CN86108590A - 生产2-酮基-d-葡糖二酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供将原料糖(如：D-葡萄糖)与属于拟葡糖酸杆菌属细菌接触后转化的物质被该细菌以高产率生产2-酮基-D-葡糖二酸的方法。

Description

本发明是关于发酵生产2-酮基-D-葡糖二酸（见式1）的方法，该酸可很好地用作饲料，洗涤剂，粘合剂，混凝土增塑剂的浓缩钙添加剂及用于糖类代谢研究的试剂。

（Ⅰ）

以前只有一种生产2-酮基-D-葡糖二酸的方法。该方法中在铜绿假单胞菌作用下，将通过化学氧化葡萄糖合成的D-葡糖再二酸通过微生物氧化得到2-酮基-D-葡糖二酸。（见捷克斯洛伐克专利N.222577，1984年2月1日）。

上述获得专利的方法需要通过化学氧化来合成D-葡糖酸，但从产率的角度它不是令人满意的工业生产技术。

由于研究了微生物氧化单糖机制，本发明者发现当把从土壤样品中分离的某种菌株CK59ls，12-5，12-15，12-4，或22-3）培养在含D-葡萄糖，D-果糖和/或其它单糖作为碳源的培养基中时，所得培养液中产生和积累了可观量的2-酮基-D-葡糖二酸。本发明者还对这些细菌进行了分类学研究，发现它们是属于一个新属的一些新菌株。本发明即是进一步研究的结果。

也就是说，本发明提供了一种生产2-酮基-D-葡糖二酸的方法，它包括将式（Ⅱ）所示化合物与属于拟葡糖酸杆菌属细菌接触，该化合物及接触过程转化的其它化合物可被氧化，从而产生和积累2-酮基-D-葡糖二酸，然后再回收产物。

该化合物如下式Ⅱ

（Ⅱ）

其中R₁是-CHO，-CH₂OH或-COOH;R₂是

H或

。

菌株K5915，12-5，12-15，12-4和22-3都是从分别在日本Wakayama    Prefecture和shiga    Prefecture收集的土壤样品中分离出的。这5个菌株每株都具有下列分类学特征：

K59ls和12-5菌株的分类学特征：

（a）形态学特征：

（1）杆状，大小为0.3～0.5×0.7～1.4微米。

（2）无细胞多形态性。

（3）靠2到4根极生鞭毛游动。

（4）不形成孢子。

（5）革兰氏阴性。

（6）不抗酸。

（b）在各种不同培养基的生长状态：

（1）营养琼脂平皿上培养：基本上不生长。培养在酵母浸出物营养琼脂平板上时，形成圆形，全缘，光滑的乳光菌落。

（2）在酵母浸出物营养琼脂斜面上培养：适度生长，呈线性，光滑的乳光菌落。

（3）在酵母浸出物营养液中培养：适度生长，整个培养液均匀混浊。

（4）营养白明胶穿刺培养：上部稀疏生长，白明胶未被液化。

（5）石芯牛乳：酸化，凝固。

（c）生理学特征：

（1）硝酸盐还原：较弱的阳性。

（2）没有发现反硝化作用。

（3）甲基红（MR）试验阳性。

（4）伏-普（Voges-Proskauer）试验阴性。

（5）不产生吲哚。

（6）不产生硫化氢。

（7）不水解淀粉。

（8）柠檬酸盐利用：阴性。

（9）利用铵盐。

（10）不产生色素。

（11）产生脲酶

（12）氧化酶试验：阳性。

（13）过氧化氢酶试验：阳性。

（14）生长在16℃到36℃间，最适温度为24-34℃，可生长在PH5.5到8.7间，最适PH是6.0-7.5。

（15）需氧。

（16）在Hugh-Leifson氏试验中氧化。

（17）从L-阿拉伯糖，D-木糖，D-葡萄糖，D-果糖，D，半乳糖，D-甘露糖，D-麦芽糖，蔗糖，乳糖，海藻糖，D-甘露醇和甘油醇中产酸而不产气。但从D-山梨醇，肌醇或淀粉既不产酸也不产气。

