JPH05500905A - サッカライド組成、その合成法と合成装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 サツカライド組成、その合成法と合成装置技術分野 本発明は、サツカライド組成、例えば、オリゴサツカライド、ポリサッカライド 、糖脂質、糖蛋白に関わる。さらに具体的に言うと、本発明は、上記および、上 記以外のサツカライド組成を、酵素法によって調製する工程に関わる。

背景技術 「炭水化物」という用語は、一般式（Ｃ）１２０）。を持つ様々な化合物、例え ば、ジサッカライド、オリゴサツカライド、ポリサッカライドを内包する。オリ ゴサツカライドは、サツカライド・ユニットから成る結合鎖であって、サツカラ イド・ユニットは、別名、糖とも言われる。このサツカライド・ユニットは、ど のような順序にも配列することができ、また、２個のサツカライド間の結合は、 約１０通りの異なるやり方のいずれのものにでもなることができる。この結果、 異なる、可能な、立体異性体オリゴサツカライド鎖の数は膨大になる。

あらゆる生物的ポリマー属の中でも、オリゴサツカライドとポリサッカライドは 、従来、もっとも研究の不足しているところであった。これは、かなりの部分が 、その、時として複雑な糖鎖の配列を決めたり、合成するのが困難であったため である。

オリゴサツカライドとポリサッカライドの合成は十分な発達を見てはいるけれど も、オリゴサツカライド合成に関しては、一般に適応可能な方法と言うものは現 在ない。

炭水化物の合成に関しては、古典的な方法が多数開発されてはいるけれども、こ れらの方法は、選択的保護や除蛋白を必要とするという厄介を免れない。さらに 、オリゴサツカライドの有機合成は、グリコシド結合の脆弱であること、領域選 択的糖結合を実現することが困難であること、一般に合成収率が低いこと、によ って妨げられている。上記困難は、炭水化物を精製し、その構造解析するのに伴 う困難と相俟って、この分野の化学にたいする研究の不足を一層際立たせるもの となっている。

従来、研究努力の多くが、炭水化物や、炭水化物フラグメントから成る分子、例 えば、糖脂質、糖蛋白に向けられて来た。

このような部分にたいする研究的興味の大部分は、蛋白と炭水化物間の相互作用 は、広範な生物認識現象に関わるという意識から来ている。この生物認識現象に は、授精、分子標的、細胞間認識、ウィルス性、細菌性、真菌性病原性がある。

現在広く認められていることであるが、糖蛋白や糖脂質のオリゴサツカライド部 分が、細胞と細胞、細胞とリガンド、細胞と細胞外基質、細胞と病原体、との間 の認識を仲介する。

上記認識現象は、細胞認識に関わる糖蛋白ないし糖脂質の活性部分に認められる ものと同じ糖配列、立体化学を持つオリゴサツカライドによって抑制されること があるらしい。オリゴサツカライドは、受容体蛋白上の結合部位を争って、糖蛋 白や糖脂質と競合すると考えられている。例えば、ジサッライド・ガラクトシル β　１−４　Ｎ−アセチルグルコサミンは、生細胞、細胞膜の受容体と相互作用 を持つ糖蛋白の１成分と考えられている。したがって、もしかしたら有毒である かもしれない部分と、細胞の結合部位を競合するという点において、オリゴサツ カライドおよびその他のサツカライド組成は、薬学、診断学、治療法に新分野を 開く可能性を持つ。

オリゴサツカライドを、ヒトおよび動物の病気の治療薬としてテストすることに ついては、比較的僅かな努力しかなされていない。これは、先にも述べた通り、 オリゴサツカライドの合成法が得られなかったためである。限られた種類の、小 さなオリボサツカライドについては、有機化学的方法によって、特注合成もでき ようが、そのような化合物の製造コストは、通常、きわめて高い。おまけに、オ リゴサツカライドを立体特異的に合成することはきわめて困難であり、ある種の 糖、例えば、シアル酸やフコースを付加することは、その結合が極端に脆弱であ るために、従来有効に実現することはできなかった。オリゴサツカライドにたい する、一般的に適用できる改良法がめられている。これは、薬学、治療用の各種 のオリゴサツカライドを大量に生産するためである。

ある種の応用においては、従来法に代わるものとして、有機合成における酵素の 使用に狙いを定めている。例えば、有機合成においては、酵素は、触媒として用 いられてきている。反応速度加速や立体選択性といった分野においては、合成酵 素反応の価値は実証済みである。さらに、ある種の酵素の低コスト生産や、その 性質の変更については、現在既に、技術がある。

炭水化物合成の触媒として、酵素を使用することは、従来から提案されてきては いるが、今日まで、オリゴサツカライドやその他の複雑な炭水化物を、相当量、 一般合成するのに有効な酵素法はまだ見つかっていない。一般に認められている ことであるが、炭水化物合成に酵素を触媒として使用するにあたって、主な制限 因子となるのは、炭水化物合成を実現するのに必要な広範な酵素の入手が、現在 、きわめて限られていることである。

Ｔｏｏｎｅ　ｅｊ　！ｌ、、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（１ ９９ＯＮ４５Ｈ７：５３６５−５４２２を参照されたい。

は乳類系においては、ヌクレオシド・モノ、ジ燐酸糖の形で活性化される８個の モノサッカライドが、多くのオリゴサツカライドを構成する要素となる。すなわ ち、ＵＤＰ−Ｇｌｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ、　ＵＤＰ−ＧＩｃＮＡｅ、　ＵＤＰ −Ｇａｌ、　ＵＤＰ−ＧｇｌＮＡｅ、　ＧＧＰ−Ｍｘｎ、　ＧＤＰ−Ｆｕｃ、及 びＣＭＰ−ＮｅｕＡｃである。これらは、Ｌｅｌｏｉｔ　経路の中間代謝物であ る。もっと多数の糖（例えば、キシロースやアラビノース）や、オリゴサツカラ イドが、微生物や植物にはある。

２群の酵素が、オリゴサツカライドのインビボ合成に関連する。Ｌｅｌｏｉ＋経 路の酵素は最大のグループである。この酵素は、糖ヌクレオシド燐酸として活性 化された糖を、成長するオリゴサツカライド鎖に移送する。非Ｌｅｌｏｉｒ経路 酵素は、糖燐酸として活性化された炭水化物ユニットは移送するが、糖ヌクレオ シド燐酸として活性化されたものは移送しない。

オリゴサツカライドの、インビトロ、酵素触媒合成については、従来二つの方策 が提案されている。Ｔｏｏｎｅ　ｅｌ　ａｌ、、上記参照。第一の方策は、グリ コジルトランスフェラーゼの使用である。第二のものは、グリコシダーゼまたは グリコジル・ヒドロラーゼを使用する。

グリコジルトランスフェラーゼは、活性化された糖を、蛋白ないし脂質に、また は、成長するオリゴサツカライドの非還元性末端に、段階的に付加するよう触媒 する。炭水化物を合成するには、多数のグリコジルトランスフェラーゼが必要の ようである。各ＮＤＰ−糖残基は、一定系のグリコジルトランスフェラーゼを必 要とし、今日までに特定されている画側以上のグリコジルトランスフェラーゼの それぞれが、ある特定のグリコシド結合の形成を触媒するようである。現在まで のところ、グリコジルトランスフェラーゼの特異性の正確な詳細は不明である。

例えば、炭水化物のどの配列が、上記酵素の多くによって認識されるのかも不明 である。

Ｌｅｌｏｉｒ経路の酵素は、オリゴサツカライドの合成に応用を見いだしてきて いる。このような方法がうまくいくためには、二つの要素が必要である。糖ヌク レオシド燐酸が、実用コストで入手できなければならず、また、グリコジルトラ ンスフェラーゼが入手できなければならない。最初の問題は、は乳類生合成に必 要なものを含めて、通常のＮＤＰ−糖に関しては解決済みである。しかしながら 、水洗の問題点は第二の問題にある。これまでのところ、ごくわずかな数のグリ コジルトランスフェラーゼしか入手されない。この種の酵素の入手可能性が、こ の種の炭水化物合成法の唯一の制限因子となっている。

従来から報告されていることであるが、多くのグリコジルトランスフェラーゼは 、単離が困難である。特に、は乳類由来のものはそうである。これは、この蛋白 が、低濃度で、かつ、膜に結合しているからである。さらに、小数のグリコジル トランスフェラーゼは固定することができるけれども、この酵素は不安定だとい う報告がある。これまでのところ、ごく小数のグリコジルトランスフェラーゼし か、市販されておらず、しかも、その原料は高価である。

したがって、酵素の遺伝子工学（すなわち、クローニング）の将来の発展には多 大の期待が寄せられていた。これは、特に、ガラクト、フコシル、シアリルの各 トランスフェラーゼを含む、いくつかのグリコジルトランスフェラーゼがクロー ニングされるようになって以来、そうであった。クローニング技術の将来の進歩 によって、他のグリコジルトランスフェラーゼのクローニングが促進され、その 安定性が強化されることが期待される。

したがって、その潜在的な有用性、および、それらを十分な量入手することが困 難であること、または、不可能であること、から見て、次のような一般的な合成 法にたいしては、長年に渡る要求があった。すなわち、オリゴサツカライド、ポ リサッカライド、糖蛋白、糖脂質、同類物を、効率的で、コスト当りの有効性の 高い、立体特異的で、一般的に応用可能なやり方で、生産する方法である。

発明の開示 すツカライド組成、特にオリゴサツカライド、ポリサッカライド、および、オリ ゴサツカライド・ユニットを含む化学的部分を与えるのが、本発明の目的である 。

