KR19990009995A - 신규한 인간성장호르몬방출인자-인간상피세포성장인자 융합유전자, 이의 발현벡터 및 이를 이용한 인간성장호르몬방출인자의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간성장호르몬의 분비를 촉진시키는 인간성장호르몬방출인자(human Growth Hormone Releasing Factor; hGRF)의 새로운 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 유전자 재조합 방법으로 hGRF 유전자를 인간상피세포성장인자 (human Epidermal Growth Factor; hEGF) 유전자와 융합하여 합성한 hEGF-hGRF 융합유전자, 이를 대장균에 대량으로 발현시켜 세포외로 분비할 수 있는 발현벡터 pEGRF및 본 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여 hEGF-hGRF 융힙단백질을 얻은 후 이를 분리시킴으로써 hGRF 단백질을 효율적으로 생산하는 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 hEGF-hGRF 융합유전자와 발현벡터를 이용하면 순수한 hGRF 단백질을세포배양액으로부터 용이하게 분리·정제할 수 있다,
Description
도 1은 인간성장호르몬방출인자(hGRF) 유전자 중 27번 아미노산인 메치오닌이 이소루신으로 치환된 유전자를 함유하는 플라스미드 벡터 pGBIle의 제조과정을 나타낸 것이다.
도 2는 대장균의 ompA 리더서열과 인간상피세포성장인자(hEGF) 유전자가 포함된 발현 벡터 pTE105에서 인간상피세포성장인자의 카르복시 말단 부위에 도 1의 pGBlle 벡터상의 hGRF 유전자를 도입시켜, 인간성장호르몬방출인자(hGRF) 단백질이 인간상피세포성장인자(hEGF)와 융합된 단백질로 발현되는 발현벡터 pEGRF의 제조과정을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 발현벡터 pEGRF를 대장균 JM101에 형질전환시킨 재조합 대장균주를 배양하여 인간성장호르몬방출인자(hGRF)안 인간상피세포성장인자(hEGF)가 융합된 형태로 발현된 결과를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블러팅한 결과를 나타낸 것이다.
[발명의목적]
본 발명은 인간성장호르몬의 분비를 촉진시키는 인간성장호르몬방출인자(Human Growth Hormone Releasing Factor, 이하 hGRF'라고 약칭함)의 새로운 제조방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 hGRF 단백질을 인간상피세포성장인자(human epidermal growth factor, 이하 hEGF라고 약칭함) 단백질과 융합한 형태로 세포외로 발현·분비시킨 후 배양액 중에서 hEGF-hGRF 융합단백질을 얻고, 이를 절단하여 hGRF 단백질을 제조하는 방법으로서, 대장균에서 hGRF가 대량으로 발현되고 발현된 hGRF 단백질이 세포외로 분비될 때까지 대장균 세포내의 프로테아제(Protease)에 의하여 분해되는 것을 억제하기 위하여 유전자 재조합 방법으로 hGRF유전자와 hGRF 유전자를 융합하여 제조한 신규한 hEGF-hGRF 융합유전자, 이를 대장균에서 대량으로 발현시켜 세포외로 분비할 수 있는 발현벡터 pEGRF, 본 발현벡터로 형질전환된 대장균 및 이를 배양하여 hGRF를 효율적으로 생산하는 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 hEGF-hGRF 융합유전자와 발현벡터를 이용하면 순수한 hGRF 단백질을 세포 배양액으로부터 용이하게 분리·정제할 수 있으며, 고수율로 얻을 수 있다.
[발명이속하는기술분야및그분야의종래기술]
인간성장호르몬방출인자(hGRF)는 44개의 아미노산으로 구성된 분자량 약 5040달톤의 폴리펩티드로서, 인간의 시상하부에서 분비되어 뇌하수체에 작용함으로써 인간성장호르몬의 방출을 촉진시키는 호르몬이다(Gillemin,et al . , Science, 218, 585-587, 1982).
이러한 hGRF는 종(species)에 따른 특이성이 없이 호르몬의 활성을 나타내므로 생체내(in vivo)에 투여하여 소, 돼지, 양, 닭 등 각종 농가 사육 동물의 성장 호르몬 분비를 촉진시킬 수 있다. 이와 같은 성장 호르몬의 분비는 사육 동물등에서 에너지 대사를 촉진시켜 그의 체중 증가 및 젖분비(젖소, 암양) 증가 등을 유발하고, 지방질을 감소시켜 육질을 우수하게 하므로, 특히 수의학 분야에서 hGRF는 중요한 단백질로 관심이 집중되고 있다(Pomnier,et al . , J. Anim Sci. ,168, 1291-1298, 1990; Etienne, Metal . ,J. Anim. Sci. , 70, 2212-2220, 1992; Lapierre,et al . , J. Anim. Sci. , -- 764-772, 1992.).