（d）其它特征：

（1）从乙醇中微量产乙酸。

（2）生长需要生物素，硫胺素，核黄素和辅酶A（co    A）。

（3）从甘油醇中产生二羟丙酮。

（4）DNA中的G+C含量为67±1摩尔%。

（5）具有含10个异戊二烯单位的辅酶Q（Co    Q10）。

（6）抗链霉素。

菌株12-15的分类学特征：

（a）形态学特征：

（1）杆状，细胞大小为0.3～0.5×0.7～1.4微米。

（2）无细胞多形态性。

（3）靠2到4根极生鞭毛游动。

（4）不形成孢子。

（5）革兰氏阴性。

（6）不抗酸。

（b）在各种培养基上的生长状态：

（1）在营养琼脂平板上培养：几乎不生长。当生长在酵母浸出物营养琼脂平板上，形成圆形，全缘，光滑的乳光菌落。

（2）在酵母浸出液营养琼脂斜面上培养：适度生长，形成线状，光滑的乳光菌落。

（3）在酵母浸出物营养培养液中培养：适度生长，整个培养液均匀混浊。

（4）营养明胶穿刺培养：仅在上部稀疏生长。白明胶未液化。

（5）石芯牛乳：酸化但不凝固。

（c）生理学特征：

（1）硝酸盐还原：阴性。

（2）没有反硝化作用。

（3）甲基红（MR）试验：阳性。

（4）伏-普试验：阴性。

（5）不产生吲哚。

（6）不产生硫化氢。

（7）不水解淀粉。

（8）利用柠檬酸盐：阴性。

（9）能利用铵盐。

（10）不产生色素。

（11）产生脲酶。

（12）氧化酶试验：阳性

（13）过氧化氢酶试验：阳性。

（14）生长在23℃-32℃，最适温度为28-32℃。生长在PH6.0-7.5间，最适PH为6.5-7.1。

（15）需氧气。

（16）在Hugh-Leifson氏试验中氧化。

（17）从L-阿拉伯糖，D-木糖，D-葡萄糖，D-果糖，D-半乳糖，D-甘露糖，麦芽糖，蔗糖，乳糖，海藻糖和甘油醇产酸但不产气。从D-甘露醇，山梨醇，肌醇或淀粉中即不产酸也不产气。

（d）其它特征：

（1）从乙醇中微量产生乙酸。

（2）生长需要生物素，硫胺素，核黄素和辅酶A。

（3）从甘油醇中产生二羟丙酮。

（4）DNA中的G+C含量为67±1摩尔%。

（5）具有含10个异戌二烯单位的辅酶Q（co    Q10）。

（6）抗链霉素。

菌株12-4的分类学特征：

（a）形态学特征：

（1）杆状，细胞大小为0.3～0.5×0.7～1.4微米。

（2）无细胞多形态性。

（3）靠2到4根极生鞭毛游动。

（4）不形成孢子。

（5）革兰氏阴性。

（6）不抗酸。

（b）在各种培养基上的生长状态：

（1）在营养琼脂平板上培养：仅生长很小的菌落;无法进行详尽的观察。当培养在酵母浸出物营养琼脂平板上时，形成一圆形，全缘，光滑的乳光菌落。

（2）在酵母浸出液营养琼脂斜面上培养：生长适度，成为线状，光滑的乳光菌落。

（3）在酵母浸出物营养培养液中培养：生长适度，整个培养液均匀混浊。

（4）营养白明胶穿刺培养：仅在上部稀疏生长。白明胶未液化。

（5）石芯牛乳：酸化但不凝固。

（c）生理学特征：

（1）硝酸盐还原：阴性。

（2）没有反硝化作用。

（3）甲基红（MR）试验：阳性。

（4）伏-普试验：阴性。

（5）不产生吲哚。

（6）不产生硫化氢。

（7）不水解淀粉。

（8）利用柠檬酸盐：阴性。

（9）能利用铵盐。

（10）不产生色素。

（11）产生脲酶。

（12）氧化酶试验阳性

（13）过氧化氢酶试验阳性。

（14）生长在16-36℃，最适温度为24-34℃。生长在PH5.5-8.2间，最适PH为6.0-7.5。

（15）需氧气。

（16）在Hugh-Leifson氏试验中氧化。

（17）从L-阿拉伯糖，D-木糖，D-葡萄糖，D-果糖，D-半乳糖，D-甘露糖，麦芽糖，蔗糖，乳糖，海藻糖和甘油醇产酸但不产气。从D-甘露醇，山梨醇，肌醇或淀粉中即不产酸也不产气。

（d）其它特征：

（1）从乙醇中微量产生乙酸。

（2）生长需要生物素，硫胺素，核黄素和辅酶A或泛酸。

（3）从甘油醇中产生二羟丙酮。

（4）DNA中的G+C含量为67±1摩尔%。

（5）具有含10个异戌二烯单位的辅酶Q（Co    Q10）。

（6）抗链霉素。

菌株22-3的分类学特征：

（a）形态学特征：

（1）杆状，细胞大小为0.3～0.5×0.7～1.4微米。

（2）无细胞多形态性。

（3）靠2到4根极生鞭毛游动。

（4）不形成孢子。

（5）革兰氏阴性。

（6）不抗酸。

（b）在各种培养基上的生长状态：

（1）在营养琼脂平板上培养：仅生长出很小的菌落，不能详尽的被观察到。当在酵母浸出物营养琼脂平板上培养时，形成一圆形，全缘，光滑的乳光菌落。

（2）在酵母浸出物营养斜面上培养生长适度，形成一条状，平滑的乳光菌落。

（3）在酵母浸出物营养培养液中培养生长适度，培养液均匀混浊。

（4）白明胶穿刺培养：仅在上层稀疏生长，白明胶不被液化。

（5）石芯牛乳：酸化但不凝固。

（c）生理学特征：

（1）硝酸盐还原呈微弱阳性。

（2）无反硝化作用。

（3）甲基红（MR）试验阳性。

（4）伏-普试验阴性。

（5）不产生吲哚。

（6）不产生硫化氢。

（7）不水解淀粉。

（8）利用柠檬酸盐：阴性。

（9）可利用铵盐。

（10）不产生色素。

（11）产生脲酶。

（12）氧化酶试验阳性

（13）过氧化氢酶试验阳性。

（14）生长在16-38℃，最适温度为24-34℃。生长于PH5.5-8.7间，最适PH为6.0-7.8。

（15）需氧气。

（16）在Hugh-Leifson氏试验中氧化。

（17）从L-阿拉伯糖，D-木糖，D-葡萄糖，D-果糖，D-半乳糖，D-甘露糖，麦芽糖，蔗糖，乳糖，海藻糖和甘油醇产酸而不产气。从D-甘露醇，D-山梨醇，肌醇或淀粉即不产酸也不产气。