天然に見られないものを含めて、広範なサツカライド組成を与えるのが、本発明 のもう一つの目的である。

ヒトないし動物の病気の作用を緩和するのに有効なサツカライド組成を与えるの が本発明のもう一つの目的である。

さらに、サツカライド組成を調製するための改良法を与えるのが、本発明のもう 一つの目的である。

的であり、かつ、サツカライド・ユニットを受容体部分に移送サツカライド組成 を調製するための酵素法を与えるのが、本発明のもう一つの目的である。

さらに、サツカライド組成を合成するのに有効な酵素の入手法を与えるのが、本 発明のもう一つの目的である。

さらに、本発明に従って、サツカライド組成を合成するのに有効な装置を与える のが、本発明のもう一つの目的である。

上記および他の目的が本発明によって達成される。すなわち、本発明は、オリゴ サツカライド、ポリサッカライド、糖脂質、糖蛋白、その他のサツカライド組成 の、酵素調製法を与える。

この方法では、供与体部分から、あらかじめ選んだサツカライド・ユニットを、 受容体部分へ、酵素促進性の移送を行なう。

複数のサツカライド・ユニットを持つサツカライド組成は、できれば、そのサツ カライド・ユニットを、受容体部分に、段階的に付加して調製したものが望まし い。この受容体部分は、それ自らが、本発明に従って調製されたサツカライド組 成である。

したがって、サツカライド組成を調製する方法が与えられるが、この方法は、受 容体部分を与え、その受容体部分を、グリコジルトランスフェラーゼに接触させ るという段階を含む。グリコジルトランスフェラーゼは、その受容体部分にだい し特異ツカライドを、受容体部分に、酵素による促進の下に移送して、すること ができるように調製する。本発明の、この方法は複数回実行されるが、それは、 第１回反応の生成物が、第２回反応の受容体部分となる、これが次々に繰り返さ れるというように実行される。

図面の簡単な説明 第１．２．３図は、本発明に従って、グリコジルトランスフェラーゼ触媒による サツカライド組成の合成に好適な装置を図示したものである。

第１図、（１）酵素１ 本発明を実施する最良態様 本明細書中、「サツカライド組成」とは、その構造の中に、１個のサツカライド ・ユニットを持つ、いかなる化学的部分をも含むことを意図したものである。糖 類、炭水化物類、サツカライド類、モノサッカライド類、オリゴサツカライド類 、ポリサッカライド類、糖蛋白類、糖脂質類は、サツカライド組成の例である。

そのような部分を含む混合物や溶液も、サツカライド組成である。

サツカライド組成は、本発明に従って、供与体部分由来のす調製される。このよ うな移送は、受容体、供与体部分を、あるグリコジルトランスフェラーゼを接触 させると起こり、通常、受容体部分と、サツカライド・ユニットとの共有結合に 終わること、すなわち、ただ−個の立体異性体の生成をもたらすことは、了解さ れるであろう。

本発明に従って調製されたサツカライド組成は、診断、治療、薬理的応用に広い 有効性を持つと考えられる。所望の標的サツカライド組成の糖配列が、通常の方 法で一旦決定された場合、そのサツカライド組成にたいする適当な合成法を決め るには、一般に、レトロ合成解析を実行する。このような合成法では、できれば 、その所望のサツカライド組成を生成するのに必要な、特定の供与体部分、受容 体部分、グリコジルトランスフェラーゼを、特定することが望ましい。

炭水化物合成に必要な多数のグリコジルトランスフェラーゼを得るのに、遺伝子 工学の将来の発達をあてにするのでなしに、本発明は、下記のように、まったく 別の方法に依存する。本発明に従って、サツカライド組成を合成する場合には、 あらかじめ選んだサツカライド・ユニット（単数）を、先ず、酵素的に、最初の 受容体部分に付着させる。すなわち、蛋白、糖蛋白、脂質、糖脂質、または、炭 水化物による開始物質に付着させる。

その次に、あらかじめ選んだサツカライド・ユニット（複数）を、このようにし て得られた生成物に、段階的に、酵素的に付着させる。このようにして、サツカ ライド組成を形成する。

あらかじめ選んだサツカライド・ユニットの各々を付着させるごとに、中間産物 を得ることになる。

本発明は、発明者の次の発見に基づく。すなわち、本合成の開始物質（すなわち 、蛋白、糖蛋白、脂質、糖脂質、または、炭水化物）と、本合成において形成さ れる各中間産物は、本合成の相当する各段階ごとに、標的サツカライド組成の合 成における次の中間産物の付着を触媒するのに特異的なグリコジルトランスフェ ラーゼを入手するのに、有利に用いることができるという発見である。

したがって、本発明に従えば、ある段階に必要なグリコジルトランスフェラーゼ は、その中間産物（受容体部分）によって単離され、標的炭水化物分子を構築す るのに必要な、次のサツカライド・ユニットを、その受容体部分に付着するのに 用いることができる。本発明によれば、この操作を繰り返し、かつ、繰り返しく 回数）の度ごとに、次のサツカライド・ユニットを、単離すべき、成長する分子 に付着するのに必要な特定のグリコジルトランスフェラーゼを生成し、標的炭水 化物分子が得られるまで続ける。

さらに、本発明によって与えられるものは、このサツカライド・ユニットを、こ の受容体部分に共有結合させるのに必要・十分であると思われる反応条件と共存 試薬である。

好ましい実施例に従えば、受容体部分は、蛋白、糖蛋白、脂質、糖脂質、または 、モノサッカライド、ジサッカライド、オリゴサツカライドないしポリサッカラ イドのような炭水化物でもよい。その他の好ましい実施例に従えば、グリコジル トランスフェラーゼは、固相の支持体に付着させられる。

本性によって、サツカライド・ユニットは、受容体部分に立体特異的に付着させ られる。一般に、供与体部分としては、サツカライドヌクレオチドを用いるのが 望ましい。供与されるべきサツカライド・ユニットを末端に持つウリヂン、グア ノシン、シチヂン燐酸物質が、供与体部分を構成するのが好ましい。

したがって、本発明はまた、特定の受容体部分にたいして特異的であり、かつ、 あらかじめ選ばれたサツカライド・二ニットを受容体部分に移送することのでき る、グリコジルトランスフェラーゼを調製する手段を提供する。この方法は、受 容体部分を、複数のグリコジルトランスフェラーゼを含むと予想される混合物と 、受容体部分とその受容体部分にたいして特異的なグリコジルトランスフェラー ゼを結合させるのに有効な条件下で、接触させることである。次に、その結果生 じた結合グリコジルトランスフェラーゼを単離する。このグリコジルトランスフ ェラーゼの配列を決定すること、このグリコジルトランスフェラーゼを、遺伝子 工学法によって、多量に製造すること、が望ましい。

目的のグリコジルトランスフェラーゼを含むと予想される混合物は、下記のよう にして特定することができる。ごくありふれたグリコシド結合については、その グリコジルトランスフェラーゼ活性は、出版物に記載されている。これは、ミル クのオリゴサツカライド、あるいは、典型的な（すなわち、広く普及している） 糖蛋白や糖脂質の炭水化物部分にたいしては、はとんど当てはまる。それよりず っと記載の少ない結合については、その結合の見られる組織、器官、食物微生物 をまず見るのがよい。一般に、結合がある特定の供給源に見られる場合、その結 合を形成した酵素もその供給源の中に存在する。

もし、サツカライド構造だけが与えられており、供給源が与えられていない場合 には、そのようなサツカライド構造を含むと思われる生物例を、利用可能なもの の内、もっとも感度の高いスクリーニング法でテストすることができる。例えば 、その化合物が、イズロン酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグル コサミンを含んでいるならば、を椎動物の結合組織をテストするのがよいだろう 。もし標的化合物がアベコースを含んでいるならば、細菌や植物をテストして、 相応するグリコジルトランスフェラーゼがあるかどうかを見るのがよいだろう。

本発明に一致して用いることのできるグリコジルトランスフェラーゼ検出法は様 々のものが発表されている。下記のものは例示にすぎない。Ｆｕｒｕｋａｖａ　 ｅｌ　ｇｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、（１９８５）　２２７：５７３−５８２は 、はう酸浸透紙による電気泳導法と、本発明者によって開発された蛍光法（第６ 図）について記載している。Ｒｏｔｂｅｔ　１１．　Ｅ！ｌｌ’ｌ　Ｃｅ１ｌ　 Ｒｅｓｅｇｒｃｈ　（１９８３）　１４３：２１７−２２５は、はう酸洗の、グ ルクロニルトランスフェラーゼにたいする応用例について記載している。これは 、以前は、比色分析によって測定（１９９０１３８（１）　：２３−３０は、デ アゾニウム塩のＮＡＤＨによる還元反応に基づく組織化学的測定法を記載してい る。

目的のグリコジルトランスフェラーゼの供給源が発見されたならば、その供給源 をホモジェナイズする。受容体部分を親和性リガンドとして、アフィニティー・ クロマトグラフィーにより、ホモジエネートから、その酵素を精製する。すなわ ち、その上に受容体部分を固定した固相基質の上に、そのホモジエネートを、グ リコジルトランスフェラーゼを受容体部分に結合させるような条件下で、通過さ せる。次に、その上に、グリコジルトランスフェラーゼを結合させた、固相支持 体を洗浄する。

次に来るのが溶出段階であって、ここで、グリコジルトランスフェラーゼを固相 から脱着し、収集する。よく知られているように、吸収されたグリコジルトラン スフェラーゼは、例えば、塩の水溶液（例えば、ＮａＣ１）を固相支持体の上に 通過させることによって、溶出することができる。

