CN1981044B - 包封干扰rna的脂质 - Google Patents

Abstract

本发明涉及将核酸-脂质颗粒递送，例如引入到细胞中的基于脂质的制剂，以及优化这些基于脂质的制剂的递送效率的测定法。所述核酸-脂质颗粒包括干扰RNA分子，具有超过一个不饱和位点的约10-约20个碳原子的烷基侧链的阳离子脂质，非阳离子脂质和抑制颗粒聚集的缀合的脂质诸如聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物或聚酰胺(ATTA)-缀合物。

Description

包封干扰RNA的脂质

对相关申请的交叉参考

本申请要求提交于2004年6月7日的美国临时专利申请号60/577,961，2004年6月7日的60/578,075，提交于2004年9月17日的60/610,746，和提交于2005年5月9日的60/679,427的权益，出于所有目的将其每个的全部内容特此并入作为参考。

发明领域

本发明涉及治疗性递送核酸的组合物和方法，其包含血清稳定性脂质递送载体，所述载体包封核酸从而在细胞或哺乳动物中提供有效的RNA干扰(RNAi)。更具体地，本发明涉及使用被包封在血清稳定性脂质颗粒中的小的干扰RNA(siRNA)，所述颗粒具有适合于全身性递送的小的直径。

发明背景

RNA干扰(RNAi)是进化上是保守的、由双链RNA(dsRNA)引发的序列特异性机制，所述双链RNA(dsRNA)诱导互补靶单链mRNA的降解并使相应的翻译序列“沉默”。(McManus和Sharp，Nature Rev.Genet.3：737(2002))。RNAi通过将更长的dsRNA链酶促裂解成约21-23个核苷酸长度的生物活性的“短干扰RNA”(siRNA)序列来发挥功能(Elbashir，et al.，GenesDev.15：188(2001))。

siRNA可以用于使目标基因产物的转录和翻译下调或沉默。例如，理想的是下调与肝疾病和病症诸如肝炎相关的基因。具体而言，理想的是下调与肝炎病毒感染和存活相关的基因。

有效和安全的核酸递送系统是对于治疗上有用的干扰RNA所必需的。病毒载体是相对有效的基因递送系统，但是遭遇到多种局限，诸如逆转成野生型的可能以及免疫应答问题。结果，非病毒基因递送系统正在受到越来越多的关注(Worgall，et al.，Human Gene Therapy 8：37(1997)；Peeters，et al.，Human Gene Therapy 7：1693-1699(1996)；Yei，et al.，Gene Therapy1：192(1994)；Hope，et al.，Molecular Membrane Biology 15：1(1998))。而且，病毒系统从循环中迅速被清除，限制到“初次通过(first-pass)”器官诸如肺、肝和脾中的转染。此外，这些系统诱导免疫应答，所述免疫应答损害通过连续注射的递送。

质粒DNA-阳离子脂质体复合物是目前最常使用的非病毒基因递送载体(Felgner，Scientific American 276：102(1997)；Chonn，et al.，Current Opinionin Biotechnology 6：698(1995))。例如，由两亲性化合物、中性脂质和去污剂组成以转染昆虫细胞的阳离子脂质体复合物公开于美国专利号6,458,382。阳离子脂质体复合物还公开于美国专利申请公开号2003/0073640。

阳离子脂质体复合物较大，系统很不确定，其不适于全身应用并可激发相当大的毒性副作用(Harrison，et al.，Biotechniques 19：816(1995)；Li，etal.，The Gene 4：891(1997)；Tam，et al，Gene Ther.7：18672000)).作为较大的带正电荷的团聚体，当被体内施用时，脂质体复合物(lipoplexes)被迅速清除，伴随在初次通过器官，特别是肺中观察到最高的表达水平(Huang，et al.，Nature Biotechnology 15：620(1997)；Templeton，et al.，NatureBiotechnology 15：647(1997)；Hofland，et al.，Pharmaceutical Research 14：742(1997))。

其它的脂质体递送系统包括，例如，反胶团、阴离子和聚合物脂质体的应用。反胶团公开于美国专利号6,429,200。阴离子脂质体公开于美国专利申请号2003/0026831。结合糊精或甘油-磷酸胆碱聚合物的聚合物脂质体分别公开于美国专利申请号2002/0081736和2003/0082103中。

用于全身性递送的包含包封的核酸的基因递送系统应该是小的(即，小于约100nm的直径)，并应该在延长的时期内，在循环中保持完整以实现递送到受影响的组织中。这需要高度稳定的，血清抗性的包含核酸的颗粒，其不与细胞和血管区室的其它成分相互作用。所述颗粒还容易地与疾病位点的靶细胞相互作用从而促进需要的核酸的细胞内递送。

最近的工作已经显示核酸可被包封在小的(约70nm直径)的“稳定的核酸-脂质颗粒”(SNALP)中，其由包封在双层脂质载体中的单一质粒组成(Wheeler，et al.Gene Therapy 6：271(1999))。这些SNALPs典型地包含“融合性的(fusogenic)”脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，低水平的阳离子脂质，并在存在聚(乙二醇)(PEG)包衣时在水性介质中是稳定的。SNALP具有全身应用，因为在静脉内(i.v.)注射后，它们显示延长的循环生存期，由于在这些区域中增加的血管通透性，它们优先聚集在远侧肿瘤位点，并可在这些肿瘤位点介导转基因表达。在i.v.注射包含萤光素酶标记基因的SPLP后，在肿瘤位点观察到的转基因表达的水平优于使用质粒DNA-阳离子脂质体复合物或裸DNA可获得的水平。

因此，本领域仍然强烈需要新的和更有效的方法和组合物来将核酸，诸如干扰RNA引入细胞中。此外，本领域需要通过下调与病毒感染和存活相关的基因来治疗或预防疾病诸如肝炎的方法。本发明解决这个和其它需求。