（d）其它特征：

（1）从乙醇微量产生乙酸。

（2）生长需要生物素，硫胺素，核黄素和辅酶A或泛酸。

（3）从甘油醇产生二羟丙酮。

（4）DNA中的G+C含量为67±1摩尔%。

（5）具有含10个异戌二烯的辅酶Q（COQ10）。

（6）抗链霉素。

将这五个土壤样品分离出的菌株与Bergey氏鉴定细菌学手册第八版（1974）和Bergey氏系统细菌学第1卷（1984）描述的细菌种详尽核对，证实这五株，即K59ls，12-5，12-15，12-4和22-3似乎都属于假单胞杆菌属，因为它们都需氧，革兰氏阴性，氧化酶试验阳性的靠鞭毛游动的杆菌。它们与缺陷假单胞菌和泡囊假单胞菌相似之处在于生长所需因素，DNA中G+C含量为67±1摩尔%，及它们都具有含10个异戌二烯单位作为醌系统。然而，这五株不同于假单胞杆菌之处在于它们从乙醇产生微量乙酸，还从甘油醇产生二羟丙酮。

这五株具有葡糖酸杆菌属一些种的特征，但与属于该属细菌的不同点在于它们的氧化酶活性是阳性;不能在PH4.5下生长;在不含糖（能源）的酵母浸出物培养基上可以良好生长也可在胨-酵母浸出物培养基上良好生长;DNA中G+C含量为67±1摩尔%。

也就是说，K59ls，12-5，12-15，12-4和22-3中没有一株是属于任何一已知属。它们可被看作一个新属的新种。因此菌株K59ls，12-5，12-15，12-4和22-3被命名为产酮糖拟葡糖酸杆菌（Pseudogluconobacter    Saccharoketogenes）

这些菌株下面在一些情况下将称作氧化细菌。它们的营养需要叙述如下：菌株K59ls，12-5和12-15具有不一般的营养需要，即它们生长时需要辅酶A。这三个菌株中不能用泛酸代替辅酶A。另一方面，12-4和22-3即可在有辅酶A时生长，也可在有泛酸或这二者都存在时生长。

可用于本发明的菌株不仅包括上述几株，还包括用紫外线或X射线诱变上述菌株得到的菌株。及用化学诱变剂如：N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（硝基亚硝基胍），甲基甲磺酸盐或含氮芥子气等处理上述菌株得到的菌株。得到诱变的方法是常规的。

TH14-86作为诱变株的例子是用硝基亚硝基胍处理K59ls得到的。这个诱变株TH14-86与母株分类学特征一样，只是如下所述它大大增加了以糖作原料产生2-酮基-D-葡糖二酸的能力。

上述的产酮糖拟葡糖酸杆菌K59ls，12-5和TH14-86已贮于1985年9月19日存在大阪发酵研究所（IFO），而产酮糖拟葡糖酸杆菌12-15，12-4和22-3于1985年12月16日也贮存在IFO。产酮糖拟葡糖酸杆菌K59ls，12-5和TH14-86于1985年10月7日贮存在国际贸易和工业部工业科技局的发酵研究所（FRI），而产酮糖葡糖酸杆菌12-15，12-4和22-3也于1985年12月20日贮存在FRI。这些微生物也自1986年8月9日作为布达佩斯条约贮存样品贮藏在FRI。

在IFO和FRI的贮存号如下：

微生物    IFO    FRI

产酮糖拟葡糖酸杆菌K59ls    14464    P-8481    BP-1130

″    12-5    14465    P-8480    BP-1129

″    TH14-86    14466    P-8479    BP-1128

″    12-15    14482    P-8577    BP-1132

″    12-4    14483    P-8576    BP-1131

″    22-3    14484    P-8578    BP-1133

可在本发明中用作化合物（Ⅱ）的化合物包括D-葡萄糖，D-果糖D-甘露糖，D-山梨醇，D-甘露醇，D-葡糖酸，2-酮基-D-葡糖酸，D-葡糖醛酮和D-甘露糖酸。这些化合物下面也称之为原料糖。

通过转化酶作用将蔗糖或糖蜜转变成的转化糖也可很好地用作原料糖。

用在本发明中的“加工的细菌细胞”表示含有酶系统的制备液，这种酶系统关系到原料糖的氧化，结果生成2-酮基-D-葡糖二酸。为举例说明这种制备液，先洗细菌细胞，将其干燥，再回收细菌细胞等步骤，为此将培养物作如下处理如：离心分离，过滤，用溶剂洗（如：用盐水），用丙酮和干冰干燥，再用聚丙烯酰胺凝胶或K-角叉菜胶等回收细胞。

原料可在培养开始加入，也可在不同时间分步加入或在培养期间连续加入。

原料糖和该微生物的接触反应中，糖在反应液中的浓度应为培养基的1-30%（W/V），W詈梦5-20%（W/V）。

原料糖可以下列方式与加工的细菌细胞接触：如向加工的细菌细胞中加原料糖，2-（N-吗啉代）-乙基磺酸（MES）缓冲液（PH6.5，0.5M）和Ca    Co，用水稀释，在锥形摇瓶中摇动混合物。

当将所述加工的细菌细胞与原料糖接触而进行反应时，反应液中糖浓度应为0.1-10%（W/V）。加工细菌细胞的量根据未加工干细胞计算应为1-30毫克/毫升。将反应液PH调至约5.5-7.5。反应温度为20-40℃，时间为1-100小时。