本発明の実施において、ホモジエネートからアフィニティー・クロマトグラフィ ーによって精製され、受容体部分上で、あらかじめ選択されたサツカライド・ユ ニットを攻撃するのに用いられる「酵素」は、各種グリコジルトランスフェラー ゼの温容部分の末端がサツカライド拳ユニットである場合、それに続合体から成 る。そして、このグリコジルトランスフェラーゼは、精製グリコジルトランスフ ェラーゼの所望の活性を邪げることのできる酵素を含むホモジェネート中の、他 の、外来性生物物質からあらかじめ精製したものである。したがって、本発明に 従って使用されるグリコジルトランスフェラーゼは、各種「グリコジルトランス フェラーゼ」の混合物であることが多い。もし望ましくば、この原料を、さらに 精製し、単一の精製グリコジルトランスフェラーゼを単離し、本発明の操作に用 いてもよい。しかし、一般に、それ以上の精製は不要である。

本発明においては、あらかじめ選ばれたサツカライド・ユニットに共有的に結合 できる、受容体部分が与えられる。代表的な受容体部分としては、蛋白類、糖蛋 白類、脂質類、糖脂質類、炭水化物類がある。受容体部分は、それが、目的のサ ツカライド組成の構造成分として存在していればいるほど、望ましいと言うこと は了解されるであろう。例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン　α２−３ガラクト シル　β１−４　Ｎ−アセチルグルコサミンのようなサツカライド組成を調製す る場合には、好ましい受容体部分は、Ｎ−アセチルグルコサミンと、ガラクトシ ル　β１−４Ｎ−−アセチルグルコサミンであろう。同様にして、ある受ルコサ ミンに移送するので、好ましい。

くサツカライド・ユニットは、通常、その末端サツカライドの非還元性末端部に 共有的に結合することも了解されるであろう。

受容体部分に移送されるべきサツカライド・ユニットは、そのサツカライド・ユ ニットにたいする供与体部分によって与えられる。本発明によれば、供与体部分 は、移送されるべきす・ツカライド会ユニットを含み、かつ、そのサツカライド ・ユニットを、受容体部分と相応のグリコジルトランスフェラーゼに接触させら れた時に、その受容体部分に与えることができる。好ましい供与体部分は、サツ カライド末端のウリジン燐酸、サツカライド末端のグアノシン燐酸、サツカライ ド末端のシチヂン燐酸のようなサツカライド・ヌクレオチド類である。

供与体部分は、受容体部分およびグリコジルトランスフェラーゼと接触した時に 、直ちに、そのサツカライド成分を与えることができるのが好ましいことは了解 されるであろう。例えば、ウリジン２燐酸ガラクトースは、ガラクトースをＮ− アセチルグルコサミンに移送するので好ましく、シチジン１燐酸Ｎ−アセチルニ ューラミン酸は、シアル酸の一種である、Ｎ−アセチルニューラミン酸を、ガラ クトシル　β　１−４　Ｎ−アセチルグあるサツカライド組成の調製に必要な受 容体部分、供与体部分を特定したならば、各受容・供与ペアにたいし１つのグリ コジルトランスフェラーゼを調製しなければならない。本技術に習熟した人なら ば、グリコジルトランスフェラーゼとは、１サツカライド・ユニットが、ある化 学的部分（ここでは供与体と定義する）から、もう一つ別のもの（ここでは、受 容体と定義する）へと移送されるのを促進する酵素と、広く定義づけることがで き、かつ、その移送するサツカライド・ユニットに従って、現象学的に命名され ていることを了解しているであろう。

それ故、ガラクトシル・トランスフェラーゼは、ガラクトースを移送するのであ り、フコシル・トランスフェラーゼは、フコースを移送する。

本発明によるグリコジルトランスフェラーゼとは、あらかじめ定められたサツカ ライド・ユニットを、受容体部分へ移送することのできるものである。グリコジ ルトランスフェラーゼは、できれば、受容体部分か、少なくとも、その、顕著な 、活性又は、暴露部分にたいして、特異的であることが望ましい。あるグリコジ ルトランスフェラーゼにおける特異性とは、ある受容体部分と接触ないし近接さ せた時に、その特定配列部分と結合を結びやすく、かつ、ある特定のサツカライ ド・ユニットを、その受容体部分へ移送させやすい、そのような性向として発揮 される。

現在、グリコジルトランスフェラーゼは、天然供給源からのものがあるだけであ って、そのため、やや数が少ない。既知のグリコジルトランスフェラーゼは、き わめて特異的なサツカライド・ユニット移送しか実現できないことは、了解され るであろう。きわめて特異的というのは、移送されるサツカライド・ユニットの 化学的性質から言っても、それが、その後、受容体部分に付着したときの立体化 学から言ってもそうである。例えば、１個のＮ−アセチルニューラミニル・トラ ンスフェラーゼは、Ｎ−アセチルニューラミン酸を、ただ１個のガラクトースを 含む受容体部分に移送して、そのＮ−アセチルニューラミン酸ユニットと、その ガラクトース・ユニットとの間にα　２−３結合を持つサツカライド組成を生成 する。

このようにして、本発明は、天然に見られる糖結合の構築を可能にする。例えば 、ガラクトース　α　１−２のＮ−アセチルニューラミン酸にたいする結合は、 天然に見ることはできず、現在実現できていない。しかしながら、ここに開示し た方法は、入手可能な、いかなる種類のグリコジルトランスフェラーゼにたいし ても応用可能である。

いくつかのグリコジルトランスフェラーゼについては、その振舞いは知られてい るとはいうものの、多くのグリコジルトランスフェラーゼについては、現在のと ころ十分にその性質が明らかにされていない。しかしながら、本発明は、本発明 の実行にふされしい全てのグリコジルトランスフェラーゼを特定し、調製するこ とのできる方法を与える。受容体部分を、アフィニティー・クロマトグラフィー の手段として用い、特定のサツカライド・ユニットを移送することのできる、し たがって、他のグリコシドを合成することのできる、酵素を単離できるというこ とは現在分かっている。

ある好ましい実施例においては、受容体部分を、例えば、固相の支持体に固定す る。この、「固相の支持体」とは、半固形の支持体をも含むことは了解されるで あろう。一旦固定させたなら、その受容体部分を、グリコジルトランスフェラー ゼを含むと予想される混合物、例えば、天然の細胞ホモジエネートに接触させる 。固定された受容体部分は、それにたいして特異的な酵素と結合するから、次に 、このシステムについて、受容体結合酵素の有無を監視する。

受容体結合酵素の有無の監視は、次のようにして実施できよう。細胞ホモジエネ ートを、固定化した受容体部分の上を通過させる。これは、例えば、細胞ホモジ エネードを、固定化した受容体部分を負荷したカラム上を通過させることによっ て実行することができる。次に、カラムを洗浄し、固定化した受容体部分で負荷 したカラムを通過する蛋白量を測定する。これ以上蛋白が検出されなくなったら 、塩の水溶液である溶出液をカラムに流し、酵素を溶出する。かくして得られた 溶出液について、グリコジルトランスフェラーゼ（単数または複数）の有無を測 定する。用いることのできる測定法については、前述した。すなわち、Ｆｕｔｕ ｋａｖｘ　ｅｔ　ｓｌ　、　Ｒｏｊｈ　ｅｔ　ａｌ　、　および、Ｂｔｎｘｕ　 ｅｔ３１の記載する方法である。

受容体部分にたいする酵素の結合が見られない場合には（すなわち、溶出液の測 定によっても、その中に、グリコジルトランスフェラーゼ（単数または複数）の 存在が認められなければ）、その混合物には、その特定の受容体にたいして特異 的な酵素は含まれていない、と結論することができる。次に、他の、例えば、動 物、および・または植物細胞ホモジエネートの混合物を、その受容体部分と接触 させる。この操作を、酵素結合が見つかるまで続ける。

受容体部分に酵素が結合している場合には、その種を分離し、さらに調べる。好 ましい実施例においては、この受容体と、この酵素候補とを再び接触させるが、 今度は、受容体部分に移送すべきサツカライド・ユニットを含む供与体部分の存 在下に行なう。もしこの接触によって、サツカライドが受容体に移送されるなら ば、その酵素は、本発明の実施に有効なグリコジルトランスフェラーゼである。

一旦、このグリコジルトランスフェラーゼが特定されたならば、本技術に習熟し た人々によく知られている技術を用いて、配列決定をし、かつ・または、複製す ることができるのは了解されるであろう。例えば、複製は、そのグルコシル・ト ランスフェラーゼをコードする遺伝子原料の単離、および、そのグリコジルトラ ンスフェラーゼを生成できる無限増殖性細胞系統の調製、を含む組換え技術によ って実現することができるであろう。複製は、本発明によるサツカライド組成の 商業規模の生産にとってはおそらく好ましいであろう。

このグリコジルトランスフェラーゼが特定されたなら、それを、受容体部分およ び供与体部分に、次の条件下に接触させる。

すなわち、サツカライド・ユニットを受容体部分に移送し、共有的に結合させる ことができるような条件である。ある特定のサツカライド・ユニット移送に相応 する、好適な条件、例えば、時間、温度、ｐＨは、この分野の技術の一つを用い 、通常の実験手法によって決めることができるのは了解されるであろう。