发明简述

本发明包括包封一个或多个干扰RNA分子的新的稳定的核酸-脂质颗粒(SNALP)，制备所述SNALPs的方法，和递送和/或施用所述SNALPs的方法。

在一个实施方案中，本发明提供包含干扰RNA和式I或II的并具有下列结构的阳离子脂质的核酸-脂质颗粒：

其中，R¹和R²独立地选自由H和C₁-C₃烷基组成的组；并且R³和R⁴独立地选自由具有约10-约20个碳原子的烷基基团组成的组，其中R³和R⁴至少其中之一包括至少两个不饱和位点.在优选的实施方案中，所述阳离子脂质选自1，2-二亚油基(dilinoleyl)氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)和1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA).在优选的实施方案中，干扰RNA分子被充分包封在核酸-脂质颗粒的脂双层中从而使在核酸-脂质颗粒中的核酸在水溶液中对于核酸酶的降解具有抗性.在优选的实施方案中，核酸颗粒对于哺乳动物是基本上无毒性的.所述核酸脂质颗粒还可以包含非阳离子脂质，双层稳定成分(即，阻止颗粒聚集的缀合的脂质，阳离子聚合物脂质，固醇(例如胆固醇))及其组合.

在一些实施方案中，干扰RNA是长度少于约60个核苷酸的小的干扰RNA分子，或长度大于约25个核苷酸的双链RNA。在一些实施方案中，所述干扰RNA转录自质粒，具体地包含靶序列的DNA模板的质粒。

在一个实施方案中，所述非阳离子脂质选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)，棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二棕榈酰磷酸乙醇胺(DMPE)，二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)，16-O-单甲基PE，16-O-二甲基PE，18-1-反式PE，1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)，固醇(例如胆固醇)及其混合物。

在一个实施方案中，抑制颗粒的聚集的缀合的脂质是聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物，聚酰胺(ATTA)-脂质缀合物，及其混合物中的一个或多个。在一个方面，所述PEG-脂质缀合物是PEG-二烷氧基丙基(DAA)，PEG-二酰基甘油(DAG)，PEG-磷脂，PEG-神经酰胺及其混合物的一个或多个。在一个方面，所述PEG-DAG缀合物是PEG-二月桂酰甘油(C₁₂)，PEG-二肉豆蔻酰甘油(C₁₄)，PEG-二棕榈酰甘油(C₁₆)，和PEG-二硬脂酰甘油(C₁₈)，的一个或多个。在一个方面，所述PEG-DAA缀合物是PEG-二月桂基氧基丙基(C₁₂)，PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(C₁₄)，PEG-二棕榈基氧基丙基(C₁₆)和PEG-二硬脂基氧基丙基(C₁₈)的一个或多个。

本发明的核酸-脂质颗粒用于治疗性递送包含干扰RNA序列的核酸。特别地，本发明的目标是提供通过使目标靶核酸序列的转录和翻译下调或沉默从而在哺乳动物中治疗疾病的体外和体内方法。在一些实施方案中，干扰RNA被配制在核酸-脂质颗粒中，并且将所述颗粒施用于需要这种治疗的患者中。在其它实施方案中，将细胞从患者中取出，体外递送干扰RNA，并再注射到患者体内。在一个实施方案中，本发明提供通过使细胞与核酸-脂质颗粒接触来将核酸引入细胞的方法，所述核酸-脂质颗粒包含阳离子脂质，非阳离子脂质，抑制聚集的缀合的脂质，和干扰RNA。

在一个实施方案中，至少约5％，10％，15％，20％，或25％的总注射剂量的核酸脂质颗粒在注射后约8，12，24，36，或48小时存在于血浆中。在其它实施方案中，超过20％，30％，40％和多至60％，70％或80％总注射剂量的核酸-脂质颗粒在注射后约8，12，24，36，或48小时存在于血浆中。在一个实施方案中，干扰RNA在肺、肝、肿瘤或炎症位点的细胞中的存在在施用后约8，12，24，36，48，60，72或96小时可检测到。在一个实施方案中，目标序列的表达的下调在施用后约8，12，24，36，48，60，72或96小时可检测到。在一个实施方案中，目标序列的表达的下调在肿瘤细胞或在炎症位点的细胞中优先发生。在一个实施方案中，干扰RNA在远离施用位点的位点的细胞中的存在在静脉内注射所述核酸-脂质颗粒后至少4天可检测到。在另一个实施方案中，干扰RNA在肺、肝或肿瘤的细胞中的存在在核酸-脂质颗粒的注射后至少4天可检测到。在另一个实施方案中，所述核酸-脂质颗粒肠胃外或腹膜内施用。

所述颗粒适合用于静脉内核酸转移，因为它们在循环中是稳定的，大小是药物动力学性质所需要的，导致了与血管外位点和靶细胞群的接近。本发明还提供包含核酸-脂质颗粒的药用组合物。

本发明的另一个实施方案提供体内递送干扰RNA的方法。将所述核酸-脂质颗粒施用(例如，静脉内地)给受试者(例如，哺乳动物诸如人)，所述核酸-脂质颗粒包含阳离子脂质、非阳离子脂质、抑制颗粒聚集的缀合的脂质，和干扰RNA。在一些实施方案中，本发明提供将干扰RNA体内递送给哺乳动物受试者的肝脏的方法。

本发明的另一个实施方案提供治疗哺乳动物受试者的疾病或病症的方法。将治疗有效量的核酸-脂质颗粒施用给哺乳动物受试者(例如，啮齿动物诸如小鼠，灵长类动物诸如人或猴)，所述核酸-脂质颗粒包含阳离子脂质、非阳离子脂质、抑制颗粒聚集的缀合脂质，和干扰RNA。在一些实施方案中，所述疾病或病症与基因的表达和/或过量表达相关并且基因的表达或过量表达被干扰RNA减少。