上述的细菌培养基即可是液体也可是固体。它们含有所述菌株能利用的营养源，然而推荐使用液体培养基大量培养。

可用作上述培养基的添加物包括碳源，氮源，矿质盐，有机酸盐和通常用于微生物培养的微量营养。

上述原料糖可不经过任何处理，用作碳源，甘油醇，蔗糖，乳糖，麦芽糖，糖蜜等可用作辅助碳源。

可用作氮源的物质包括有机或无机氮混合物，诸如：铵盐（硫酸铵，氯化铵，磷酸铵等），玉米浆（后面有时称之为CSL），胨，肉浸出物，酵母浸出物，干酵母，黄豆粉，棉籽粉和尿素。可用的矿质盐包括钾盐，钠盐，钙盐，镁盐，铁盐，锰盐，钴盐，铜盐或磷酸盐。

可用的微量营养不仅包括上述细菌生长所必需的营养因子如：辅酶A，泛酸，生物素，硫胺素和核黄素，还包括那些促进菌株生长和产生2-酮基-D-葡糖二酸的混合物如：黄素单核苷酸（下面称之为FMN），黄素腺嘌呤＝核苷酸（下面称为FAD），各种维生素，L-半胱氨酸，L-谷氨酸和硫代酸钠，这些物质即可以化合物形式，也可是含它们的天然物质。

可用的培养方法包括静态培养，振荡培养，浸没培养。大量培养时，推荐用浸没培养。

培养条件取决于菌株，培养基成分及其它因素;可根据每种情况选择条件，从而可高效生产所需产物。例如：温度可选25-35℃，PH为5-9。上述条件下培养10-120小时。这种情况下，PH通常随着产物的积累而降低，这时可加一种合适的碱性物质如：氢氧化钠，氢氧化钾或氨水或一种合适的缓冲液以保持生产2-酮基-D-葡糖二酸的最优PH。

将除上述氧化细菌以外的其它菌培养物灭掉，这些杀死的杂菌也可作为培养基的成分被利用。用于此目的细菌包括芽孢杆菌，假单胞杆菌，柠檬细菌，大肠杆菌和欧文氏菌等属的细菌。特别是下列细菌：

蜡状芽孢杆菌（IFO3131）

枯草芽孢杆菌（IFO3023）

短小芽孢杆菌（IFO12089）

巨大芽孢杆菌（IFO12108）

解淀粉芽孢杆菌（IFO3022）

三叶草假单胞菌（IFO12056）

弗氏柠檬酸细菌（IFO3546）

大肠杆菌（IFO3546）

草生欧文氏菌（IFO12686）

它们可以下列方式促进氧化菌的生长：将这些菌在合适培养基中，20-40℃下培养2-4天，然后灭菌，将培养混合物以0.5～5%（W/V）比率加入氧化菌培养基。

根据2-酮基-D-葡糖二酸的性质，用常规方法分离和纯化在培养液或反应液中产生和积累的该酸。2-酮基-D-葡糖二酸可以是游离酸也可以其钠、钾、钙、铵盐的形式被分离出来。

只要不与本发明目的抵触，可采用任何分离的方法。如：可通过过滤或离心以反应产物中先除去细菌细胞，需要的话再用活性炭处理脱色。还可进一步浓缩反应产物，沉淀析晶。通过过滤收集所得结晶，再结晶，分离出所得产物。溶剂萃取，色谱法，盐析法也可应用，即可单独用一种方法也可几种方法结合使用，可进行一次，也可重复多次。

得到游离形式的2-酮基-D-葡糖二酸时，它可用合适方法被转变成钠、钾、钙、铵等盐;得到盐形式的该酸时，它即可用合适方法被转变成游离酸也可转变成其它的盐。

通过测定其物理化学性质如：元素组成，熔点，旋光性及红外光谱鉴定出所得产物是2-酮基-D-莆糖二酸。

用高效液相色谱定量分析了反应液中或培养液中产生的2-酮基-D-葡糖二酸，（流动相：稀硫酸，PH2.2;流速：0.5毫升/分;测量仪器：差示折射计）柱内装磺酸化聚苯乙烯凝胶柱（Shimadzu    Corp.，SCK-101H柱，7.9mm×30cm）;如下面参考例所述，根据捷克斯洛伐克专利No222，577（1984）的方法，用铜绿假单胞菌（IFO3448）把D-葡糖二酸转化的2-酮基-D-葡糖二酸作为标准样品。

用能将D-葡萄糖等氧化成2-酮基-D-葡糖二酸的拟葡糖酸杆菌，本发明使其可以高产率生产2-酮基-D-葡糖二酸。

图1和2分别表示例1所得结晶物质和参考例所得标准样品的红外吸收光谱。

下面将用参考例及实施例详细说明本发明，除非特别定义，培养基的%体积均表示为重量/体积%。

参考例：

将30毫升由0.5%胨，0.5%酵母浸出物，1.0%D-葡萄糖和0.1%KHPO组成的培养基（下面称作PYG培养基）转移到一个200毫升的锥形烧瓶中，在120℃灭菌20分钟。向烧瓶内接种一个铂环量的铜缘假单胞菌（IFO3448）新鲜细胞。该菌在加2.0%琼脂的PYG斜面培养基，28℃已培养2天。将细菌置于30℃下转动震荡培养（200转/分）24小时;所得培养液用作种子培养液。