例えば、受容、供与体部分は、２価陽イオン、特に、ＭｎＣｌ２によって供給さ れるようなマンガン陽イオンの存在下で接触させるのが望ましい。

好ましい実施例においては、このグリコジルトランスフェラーゼを、固相の支持 体に付着させることによって固定し、それにたいして接触させるべき受容、供与 体部分を、その上に加えるのが望ましい。前述したように、本発明に従って用い られるグリコジルトランスフェラーゼは、所期の活性を持つ、少なくとも１個の グリコジルトランスフェラーゼを含むグリコジルトランスフェラーゼ類の混合物 であることが多いが、精製した単一グリコシルトランスフェラーゼの使用もまた 本発明に一致する。この好ましい実施例においては、グリコジルトランスフェラ ーゼ類の混合物か、または、精製した単一グリコシルトランスフェラーゼのどち らでも固定してよい。また別のやり方として、そのグリコジルトランスフェラー ゼ、供与体、受容体を、それぞれ溶液として供給し、溶質として接触させてもよ い。

グリコジルトランスフェラーゼ類、そして、必要なら、受容体部分を固定するた めの好ましい操作は、ｐｏ１７　（ａｃｒ７１ａｍｉｄｅ−ｃ。

−Ｎ−ａｃ＋７１ｏｘ７ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ　（ＰＡＮ）のような水溶性ポ リマー前駆体、トリエチレンテトラミンのような架橋結合性ジアミン、および、 当該グリコジルトランスフェラーゼを、中性バッファー中で、共重合させること である。これについては、Ｐｏ１ｌａｃｋ　ｅｌ　！＋、。

］、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、（１９８Ｇ）　１０２：６３２４−３６に開 示しである通りである。ＰＡＮにこの酵素類を固定するのは、小量の酵素を使う だけで、高い酵素活性を得ることができ、かつ、酵素とポリマー間の結合が安定 であるという理由で有効である。

さらに、好ましい固定法は、グリコジルトランスフェラーゼのアミノ基を、固相 支持体のオキシレーン基か（例えば、Ｃｈａｎｅｌ　！ｌ、　Ｅｎ！７ｍｅ　Ｅ ｎｇ、（１９８０）　５：４５７−４６０を参照）、臭化シアン活性化「セファ デックス」または「セファローズＪ　（Ａｘｅｎｅｔ　ｘｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　 （１９６７）　２１４：１３Ｇ２−１３０４）上に固定することであある好まし い実施例として、そのグリコジルトランスフェラーゼを含む、中等度に精製した 組成から、そのグリコジルトランスフェラーゼを固定してもよい。極めて酵素純 度の高い標本（すなわち、１分間のインキュベーションにだいし、１μｇの蛋白 当り移送されるものをｌ　ｎＭｏ１ｅで表わした比活性で見てそういうのである が）はど、固相の支持体に共有的に固定するには効率が悪い。これは、１０倍か ら１００倍純度の低い標本に比べると、誘導パーセントが低いという意味で言う のであるが。

グリコジルトランスフェラーゼの活性部分の、固定による損傷は避けるべきであ る、というのは了解されるであろう。本発明者は、次の観察をしている。すなわ ち、グリコジルトランスフェラーゼを、固定操作の間、特異的に保護すると、問 題のグリコジルトランスフェラーゼに比べて、固定操作の間の汚染性酵素活性が 消失する傾向があることである。固定操作の間、グリコジルトランスフェラーゼ を、その酵素の必要とする陽イオン、その酵素によって認識されるヌクレオチド 、および、その酵素によって認識される受容体によって保護してもよい。例えば 、ガラクトシルトランスフェラーゼは、固定の間、Ｍｎ”＋Ｎ−アセチルグルコ サミン、　ＵＤＰによって保護してもよい。これは、いずれの移送法であっても 用いてよい。汚染性の蛋白分解酵素は、このようには、固定操作の間、全く保護 されない。

固定操作の間、所期のグリコジルトランスフェラーゼのみが保護されるので、標 的サツカライド組成の合成を邪げる酵素や、標的サツカライド組成の合成を邪げ る酵素活性は消失する傾向にある。干渉性酵素の例は、蛋白分解酵素があるが、 これは、もし消失していなければ、所期のグリコジルトランスフェラーゼに作用 するし、また、グリコシダーゼがあるが、これは、もし消失していなければ、サ ツカライド製品に作用する。

前述したように、本発明に基づいて、受容体部分を、供与体部分とグリコジルト ランスフェラーゼに接触させて調製したサツカライドは、今度は、自らが、さら に酵素を単離するための受容体部分の、また、後続のサツカライド・ユニットが 移送される受容体部分の、役目を果たす。このような接触によって、サツカライ ド組成にサツカライド・ユニットを付加するのは、炭水化物や、約３サツカライ ド・ユニットを越えるサツカライド鎖の合成にとっては望ましい。

例えば、トリサツカライドＮ−アセチルニューラミニル　α２−３ガラクトシル 　β１−４Ｎ−アセチルグルコサミンを調製する場合には、ジサッカライド・ガ ラクトシル　β　１−４Ｎ−アセチルグルコサミンを、本発明にしたがって調製 し、次に、これを、受容体部分として用い、それに、後続のユニットを付加する 。本技術に習熟した人であれば、本発明のサツカライド組成に付加されるサツカ ライド・ユニットは、同じものでも、別物でもよいことが了解されるであろう。

本発明のサツカライド・ユニットは、極めて広範囲の応用分野に使用され、既知 の供給源から入手されるサツカライド組成と同様に使用できる。このサツカライ ド組成は、は乳類の治療処置、予防処置として用いるのが好ましい。これについ ては、Ｕ、　Ｓ、出願０７／２４１．０１２に開示した通りである。

本発明のサツカライド組成は、細胞表面受容体の阻止剤として、ウィルス性、細 菌性、真菌性の多数の病気治療に使用を見込まれている。その病気には、例えば 、肺炎、カンジダ症、尿路感染、歯周囲炎、下痢がある。例えば、本発明にした がって調製されたオリゴサツカライドは、肺炎菌のような病原体が、は乳類膜分 子に付着するのを抑制することができる。そのような病原体を、クロマトグラフ ィーや、電気原簿によって分離した細胞糖蛋白や糖脂質とインキュベートしても よいだろう。特定の付着パターンを検出したら、その標的化合物を分析し、抑制 性サツカライド化合物を調製することができるだろう。もし、その相補的分子の いずれかが、そのサツカライド成分を介して機能しているのであれば、特定のサ ツカライド組成が、付着を抑制するはずである。

本発明によって調製されるサツカライド組成は、下記の応用分野に使用すること ができる。

１、栄養添加物 ＊幼児用処方 α１−２　β１−４ （例えば、ｔｏｅ　ｇａｌ　ｇｌｃＮＡｃ”−”　ｇｘｌ”−’　ｇｌｏ）＊老 人用処方 ＊特別ケア処方 ２、抗菌剤 ＊肺炎（例えば、ｇｇｌＮＡｃｕ±」〃ヤｇｘｌ九　山）＊尿路感染 α１２　β１−４ （例えば、’　”　’　＋　ｇ　”　９山Ｎ＾’　２　ｇ　”　’　ａ　ｇ　ｌ 　Ｏ）＊虫　歯 ＊歯周囲疾患 α２−３　β１−３ （例えば、ＮＡＮ　ｇａｌ　ｇａｌＮＡｃ　）−〉−一一一一〉 ＊下痢 （例えば、ｇａ　ｌ　ＮＡＣ＋ｇａ　ＬＬＬＬＬｇ　ｌ　ｃ　ＮＡ　ｅ！！−Ｌ Ｌ　ｇａ　ＩＬトムｇ　ｌ　ｕ）↑α１２ ｔｏｅ ＊外科（院内）感染 ＊カテーテル関連性感染 ３、抗腫瘍剤 ＊硬結性腫瘍転移 α２−３　β１３ （例えば、ＮＡＮ→ｇａｌ−一→ｇｌ山ｃ　Ｌ旦Ｌｇ　ａ　ｌ　）↑α１−４ ｔｏｅ ４、抗炎症剤 ＊好中球・血小板相互作用 ＩＷＢＣ内皮相互作用 ５、海上牽引感緩和剤 本船体動揺感 ６、避妊薬 （例えば、ｇ　ｌ　ｅＮＡｃａ　ｇａ　ｌ−Ｃｇ　ｌ　ｃＮＡｃ二ｇ　ａ　ｌｌ ±」〉）［−６ ＊泡状およびゼリー状成分 ７、抗ウィルス剤 ＊ヘルペス ＊インフルエンザ ＊ＨＩＶ ８、抗真菌剤および抗酵母剤 ＊経口および膣性カンジダ症（例えば、グルコマンナン複合体、Ｌ−ＲＨＡＭ、 　Ｄ−Ｇａｌ含有、ａ　−Ｄ−ＶＡＮ　（Ｌ−６１ｎ分枝ａ　−（ｔ−２）Ｄ− Ｇｌｃ、±−Ｐ−０−ｓｕｇａｔ　）書 ＊アクチノミセテス ９、食品添加物 （例えば、トラガント壷ゴム、ａ　−Ｄ−ＧＡ　ＩＡｐ　（１−４）　ｎ↑ Ｄ−Ｘ７１　ｐ ±ａ−Ｌ−Ｆｕｃｐ又は±β−Ｄ−Ｇｉｌｐ　）＊乳化剤 ＊増粘剤 （例えば、カラゲナン（族）、 ［Ｄ−Ｇｚｌｐα−（１−３）Ｄ−Ｇａｌｌ）β−（１−４）コ　）ｎ Ｉ ６または２ＳＯ２−３Ｏ４ または　または ３、６−ａｎｈ７ｄｒｏ　２．６−ＤｉＳＯ４１０、獣医用剤 ＊抗菌剤 ＊抗ウィルス剤 ＊抗真菌剤 ＊抗炎症剤 上記から、本発明は、本発明に従って調製されたサツカライド組成を含む、医薬 組成物、食品組成物のようなその他の組成を与える。本発明によって与えられる 医薬組成物・食品組成物のいずれにおいても、本発明のサツカライド組成は、１ ０’μｇ／ｍｌから１００　ｍｇ／ｍｌの量として存在する。