附图简述

图1举例说明本发明的两个示范性阳离子脂质的结构：1，2-二亚油基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)和1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)。

图2举例说明DLinDMA的合成路线。

图3举例说明DLenDMA的合成路线。

图4举例说明通过在DSPC∶胆固醇∶DODMA∶PEG-DMG脂质体中体外递送被包封的抗-β-半乳糖苷酶siRNA来下调在CT26.CL25细胞中β-半乳糖苷酶的表达。

图5举例说明用LUVs进行的清除率研究显示包含PEG-DAGs的SNALPs是可与包含PEG-神经酰胺C20的SNALPs相比较的。

图6举例说明包含PEG-DAGs的SNALPs的药物代谢动力学特性。

图7举例说明包含PEG-DAGs的SNALPs的生物分布特性。

图8举例说明在具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中，在IV施用包含PEG-神经酰胺C₂₀的SPLPs后24小时对比IV施用包含PEG-DAGs的SPLPs后24小时的萤光素酶基因的表达。

图9举例说明在具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中，在IV施用包含PEG-神经酰胺C₂₀的SPLPs后48小时对比IV施用包含PEG-DAGs的SPLPs后48小时的萤光素酶基因的表达。

图10举例说明在具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中，在IV施用包含PEG-神经酰胺C₂₀的SPLPs后72小时对比IV施用包含PEG-DAGs的SPLPs后72小时的萤光素酶基因的表达。

图11举例说明显示在静脉内施用包含PEG-DAA缀合物和PEG-DAG缀合物的SPLP后48小时在肿瘤中的萤光素酶基因表达的数据。

图12举例说明显示在静脉内施用包含PEG-DAA缀合物和PEG-DAG缀合物的SPLP后在肝、肺、脾、心脏和肿瘤中的萤光素酶基因表达的数据。

图13举例说明在施用SPLPs和SNALPs后在具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中的清除率研究的数据，所述SPLPs包括PEG-DAA缀合物并包含编码在CMV启动子控制下的萤光素酶的质粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗-萤光素酶siRNA。

图14举例说明在具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中，对SPLPs和SNALPs的药物代谢动力学特性研究的数据，所述SPLPs包括PEG-DAA缀合物并包含编码在CMV启动子控制下的萤光素酶的质粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗-萤光素酶siRNA。

图15举例说明在施用SPLPs，pSPLPs和SNALPs后在具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中的清除率研究的数据，所述SPLPs包括PEG-DAA缀合物或PEG-DAG缀合物并包含编码在CMV启动子控制下的萤光素酶的质粒，所述pSPLPs包含PEG-DAG缀合物并包含编码在CMV启动子控制下的萤光素酶的质粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗-萤光素酶siRNA。

图16举例说明在具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中对SPLPs，pSPLPs和SNALPs的药物代谢动力学特性的研究的数据，所述SPLPs包括PEG-DAA缀合物或PEG-DAG缀合物并包含编码在CMV启动子下的萤光素酶的质粒，所述pSPLPs包括PEG-DAG缀合物并包含编码在CMV启动子控制下的萤光素酶的质粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗萤光素酶siRNA。

图17举例说明体外数据，所述体外数据证明在用SPLPs和SNALPs处理的表达萤光素酶的细胞中的萤光素酶表达的沉默，所述SPLPs包括PEG-脂质缀合物并包含编码在CMV启动子的控制下萤光素酶的质粒，所述SNALPs包括PEG-脂质缀合物并包含抗萤光素酶siRNA。

图18举例说明体内数据，所述体内数据证明在用SPLPs和SNALPs处理的具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中的萤光素酶表达的沉默，所述SPLPs包括PEG-DAA缀合物并包含编码在CMV启动子的控制下的萤光素酶的质粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗萤光素酶siRNA。

图19举例说明体内数据，所述体内数据证明在用SPLPs和SNALPs处理的具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中的萤光素酶表达的沉默，所述SPLPs包括PEG-DAA缀合物并包含编码在CMV启动子的控制下的萤光素酶的质粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗萤光素酶siRNA。

图20举例说明体内数据，所述体内数据证明在用SPLPs和SNALPs处理的具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中的萤光素酶表达的沉默，所述SPLPs包括PEG-DAA缀合物并包含编码在CMV启动子的控制下的萤光素酶的质粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗萤光素酶siRNA。

图21举例说明体内数据，所述体内数据证明在用SPLPs和SNALPs处理的具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中的萤光素酶表达的沉默，所述SPLPs包括PEG-DAA缀合物并包含编码在CMV启动子的控制下的萤光素酶的质粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗萤光素酶siRNA。

图22举例说明体内数据，所述体内数据证明在用SPLPs和SNALPs处理的具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中的萤光素酶表达的沉默，所述SPLPs包括PEG-DAA缀合物并包含编码在CMV启动子的控制下的萤光素酶的质粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗萤光素酶siRNA。

图23举例说明这样的数据，所述数据显示将SPLP(即，SNALP)在体外转染稳定表达萤光素酶的Neuro2a细胞后基因表达的沉默，所述SPLP包含DODAC，DODMA，或DLinDMA并包封抗萤光素酶siRNA序列.