将予先用NaOH调PH至7.0的5%（w/v）D-葡糖二酸单钾水溶液（Sigma Corp.，U.S.A）通过0.45微米孔径的滤纸过滤，除掉微生物，然后将其加入PYG培养基，使其浓度稀释为1%（w/v）。将1毫升上述种子培养液转到含20毫升上述培养基的200毫升容积的锥形烧瓶，30℃下震荡培养24小时。通过高效液相色谱发现所得培养液中含9.02毫克/毫升2-酮基-D-葡糖二酸。将细菌细胞从590毫升培养液中除去，得到580毫升上清液。将上清液过内装Amberlite阳离子交换树脂IR120 B的柱（H⁺形，Roam & Haas Co.USA，200毫升），然后用150毫升去离子水洗掉阳离子。再将清液通过一个活性炭柱（70毫升），用50毫升去离子水洗，从而使其脱色。用Ca（OH）₂使洗脱液（780毫升）的PH调至6.5;过滤除去白色混浊物，将清液在降压条件下浓缩到约20毫升。

将浓缩物中形成的白色不定形结晶收集在一张玻璃滤纸上，用一系列少量的冷水、甲醇，二乙醚洗结晶，减压干燥，得到5.04克3.5-水合2-酮-D-葡糖二酸二钙，该结晶物分析资料如下：

熔点：152-157℃（分解）

元素分析资料（C₆H₆O₈Ca·3.5H₂O）（%）：

计算值：C;23.30，H;4.24，Ca;12.96

测定值：C;23.15，H;4.18，Ca;14.00

旋光率：[α]²⁵ _D＝+9°（C＝1.075，0.1NHCl）

红外吸收光谱：主要吸收波数如下：

波数（cm^-1）3590，3500，3400～2700（宽）＊，1650，1600，1430，1380，1360，1300，1250，1240，1220，1125，1095，1065，1040，1005，995，955，900，840，800，765，725

实施例1：

将20毫升由20%D-葡萄糖，1.0%胨，1.0%干酵母和2.0% CaCO₃的种子培养基转到一个200毫升的锥形烧瓶中，在120℃高压灭菌20分钟。将一铂环量的产酮糖拟葡糖酸杆菌K591S（FERMBP-1130，IFO14464）细胞接种到烧瓶中，该菌已在含2.5%D-山梨醇，1.0%胨，1.0%酵母浸出物，0.2% CaCO₃和2.0%琼脂的斜面培养基上，28℃下培养4天。然后在30℃下震荡（200转/分）培养2天，得到种子培养液。将200毫升与种子培养基成分一样的培养基转到一个1升的锥形烧瓶，如上同样方式灭菌，然后将10毫升种子培养液转到这个大锥形瓶中，然后在30℃震荡培养3天。

发现所得的培养液含19.4毫克/毫升2-酮基-D-葡糖二酸。

离心（7000转/分，10分钟）该培养液（1600毫升）以除去含细菌细胞的沉淀，得到1520毫升上清液。冷却到4℃后，将其静置3天，得到2-酮基-D-葡糖二酸钙的不定形结晶。将所得结晶收集在一张玻璃滤纸上（No3），用一系列少量的冷水、甲醇和二乙醚洗结晶，降压下在五氧化二磷上干燥，得到18克三水合，2-酮基-D-葡萄二酸二钙。所得结晶的分析资料如下：

熔点：152-157℃（分解）

元素分析资料（C₆H₆O₈Ca·3H₂O）（%）：

计算值：C;24.00，H;4.03，Ca;13.35

测定值：C;23.96，H;4.16;Ca;13.00

旋光率：[α]²⁵ _D＝+7.9°（C＝1.065，0.1NHCl）

红外吸收光谱：主要吸收波数如下：

波数（cm^-1）3590，3500，3400～2700（宽），1650，1600，1430，1380，1360，1300，1250，1240，1125，1095，1065，1040，1005，995，955，900，840，800，765，725

这里得到的结晶物质与标准样品显示同样的红外吸收光谱（见图1和2），在高效液相色谱中显示同样的保留时间（9.4分钟），在214纳米紫外吸收对差示折射指数有同样比率（大约为1.0）。用纤维板（Merck），以酚，甲酸和水混合液（7.5∶5∶25）作溶剂，室温下进行薄层层析3小时，结晶物质与标准样品都显示同样的Rf值（0.20）。此外，它们还有相同的颜色反应，即与硝酸银试剂，苯二胺试剂和苯胺酞酸（anilinephthalicacid）试剂反应都分别显稍黑-棕色，黄色和黄色。

基于上述分析资料，产酮糖拟葡糖酸杆菌K591S产生的葡萄糖代谢产物被鉴定是2-酮基-D-葡糖二酸。

实施例2：

同例1所示同样方法，制备产酮糖拟葡糖酸杆菌K591S（FERMBP-1130，IFO14464），12-5（FERM，BP-1129，IFO14465），12-15（FERM，BP-1132，IFO14482），12-4（FERMBP-1131，IFO14483）和22-3（FERM    BP-1133，IFO14484）的种子培养液。加原料糖，（见表1）制备发酵培养基，浓度为5%（w/v）原料糖予先灭菌，溶在由3.0%CSL，0.5%干酵母，0.5%硫酸铵，0.05%硫代硫酸钠，0.2%硫酸铁和3.0% CaCO₃组成的PH6.5的溶液中。将1.25毫升每种种子培养液加入含25毫升发酵培养基的200ml锥形瓶中，30℃下震荡培养3天。用0.3N硫酸稀释培养液，离心，将所得上清液进行高效液相色谱测定其2-酮基-葡糖二酸含量。结果见表Ⅰ。