何かある特定の医薬組成物または食品組成物におけるサツカライド組成の濃度は 、使用するサツカライドの活性という点から見ると様々であろう。医薬組成物の 場合、その組成の中のサツカライドの濃度は、何かの組成にたいして、インビト ロで測定した活性に依存するであろう。食品組成物について言えば、本発明のサ ツカライド組成の濃度は、添加する化合物の既知の活性に従って決めることがで きる。

例えば、母乳は、上記のように、幼児のためにも、尿路感染を防ぐ抗菌剤として も有効であるようなサツカライド組成を含んでいる。これを踏まえて、本発明は 、市販の幼児用処方に改良を加えたものである。すなわち、これら市販の幼児用 処方に、上記のサツカライド組成を添加することによってそれを実現した。上記 の、特定のサツカライドを、市販の幼児処方に、０．１μｇ／ｍｌから１０００ μｇ／ｍ　ｌの量加えてもよい。このサツカライドは、母乳には、およそ１０μ ｇ／ｍ　ｌの濃度で存在する。

医薬組成物には、発熱性物質があってはならない。本発明に一致する医薬組成物 は、その分野に既知のやり方で調製し、経口、静注、筋注、直腸、経皮、経鼻孔 （例えば、鼻粉霧）投与に適するようにしてもよい。それはまた、クリーム、塗 り薬、懸濁液等の形で、局所投与にふされしいように調製してもよい。

ユニのサツカライドは、従来、食品、繊維、石油化学における一般化学薬品とし ても、主に医学領域における特殊化学薬品としても、重要なものと注目されてき たが、これまで、サツカライド組成を調製するための効率的方法が無かったため に、サツカライド組成を、活性成分として含む市販組成を得ることはできなかっ た。

本発明は、そのようなサツカライド組成を、初めて、簡単に大量に入手すること を可能にした。本発明の方法を用いれば、これまでほんの小量しか入手できなか ったサツカライド組成が、また、これまで入手出来なかったサツカライド組成が 、グラムないしキログラム量で簡単に生産できる。本発明によって与えられるサ ツカライド組成の純度は、９５重量％を越える。ある種の、高純度を要求する応 用では、本発明の方法を用いて、９８重量％からほとんど１００重量％に近い純 度のサツカライド組成を得ることも可能である。

したがって、本発明は、今や、サツカライド組成を有効量含む医薬組成物ならび に他の組成物を初めて供給することになる。

本発明は、本発明に従って生産されるサツカライド組成を、少なくとも１００　 ｍｇ　、できれば少なくとも５００　ｍｇの量として、かつ、それを、その組成 の９５重量％まで含む組成物を供給する。

もう一つの実施例として、本発明は、本発明に従って使用するのに適当な装置を 与える。これは、グリコジルトランスフェラーゼ触媒による、サツカライド組成 の合成に用いられるものである。そのような装置の模式形態を、第１．２．３図 に示す。

ある、きわめて基本的な実施例をあげると、本発明の装置は、一つの反応室を持 つ。この中で、全部のグリコジルトランスフェラーゼ、あらかじめ選んだサツカ ライド・ユニットと最初の受容体部分のすべてを結合させる。グリコジルトラン スフェラーゼの特異性によって、この混合物は、十分な時間を与えれば、本発明 のサツカライド組成を生産する。

第１．２．３図は、本発明にしたがって用いることのできる、効率的設計の装置 を図示している。図に示した装置は、その基本要素として、入口、出口を備えた 反応器を含む。この反応器は、複数の、あらかじめ選んだサツカライド・ユニッ トを、受容体部分上に、連続的に共有結合させていき、それを、その共有結合の 各々に特異的な、複数の、相応のグリコジルトランスフェラーゼの触媒の下に行 なう、そのような結合反応の実施に適している。これは、少なくとも３個の、望 ましくは、４個の、さらに望ましくは、４個を越える数の、例えば、５．６．７ 個以上の、異なるグリコジルトランスフェラーゼを含み、かつ、これら酵素は望 ましくは固定されている。

人口機構は、受容体部分と、複数の、あらかじめ選んだサツカライド・ユニット とを、反応器内に導入し、サツカライド組成が合成されるよう、ふされしく出来 ているものである。できれば、入口機構は、反応器内に、グリコジルトランスフ ェラーゼを導入するのにもふされしくできており、かつ、グリコジルトランスフ ェラーゼ自体はできれば固定されていることが望ましい。出口機構は、サツカラ イド組成を、反応器から放出させるためのものである。

第１図は、固相支持質を負荷した、カラム型反応器を示す。

本工程に使用される、異なるグリコジルトランスフェラーゼ（酵素１．２．３） を、その固相支持体全体にランダムに分布させても、または、第１図に示すよう に数層に配置してもよい。

最初の受容体部分（図のＡ）と、あらかじめ選んだサツカライド・ユニット（図 の、Ｂ、Ｃ，Ｄ）とを、入口機構から、反応器内に負荷し、固相の支持体を通過 させる。この支持体上で、サツカライド組成が、特異的グリコジルトランスフェ ラーゼの活動により生産され、出口機構から、分子＾−〇−Ｃ−Ｄとして回収さ れる。

第２図に示した実施例では、最初の受容体部分と、その最初の受容体部分に付着 させるべき、あらかじめ選んだサツカライド・ユニットとを、固相支持体の頂上 に負荷し、選択された各サツカライド・ユニットの添加に特異的なグリコジルト ランスフェラーゼを、反応混合物の流れの方向にそって、対応する層に配置する 。次に、あらかじめ選んだ、異なるサツカライドを、図に示すように、反応混合 物の流れに沿って、対応的に適当する位置に、それぞれに添加する。

もう一つの好ましい実施例では、これは、第３図に示されているが、反応器は、 直列に接続した、複数（ｎ）の反応層から成る。この接続は、相互の、連続的流 体連絡を可能にするように行なわれており、また、ここに、（ｎ）は、付着させ るサツカライド・ユニットの数より多くはない、そのような数にほぼ相当する。

各反応層は、あらかじめ選んだ、特定のサツカライド・ユニットを、前段の反応 層で形成された中間産物に結合させるのに特異的触媒として働く、少なくとも１ 個のグリコジルトランスフェラーゼを含んでいる。

本実施例に従えば、最初の受容体部分（Ａ）と、その受容体部分に付着させるべ き、あらかじめ選ばれた、最初のサツカライド・ユニット（Ｂ）を、最初の反応 層を通過させるが、この反応層は、あらかじめ選ばれた、最初のサツカライド・ ユニットを、最初の受容体部分に結合させるのに特異的触媒として働くグリコジ ルトランスフェラーゼを含んでおり、これにより、最初の中間産物が生産される 。次に、この最初の中間産物は、第２の反応層（ｎ＝１）に転送され、ここで、 あらかじめ選ばれた第２のサツカライド・ユニット（Ｘ　）、および、あらかし め選ばれた第２のサツカライド・ユニットを、形成された第１の中間産物に結合 させるのに特異的触媒として働くグリコジルトランスフェラーゼ（Ｅｌ、Ｉｌ） とに、結合させられる。この工程を、Ａ−Ｂ−・・・・・・（Ｘ）　・・・・・ ・２と書かれている標的サラ＝ｎ カライド組成が得られるまで、反応層の相当する数だけ繰り返す。ここに、各Ｘ 部分は、独立に選択されるものとする。

もう一つの好ましい実施例では、これも、第３図に描かれているが、各中間産物 ４を精製する機構が、各反応層間の、流体連絡路に位置している。この中間産物 は、ある任意の反応層から放出される反応混合物から形成されるものである。こ の精製機構は、反応混合物中の汚染物を除去するもので、この汚染物は、あらか じめ選ばれた、次段のサツカライド・ユニットを、形成された中間産物に結合さ せる効率を邪げるものである。

本発明の、これ以外の、目的、長所、新しい特質は、下記の実施例を調べれば、 この分野に熟練した人々にとっては明かであろう。ただし、この実施例は、限定 的な意図を持つものではない。

実施例１．トリサツカライドＮ−アセチルニューラミニルα２−３ガラクトシル β１−４Ｎ−アセチルグルコサミンの調製５本の試験管の各々に、ｐＨ７，４の 燐酸カルシウム・バッファー、１０μ＋、　５０ＭＭ　ＭｎＣｌ２．１０μｍ　 、シチジン１燐酸−［１４Ｃ］−Ｎ−アセチルニューラミン酸、１７．　ＯＯＯ ＣＰＭ　、ガラクトシル・トランスフェラーゼ、２５μｌ、Ｎ−アセチルニュー ラミニル・トランスフェラーゼ、２５μｍを加えた。グリコジル・トランスフェ ラーゼは、牛初乳から、セファデックスＧ−１００ゲル・クロマトグラフィーに よって精製した。

試験管１に、さらに、４ｈｍのウリジンニ燐酸ガラクトース、１０μｌ　、４０ ｍＭＮ−アセチルグルコサミン、ＩＯμｌを加えた。試験管１を、水中で、１時 間インキュベートした。