또한 의학 분야에서도 hGRF를 질병의 치료에 사용하려는 많은 시도들이 이루어졌다. 구체적으로 hGRF는 왜소증 및 발육 지연의 치료에 사용되는 것을 포함하여 동화 단백질이 결핍된 경우인 연골의 골절, 골다공증, 상처, 넓은 부위의 화상 등의 치료에도 널리 응용될 수 있다(Borges, J. L. ,et al. ,Lancet, 16, 119-123, 1983; Garrel, D. R. ,et al. , J, Surgical Research, 51, 297-302, 1991). 또한 최근 hGRF가 배란을 촉진하여 임신율을 증가시키고(Tuladi,et al. ,Human Reproduction, Vol . 8, No. 4, 525-527, 1993; Volpe, A.et al. ,Human Reproduction, Vol. 6, No. 9, 1128-1232, 1991), 식욕 감퇴 환자에서 식욕을 증가시킨다고(Vaccarino, F. J. ,et al . , Biol. Psychiatry, 35, 446-451, 1994) 밝혀져서 hGRF 단백질이 질병의 치료에서 갖는 유망성이 점점 확대되고 있다.
1982년 길레민(Gillemin)이 인간 췌장 종양에서 얻은 추출액으로부터 상기 hGRF의 미노산 서열를 최초로 발견한 이후 이호르몬을 인위적으로 합성하려는 많은 연구가 이루어졌다. 인간성장호르몬방출인자(hGRF)는 비교적 짧은 단일 폴리펩티드이므로, 화학적 합성 방법에 의해 hGRF 및 그 유도체가 용이하게 제조될 수 있으며(대한민국 특허공고 제92-6564호), 실제로 일부 합성 hGRF는 진단 시약용으로 판매되어 왔다. 그러나 화학적으로 단백질을 합성하는 방법은 그 수율이 낮을뿐 아니라 비용도 많이 들어 hGRF를 대량으로 생산하는데 많은 문제점이 있었다.
이에 최근에는 유전자 재조합 방법으로 hGRF를 생산하고자 하는 많은 시도가 이루어졌다. 1985년에 크라바도르 등은 박테리오파아지 람다의 PL프로모터를 이용하여 대장균에서 hGRF의 세포내 발현을 시도하였다.(Cravador, et al., Biochimie, 67,, 829-834, 1985).
그러나 hGRF 단백질은 대장균내에 있는 프로테아제에 의하여 분해되기 쉬운 문제점이 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 프로테아제에 안정한 다른 단백질을 코딩하는 유전자를 hGRF 유전자와 융합함으로써 프로테아제에 의하여 hGRF가 분해되는 것을 방지하고자 하는 연구들이 진행되어 왔다.
1988년에 빌라 등은 GRF 유전자에 트립토판 E 유전자를 결합시켜 융합 단백질 형태로 GRF를 세포내에서 발현시켰다(S. Villa. ,et al . , Eur. J. Biochem. , 171, 137-141, 1988). 또한, 1987년에 안바 등은 GRF 유전자 옆에 포스페이트 결합 단백질 S 유전자를 결힙시켜 이를융합 단백질 형태로 세포내에서 발현시켰으며(Anba, et al . , 53, 219-226,1987),1992년 이와쿠라 등도 hGRF 유전자 옆에 다이하이드로 환원 효소(DHFR) 유전자를 결힙시켜 융합 단백질 형태로 이를 세포내에서 발현시켰다(lwakara, et al . , 111, 37-45, 1992).
그러나 상기의 방법들은 hGRF 단백질을 세포내에서 발현시키는 방법으로써, 외래 단백질이 대장균내에 존재시 프로테아제에 의해 신속히 분해되어지는 단점이 있다. 또한 hGRF 단백질을 회수하기 위해서는 대장균을 파쇄하여 단백질을 수거해야 하므로, 정제 절차가 복잡해지며 수율이 감소하고, 분리·정제시 많은 시간과 노력이 필요하며, 대장균을 파쇄하여 단백질을 회수하는 과정에서 대장균의 엔도톡신이 불순물로서 혼입될 수 있으므로 엔도톡신을 완전히 제거하기 위한 추가적인 과정이 필요한 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 위안 같은 문제점을 해결하고자, 대장균에서 ㅑ1질을 응힙단백질 형태로 대량으로 발현시킨 후 대장균 세포 밖의 正∥리플역 및 서l포외로 분出되게 힘으로세 세포내 프로테아제Oll 의하여 hGRF 딘해되는 것을 억제하고, hGRF 단백질을 희수힐 皿 세포를 나샌하지 않고 ㅃ부터 hGRF 단백질을 희수하여 세포내 단백질 불순물의 혼입을 막고 정제를 용이하게 하고자 오랜 연구를 수행하였다.
그 결과 대장균에서 hGRF 단백질이 대량으로 발현된 후 세포외로 분비될 때까지 안정하게 유지될 수 있도록, 발현도 우수하며 대장균의 프로테아제(Protease)에 상당히 안정한 hEGF의 유전자를 hGRF 유전자에 결합하여 hEGF-hGRF 융합 유전자를 합성하고, 융합단백질을 세포외로 발현시킬 수 있는 발현벡터릍 유전자 재조합 방법으로 제조하고, 본 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여 배양 액중에서 hEGF-hGRF 융합단백질을 대량으로 제조할 수 있는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명에 따라 제조된 이 융합단백질은 브롬시안화물(cyanobromide, 이하 CNBr로 약칭함)로 처리하게 되면 hEGF 단백질 hGRF 단백질 상이가 절단되어 순수한 hGRF 단백질의 회수가 용이하게 된다.
