ285440B6 true CZ285440B6 (cs) | 1999-08-11 |
Family
ID=6404857
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS911101A CZ285440B6 (cs) | 1990-04-21 | 1991-04-18 | Způsob výroby cizích proteinů v streptomycetách |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0453969B1 (cs) |
| JP (1) | JP3319605B2 (cs) |
| KR (1) | KR0168669B1 (cs) |
| CN (1) | CN1049248C (cs) |
| AT (1) | ATE142263T1 (cs) |
| AU (1) | AU630287B2 (cs) |
| BR (1) | BR9101587A (cs) |
| CA (1) | CA2040810C (cs) |
| CZ (1) | CZ285440B6 (cs) |
| DE (2) | DE4012818A1 (cs) |
| DK (1) | DK0453969T3 (cs) |
| ES (1) | ES2093043T3 (cs) |
| FI (1) | FI911882L (cs) |
| GR (1) | GR3021040T3 (cs) |
| HR (1) | HRP940770A2 (cs) |
| HU (1) | HU210358B (cs) |
| IE (1) | IE911322A1 (cs) |
| IL (1) | IL97903A0 (cs) |
| LT (1) | LT3686B (cs) |
| LV (1) | LV10494B (cs) |
| NO (1) | NO911557L (cs) |
| NZ (1) | NZ237882A (cs) |
| PL (2) | PL169596B1 (cs) |
| PT (1) | PT97427B (cs) |
| RU (1) | RU2055892C1 (cs) |
| SK (1) | SK110191A3 (cs) |
| TW (1) | TW213487B (cs) |
| YU (1) | YU48435B (cs) |
| ZA (1) | ZA912937B (cs) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SK279686B6 (sk) * | 1990-09-05 | 1999-02-11 | Hoechst Aktiengesellschaft | Spôsob hydrolýzy reťazca aminokyselín preproinzulí |
| EP0600372B1 (de) | 1992-12-02 | 1997-02-05 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur Gewinnung von Proinsulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
| ES2161726T3 (es) * | 1993-04-27 | 2001-12-16 | Hoechst Ag | Formas amorfas monoesfericas de derivados de insulina. |
| DE4405179A1 (de) * | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
| CN1061375C (zh) * | 1996-07-19 | 2001-01-31 | 中国科学院上海生物工程研究中心 | 利用异源启动子在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白 |
| DE59711533D1 (de) | 1996-07-26 | 2004-05-27 | Aventis Pharma Gmbh | Insulinderivate mit erhöhter Zinkbindung |
| DE19825447A1 (de) | 1998-06-06 | 1999-12-09 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung |
| CN1298742C (zh) * | 2003-06-03 | 2007-02-07 | 上海新药研究开发中心 | 一种适合于高效表达的融合蛋白及其生产方法 |
| RU2395296C1 (ru) * | 2009-02-19 | 2010-07-27 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Концерн О3" | Способ получения препарата проинсулина для перорального применения |
| CN104818291A (zh) * | 2015-05-08 | 2015-08-05 | 江南大学 | 一种链霉菌重组表达载体的构建及应用 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4366246A (en) | 1977-11-08 | 1982-12-28 | Genentech, Inc. | Method for microbial polypeptide expression |
| DE3418274A1 (de) | 1984-05-17 | 1985-11-21 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Signalpeptid fuer die exkretion von peptiden in streptomyceten |
| DE3707150A1 (de) * | 1987-03-06 | 1988-09-15 | Hoechst Ag | Tendamistat-derivate |
| DE3714866A1 (de) * | 1987-05-05 | 1988-11-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
| DE3715033A1 (de) | 1987-05-06 | 1988-11-17 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung von fusionsproteinen |
| DE3716722A1 (de) | 1987-05-19 | 1988-12-01 | Hoechst Ag | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von angiogeninen |
| DE3843713A1 (de) * | 1988-04-25 | 1989-11-02 | Henkel Kgaa | Verwendung von calcinierten hydrotalciten als katalysatoren fuer die ethoxylierung bzw. propoxylierung |
| ES2081826T3 (es) * | 1988-11-03 | 1996-03-16 | Hoechst Ag | Procedimiento para la preparacion de un producto previo de insulina en estreptomicetos. |
-
1990
- 1990-04-21 DE DE4012818A patent/DE4012818A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-04-18 YU YU69691A patent/YU48435B/sh unknown