图24举例说明显示体外SNALP介导的基因沉默的数据。

图25举例说明显示在静脉内递送包封编码萤光素酶的质粒的SPLP后48小时，在肿瘤中萤光素酶基因表达的数据。所述SPLP包括PEG-C-DMA缀合物和DODMA或DLinDMA。所述PEG部分具有2000或750的分子量。

图26举例说明显示在静脉内施用包封编码萤光素酶的质粒的SPLP后48小时，在具有Neuro2A肿瘤的雄性A/J小鼠中萤光素酶基因表达的数据。所述SPLP包括各种百分比的(即15％，10％，5％或2.5％)的PEG-C-DMA和DODMA或DLinDMA。

图27举例说明这样的数据，所述数据显示在单一静脉内施用包含不同百分比(即2％，5％，10％，或15％)的PEG-C-DMA的³H-CHE-标记的SPLP或SNALP或空载小泡后，在雄性A/J小鼠的血浆中剩余的SPLP、SNALP或空载小泡的注射剂量的百分比。

图28举例说明这样的数据，所述数据显示在单一静脉内施用包含各种百分比的PEG-C-DMA的³H-CHE-标记的制剂后48小时，在携带Neuro-2A肿瘤的雄性A/J小鼠中，SPLP，SNALP或空载小泡的生物分布。所述SNALP和空载小泡包括DLinDMA。所述SPLP包括DODMA。

图29举例说明这样的数据，所述数据显示在静脉内施用包含DLinDMA的SNALP后48小时，在A/J小鼠中的远端、稳定的Neuro2A-G肿瘤中萤光素酶表达的沉默。

图30举例说明这样的数据，所述数据显示在递送包含DLinDMA和包封抗-萤光素酶siRNA的SNALP制剂后，在Neuro2A-G细胞中萤光素酶表达的沉默。

图31举例说明这样的数据，所述数据显示在递送包含DLinDMA和包封抗-萤光素酶的siRNA的SNALP制剂后，在Neuro2A-G细胞中的萤光素酶表达的沉默。在缺乏或存在氯喹的情况下进行SNALP制剂的递送。本发明的详细描述

介绍

本发明显示将短的干扰RNA(siRNA)分子包封在包含式I，II或其混合物的阳离子脂质的SNALPs中的未预期的成功。本文所述的SNALPs可以用于将siRNA递送到细胞中从而使目标靶序列沉默。可以将包含广泛范围浓度的任一种的另外的阳离子脂质，非阳离子脂质，和其它脂质的SNALP用于进行本发明。所述SNALP可以与来自任何来源的包含干扰RNA序列并包含任何多核苷酸序列的任何核酸一起制备，并可以使用许多方法中的任一种进行制备。

定义

术语“脂质”指一组有机化合物，其包括，但不限于脂肪酸的酯，并且特征是在水中不溶，但是在许多有机溶剂中是可溶的。通常将它们分成至少三类：(1)“简单的脂质”其包括脂肪和油以及蜡；(2)“化合物脂质”其包括磷脂和糖脂；(3)“衍生的脂质”诸如类固醇。

“脂质小泡”指可用于递送化合物的任何脂质组合物，其包括，但不限于，脂质体，其中水体积被两亲性脂双层所包封；或其中脂质包被包括大分子组分的内部，诸如包括干扰RNA序列的质粒，伴随减少的水性内部；或脂质团聚体或胶团，其中被包封的成分包含在相对混乱的脂质混合物中。

用于本文时，“包封的脂质”可指提供具有充分包封、部分包封或两者的化合物的脂质制剂.在一个优选的实施方案中，将所述核酸充分包封在脂质制剂中(例如形成SPLP，pSPLP，或其它SNALP).

用于本文时，术语“SNALP”指稳定的核酸脂质颗粒，包括SPLP。SNALP代表包被减少的水性内部的脂质的小泡，所述内部包括核酸(例如，ssDNA，dsDNA，ssRNA，microRNA(miRNA)，短发夹RNA(shRNA)，dsRNA，siRNA或质粒，包括自其中转录干扰RNA的质粒)。用于本文时，术语“SPLP”指包括被包封于脂质小泡中的核酸(例如，质粒)的核酸脂质颗粒。SNALPs和SPLPs典型地包含阳离子脂质，非阳离子脂质，和阻止所述颗粒聚集的脂质(例如，PEG-脂质缀合物)。SNALPs和SPLPs具有全身施用，因为它们在静脉内(i.v.)注射后显示延长的循环寿命，在远端位点(例如，在身体上与施用位点分隔的位点上聚集并且可以介导被转染的基因在这些远端位点的表达。SPLPs包括“pSPLP”，其包括如在WO 00/03683中提及的被包封的缩合剂-核酸复合物。

术语“形成小泡的脂质”倾向于包括任何具有疏水部分和极性头部基团的两亲性脂质并且其本身可以在水中自发形成双层小泡，示例为大多数磷脂。

术语“采用小泡的脂质”倾向于包括稳定与脂双层结合的任何两亲性脂质，以及其它的两亲性脂质，其疏水部分与内部，双层膜的疏水区域接触，并且其极性头部基团部分朝向外部，膜的极性表面。采用小泡的脂质包括这样的脂质，其能够独立地适宜于采用非层状的相，还能够在存在双层稳定组分时，采取双层结构。典型的实例是DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)。双层稳定组分包括，但不限于，抑制SNALPs聚集的缀合的脂质，聚酰胺低聚物(例如，ATTA-脂质衍生物)、肽、蛋白质、去污剂、脂质-衍生物、PEG-脂质衍生物诸如与二烷氧基丙基偶联的PEG、与二酰基甘油偶联的PEG、与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG，和与神经酰胺缀合的PEG，如美国专利号5,885,613所述。