[발명이이루고자하는기술적과제]
본 발명은 hGRF 단백질을 융합단백질 형태로 세포막의 페리플라스믹 영역 및 세포외로 발현ㆍ분비 시킨 후 이로부터 hGRF 단백질을 제조하는 방법으로,
대장균에서 대량으로 발현되고, 발현된 단백질이 세포외로 분비될 때 까지 대장균의 프로테아제에 분해되지 않는 안정한 단백질을 코딩하도록 설계된 새로운 hEGF-hGRF 융합유전자를 제공함에 그 목적이 있다. 본 발명의 hEGF-hGRF 융합유전자는 hEGF-hGRF 융합단백질을 용해성 형태(soluble form)로 대량발현한 후 이를 세포외로 분비할 때까지 hGRF 단백질이 프로테아제에 의하여 분해되는 것을 억제함으로써 고수율로 hGRF 단백질을 얻을 수 있게 한다.
본 발명은 hGRF유전자를 함유하는 플라스미드 pGB002[한국종균협회 수탁번호 : KFCC-1094, 대한민국 특허 1996년 특허출원 제 53539호, 새로운 인간성장호르몬 방출인자 (hGRF)유전자, 그의 발현벡터 및 이를 이용한 hGRF의 제조방법 참조] 내 hGRF 유전자 중 27번 아미노산인 메치오닌을 코딩하는 서열을 이소루신으로 치환하여 제조한 플라스미드벡터 pGBlle를 제공한다. 본 발명의 hGRF 유전자는 메치오닌이 이소루신으로 치환되었기 때문에 hEGF-hGRF 융합단백질을 CNBr로 절단할때 hGRF 단백질이 CNBr에 의하여 절단되지 않는다.
또한 본 발명은 hEGF-hGRF 융합유전자를 함유하여 hEGF-hGRF 융합단백질을 용해성 형태(soluble form)로 대량발현시켜 세포 배양액으로 분비할 수 있는 발현벡터를 제공함에 그 목적이 있다.
구체적으로 본 발명은 ompA 리더 서열하에서 hEGF를 대량으로 발현하고 세포외로 분비시키는 발현 벡터 pTE105[대한민국 특허출원 93-6979호 인간상피세포성장인자(hEGF) 발현벡터 및 이를 이용한 hEGF의 제조방범 참조]내 hEGF 유전자의 카르복시 말단 부위에, 상기 pGB1le 플라스미드 벡터내의 hGRF(Met271le) 유전자를 삽입하여 tac 프로모터의 조절에 의해 hEGF-hGRF 융합단백질을 발현할 수 있는 발현벡터 pEGRF를 제공한다.
또한 본 발명은ompA리더 서열-보편적 해독 정지 서열-trpA전사 정지서열이 있어서,ompA리더 서열과 보편적 해독 정지 서열 사이에tac프로모터에 의해 전사가 조절되는 hEGF 유전자가 삽입된 발현 카세트를 이용하여 상기 발현 벡터를 제조하는 방법을 제공함에 그 목적이 있다. 구체적으로는 hEGF 유전자의 카르복시 말단 부위를 Afl ll와 Pac l 제한 효소로 절단시켜 얻은 pTE105 발현 벡터의 2917염기의 핵산 절편과 pGBlle 플라스미드 벡터로부터 138염기의 Mbo ll와 Pac l으로 절단시킨 절편을 얻고 9bp의 합성된 핵산 링커를 연결하여 본 발명의 발현 벡터 pEGRF를 제조한다.
본 발명의 발현벡터 pEGRF으로 대장균주 JM1O1을 형질전환시켜 얻은 형질전환체를 1997년 3월 27일에 한국 종균 협회에 기탁하였다(수탁번호 : KFCC-10963).
또한 본 발명은 상기 대장균 형질전환체를 배양하여 대장균 균체를 얻고 이로부티 hGRF 단백질을 제조하는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.
상기 과정을 통해, 순수한 인간성장호르몬방출인자를 용이하게 분리·정제할 수 있다.
[발명의 구성 및 작용 ]
본 발명은 대장균에서 대량으로 발현시키는데 용이하고, 발현된 단백질이 세포외로 분비될 때까지 안정하도록 설계된 새로운 인간상피세포성장인자(hEGF) 유전자와 인간성장호르몬방출인자(hGRF)유전자가 융합된 hEGF-hGRF 융합유전자를 제공한다.
본 발명에서 융합파트너는 다음의 3가지 사항을 고려하여 선정되었다.
첫째, 단백질이 대량으로 발현될 수 있고, 둘째, 발현된 단백질이 세포내에서 안정한 구조를 가지고, 셋째, 발현된 단백질이 용해성 형태(solube form)로 세포외로 분비됨으로써 융합단백질의 회수 및 정제를 용이하게 할 수 있어야 한다.
이러한 조건을 만족시키는 융합파트너로서 본 발명에서 hEGF 유전자를 융합파트너로 사용함에 따라 다음의 5가지 장점을 가진다.