試験管２にも、４０ｍＭのウリジンニ燐酸ガラクトース、１０μｍを加えた。試 験管２を３７℃で、１時間インキュベートした。

試験管３にも、４０１のＮ−アセチルラクトザミン、１０μ！を加えた。試験管 ３を、３７℃で１時間インキュベートした。

試験管４と５に、４０ｍＭのウリジンニ燐酸ガラクトース、１０μｍと、４０μ ｍＭのＮ−アセチルグルコサミン、１０μｍを加えた。

試験管４と５を、３７℃で１時間インキュベートした。

インキュベーション後、試験管の内容を、各々、４ホウ酸ナトリウムで飽和させ たペーパー上で、高圧の電気原簿にかけた。

等位置に標識したトリサツカライド産物は、その移動性によって特定した。これ は、試験管３に形成された精製物で示される通りである。

試験管　トリサツカライド（ｃｐｍ　）これで分かるように、試験管４．５中に 、適当な受容体部分、供与体部分、グリコジルトランスフェラーゼのあることが 、モノサッカライド開始物質から、予想通りのトリサツカライド産物を生成した 。通常、シアル酸Ｎ−アセチルニューラミン酸は、これを、サツカライド組成に 組み込もうとする有機合成化学者にとって、特殊な問題を形成することになる。

これは、そのグリコシド結合が、酸にたいして脆弱であることから発生する。

シチジン１燐酸Ｎ−アセチルニューラミン酸からトリサツカライドを酵素的に合 成すれば、強い酸性条件下で、保護基を除去することに伴う合成上の問題を取り 除くことができる。

受容体部分（Ｎ−アセチルグルコサミン）は、最初、供与体部分（ウリジンニ燐 酸ガラクトース）、グルコシル・トランスフェラーゼ（ガラクトシル・トランス フェラーゼ）と接触し、サツカライド組成（ガラクトシルβ　１−４　Ｎ−アセ チルグルコサミン）を形成し、これが、次に、第二の供与体部分（シチジン１燐 酸Ｎ−アセチルニューラミン酸）と第二のグリコジル・トランスフェラーゼ（Ｎ −アセチルニューラミニル−トランスフェラーゼ）との接触時には、受容体部分 として働（と、考えられている。

試験管４・５においては、モノサッカライド開始物質から、トリサツカライド産 物を合成したのであるが、このことは、試験管３の産物との比較から確かめられ た。すなわち、試験管３においては、トリサツカライドは、ジサッカライド受容 体部分（Ｎ−アセチルラクトサミン）を、シチヂン１燐酸Ｎ−アセチルニューラ ミニン酸、および、Ｎ−アセチルニューラミニル会トランスフェラーゼに接触さ せて形成した。

試験管２にはトリサツカライドが存在しなかったが、これは、トリサツカライド 形成には、適当な受容体部分が必要であることを示している。試験管１にはトリ サツカライドが存在しなかったが、これは、トリサツカライドの合成は、実際に 、何らかの酵素（グリコジル・トランスフェラーゼ）の活性に依存していること を示している。すなわち、この酵素が低温で不活性であったわけである。

オリゴサツカライド、Ｎ−アセチルガラクトサミニル　α　１−３（フコシル　 α　ｌ−２）　、ガラクトシル　β　１−４Ｎ−アセチルグルコサミニル　β１ −３ガラクトース（下痢誘発性細菌にたいする標的）、および、Ｎ−アセチルガ ラクトサミニル　β１−４ガラクトシル　β１−４グルコース（肺炎誘発性細菌 にたいする標的）も、本発明の工程を用いて、同様に調製できると期待されてい る。

実施例２．テトラサツカライド生合成プロトコル酵素−−Ｎ−アセチルグルコサ ミニル・トランスフェラーゼヒト初乳を、ｖｏ、　ｏｏｏｘ　ｃで、１時間遠心 する。２５％飽和硫酸アンモニウム分画で上清を生じ、これを透析して、硫酸ア ンモニウムを除去する。残留物を、セファデックスＧ−２００カラムに注ぐ。蛋 白スペクトラムは、２８０　ｎｍで、分光学的に測定し、放射能測定を行い、ト ランスフェラーゼ活性を持つ分画の位置を特定する。単一酵素ピークを含む分画 をプールし、＾ｍ１ｃｏｎろ過により１０倍に濃縮する。プールした酵素標本を 再び測定する。蛋白の濃度は、ＢｉｏＲａｄ法を用いて定量する。この標本の比 活性は、１μｇ蛋白、１分当り　５．３　ｐＭｏｌｅである。

ガラクトシル・トランスフェラーゼ ヒト初乳を、８．７００１Ｇで、１５分遠心する。上溝を、チーズ布で濾し、ｌ （１ｍｌをセファデックスＧ−１００カラム（２，５Ｘ　９Ｇｃｍ）に注ぐ。蛋 白スペクトラムは、２８Ｇｎｏ＋で、分光学的に測定し、放射能測定を行い、酵 素活性を持つ分画の位置を特定する。最高の活性を持つ分画をプールし、八ｍ１ ｃｏｎろ過により１０倍に濃縮する。プールされた酵素標本は、再び、測定し、 その蛋白濃度を、上記のように定量する。標本の比活性は、１μｇ蛋白、１分当 り　１５．４　ｐＭｏｌｅである。

酵素固定−Ｎ−アセチルグルコサミニル・トランスフェラーゼ３０θＩ１ｇのＥ ｕｐｃｔｇｉｊビーズ（１，２ｍ１）を、脱イオン水で、三回洗浄し、次に、消 毒Ｈｅｐｅｓバッファー水で、３回、洗浄する。

酵素標本の１ｍｌを、ＵＤＰ、ラクトース、ＭｎＣｌ２（最終濃度はそれぞれ、 １０．２５．　１０ｍＭ）　、−滴のクロロフォルムとと共に、Ｈｅｐｅｓバッ ファー溶液中で、ビーズと結合させる。ビーズを、４℃で、２１／２日静かに撹 拌する。分液を採取し、定期的に測定する。誘導化を防ぐために、ビーズを、無 菌のバッファーで３回洗浄し、ＵＤＰ、ラクトース、ＭＩＩＣ１２、クロロフォ ルムを含むバッファー中に、冷却保存する。

ガラクトシル・トランスフェラーゼ ３．７５ｇのビーズを、脱イオン水で、３回洗浄し、次に、無菌の、１ｅｐｅｓ 緩衝水で、３回洗浄する。このビーズを、各３ｍｌの酵素標本液に（いずれの場 合も、至適誘導条件は、２００　ｍｇのビーズにたいして蛋白的１ｍｇの時に起 こる）、ＵＤＰ、　ＧＩｃＮＡｃ。

ＭｎＣｌ２（最終濃度はすべてｌ０ｍＭ　）や、１滴のクロロフォルムと一緒に 、Ｈｅｐｅｓ緩衝液中で与えた。誘導化と保存は、上記の通りである。ただし、 ＧｌｃＮａｃは、ラフ！・−スでなく、ガラクトシル・トランスフェラーゼと共 に用いる。これは、Ｎ−アセチルグルコサミニル・トランスフェラーゼにたいす る受容体である。

テトラサツカライド生産 誘導化されたＮ−アセチルグルコサミニル・トランスフェラーゼ（０，５ｍｌ　 ビーズ）を、ラクトース（２５ｍＭ）、ＵＤＰＧＩｃＮＡｃ（８０μＭ　）　、 ＭｎＣＭｎＣ１２（１０と共に、２１時間、絶えず撹拌しながら、インキュベー トする。このインキュベーションを２重に行なう。片方のインキュベーションに よる上清は、トリサツカライド（１４μｇ）の生成量を測定するのに用いられ、 もう一方のインキュベーションによる上清は、ガラクトシル・トランスフェラー ゼによって誘導された０、　５ｍｌビーズに加えられる。

したがって、このガラクトシル・トランスフェラーゼ・インキュベーション物は 、１４μｇのトリサツカライド、２５μｇのＵＤＰｇｉｌ、１０１のＭｎＣｌ２ を含む。室温で２４時間置くと、第二の酵素標本は、約１．６μｇのテトラサツ カライドを生成した。３１時間後では、２．２μｇのテトラサツカライドが生産 された。

実施例３ 下記の処方は、３種の、比較的複雑なオリゴサツカライドを合成するのに用いる ことができよう。すなわち、Ａ、Ｂ型ミルク・オリゴサツカライド（１，ＴＩ） とトラガカント・ゴムであって、後者は、食品添加物として、トン単位で使用さ れる植物性オリゴサツカライドである。

（１）　ｇａｌＮＡｆ：ａｌ、　→（ｆｌＩｃａｌ、２→）ｇａｌβ１．　３→ （Ｉｕｃα１．　４→）ＧｌｅＮＡｃβ１．　３→ｇａｌβｌ、４→ｇｌｃ最初 に、ＣＮＢ＋活性支持体、例えば、セファローズに付着させるグルコースの、ヘ キサノラミン・グルコシド（ｇｌｃ−０１ＣＨ２）６−Ｎ１（２）を、ヘキサノ ラミンのアミノ基を介して合成する。

次に、グルコース認識性のガラクトシル・トランスフェラーゼを、このアフィニ ティー・リガンドを用いて、ヒトのミルクないし初乳から精製する。この酵素は 、一部でも精製すれば、グルコースをガラクトース化するのに使用することがで き、ラクトースを生成する。

別のやり方としては、ラクトースのヘキサノラミン・グリコシドを合成する。こ れは、安価で、簡単に手にはいるジサッカライドである。このようにして生成さ れたラクトースを、セファローズに付着させ、アフィニティー・リガンドとして 用いる。