术语“两亲性脂质”部分地指任何适合的材料，其中脂质材料的疏水部分朝向疏水相，而亲水部分朝向水相。两亲性脂质通常是脂质小泡的主要成分。亲水性质来自极性或带电基团诸如碳水化合物，磷酸盐(酯)，羧基、硫酸根合、氨基、巯基、硝基、羟基和其它类似基团的存在。疏水性可以通过包含非极性基团来赋予，所述非极性基团包括，但不限于，长链饱和和不饱和脂族烃基团和由一个或多个芳香族、脂环族或杂环基团取代的这样的基团。两亲性化合物的实例包括，但不限于，磷脂、氨脂质和鞘脂类。磷脂的代表性实例包括，但不限于，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱或二亚油酰磷脂酰胆碱。缺乏磷的其它化合物，诸如鞘磷脂、鞘糖脂家族、二酰基甘油和β-酰氧基酸也在被称为两亲性脂质的组中。另外，上述的两亲性脂质可与其它脂质混和，所述脂质包括甘油三酯和固醇。

术语“中性脂质”指在选定的pH以未带电荷或中性两性离子形式存在的许多脂质种类中的任何一种。在生理pH下，这样的脂质包括，例如，二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。

术语“非阳离子脂质”指如上所述的任何中性脂质以及阴离子脂质.非阳离子脂质包括，例如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)，棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二棕榈酰磷酸乙醇胺(DMPE)，二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)，16-O-单甲基PE，16-O-二甲基PE，18-1-反式PE和1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE).

术语“阴离子脂质”指在生理pH下带负电荷的任何脂质。这些脂质包括，但不限于，磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺，赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)，和其它与中性脂质连接的阴离子修饰基团。

术语“阳离子脂质”指在选定的pH，诸如生理pH下携带净正电荷的许多脂质种类中的任何一种。这些脂质包括，但不限于，1，2-二亚油基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)，1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)，N，N-二油基-N，N-氯化二甲铵(DODAC)；N-(2，3-二油基氧基)丙基)-N，N，N-氯化三甲铵(DOTMA)；N，N-二硬脂酰-N，N-溴化二甲铵(DDAB)；N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-氯化三甲铵(DOTAP)；3-(N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)和N-(1，2二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)。下列脂质是阳离子的并且在低于生理pH具有正电荷：DODAP，DODMA，DMDMA等。

术语“疏水脂质”指具有非极性基团的化合物，其包括，但不限于，长链饱和和不饱和脂族烃基团并且这些基团任选地被一个或多个芳香族、脂环族或杂环族基团所取代。合适的实例包括，但不限于，二酰基甘油、二烷基甘油、N-N-二烷基氨基、1，2-二酰氧基-3-氨基丙烷和1，2-二烷基-3-氨基丙烷。

术语“融合性的”指脂质体，SNALP或其它药物递送系统与细胞膜融合的能力。所述膜可以是质膜或围绕细胞器，例如内体、核等的膜。

术语“二酰基甘油”指具有2-脂肪酰基链的化合物，其R¹和R²都独立地具有通过酯键与甘油的1-和2-位置键合的2-30个碳原子。所述酰基基团可以是饱和的或具有不同程度的不饱和。二酰基甘油具有如下的通式：

术语“二烷氧基丙基”指具有2-烷基链的化合物，其R¹和R²都独立地具有2-30个碳。烷基基团可以是饱和的或具有不同程度的不饱和。二烷氧基丙基具有如下的通式：

术语“ATTA”或“聚酰胺”指，但不限于，在美国专利号6,320,017和6,586,559中公开的化合物.这些化合物包括具有如下式的化合物：

其中：R是选自由氢、烷基和酰基组成的组中的成员；R¹是选自由氢和烷基组成的组中的成员；或任选地，R和R¹和它们所结合的氮原子形成叠氮基部分；R²是选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的芳基和氨基酸侧链的组的成员；R³是选自由氢、卤素、羟基、烷氧基、巯基、肼基、氨基和NR⁴R⁵组成的组的成员，其中R⁴和R⁵独立地是氢或烷基；n是4-80；m是2-6；p是1-4；并且q是0或1。那些本领域技术人员将清楚的是其它聚酰胺可用在本发明的化合物中。

术语“多肽”，“肽”和蛋白质在本文交互使用来指氨基酸残基的聚合物。该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。用于本文时，术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质(即，抗原)，其中所述氨基酸残基通过共价肽键连接。

术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物，和以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥功能的氨基酸模拟物。术语“碱性氨基酸”指天然存在的氨基酸以及合成氨基酸和/或在选定的pH，诸如生理pH具有净正电荷的氨基酸模拟物。该组包括，但不限于，赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸等。天然存在的氨基酸是由遗传密码所编码的那些，以及在后来修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、α-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构，即与氢、羧基基团、氨基基团和R基团结合的碳，的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保持与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”指具有不同于氨基酸的通用化学结构的结构，但是以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥功能的化合物。

本文中的氨基酸可以通过由IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的公知的三字母符号或一字母符号来表示。同样地，核苷酸可以通过它们的公知的单字母密码表示。

术语“核酸”或“聚核酸”指包含至少两个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的以单或双链形式存在的聚合物。除非具体限制，该术语涵盖包含天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参照核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另外指出，具体的核酸序列还暗含涵盖其保守性修饰的变体(例如，简并密码子取代)，等位基因，直向同源物，SNPs和互补序列以及明确指出的序列。具体地，可通过产生序列来获得简并密码子取代，在所述序列中一个或多个选定(或所有)的密码子的第三个位置由混和的碱基和/或脱氧肌苷残基所取代(Batzer et al.，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka et al.，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Cassol et al.(1992)；Rossolini et al.，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994)).“核苷酸”包含糖脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA)，碱基，和磷酸基团.核苷酸通过磷酸基团连接在一起.“碱基”包括嘌呤和嘧啶，其进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷，和天然类似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括，但不限于取代新的反应基的修饰，所述反应基诸如，但不限于，胺、醇、硫醇、羧酸盐(酯)和卤代烷.DNA可以以反义、质粒DNA、质粒DNA的部分、预压缩的DNA、聚合酶链反应(PCR)的产物、载体(P1，PAC，BAC，YAC，人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些基团的衍生物存在.术语核酸与基因、cDNA、由基因编码的mRNA和干扰RNA分子可交互地使用.