첫째, hEGF를 대장균에서 대량으로 발현하는 기슬이 확보되어 있기 때문에 hEGF-hGRF 융합단백질을 대량으로 발현할 수 있으며, 둘째, hEGF는 53개의 아미노산으로 구성된 작은 단백질이면서 host protease에 상당히 안정한 구조를 가지므로, 발현된 hEGF-hGRF 융합단백질이 세포외로 분비되는 동안에 세포내에서 안정하게 보존되며, 셋째, hEGF 유전자 앞에 ompA 리더 서열을 붙여 용해성 형태(soluble form)로 세포외로 발현시킴으로서 융합 단백질의 회수 및 정제를 용이하게 하며, 넷째, hEGF의 역가 측정법(ELISA, RIA)이 확립되어 있음으로 융합 단백질의 정제과정에서 분석 및 정량이 가능하며, 다섯째, 기존의 hEGF의 정제 방법이 확립되었으므로 대량 정제가 용이하다(본 발명자가 출원한 대한민국 특허츨원 제93-6978, 93-6979, 93-6980호 참조).
구체적으로 평균 400 밀리그램 / 리터의 과량으로 발현되는 hEGF 유전자 (대한민국 특허출원 제93-6979호)의 카르복시 말단에 CNBr에 의해 절단 가능한 아스파라긴-메치오닌 링커 유전자를 이용하여 hGRF 유전자를 융합시킴으로써, hostprotease에 의한 hGRF의 분해를 막으면서, CNBr로 처리시 융합단백질로부터 hERF 단백질과 hGRF 단백질을 절단하여 분리·정제를 용이하게 하고자 한다.
본 발명은 메치오닌이 이소루신으로 치환된 hGRF 유전자를 포힘하는 플라스미드 벡터 pGBlle를 제공한다.
천연형 hGRF 단백질의 27번째 아미노산은 메치오닌으로서, 단백질 정제과정에서 CNBr처리시 절단이 되므로, CNBr 처리에 의해 hGRF 단백질이 손상되는 것을 방지하기 위해, 이 27번째 아미노산인 메치오닌을 이소루신으로 치환하는 과정이 수행되었다.
우선 hGRF 유전자를 얻기 위해, hGRF 유전자를 함유하는 플라스미드 벡터 pGB002(대한민국 특허 출원 제 96-53539호)를 이용하였다.
구체적으로 플라스미드 벡터 pGB002를 제한 효소 Bsm AI과 Kpn I으로 절단하여 112bp 크기의 hGRF 유전자 절편을 얻고, 동일한 플라스미드 벡터를 Kpn I과 Pst I 제한 효소로 절단하여 2952bp의 크기를 갖는 유전자 절편을 얻는다. hGRF 단백질내의 27번째 아미노산인 매치오닌을 이소루신으로 치환시키기 위해 서열번호 1과 2의 염기 서열을 갖는 14bp의 합성 링커를 제조하였다.
상기의 hGRF 유전자 절편, 플라스미드 벡터 pGB002를 Kpn I, Pst I 제한효소로 절단한 2952bp의 유전자 절편, hGRF 단백질내의 매치오닌이 이소루신으로 치환되도록 고안된 14bp의 합성링커 유전자를 T4 DNA 리가아제로 반응시켜 연결한 후, 이를 대장균 XL1-blue에 하나한의 방법(Hanahan,et al., DNA CIoning, Vol 1, A Practica1 Approach, IRL Press, 1985,109-135P) 등으로 형질전환시겨, 플라스미드 벡터 pGBlle을 얻는다·
본 발명은 상기 플라스미드 벡티 pGBlle내 hGRF(Met271le) 유전자를, 대장균에서에hEGF를 대량으로 발현시킨 바 있는 발현 벡터인 pTE105내 hEGF 유전자의 카르복시 말단 부위에 삽입하여, hEGF 와 hGRF가 융합된 형태로 발현되도록 제조된 발현 벡터 pEGRF를 제공한다.
구체적으로 hEGF 유전자에 hGRF 유전자를 융합하기 위하여 hEGF 발현 벡터 pTE105내에 존재하는 hEGF 유전자의 카르복시 말단 부분을 제한 효소 Afl II로 절단하고, 제한 효소 Pac I으로 절단하여 hEGF 유전자가 힘유된 2917bp의 유전자 절편을 얻는다. 이 과정에서 hEGF의 카르복시 말단의 6개 아미노산이 제거되어 47개의 아미노산을 갖는 구조가 된다. 그러나 천연형 hEGF에서 카르복시말단의 6개 아미노산이 절단되는 것은 hEGF의 3차 구조에 영향을 미치지 않으며, 본 발명에서 hEGF를 융합 파트너로 사용한 목적인 구조적 안정성, 숙주의 프로테아제에 대한 안정성, 세포외 분비의 용이성, 회수·정제 및 역가측정의 용이성 등에는 영향을 미치지 않는다. 또한 상기의 플라스미드 벡터 pGBIle를 Sac I과 Pac I 제한 효소로 절단하여 hGRF 유전자를 포함하는 169bp의 유전자 절편을 얻은 후, 이를 다시 Mboll 제한 효소로 절단하여 138bp의 hGRF 유전자 절편을 얻는다. 발현 벡터 pTE105에서 얻은 2917bp의 절편과 상기 138bp의 hGRF 유전자 절편을 CNBr에 의해 절단되는 메치오닌을 포함하는 9bp의 합성 링커(서열 번호 3,4 참조)와 T4 DNA 리가아제로 접합시켜, 새로운 발현 벡터 pEGRF를 제조한다(도 2 참조).