表1    2-酮基-D-葡糖二酸的产量（毫克/毫升）

菌株

原料糖（5%）    K591S    12-5    12-15    2-4    22-3

D-葡萄糖    44.9    49.1    57.1    41.6    48.6

D-果糖    33.0    40.3    39.4    20.8    42.7

D-山梨醇    14.6    31.5    16.5    14.9    42.4

D-甘露糖    4.9    5.2    8.8    15.8    9.5

D-甘露醇    8.2    12.6    10.3    7.7    15.1

D-葡糖酸    31.8    33.1    18.2    9.5    -

2-酮基-D-葡糖酸＊    16.4    19.7    13.5    5.3    -

＊用2.5%（w/v）浓度

实施例3：

将含2.0%D-葡萄糖，1.0%胨，1.0%干酵母，2.0%碳酸钙和0.01%    Actcot（一种防泡剂，Takeda化学株式会社）的500毫升予培养基转到一个2升的Sakaguchi烧瓶，在120℃灭菌20分钟。将在例1所述斜面培养基，28℃下培养4天的产酮糖拟葡萄酸杆菌菌株12-5（FERM    BP-1129，IFO14465）的活细胞悬浮在10毫升无菌水中，再将该悬浮转入上述Sakaguchi烧瓶，然后在28℃往复震荡培养（85spm）二天，得到的培养液用作予培养。

将含3.0%D-葡萄糖，1.0%胨，1.0%干酵母，2.0%碳酸钙和0.03%    Actol的种子培养基30升装入一个50升的发酵罐中，125℃下灭菌20分钟。将1升上述予培养液转入该发酵罐，在28℃，通气24升/分，1.0千克/cm压力下培养，以200转/分速度搅动，2天后得到种子培养液。

将28℃生长在例1所述斜面培养基上生长2天的巨大芽孢杆菌（Bacyllus    megatenum）（IFO12108）细胞悬浮在10毫升无菌水中，将全部悬浮液接种到含予培养基同样成分的一个Sakaguchi瓶中，将其在28℃往复震荡培养（84spm）2天，得到巨大芽孢杆菌的种子培养液。

将含4.0%蔗糖，4.0%棉子粉，0.65%K₂HPO₄，0.55%KH₂PO₄，0.05%硫酸铵，0.05%NaCl，0.05%硫酸镁和0.05%泛酸钙的培养基（PH7.0）30升装入一个50升的发酵罐，125℃灭菌20分钟。将1升巨大芽孢杆菌种子培养液转入该发酵罐，在28℃，1.0千克/厘米内压，通风24升/分条件下培养。以200转/分搅动培养4天。120蒸气灭菌所得培养液20分钟，将其贮藏在冷凉处，备用作下面发酵培养基的组分的巨大芽孢杆菌灭菌培养液。

将含10.0%D-葡萄糖（在120℃灭菌15分钟），1.0%胨，0.1%硫酸亚铁，0.01%L-半胱氨酸，6.0%碳酸钙，1微克/毫升FMN，1微克/毫升盐酸硫胺素，0.5微克/毫升生物素，0.02%    Actcol和4.0%上面提及的灭菌的E大芽孢杆菌培养液的发酵培养基120升装入200升发酵罐，将其在125℃灭菌20分钟。将上述种子培养液10升转入这个发酵罐，在28℃，以1.0千克/厘米压力，96升/分通气条件下培养。以200转/分搅动培养4天。得到的培养液含99.3毫克/毫升2-酮基-D-葡糖二酸。

用Sharpless离心机（15，000转/分）处理该培养液（110升），得到约31千克湿沉淀物。用150升水洗之，再离心（3，000转/分），然后悬在30升丙酮中，脱水，离心（3，000转/分），得到一白色粉末，将其在50℃，减压干燥24小时，得到14.6千克白色的2-酮基-D-葡萄二酸二钙的粗粉。粗粉的纯度以游离2-酮基-D-葡萄二酸计为58.9%。

实施例4

将5克如例1同样方式得到的粗2-酮基-D-葡萄二酸二钙[含85.1%三水合2-酮基-D-葡萄二酸二钙（C₆H₆O₈Ca·3H₂O），是通过高效液相色谱定量测定的]放在一个500毫升的爱伦美氏烧瓶中，搅动将其悬在300毫升蒸馏水中。将60毫升阳离子交换树脂IR-120 B（Rohm & Haas Co.，USA）加入该悬液中，室温下搅动1小时。将反应产物过一个玻璃滤纸，残留固体用100毫升蒸馏水洗。将滤液和洗液合并，减压浓缩至约50毫升。再将浓缩液过一个Millipore滤纸（Millipore Co.，USA，GS WPO4700，孔径0.22微米）。其上约10克Hyflo Supor Cel（Johns Manvirle，USA，Cellite）予先涂布。用20毫升蒸馏水洗，然后将洗液与滤液合并。根据高效液相色谱定量测定（回收率90.1%）滤液含2.66克2-酮基-D-葡糖二酸。