“保守修饰的变体”应用于氨基酸和核酸序列。关于具体的核酸序列，“保守修饰的变体”指编码相同的或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或核酸不编码氨基酸序列时，指基本相同的序列。因为遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA，GCC，GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在其中丙氨酸被密码子指定的每个位点，所述密码子可以被改变为所述的相应密码子的任一个，而不改变编码的多肽。这些核酸改变是“沉默的改变”，其是保守性修饰的改变的一种。编码多肽的本文的每个核酸序列还描述了核酸的每个可能的沉默改变。本领域技术人员将认识到在核酸中的每个密码子(除了AUG，其一般仅是甲硫氨酸的密码子，和TGG，其一般仅是色氨酸的密码子)可以被修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默的改变隐含在每个描述的序列中。

术语“基因”指包括部分长度或全长的编码序列的核酸(例如，DNA或RNA)序列，所述编码序列是产生多肽或前体(例如，A，B，C，D，E，或G型肝炎病毒；或单纯疱疹病毒)所必需的。

用于本文时，“基因产物”指基因的产物，诸如RNA转录物。

术语“干扰RNA”或“RNAi”或“干扰RNA序列”指这样的双链RNA，其导致特异mRNAs的降解并且可以用于干扰来自需要的mRNA目标转录物的翻译。将长度约为15-30个核苷酸的短的RNAi称为“小的干扰RNA”或″siRNA″。一般将更长的RNAi称为“双链RNA”或“dsRNA”。转录dsRNA或siRNA(例如，如短发夹双链体)的DNA分子还提供RNAi。转录dsRNA的DNA分子还公开在美国专利号6,573,099，和在美国专利公开号20020160393和20030027783中。将转录siRNA的DNA的分子综述于Tuschl和Borkhardt，Molecular Interventions，2：158(2002)中。

所谓使基因或核酸“沉默”或“下调”倾向于指与在缺乏干扰RNA或其它核酸序列时检测到的正常水平相比，靶核酸序列，即被RNAi靶向的序列的转录和/或翻译的可检测的减少，或在靶序列或蛋白质的量或活性中的减少。可检测的减少可以小到约5％或10％，或大到约80％，90％或100％。更典型地，可检测到的减少是约20％，30％，40％，50％，60％，或70％。

用于本文时，术语“水溶液”指全部或部分包含水的组合物。

用于本文时，术语“有机脂质溶液”指全部或部分包含具有脂质的有机溶剂的组合物。

用于本文时，“远端位点”指物理上的分离位点，其不限于邻近的毛细血管床，而包括广泛分布于整个生物体的位点。

与核酸-脂质颗粒相关的“血清-稳定性”指在暴露于将显著降解游离DNA的血清或核酸酶测定后不被明显降解的颗粒。合适的测定包括，例如，标准血清测定或DNA酶测定诸如那些在下面的实施例中描述的。

用于本文时，“全身性递送”指导致化合物在生物体内广泛生物分布的递送。一些施用的技术可以导致某些化合物的全身递送，但是不能导致其它化合物的全身递送。全身性递送指有效的，优选地，治疗量的化合物与身体的大部分接触。为了获得广泛的生物分布，通常需要血液生存期从而使化合物在到达施用位点远端的疾病位点前，不被迅速降解或清除(诸如通过初次通过器官(肝、肺等))或通过迅速、非特异性的细胞结合)。核酸-脂质颗粒的全身性递送可以以本领域已知的任何方式进行，所述方式包括，例如，静脉内、皮下、腹膜内。在一个优选的实施方案中，核酸-脂质颗粒的全身性递送是通过静脉内递送进行的。

稳定的核酸-脂质颗粒(SNALPs)及其性质

稳定的核酸-脂质颗粒，或备选地，SNALPs典型地包括阳离子脂质(即，式I或II的阳离子脂质)和核酸。这些SNALPs还优选地包括非阳离子脂质和双层稳定组分(即，抑制SNALPs聚集的缀合的脂质)。本发明的SNALPs典型地具有约50nm到约150nm的平均直径，更典型地约100nm到约130nm的平均直径，最典型地约110nm到约115nm的平均直径，并基本上无毒的。此外，存在于本发明的SNALPs的核酸在水溶液中对核酸酶的降解具有抗性。

在一个实施方案中，本发明提供稳定的核酸-脂质颗粒(SPLPs或SNALPs)和其它的基于脂质的载体系统(例如，脂质体，胶束，病毒体，脂质-核酸颗粒，核酸复合物及其混合物)，其包含本发明的阳离子脂质，即式I，式II，或其组合的阳离子脂质。本发明的脂质-核酸颗粒典型地包括核酸，式I或式II的阳离子脂质，非阳离子脂质和PEG-脂质缀合物。式I或式II的阳离子脂质典型地构成在所述颗粒中存在的从约2％到约60％，从约5％到约50％，从约10％到约45％，从约20％到约40％，或约30％的总脂质。所述非阳离子脂质典型地构成在所述颗粒中存在的约5％到约90％，从约10％到约85％，从约20％到约80％，从约30％到约70％，从约40％到约60％或约48％的总脂质。所述PEG-脂质缀合物典型地构成在所述颗粒中存在的从约1％到约20％，从约1.5％到约18％，从约4％到约15％，从约5％到约12％，或约2％的总脂质。本发明的核酸-脂质颗粒还可以包含胆固醇。如果存在，胆固醇典型地构成在所述颗粒中存在的约10％到约60％，约12％到约58％，从约20％到约55％，或约48％的总脂质。对于本领域技术人员将容易变得显而易见的是，例如，使用在本文所述的ERP测定，核酸-脂质颗粒的成分的比例可以变化。例如，对于全身递送，阳离子脂质可以构成在所述颗粒中存在的约5％到约15％的总脂质，而对于局部或区域性递送，所述阳离子脂质构成在所述颗粒中存在的约40％到约50％的总脂质。