본 출원인은 새로운 발현 벡터 pEGRF를 대장균 JM101에 형질전환시켜 얻은 형질 전환체를 국제 기탁 기관인 한국 종균 협회에 1997년 3월 27일에 기탁하였다(수탁 번호 : KFCC-10963).
hEGF안 hGRF가 융합된 형태의 유전자 서열은 서열 번호 1에 나타난 바와 같으며, 이로부터 발현되는 hEGF-hGRF 융합단백질의 서열은 서열 번호 2과 같다.
발현된 hEGhGRF 융합단백질은 아스파라긴-메치오닌 링커로 연결되어 있기 때문에 CNBr로 간단하게 분리할 수 있으며, 최종적으로 얻어지는 hGRF 단백질의 서열은 서열 번호 3과 같다.
본 발명의 발현 벡터 pEGRF는 대장균에서 hEGF-hGRF 융합 단백질을 발현시켜 세포외로 분비할 수 있으므로 효율적으로 hGRF 단백질을 생산하는데 매우 적합하다. 구체적으로 본 발명의 발현 벡터는 단백질 발현시 tac 프로모터(de Boer,et al. , DNA, 2, 231-235,1983; Amann,et al. , Gene, 25, 167-178, 1983)를 이용하여 hEGF-hGRF 융합 단백질을 발현하므로 손쉽게 그 발현을 조절할 수 있으며, 그 프로모터 하단에 두 개의 리보좀 결합 부위(Ribosome binding site; Shine and Dalgano, Pro. Natl. Acd. Sci, USA, . 71, 1342, 1974) 가 존재하여 단백질의 해독 개시가 보다 효율적으로 수행될 수 있다.
또한, 본 발명의 발현 벡터는 인위적으로 합성된 ompA 리더 서열,보편적 해독 정지 서열 및 trpA 전사 정지 서열 등을 함유하므로, hEGF-hGRF 융합 단백질이 정확하고 효율적으로 발현되어 세포 외부로 분비되는 것이 용이하다. 또한 본 발명의 발현 벡터는 그 내부에 파 부위(parsite; Austin and Abeles, J. Mol.Biol. , 169, 373-387, 1983)를 함유하여 벡터가 대장균내에서 안정하게 유지될 수 있다.
한편 대장균의 발현 벡터는 일반적으로 암피실린 내성마터(ampicillin-resistant marker)를 이용하는데, 이 마커가 코딩하는 유전자는 베타락타마제를 발현시켜 분비한다. 따라서 외래 단백질을 발현시켜 세포외로 분비시키는 경우 이는 베타-락타마제와 경쟁적으로 작용하여 단백질의 분비를 감소시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명의 발현 벡터는 테트라싸이클린 내성 마커(tetracyline-resistant marker)를 함유하도록 제조되어, 발현된 hEGF-hGRF 융합단백질이 효과적으로 세포외로 분비될 수 있다.
또한, 전체적으로 발현 벡터의 크기가 아주 작아 숙주 세포내에서 안정하고 외래단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있다. 또한 발현된 hEGF-hGRF 융합 단백질을 CNBr 처리로 간편하게 분리·정제가 가능하며, 이 과정에서 hEGF와 hGRF를 동시에 생산할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 아미노산 서열에 있어서 '기능적으로 동등한' 이란, 키메라 단백질의 아미노산 서열 중에서 Gly, Ala; Val, IIe, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및 Phe, Try 과 같은 조합으로 치환된 모든 단백질을 의미한다. 또한 본 발명의 염기서열에 있어서, ' 기능적 등가물'이라 함은 융합유전자의 염기서열 중에서 전기 조합의 아미노산을 제공할 수 있는 염기서열을 가지는 모든 유전자를 의미한다.
이하, 실시예에서 본 발명을 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : [11e27]hGRF1-44단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터 pGB11e의 제조
본 발명에서 설계한 hGRF 유전자(Met2711e)를 제조하기 위하여 서열 번호 3의 15개의 염기로 구성된 15머와 서열 번호 5의 23개의 염기로 구성된 23머의 올리고뉴클레오티드를 합성한 후, hGRF 유전자를 함유하는 플라스미드 벡터 pGB002를 이용하여 클로닝하였다. 먼저 플라스미드 벡터 pGBO02 600나노그램을 Kpn 1과 Pst 1 제한 효소로 절단하여 플라스미드 벡터 부분의 2952bp DNA 절편을 분리하였다. 그리고 동일한 벡터를 Bsm A1과 Kpn 1 제한 효소로 절단하여 hGRF 유전자에 해당하는 112bp DNA 절편을 분리하였다.
에펜돌프(Eppendorf) 실험판에 상기 각 합성 올리고뉴클레오티드의 농도가 마이크로리터당 100피코몰이 되도록 멸균된 2차 증류수로 완전히 용해시킨 다음, 에펜돌프 시험관에 각 올리고뉴클레오디드를 10마이크로리터씩 첨가하여 잘 섞고 95℃에서 5분간 가열하고 이후 온도가 37℃까지 되도록 천천히 온도를 내려 반응시킨다.