次に、これを用いて、ヒト初乳、ないし、ヒト血漿由来の、Ｎ−アセチルグルコ サミニル・トランスフェラーゼを一部精製する。

次に、この第２のトランスフェラーゼを用いて、Ｎ−アセチルグルコサミンをラ クトースに加え、トリサツカライドを生成し、これを、再び、セファローズに付 着させる。この、結合したトリサツカライドを用いて、β１．３　ガラクトシル ・トランスフェラーゼ（ブタ顎下腺由来）を得、これが、次に、次段の酵素−一 α１．４フコシル・トランスフェラーゼ（ブタ肝臓由来）を生成する基質を生産 する。α１，２　フコシル・トランスフェラーゼ（ブタ顎下腺由来）、および、 最後に、Ａ型ミルク・オリゴサツカライドの合成を停止させる、α１，３Ｎ−ア セチルガラクトサミニル・トランスフェラーゼ（ブタ顎下腺由来）を、この段階 法により、アフィニティー・クロマトによって生成する。このようにして得られ た各トランスフェラーゼは、いくつかの手段の内のいずれかを用いて、固相基質 に固定し、この基質を、カラム型に注ぐ。

酵素含有カラムを順々に、誘導される基質の合成が次第に小量になっていく順序 に使用し、各溶解性オリゴサツカライドを大量に合成する。これよりさらに単調 な別法として、各酵素を順番に用いて、その産物の小量を合成し、次に、これを 、ヘキサノラミン・リンカ−を用いて、セファローズに固定するやり方がある。

この別法では、ヘキサノラミン・リンカ−を、６種の化合物に付着させ、誘導化 を、６種のヘキサノラミン含有グリコシドによって行なうことが必要となろう。

この方法では、ただ、ヘキサノラミン１段階と、グルコース−ヘキサノラミンか らセファローズへの１誘導化しか必要でなく、シかも、後者は、比較的込み入っ たところのない過程である。

糠付着の順番は重要である。近位フコース（α１．４をｇｌｃＮ＾ｃ１に付着さ せる）は、第２のフコース（α１．２をガラクトースに付着させる）の添加の前 に、反応を完了した、中核テトラサツカライドに付着させなければならない。最 後に、末端ｇａｌＮＡｃ（α１．３）を加えて、７糖オリゴサツカライドを完了 する。この順番は、グリコジル・トランスフェラーゼの特異性から要求されるも のである。

（Ｉｔ）　ｇ＊ｌαｌ、３　→（）ｕｃα１．　２→）ｇａｌβ１．　３−”（ Ｉｕｃａｌ、４→）ＧｌｃＮＡｃβ１，３→ｇａｌβ１．　４→ｇｌｃ■を合成 したならば、ＩＩも厳密に同様にして合成する。ただし、ヘキササツカライドを 用いる。これは、第一に、Ｎ−アセチルガラクトシル・トランスフェラーゼでは なく、ガラクトシル・トランスフェラーゼにたいする保護基を持って誘導される α１，３ガラクトシル・トランスフェラーゼを精製するのに用いられる。つぎに 、この酵素を用いて、Ｂ型オリゴサツカライドを合成する。

（ＩＩＩ）　Ｅ−−−−−−（Ｉｕｃａｌ、３→ｘＴＬβ１．　３→）ｇａｌＡ ａ　１．４　−”　（ｇａ　ｌ、　β１．４　→ｕｌβ１．　３→）ｇａｌＡ　 ・・−−−・コトラガカント轡ゴムのα１，４ガラクツロン酸幹鎖、これは、最 近では、わずかに、中東に土着するある樹種の皮から入手することができるもの であるが、これを合成する酵素を単離するには、ヘキサガラクツロナンスを、柑 橘類果皮の一般的な成分であるペクチンから調製し、これを、アフィニティー・ クロマトのリガンドとして用いる。

同じアフィニティー・リガンドを、樹種に用いて、次には、近位β１，３キシロ シドを合成するキシロシル・トランスフェラーゼを単離することができる。キシ ロシル化したガラクツロン酸は、一旦誘導されると、フコシル・トランスフェラ ーゼ、ガラクトシル・トランスフェラーゼの単離に用いることができる。後者は それぞれ、キシロシル化したガラクツロン酸コシル化、ガラクトシル化する。こ のオリゴサツカライドの場合、キシロシル化、フコシル化、ガラクトシル化の度 合は、経験的に、これら化合物が、対応する酵素含有カラムを通過するその回数 でコントロールされる。生成される繰り返しユニットの数は、最初に用いられる ガラクツロン酸の数に依存し、この数は、長さにして、４から２０モノサツカラ イド・ユニットの間に渡る。

＊＊＊＊＊ 上記の開示事項に照らして、本発明については、多数の修飾、変更が可能である ことは明かである。従って、付属の請求項の範囲内においても、本発明は、ここ に特に記載したものとは別のやり方で実行することもできるということは了解さ れる筈である。

ＦＩＣ：、３ サツカライド組成、その合成法と装置 要　約 サツカライド組成の調製法を開示した。この方法は、反復的で、下記の３段階か ら成る。

（ｉ）あらかじめ選んだサツカライド・ユニットを受容体部分に移送することの できるグリコジルトランスフェラーゼを単離するが、この単離は、この受容体部 分を、このグリコジルトランスフェラーゼを含むと予測される混合物と、この受 容体部分とこのグリコジルトランスフェラーゼとの結合を実現させる条件下で、 接触させて行い、これによって、グリコジルトランスフェラーゼを単離する。受 容体部分は、蛋白、糖蛋白、脂質、糖脂質、ないし、炭水化物である。

（ｉ　ｉ）次に、単離されたグリコジルトランスフェラーゼを用いて、受容体部 分と、あらかじめ選んだサツカライド・ユニットとの間の結合を触媒する。

（ｉ　ｉ　ｉ）段階（ｉ）と（ｉ　ｉ）を複数回繰り返し、この時、この方法の 第１回工程で得られた中間産物を、第２回工程の受容体部分として用いる。

国際調査報告 １・・＝＝藺・ｙｍ−＝−・−Ｉ＋＝、Ｐｅｒ／ＵＳ９１１０２４３０１・・・ ・Ｉ＋・・・已・・ｅ山（・−・・・ＰＣＴ／ＵＳ９１．１０２４３０ＰＣＴ／ ＬＩＳ９１１０２４３０ Ｌ　Ｃｌａｉｍｓ　１−２７　ａｎｄ　３４−３８　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｐ ｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｍａｋｉｎｇ、ａｐｒｏｄｕｃｔ　ａｎｄ　ａｎ　ａｐｐ ａｒａｔｕｓ　ｃｌａｓｓｉｆｉａｂｌｅ　ｉｎ　Ｃ１ａｓｓ　４３５゜５ｕｂ ｃｌａｓｓ　９７゜ ）ＬＣ１ａｉｍ２Ｂ、ｄｒａｗｎｔｏａｃｏｍｐｏｅｉｔｊｏｎｃｌａｓｓｉｆ ｉａｂｌｅｉｎＣ１ａｓｓ５１４、５ｕｂｃｌａｓｓ　６１゜ ＨＴ、　Ｃｌａｉｍ　２９．ｄｒａＷｎ　ｔｏ　ａ　ＣＯｍｐｎ８ｉｔｉＯｎ　 ｃ）ａｓｅｉｆｉａｂｌｅ　ｉｎ　Ｃ１５ｒ４ｔ４４２４．５ｕｂｃｌａｓｓ　 ５４゜ 工ｖ、　Ｃｌａｉｍ　３０．ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　 ｃｌａｓ＋５ｉｆｉａｂｌ＋ｑ　ｉｎ　Ｃ１ａｓｓ５１４．５ｕｂｃｌａｓｓ　 ５ＢＲ。

ｖ、　Ｃｌａｉｍ　３１．　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　 ｃｌａｓ＋５ｉｆｉａｂｌｅ　ｉｎ　（＋１ａｐｓ５１４、ａｕｂｃｌａｓｓ　 ２３゜ ＶＬ　Ｃｌａｉｍ　３２．　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｆｏｏｄ　ｃｏｍｐｏｓｉ ｔｉｏｎ　ｃｌａｓｓｉｆｉａｂｌｅ　１ｎＣ１ａｓｓ　４２６．　５ｕｂｃｌ ａｎｎ　５３ユ＋。