A.阳离子脂质

可以将式I和II的阳离子脂质单独，或组合以一种或多种其它的阳离子脂质种类或非阳离子脂质种类来用在本发明中。式I和II的阳离子脂质具有下列结构：

其中R¹和R²进行独立地选择并且是H或C₁-C₃烷基。R³和R⁴进行独立地选择并且是具有约10-约20个碳原子的烷基基团；其中R³和R⁴至少一个包括至少两个不饱和位点。在一个实施方案中，R³和R⁴都是相同的，即R³和R⁴都是亚油基(C18)等。在另一个实施方案中，R³和R⁴是不同的，即R³是十四烷基(C14)，且R⁴是亚油基(C18)。在优选的实施方案中，本发明的阳离子脂质是对称的，即R³和R⁴都是相同的。在另一个优选的实施方案中，R³和R⁴都包含至少两个不饱和位点。在一些实施方案中，R³和R⁴独立地选自十二碳二烯基，十四碳二烯基，十六碳二烯基，亚油基和二十碳二烯基。在优选的实施方案中，R³和R⁴都是亚油基。在一些实施方案中，R³和R⁴包含至少三个不饱和位点并且独立地选自，例如十二碳三烯基，十四碳三烯基，十六碳三烯基，亚麻基和二十碳三烯基。

本文所述的式I和式II的阳离子脂质典型地在选定的pH，诸如生理pH上携带净正电荷。令人惊讶地发现，包含具有多个不饱和位点，例如至少2个或3个不饱和位点的烷基链的阳离子脂质对于形成具有增加的膜流动性的脂质-核酸颗粒是特别有用的。将也用在本发明中的许多阳离子脂质和相关类似物描述在同时待审的USSN 08/316,399；美国专利号5,208,036，5,264,618，5,279,833和5,283,185，和WO 96/10390中。

另外的适合的阳离子脂质包括，例如双十八烷基二甲铵(″DODMA″)，二硬脂酰二甲铵(″DSDMA″)，N，N-二油基-N，N-氯化二甲铵(″DODAC″)；N-(2，3-二油基氧基)丙基)-N，N，N-氯化三甲铵(″DOTMA″)；N，N-二硬脂酰-N，N-溴化二甲铵(″DDAB″)；N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-氯化三甲铵(″DOTAP″)；3-(N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(″DC-Chol″)和N-(1，2二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(″DMRIE″)。在本发明中也有用的许多这些脂质和相关类似物，描述在美国专利号5,208,036，5,264,618，5,279,833，5,283,185，5,753,613和5,785,992中。

B.非阳离子脂质

用于本发明的非阳离子脂质可以是能够产生稳定复合物的多种中性不带电荷的，两性离子或阴离子脂质中的任一种。它们优选地是中性的，尽管它们可以备选地是带正电荷或带负电荷的。用在本发明中的非阳离子脂质的实例包括：磷脂-相关的物质，诸如卵磷脂，磷脂酰乙醇胺，溶血卵磷脂，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，鞘磷脂，脑磷脂，心磷脂，磷脂酸，脑苷脂，二鲸蜡基磷酸酯，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)，棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二棕榈酰磷酸乙醇胺(DMPE)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，16-O-单甲基PE，16-O-二甲基PE，18-1-反式PE，1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)。非阳离子脂质或固醇诸如胆固醇可以存在。另外的不含磷的脂质是，例如，硬脂胺，十二烷胺，十六烷胺，棕榈酸乙酰酯，甘油蓖麻醇酸酯，硬脂酸十六烷酯，十四烷酸异丙酯，两性丙烯酸酯聚合物，三乙醇胺-硫酸月桂酯，烷基-芳基硫酸酯聚乙氧化脂肪酸酰胺，二(十八烷基)二甲基溴化铵等，二酰基磷脂酰胆碱，二酰基磷脂酰乙醇胺，神经酰胺，鞘磷脂，脑磷脂，和脑苷脂。其它的脂质诸如溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺可以存在。非阳离子脂质还包括基于聚乙二醇的聚合物诸如PEG 2000，PEG 5000和与磷脂或与神经酰胺(被称作PEG-Cer)缀合的聚乙二醇，如在同时待审的USSN 08/316,429中所描述的。

在优选的实施方案中，非阳离子脂质是二酰基磷脂酰胆碱(例如，二硬脂酰磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱和二亚油酰磷脂酰胆碱)，二酰基磷脂酰乙醇胺(例如，二油酰磷脂酰乙醇胺和棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺)，神经酰胺或鞘磷脂。在这些脂质中的酰基基团优选地是来自具有C₁₀-C₂₄碳链的脂肪酸的酰基基团。更优选地是酰基基团是月桂酰，肉豆蔻酰，棕榈酰，硬脂酰或油酰。在特别优选的实施方案中，非阳离子脂质将是胆固醇，1，2-sn-二油酰磷脂酰乙醇胺，或卵鞘磷脂(ESM)。

C.双层稳定组分

除了阳离子和非阳离子脂质之外，本发明的SPLPs包含双层稳定组分(BSC)诸如ATTA-脂质或PEG-脂质，诸如偶联于二烷氧基丙基的PEG(PEG-DAA)，如在例如WO 05/026372中所述，偶联于二酰基甘油的PEG(PEG-DAG)，如在例如美国专利公开号20030077829和2005008689中所述，偶联于磷脂酰乙醇胺(PE)的PEG(PEG-PE)，或缀合于神经酰胺的PEG，或其混合物(见，美国专利号5,885,613)。在一个优选的实施方案中，所述BSC是抑制SPLPs的聚集的缀合的脂质。适合的缀合的脂质包括，但不限于，PEG-脂质缀合物，ATTA-脂质缀合物，阳离子-聚合物-脂质缀合物(CPLs)或其混合物。在一个优选的实施方案中，所述SPLPs包含与CPL一起的PEG-脂质缀合物或ATTA-脂质缀合物。