분리한 플라스미드 벡터 부분인 2952bp DNA 절편 20나노그램에 hGRF 유전자에 해당하는 112bp DNA 100나노그램, 합성 유전자 100나노그램을 첨가하여, 0.5 마이크로리터의 T4 DNA 리가아제로 연결시켰다. 이 벡터를 대장균 XL1-blue 균주(Stratagere사, Cat. No. 200249)를 electroporation 방법으로 형질전환시키고, 50 마이크로그램/밀리리터의 암피실린이 함유된 배지에 배양하여 형질 전환체를 분리하였다.
이렇게 제조된 hGRF유전자를 포함된 형질 전환체내의 pBluescript 11 SK(+) 플라스미드 벡터를 pGBlle이라고 명명하고, Kpn l, Sac l, Nla lll 제한 효소로 단일 및 이중 절단시킨 후 1% 아가로스겔 전기 영동하여 hGRF 유전자가 바르게 삽입되었음과 Met27lle의 치환을 확인하였다.
실시예 2 : hEGF와 hGRF의 융합단백질을 생산할 수 있는 발현벡터 pEGRF의 제조
대장균에서 hEGF와 hGRF의 융합 단백질을 생산할 수 있는 발현 벡터를 제조하기 위하여, 실시예 1에서 얻은 hGRF(Met271le) 유전자를 함유하는 플라스미드 벡터 pGB1le 약 900나노그램에 제한 효소 Sac l 과 Pac l 을 각각 6마이크로리터씩 첨가하여 37℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 1% 아가로오즈겔 전기영동으로 절단을 확인한 다음 hGRF 유전자에 해당하는 169bp DNA 절편이 위치하는 부분의 아가로오즈겔을 칼로 잘라내어 QIAEX II DNA 용출 키트(Qiagen사, Cat. No. 20021)를 이용하여 20마이크로리터 증류수에 녹여 순수하게 분리하였다. 여기에 다시 Mbo II 제한효소 3마이크로리터를 첨가하여 완전 절단시켜, 138bp의 DNA 절편을 얻었다. 마찬가지로 hEGF 단백질을 생산할 수 있는 발현 벡터인 pTE105 약 500나노그램에 제한 효소 Afl ll 와 Pac l 을 각각 3마이크로리터씩 첨가하여 37℃에서 6시간 동안 반응 시켰다. 플라스미드 벡터와 hEGF의 아미노 말단이 함유된 2917bp DNA 절편을 분리한 후, 20마이크로리터의 증류수에 녹였다.
hGRF 단백질 앞에 메치오닌 아미노산을 도입하기 위하여 서열 번호 6의 14개의 염기로 구성된 14머와 서열번호 7의 9개의 염기로 구성된 9머의 올리고뉴클레오티드를 합성한 후, 에펜돌프 시험관에 각 합성 올리고뉴클레오티드의 농도가 마이크로리터당 100피코몰이 되도록 멸균된 2차 증류수로 완전히 용해시켰다. 에펜돌프 시험관에 각 올리고뉴클레오티드를 10 마이크로리터씩 첨가하여 잘 섞은 다음, 95℃에서 5분간 가열하고 이후 온도가 37℃까지 되도록 천천히 온도를 내려 반응시켰다.
이렇게 Afl ll, Pac l 제한 효소로 절단된 hEGF를 함유하는 2917bp의 발현벡터 2마이크로리터와 Pac l 및 Mbo 1I 제한 효소로 절단된 138bp의 hGRF 유전자 절편 6마이크로리터, 그리고 9bp의 합성 유전자 4마이크로리터를 잘 혼합한 다음, T4 DNA 리가아제 0.5마이크로리터를 첨가하여 16℃에서 18시간 동안 연결 반응시킨 후, 대장균 JM101 균주에 삽입함으로써 형질전환시켰다. 형질전환을 통해 hEGF와 hGRF의 융합 단백질을 생산할 수 있는 발현 벡터를 얻어 pEGRF라고 명명하고, Afl ll, Pac l, Bst Xl 제한 효소로 단일 및 이중 절단하여 hGRF 유전자가 바르게 삽입되었음을 확인하였다.
본 발명의 발현 벡터 pEGRF로 대장균 JM1O1 균주를 형질전환시겨 얻은 형질 전환체를 국제 기탁 기관인 한국 종균 협회에 1997년 3월 27일에 기탁하였다(수탁번호 : KFCC-10963).
실시예 3 : 대장균 형질전환체 hEGF-hGRF 융합단백질의 발현
hEGF-hGRF 융합 단백질을 발현시키기 위해서, 발현 벡터 pEGRF로 형질전환된 대장균주 JM101을 테트라싸이클린(12.5㎍/ml)이 함유된 LB배지 3ml에 접종하여 30℃에서 18시간동안 배양하였다. 이 배양액을 동일한 배지 100ml에 초기 대장균 농도가 600nm의 파장하에서 0.1(O.D)이 되도록 접종하였다.
30℃, 250rpm에서 진탕 배양을 하다 대장균 농도가 0.5(O.D)에 이르렀을때 IPTG(Sigma사, Isopropy1-β-D-thiogalactopyranoside, Cat. No.16758)를 최종 농도 1밀리몰이 되도록 첨가하여 hEGF-hGRF 융합 단백질의 발현을 유도하였다. 발현 유도후 0, 1, 2, 4, 6시간째의 배양액 1ml을 채취하여 12000rpm에서 3분간 원심분리한 후, 상등액과 대장균을 분리, 수거하였다.