将该滤液过内装10克活性炭的柱（Takeda化学株式会社，色谱用ShirasagiA），用100毫升蒸馏水洗。洗脱液分开，并转入两个500毫升茄形烧瓶，冷冻干燥7小时，将水蒸发掉。所得无色，油状物质用五氧化二磷减压干燥3小时，用作元素分析及红外分析的样品。

元素分析资料（%）：（C₆H₈O₈·1.4H₂O）

计算值：C;30.88，H;4.66

测定值：C;31.12，H;4.57

高效液相色谱：保留时间＝7.30分钟。

红外（胶片）：主要吸收波数（cm^-1）3700～2700，

1730，1700（窄），1680（窄），1640

＊高效液相色谱测定条件：

仪器：Shimadzu    Lc-3A型

柱：Aminex离子排斥HPX-87H，300×7.8毫米（Bio-Rad）

流速：0.6毫升/分

柱温：25℃

流动相：0.008N硫酸

检波器：紫外（210纳米），红外（Showa    Denko，SE-31型）

实施例5：

根据例4所述方法从5克粗三水合2-酮基-D-葡糖二酸二钙[含85.1%C₆H₆O₈Ca·3H₂O]制备10毫升2-酮基-D-葡糖二酸液[通过高效液相色谱定量测定发现含2.71克（0.013摩尔）2-酮基-D-葡糖二酸，产率为92.0%]，将这10毫升溶液通过一个内装30毫升DOWEX 50W-X8（Dow chemical co.USA，Na⁺型阳离子交换树脂柱。用蒸馏水洗脱，得400毫升洗脱液（PH值为3.4）。将其减压浓缩，干燥。将甲醇（400毫升）加入残留物，搅动，得到粉状物质，再过滤收集粉末，用少量丙酮洗，在干燥器中减压干燥：得到2.44克2-酮基-D-葡萄二酸单钠（产率：75.6%）。

熔点：155-160℃（分解）

元素分析资料（%）（C₆H₇O₈Na·H₂O）

计算值：C;29.04，H;3.66

测定值：C;28.72，H;3.80

红外光谱（KBr）：主要吸收波数（cm^-1）3600-2800，1720，1620，1410

实施例6

根据例4方法从5克粗三水合2-酮基-D-葡萄二酸二钙[含85.1%C₆H₆O₈Ca·3H₂O]制备10毫升2-酮基-D-葡糖二酸溶液[通过高效液相色谱定量测定发现含2.71克（0.013摩尔）2-酮基-D-葡萄二酸]，将这10毫升溶液通过一个内装30毫升Dowex 50W-X8（K⁺型）的柱。用蒸馏水洗脱柱，得400毫升洗脱液（PH值3.42）。减压浓缩洗脱液，将400毫升甲醇加入残留物，搅动，得粉状物质。过滤收集该粉末，用少量丙酮洗之，在干燥器中减压干燥：得到2.12克2-酮基-D-葡萄二酸单钾（产率：61.7%）。

熔点：135-150℃（分解）

元素分析资料（%）（C₆H₇O₈K·H₂O）

计算值：C;27.27，H;3.43

测定值：C;26.83，H;3.66

红外光谱（KBr）：主要吸收波数（cm^-1）3600～2800，1720，1610，1410

实施例7：

表2斜面培养基

成分    克/升

D-山梨醇    25

胨    10

酵母浸出物    10

CaCO₃2

琼脂    20

PH7.0

表3：完全培养基

成分    克/升

D-山梨醇    25

胨    10

酵母浸出物    10

PH6.5（用作固体培养基时，加20克琼脂）

表4：

基本培养基

成分    克/升

蔗糖    5

K₂HPO₄3

KH₂PO₄1

（NH₄）₂SO₄1

Nacl    1

MgSO₄·7H₂O 0.1

MnCl₂·nH₂O 0.002

L-谷氨酸钠    0.1

L-半胱氨酸    0.1

辅酶A    0.002

FMN    0.002

硫胺素    0.002

生物素    0.001

PH7（如用作固体培养基需加20克琼脂）

将-铂环量的产酮糖拟葡萄糖酸杆菌K591    S接种到含5毫升表3所示完全培养基的一个试管（16毫米×160毫米）中，该菌株已在表2所示斜面培养基上30℃震荡培养2天。取1毫升该培养液转移到内含5毫升同样培养基的试管，然后将其震荡培养4小时。将所得培养液（5毫升）无菌下在5℃，以12，000转/分离心15分钟，收获细胞。将这些细胞悬浮在10毫升的Tris-马来酸缓冲液（PH6.5;0.05M）中，再离心。重复两次离心洗细胞，然后将洗净的细胞悬浮在含1毫克/毫升亚硝基胍的上述缓冲液，30℃下摇动2小时使细菌突变。将悬液在5℃以12，000转/分离心15分钟以收集细胞，然后每次用10毫升的Tris-马来酸缓冲液洗，洗两次，回收含亚硝基胍处理细胞的部分。用0.85%盐水将其稀释到合适浓度，在涂布到含15毫升完全培养基（固体）的平板上（直径：9cm）。将接种的平板在28℃培养5天，长出菌落。给菌落计数，与未处理的对照比较。由于亚硝基胍处理，微生物死亡率达90.4%。将完全培养基平板上的菌落影印到表4所示基本培养基平板上，28℃培养3天后，产生营养缺陷型频率（营养突变）为约6.6%。