ＶＩｌ、　Ｃｌａｉｍ　３３．ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｆｏｏｄ　ｃｏｍｐｏｓ ｉｔ、ｉｏｎ　ｃｌａｓｓｉｆｉａｂｌｅ　１ｎＣ１ａｓｓ　４２６．　５ｕｂ ｃｌａｓｓ　５３１＋。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．あらかじめ選んだサッカライド・ユニットを、受容体部分に連続的に結合さ せることによる、グリコシルトランスフェラーゼ触媒による、サッカライド組成 の調製法であって、次の諸段階から成る方法： （ｉ）あらかじめ選んだサッカライド・ユニットを受容体部分に移送することの できる、グリコシルトランスフェラーゼを、受容体部分と、複数のグリコシルト ランスフェラーゼを含むと予想される混合物とを、上記受容体部分と上記グリコ シルトランスフェラーゼの結合を実現させるような条件下で接触させ、それによ って、上記グリコシルトランスフェラーゼを単離するすることによって調製し、 ここに、上記受容体部分は、蛋白類、糖蛋白類、脂質類、糖脂質類、炭水化物類 から選ばれた一つであり； （ｉｉ）上記あらかじめ選んだサッカライド・ユニットを、上記グリコシルトラ ンスフェラーゼ触媒の下で、上記受容体部分に結合させるのに十分な条件と共存 試薬を供給し、これにより、ある産物を得； （ｉｉｉ）段階（ｉ）、（ｉｉ）を複数回実施することで、それによって、任意 の一回工程における段階（ｉｉ）で得られた産物を、次回工程の段階（ｉ）の受 容体部分として使用し、これを、上記サッカライド組成が得られるまで繰り返す 。 ２．請求項１の方法であって、上記炭水化物が、モノサッカライド類、ジサッカ ライド類、オリゴサッカライド類、及びポリサッカライド類から成るグループか ら選ばれた一つである方法。 ３．請求項１の方法であって、段階（ｉｉ）で用いられるグリコシルトランスフ ェラーゼが、固相支持体に固定されている方法。 ４．請求項３の方法であって、固相支持体に付着された上記グリコシルトランス フェラーゼが、固定操作の間、上記グリコシルトランスフェラーゼの活性部位を 保護することによって得られたものである方法。 ５．請求項１の方法であって、上記共存試薬が、マンガン陽イオンを含む方法。 ６．請求項１の方法であって、段階（ｉｉ）で使用される上記サッカライドがサ ッカライド・ヌクレオチドである方法。 ７．請求項５の方法であって、上記ヌクレオチドが、ウリジン、グアノシン及び シチジン燐酸類から成るグループから選ばれた一つである方法。 ８．請求項１の方法であって、上記第一回工程で使用される上記受容体部分が、 蛋白類、糖蛋白類、脂質類及び糖脂質類から成るグループから選ばれた一つであ る方法。 ９．請求項１の方法であって、上記第一回工程で使用される上記受容体部分が、 モノサッカライド類、ジサッカライド類、オリゴサッカライド類及びポリサッカ ライド類から成るグループから選ばれた一つである方法。 １０．請求項１の方法であって、上記第一回工程で使用される上記受容体部分が 、Ｎ−アセチルグルコサミンである方法。 １１．請求項１の方法であって、上記第一回工程で使用される上記受容体部分が Ｎ−アセチルグルコサミンであり、上記第一回工程で使用される上記グリコシル トランスフェラーゼがガラクトシル・トランスフェラーゼであり、上記第２回工 程で使用される上記グリコシルトランスフェラーゼがＮ−アセチルニューラミニ ル・トランスフェラーゼである方法。 １２．請求項１の方法であって、上記第２回工程で使用される上記受容体部分が 、ガラクトシル　β１−４　Ｎ−アセチルグルコサミンである方法。 １３．請求項１の方法であって、使用される供与体部分の少なくとも１つが、シ チジン１燐酸Ｎ−アセチルニューラミン酸である方法。 １４．請求項１の方法であって、複数のグリコシルトランスフェラーゼを含むと 予想される上記混合物が、細胞ホモジェネートである方法。 １５．請求項１の方法であって、上記サッカライド組成が、下記の式の一つで表 わされる化合物である方法：（ｉ）▲数式、化学式、表等があります▼；（ｉｉ ）▲数式、化学式、表等があります▼；（ｉｉｉ）▲数式、化学式、表等があり ます▼；（ｉｖ）▲数式、化学式、表等があります▼；（ｖｉ）▲数式、化学式 、表等があります▼１６．医薬組成物であって、薬学的に受容できる付形剤また は搬送剤と共に、ヘパリン以外のサッカライド組成を含み、該サッカライド組成 は、あらかじめ選ばれたサッカライド・ユニットを、受容体部分へ、グリコシル トランスフェラーゼ触媒の下、連続的に結合させる方法によって調製されるもの で、その方法は、下記の諸段階から成る： （ｉ）あらかじめ選んだサッカライド・ユニットを受容体部分に移送することの できる、グリコシルトランスフェラーゼを、受容体部分と、複数のグリコシルト ランスフェラーゼを含むと予想される混合物とを、上記受容体部分と上記グリコ シルトランスフェラーゼの結合を実現させるような条件下で接触させ、それによ って、上記グリコシルトランスフェラーゼを単離するすることによって調製し、 ここに、上記受容体部分は、蛋白類、糖蛋白類、脂質類、糖脂質類、炭水化物類 から選ばれた一つであり； （ｉｉ）上記あらかじめ選んだサッカライド・ユニットを、上記グリコシルトラ ンスフェラーゼ触媒の下で、上記受容体部分に結合させるのに十分な条件と共存 試薬を供給し、これにより、ある産物を得； （ｉｉｉ）段階（ｉ）、（ｉｉ）を複数回実施することで、それによって、任意 の一回工程における段階（ｉｉ）で得られた産物を、次回工程の段階（ｉ）の受 容体部分として使用し、これを、上記サッカライド組成物が得られるまで繰り返 す。 １７．請求項１６の医薬組成物であって、少なくとも１００ｍｇの上記サッカラ イド組成を含む組成物。 １８．請求項１６の医薬組成物であって、少なくとも１ｇの上記サッカライド組 成を含む組成物。 １９．請求項１６の医薬組成物であって、上記第一回工程で使用される上記受容 体部分が蛋白である組成物。 ２０．請求項１６の医薬組成物であって、上記第一回工程で使用される上記受容 体部分が糖蛋白である組成物。 ２１．請求項１６の医薬組成物であって、上記第一回工程で使用される上記受容 体部分が脂質である組成物。 ２２．請求項１６の医薬組成物であって、上記第一回工程で使用される上記受容 体部分が糖脂質である組成物。 ２３．請求項１６の医薬組成物であって、上記第一回工程で使用される上記受容 体部分が炭水化物である組成物。 ２４．請求項１６の医薬組成物であって、上記第一回工程で使用される上記受容 体部分がモノサッカライドである組成物。 ２５．請求項１６の医薬組成物であって、上記第一回工程で使用される上記受容 体部分がジサッカライドである組成物。 ２６．請求項１６の医薬組成物であって、上記第一回工程で使用される上記受容 体部分がオリゴサッカライドである組成物。 ２７．請求項１６の医薬組成物であって、上記第一回工程で使用される上記受容 体部分がポリサッカライドである組成物。 ２８．肺炎の療法ないし治療に用いるのにふさわしい医薬組成物であって、下記 の式の化合物を有効量含み、▲数式、化学式、表等があります▼ かつ、薬学的に受容できる搬送剤ないし付形剤を伴っている組成物。 ２９．歯周囲疾患の療法ないし治療に用いるのにふさわしい医薬組成物であって 、下記の式の化合物を有効量含み、▲数式、化学式、表等があります▼ かつ、薬学的に受容できる搬送剤ないし付形剤を伴っている組成物。 ３０．硬結性腫瘍の療法ないし治療に用いるのにふさわしい医薬組成物であって 、下記の式の化合物を有効量含み、▲数式、化学式、表等があります▼； かつ、製薬的に受容できる搬送剤ないし付形剤を伴っている組成物。 ３１．避妊薬として用いるのにふさわしい医薬組成物であって、下記の式の化合 物を有効量含み、 ▲数式、化学式、表等があります▼ かつ、薬学的に受容できる搬送剤ないし付形剤を伴っている組成物。 ３２．トラガカント・ゴムまたはカラゲナン以外の、サッカライド組成を含む食 品であって、該サッカライド組成は、あらかじめ選んだサッカライド・ユニット を、受容体部分へ、グリコシルトランスフェラーゼ触媒の下、連続的に結合させ る方法によって調製されるもので、その方法は、下記の諸段階から成る： （ｉ）あらかじめ選んだサッカライド・ユニットを受容体部分に移送することの できる、グリコシルトランスフェラーゼを、受容体部分と、複数のグリコシルト ランスフェラーゼを含むと予想される混合物とを、上記受容体部分と上記グリコ シルトランスフェラーゼの結合を実現させるような条件下で接触させ、それによ って、上記グリコシルトランスフェラーゼを単離するすることによって調製し、 ここに、上記受容体部分は、蛋白類、糖蛋白類、脂質類、糖脂質類、炭水化物類 から選ばれた一つであり； （ｉｉ）上記あらかじめ選んだサッカライド・ユニットを、上記グリコシルトラ ンスフェラーゼ触媒の下で、上記受容体部分に結合させるのに十分な条件と共存 試薬を供給し、これにより、ある産物を得； （ｉｉｉ）段階（ｉ）、（ｉｉ）を複数回実施することで、それによって、任意 の一回工程における段階（ｉｉ）で得られた産物を、次回工程の段階（ｉ）の受 容体部分として使用し、これを、上記サッカライド組成物が得られるまで繰り返 す。 ３３．幼児食品において、０．１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの量の次式の化 合物を含む改良である該食品。 （ｉ）▲数式、化学式、表等があります▼３４．サッカライド組成の、グリコシ ルトランスフェラーゼ触媒による合成のための装置であって、反応器； 上記反応器における少なくとも４つの異なるグリコシルトランスフェラーゼ； 入口機構であって、受容体部分と、複数のあらかじめ選ばれたサッカライド・ユ ニットを、上記サッカライド組成が合成されるように上記反応器に導入するため のもの；出口機構であって、上記サッカライド組成を上記反応器から放出するた めのもの； から成り、ここに、上記受容体部分は、蛋白類、糖蛋白類、脂質類、糖脂質類及 び炭水化物類から成るグループから選ばれた、一つである前記装置。 ３５．請求項３４の装置であって、上記反応器が、相互に連続的に流体連絡を形 成するように、連続的に接続された複数の反応層から成り、ここに、各反応層は 、あらかじめ選んだサッカライド・ユニットを、前段反応層で形成された中間産 物に結合させるのに特異的な触媒として働くグリコシルトランスフェラーゼを含 む装置。 ３６．請求項３４の装置であって、上記反応層の各々において形成された中間産 物を、そこで生成された他の反応混合物より精製する手段が、流体連絡内で、上 記反応層それぞれの間にある装置。 ３７．請求項３４の装置であって、上記グリコシルトランスフェラーゼが固相支 持体上に固定されている装置。 ３８．請求項３７の装置であって、上記固相支持体の上に固定された上記グリコ シルトランスフェラーゼの活性部位が、固定操作の間保護されている装置。