분리된 대장균으로부터 페리플라즘내의 단백질을 다음의 방법으로 추출하였다. 수거된 대장균을 세척하기위해 인산 완충 용액(Phosphate buffered saline, pH7.4)으로 재현탁하고 12000rpm으로 3분간 4℃에서 원심분리한 후 상등액을 버린다. 대장균 부피의 10배의 삼투 충격 용액 l (20mM Tris-HC1, pH8, 2.5mM EDTA, 20% Sucrose)을 첨가한 후 재현탁하여 얼음 위에 10분간 방치한다. 8000rpm으로 10분간 4℃에서 원심분리후 상등액을 버린다. 대장균 부피의 10배의 삼투 충격 용액 ll(20mM Tris-HCI, pH8, 2.5mM EDTA)를 첨가한 후 재현탁하고 얼음 위에 10분간 방치한다. 12000rpm으로 5분간 4℃에서 원심분리후 상등액을 수거한다,
각 시간에 따른 배양 상등액과 떼리플라즘내 단백질 시료 10마이크로리터를 SDS-PAGE용 환원 완충 용액(2X) 10마이크로리티와 섞고, 100℃에서 5분간 처리한 후 SDS-PAGE를 수행하였다. 도 3의 (가)는 SDS-PAGE후 Coomassie staining을 수행한 결과이다.
1-5번 레인은 발현 유도후 0, 1, 2, 4, 6시간의 배양 상등액이며, 6-10번 레인은 발현유도후 0, 1, 2, 4, 6시간의 페리플라즘내의 단백질이다.
도 3의 (나)는 동일한 시료의 웨스턴 블럿 분석결과이다. 각 레인의 시료는 SDS-PAGE의 경우와 동일하며, 1차 항체는 토끼내에서 만들어진 hEGF에 대한 항체를 인산 완충 용액으로 1:1000의 희석 비율로 희석하여 사용하였으며, 2차 항체는 퍼옥시다제(peroxidase)가 결합된 토끼의 2차항체(Sigma사, Cat. No. A0545)릍 사용하였다. 발현 유도 시점에서부터 약 10,000달톤에 상응하는 위치에서 hEGF-hGRF 융합 단백질이 기본적 수준으로 발현되며, 발현유도 1시간후부터 발현량이 증가되는 것이 확인되었다. 또한 발현 유도 4시간후부터 hEGF-hGRF 융합 단백질이 세포외로 분비됨을 확인하였다.I
[발명의효과]
본 발명은 hGRF 단백질을 융합단백질 형태로 대량으로 발현시킨 후 세포외로 분비되게 함으로써 세포내 프로테아제에 의하여 hGRF 단백질이 분해되는 것을 억제하여 수율을 높일 수 있고, hGRF 단백질을 회수할 때 세포를 파쇄하지 않고 배양액으로부터 hGRF 단백질을 회수할 수 있어 세포내 불순 단백질이 혼입되는 것을 방지하며 분리·정제할 수 있다.
본 발명의 hEGF-hGRF 융합유전자는 hEGF-hGRF 융합단백질을 발현하기 때문에 hGRF가 세포외로 분비될 때까지 대장균 내에서 안정하게 보존되며, 본 발명의 발현벡터 pEGRF는 대장균에서 융합단백질을 대량으로 발현하게 하고 이를 페리플라스믹 영역 및 세포외로 분비할 수 있으므로, 세포배양액으로부터 용이하게 hGRF 단백질을 분리·정제할 수 있다.
[서 열 목 록]
서열번호 : 1
서열의 길이 : 279
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : DNA
[서열표 1]
AAC AGC GAC TCC GAA TGC CCG CTG AGC CAT GAC GGC TAC TGC CTG
TTG TCG CTG AGG CTT ACG GGC GAC TCG GTA CTG CCG ATG ACG GAC
CAC GAC GGC 印A TGC AT니AC ATC GM GCA CTG GAC AAA TAC GCG
GTG CTG CCG CAT ACG TAC ATG TAG CTT CGT GAC CTG TTT ATG CGC
GAC CTT MC ATG TAC GCT GAC GCT ATC TTC ACT MC TCT TAC CGT
CTG GAA TTG TAC ATG CGA CTG CGA TAG AAG TGA TTG AGA ATG GCA
AAA GTT CTG GGT CAG CTG TCT GCT CGT AAA CTG CTG CAG GAT ATC
TTT CM GAC CCA GTC GAC AGA CGA GCA TTT GAC GAC GTC CTA TAG
ATC TCT CGT GAG CAG GGT GAA TCT AAC CAG GAA CGT GGT GCA CGT
TAG AGA GCA CTC GTC CCA CTT AGA TTG GTC CTT GCA CCA CGT GCA
GCG CGC CTG
CGC GCG GAC
[서 열 목 록]
서열번호 : 2
서열의 길이 : 93
서열의 형 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 펩타이드
[서열표 2]
Asn Ser Asp Ser G1u Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu
His Asp G∥y Val Cys Met Tyr lle Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala
Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr 기le Gly G∥u Arg Cys G1n Tyr Arg
Asp Leu Asn Met Tyr Ala Asp Ala lle Phe Thr Asn Ser Tyr Arg
lle Ser Arg Glu Gln Gly Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly A1a Arg
Ala Arg Leu
[서 일 목 록]
서열번호 : 3
서열의 길이 : 44
서열의 형 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 폡타이드
[서열표 3]
Tyr Ala Asp Ala lle Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly
Gln Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp I1e lle Ser Arg Glu
Gln Gly Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu
[서 열 목 록]
서열번호 : 4
서열의 길이 : 14
서열의 형 : 핵산
샌의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오티드)
[서열표 4]
GATATCATCT CTCG
[서 일 목 록]
서열번호 : 5
서열의 길이 : 23
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오티드)
[서열표 5]
CTGACGAGAG ATGATATCCT GCA
[서 열 목 록]
서열번호 : 6
서열의 길이 : 14
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오티드)
[서열표 6]
TTMCATGTA CGCT
[서 일 목 록]
서열번호 : 7
서열의 길이 : 9
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오티드)
[서열표 7]
GCGTACATG
Claims (13)
- 인간상피세포성장인자(hEGF) 유전자와 27번 아미노산인 메치오닌 대신 이소루신으로 치환된 인간성장호르몬방출인자(hGRF) 유전자가 연결된 인간상피세포성장인자-인간성장호르몬방출인자 융합유전자.