将在完全培养基平板上用诱变剂处理的菌落划线接种到新鲜的完全培养基上，每平板划12株，长约2厘米。28℃下培养2天后，将一铂环量的生长细胞转到一个内装3毫升含7.0%D-葡萄糖（单独灭菌），1.0%干酵母，1.0%胨，0.1%氯化铁，3.0%CaCO₃的培养基（PH6.5）的试管中，30℃下摇动培养3天。被试验的突变菌株中，TH14-86产生2-酮基-D-葡糖二酸的量是其母株K591S在同样条件下产酸量的两倍。这个TH14-86（TFO14466;FERNMBP-1128）被选作氧化D-葡萄糖能力高的一个氧化菌株。

实施例8：

将例7中的产酮糖拟葡糖酸杆菌K591S突变来的TH14-86菌株在一斜面培养基28℃下培养4天。从斜面培养物中取出一铂环量的该细菌细胞，将其接种到一含20毫升例1所述种子培养基的200毫升锥形烧瓶中，30℃下摇动培养2天。

将200毫升含3.0%D-葡萄糖，1.0%胨，1.0%干酵母和2.0%CaCO₃的予培养基装入一个1升的锥形烧瓶，120℃下灭菌20分钟。用20毫升上述培养液接种，在30℃摇动培养2天，得到TH14-86菌株的予培养液。

将一个5升发酵罐灭菌，装入2.4升含5.0%D-葡萄糖（单独灭菌），4.0%（v/v）灭菌的巨大芽孢杆菌培养液（如例3制备），1.0%胨0.3%硫酸铵，0.05% Na₂S₂O₃，0.05%KH₂PO₄，0.05%硫酸镁，0.1%FeSO₄·7H₂O，0.05% ACTCOL，5毫克/升MnSO₄·4H₂O，1毫克/升FMN，1毫克/升硫胺素，0.5毫克/升生物素和9.0%CaCO₃的发酵培养基，在120℃灭菌30分钟。

用300毫升上述TH14-86予培养液接种发酵培养基，在32℃，通气2.0升/分，以800转/分摇动，培养54小时，再将300克D-葡萄糖溶在水中，制备600毫升D-葡萄糖液，再在120℃灭菌20分钟，先培养6小时后将该糖液连续加入发酵罐18小时。

发现培养液（3.05升）含164.9毫克/毫升2-酮基-D-葡糖二酸。

实施例9：

将25毫升含1.0%L-山梨糖（单独灭菌），0.5%胨，和0.5%酵母浸出物的培养基（PH7.0）装入一个200毫升锥形烧瓶。将其在120℃灭菌15分钟，用一铂环量产酮糖拟葡糖酸杆菌TH14-86株接种，该菌株已在表2所示斜面培养基上28℃下生长4天。

接种后在30℃摇动培养2天，得到种子培养液。

将25毫升含0.5%D-葡萄糖（单独灭菌），1.0%胨，0.5%酵母浸出物和2.0%CaCO₃的培养基（PH7.0）装入一个200毫升锥形烧瓶中，在120℃灭菌15分钟。用1.0毫升上述种子培养液接种，再在30℃下培养2天。

将所得培养液（460毫升）在室温下静置20分钟，倾出液体，除去沉积物。将所留液体以1.000转/分低速，室温下离心，除去主要为CaCO₃的沉积物。所得细胞悬液进而在5℃下离心（6，000转/分）10分钟，将收集的细胞用冷盐水（0.85%）洗两次，每次用约100毫升，再在5℃离心（6，000转/分），得到洗净的细胞。再将其悬在35毫升的冷盐水（0.85%），得到洗净细胞的悬液。取2毫升，加入300毫克D-葡萄糖，0.5毫升2-（N-吗啉代）乙基磺酸（MES）缓冲液（PH6.5;0.5M）和180毫克CaCO₃，再用水稀释到10毫升。混合液在一个100毫升锥形烧瓶中，30℃下摇动，使其反应24小时。发现反应后混液含25.7毫克/毫升2-酮基-D-葡糖二酸。

Claims (8)

1、生产2-酮基-D-葡糖二酸的方法，包括将下式所示链结构的化合物与属于拟葡糖酸杆菌属的细菌接触，该菌氧化所述化合物或培养基中由它转的其它物质，产生和积累2-酮基-D-葡糖二酸，然后再回收该酸，上述链结构化合物如下式：

其中R₁是-CHO，-CH₂OH或COOH；R₂是

,

。

2、根据权利要求1的方法，其中的细菌是产酮糖拟葡糖酸杆菌。

3、根据权利要求1的方法，其中的细菌是产酮糖拟葡糖酸杆菌K591S  菌株（FERM  BP-1130，IFO  14464），12-5株（FERM  BP-1129，IFO  14465），TH14-85株（FERM  BP-1128，IFO  14466），12-15株（FERM  BP-1132，IFO  14482），12-4株（FERM  BP-1131，IFO  14483）或22-3株（FERM  BP-1133，IFO  14484）。

4、根据权利要求1的方法，其中的细菌是产酮糖拟葡糖酸杆菌TH14-86（FERM  BP-1128，IFO  14466）。

5、根据权利要求1的方法，其中的化合物是D-葡萄糖。

6、根据权利要求1的方法，其中的化合物是D-葡萄糖。

7、根据权利要求1的方法，其中的化合物与细菌接触时所用浓度根据培养基计为1-30%（w/v）。

8、根据权利要求7的方法，其中化合物的浓度根据培养基计为5-20%（w/v）。

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