- 1991-04-18 EP EP91106268A patent/EP0453969B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-18 AT AT91106268T patent/ATE142263T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-04-18 ES ES91106268T patent/ES2093043T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-18 CZ CS911101A patent/CZ285440B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-04-18 FI FI911882A patent/FI911882L/fi not_active Application Discontinuation
- 1991-04-18 DE DE59108128T patent/DE59108128D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-18 DK DK91106268.5T patent/DK0453969T3/da active
- 1991-04-18 SK SK1101-91A patent/SK110191A3/sk unknown
- 1991-04-19 CA CA002040810A patent/CA2040810C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-19 BR BR919101587A patent/BR9101587A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-04-19 PL PL91309698A patent/PL169596B1/pl unknown
- 1991-04-19 ZA ZA912937A patent/ZA912937B/xx unknown
- 1991-04-19 HU HU911302A patent/HU210358B/hu unknown
- 1991-04-19 NZ NZ237882A patent/NZ237882A/en unknown
- 1991-04-19 PT PT97427A patent/PT97427B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-04-19 KR KR1019910006250A patent/KR0168669B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-19 RU SU914895292A patent/RU2055892C1/ru active
- 1991-04-19 IE IE132291A patent/IE911322A1/en unknown
- 1991-04-19 PL PL91289953A patent/PL169178B1/pl unknown
- 1991-04-19 IL IL97903A patent/IL97903A0/xx unknown
- 1991-04-19 AU AU75154/91A patent/AU630287B2/en not_active Expired
- 1991-04-19 NO NO91911557A patent/NO911557L/no unknown
- 1991-04-20 CN CN91102541A patent/CN1049248C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-20 JP JP11700691A patent/JP3319605B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-28 TW TW080104141A patent/TW213487B/zh active
-
1993
- 1993-05-04 LV LVP-93-283A patent/LV10494B/xx unknown
- 1993-12-03 LT LTIP1523A patent/LT3686B/lt unknown
-
1994
- 1994-10-25 HR HRP-696/91A patent/HRP940770A2/hr not_active Application Discontinuation
-
1996
- 1996-09-13 GR GR960402399T patent/GR3021040T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3730255B2 (ja) | イーストにおいて発現されたｎ末端に伸長した蛋白質 | |
| JP2521413B2 (ja) | シグナル配列をコ―ドしているｄｎａと直接結合しているヒト成長ホルモンをコ―ドしているｄｎａ | |
| JP4243104B2 (ja) | 重要なタンパク質の細菌培養上清中への分泌のための融合タンパク質 | |
| IL95495A (en) | Fusion proteins their preparation and use | |
| DE2848053A1 (de) | Synthetische dna und verfahren zu ihrer herstellung | |
| JPS63251095A (ja) | 新規融合蛋白質およびその精製方法 | |
| FI93734B (fi) | Menetelmä eukaryoottisen painolastiosan sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoisia tuotteita | |
| EP0211299A2 (de) | Fusionsproteine, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung | |
| CZ285440B6 (cs) | Způsob výroby cizích proteinů v streptomycetách | |
| Molina et al. | Expression of a synthetic gene encoding potato carboxypeptidase inhibitor using a bacterial secretion vector | |
| DE3879823T2 (de) | Verfahren zur herstellung von menschlichem wachstumshormon. | |
| EP0946735A1 (en) | N-terminally extended proteins expressed in yeast | |
| US5171673A (en) | Expression of heterologous dna using the bacillus coagulans amylase gene | |
| US5426036A (en) | Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes | |
| FI97549B (fi) | Menetelmä vierasproteiinien valmistamiseksi Streptomycessoluissa | |
| IE58385B1 (en) | A signal peptide for the excretion of peptides in streptomycetes | |
| EP0314184B1 (en) | Expression plasmids | |
| CA2002062A1 (en) | Process for the preparation of an insulin precursor in streptomycetes | |
| DE69930118T2 (de) | Verfahren zur herstellung von proteinen in transformierten hefezellen | |
| KR940004543B1 (ko) | 이.콜라이의 trp 발현 시스템을 갖는 벡터를 제조하는 방법 | |
| JPS62228283A (ja) | Ｄｎａ遺伝子、およびこれを含むプラスミドならびにこのプラスミドを用いる蛋白質の菌体外分泌法 | |
| KR19990009995A (ko) | 신규한 인간성장호르몬방출인자-인간상피세포성장인자 융합유전자, 이의 발현벡터 및 이를 이용한 인간성장호르몬방출인자의 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20110418 |