- 제 1항에 있어서, 인간상피세포성장인자(hEGF) 유전자와 인간성장호르몬방출인자(hGRF) 유전자가 아스파라긴-메치오닌을 코딩하는 링커 유전자로 연결된 인간상피세포성장인자-인간성장호르몬방출인자 융합유전자.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 유전자는 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 인간상피세포성장인자-인간성장호르몬방출인자 융합유전자.
- 제 3항의 인간상피세포성장인자-인간성장호르몬방출인자 융합유전자를 함유하는 플라스미드 발현벡터 pEGRF.
- 제 4항에 있어서, tac 프로모터에 의하여 인간상피세포성장인자-인간성장호르몬방출인자 융합유전자의 발현이 조절되는 플라스미드 발현벡터 pEGRF.
- 제 4항에 있어서, omp A 리더서열에 의하여 인간상피세포성장인자-인간성장호르몬방출인자 융합단백질을 발현시켜 세포배양액으로 분비할 수 있는 플라스미드 발현벡터 pEGRF.
- 제 4항의 플라스미드 발현벡터 pEGRF로 대장균 JM101 균주(Escherichia coli JM101)를 형질전환시켜 얻은 형질전환체 (수탁번호 : KFCC-10963).
- 제 1항의 인간상피세포성장인자-인간성장호르몬방출인자 융합유전자로부터 발현되는 인간상피세포성장인자-인간성장호르몬방출인자 융합단백질
- 제 8항에 있어서, 융합단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 인간상피세포성장인자-인간성장호르몬방출인자 융합단백질.
- 제 1항의 재조합 DNA로 형질전환된 숙주미생물을 배양하고, 인간상피세포성장인자와 인간성장호르몬방출인자가 융합된 융합단백질을 수득한 후 융합단백질을 절단함으로써 인간성장호르몬방출인자 단백질을 제조하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 인간성장호르몬방출인자 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간성장호르몬방출인자 단백질을 제조하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 브롬시안화물(cyanobromide ; CNBr)을 사용하여 융합단백질을 절단하여 인간성장호르몬방출인자 단백질을 제조하는 방법.
- 제 1항의 재조합 DNA로 형질전환된 숙주미생물을 배양하고, 인간상피세포성장인자와 인간성장호르몬방출인자가 융합된 융합단백질을 수득한 후 융합단백질을 절단함으로써 인간성장호르몬방출인자를 제조하는 방법에 의해 제조된 인간성장호르몬방출인자 단백질.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019970032600A KR100226985B1 (ko) | 1997-07-14 | 1997-07-14 | 신규한 인간성장호르몬방출인자-인간상피세포성장인자 융합유전자, 이의 발현벡터 및 이를 이용한 인간성장호르몬방출인자의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019970032600A KR100226985B1 (ko) | 1997-07-14 | 1997-07-14 | 신규한 인간성장호르몬방출인자-인간상피세포성장인자 융합유전자, 이의 발현벡터 및 이를 이용한 인간성장호르몬방출인자의 제조방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR19990009995A true KR19990009995A (ko) | 1999-02-05 |
| KR100226985B1 KR100226985B1 (ko) | 1999-10-15 |
Family
ID=19514360
Family Applications (1)
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| KR1019970032600A KR100226985B1 (ko) | 1997-07-14 | 1997-07-14 | 신규한 인간성장호르몬방출인자-인간상피세포성장인자 융합유전자, 이의 발현벡터 및 이를 이용한 인간성장호르몬방출인자의 제조방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100226985B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002053167A3 (es) * | 2001-01-03 | 2002-11-14 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Combinacion farmaceutica para el tratamiento del dano tisular debido a falta de irrigacion sanguinea arterial |
-
1997
- 1997-07-14 KR KR1019970032600A patent/KR100226985B1/ko not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002053167A3 (es) * | 2001-01-03 | 2002-11-14 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Combinacion farmaceutica para el tratamiento del dano tisular debido a falta de irrigacion sanguinea arterial |
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| Publication number | Publication date |
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| KR100226985B1 (ko) | 1999-10-15 |
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