PEG是聚乙二醇，一种具有两个末端羟基基团的线性，乙烯PEG重复单元的水溶性聚合物。根据它们的分子量，将PEGs进行分类；例如，PEG 2000具有约2,000道尔顿的平均分子量，并且PEG5000具有约5,000道尔顿的平均分子量。PEGs是可从Sigma Chemical Co.和其它公司商购的并且包括例如下列各项：单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)，单甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)，单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)，单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH₂)，单甲氧基聚乙二醇-tresylate(MePEG-TRES)，和单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。此外，单甲氧基聚乙二醇-乙酸(MePEG-CH₂COOH)，对于制备PEG-脂质缀合物，包括PEG-DAA缀合物特别有用。

在优选的实施方案中，所述PEG具有从约550道尔顿到约10,000道尔顿，更优选地约750道尔顿到约5,000道尔顿的平均分子量，更优选地，具有约1,000道尔顿到约5,000道尔顿的平均分子量，更优选地具有约1,500道尔顿到约3,000道尔顿的平均分子量，并且，甚至更优选地具有约2,000道尔顿或约750道尔顿的平均分子量。所述PEG可以任选地被烷基，烷氧基，酰基或芳基所取代。PEG可以直接缀合于所述脂质或可以通过接头部分连接于所述脂质。可以使用适合于将PEG偶联于脂质的任何接头部分，包括，例如包含非酯的接头部分和包含酯的接头部分。在优选的实施方案中，所述接头部分是包含非酯的接头部分。用于本文时，术语“包含非酯的接头部分”指不包含羧酸酯键(-OC(O)-)的接头部分。适合的包含非酯的接头部分包括，但不限于，酰氨基(-C(O)NH-)，氨基(-NR-)，羰基(-C(O)-)，氨基甲酸酯(-NHC(O)O-)，脲(-NHC(O)NH-)，二硫化物(-S-S-)，醚(-O-)，琥珀酰(-(O)CCH₂CH₂C(O)-)，琥珀酰胺(-NHC(O)CH₂CH₂C(O)NH-)，醚，二硫化物等，及其组合(诸如包含氨基甲酸酯接头部分和酰氨基接头部分的接头)。在优选的实施方案中，将氨基甲酸酯接头用于将PEG偶联于脂质。

在其它实施方案中，包含酯的接头部分用于将PEG偶联于脂质。适合的包含酯的接头部分包括，例如，碳酸酯(-OC(O)O-)，琥珀一酰基，磷酸酯(-O-(O)POH-O-)，磺酸酯，及其组合。

可以将磷脂酰乙醇胺与聚乙二醇缀合从而形成双层稳定组分，所述磷脂酰乙醇胺具有各种链长度和饱和程度的各种酰基链基团。这些磷脂酰乙醇胺是可商购的，或可以使用那些本领域技术人员已知的常规技术来分离或合成。包含具有在C₁₀-C₂₀范围内的碳链长度的饱和的或不饱和的脂肪酸的磷脂酰乙醇胺是优选的。还可以使用这样的磷脂酰乙醇胺，其具有单或双不饱和脂肪酸及饱和的和不饱和脂肪酸的混合物。合适的磷脂酰乙醇胺包括，但不限于，如下：二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。

术语“ATTA”或“聚酰胺”指，但不限于，在美国专利号6,320,017和6,586,559中公开的化合物。这些化合物包括具有下式的化合物：

其中：R是选自由氢、烷基和酰基组成的组中的成员；R¹是选自由氢和烷基组成的组中的成员；或任选地，R和R¹和它们所结合的氮原子形成叠氮基部分；R²是选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的芳基和氨基酸侧链的组的成员；R³是选自由氢、卤素、羟基、烷氧基、巯基、肼基、氨基和NR⁴R⁵组成的组的成员，其中R⁴和R⁵独立地是氢或烷基；n是4-80；m是2-6；p是1-4；并且q是0或1。那些本领域技术人员将清楚的是其它聚酰胺可用在本发明的化合物中。

术语“二酰基甘油”指具有2-脂肪酰基链的化合物，R¹和R²都独立地具有通过酯键与甘油的1-和2-位键合的2-30个碳原子。所述酰基基团可以是饱和的或具有不同程度的不饱和。二酰基甘油具有如下的通式：

术语“二烷氧基丙基”指具有2-烷基链的化合物，其R¹和R²都独立地具有2-30个碳。烷基基团可以是饱和的或具有不同程度的不饱和。二烷氧基丙基具有如下的通式：

在一个优选实施方案中，PEG-脂质是具有下式的PEG-DAA缀合物：

在式VI中，R¹和R²被独立地选择并是具有约10-约22个碳原子的长链烷基基团。所述长链烷基基团可以是饱和的或是不饱和的。适合的烷基基团包括，但不限于，月桂基(C12)，肉豆蔻基(C14)，棕榈基(C16)，硬脂基(C18)和二十碳烷基(C20)。在优选的实施方案中，R¹和R²是相同的，即R¹和R²都是肉豆蔻基(即二肉豆蔻基)，R¹和R²都是硬脂基(即，二硬脂基)等。

在上述式VI中，“R¹和R²”被独立地选择并是具有约10-约20个碳原子的烷基基团；PEG是聚乙二醇；且L是如上所述包含非酯的接头部分。适合的烷基基团包括，但不限于，月桂基(C12)，肉豆蔻基(C14)，棕榈基(C16)，硬脂基(C18)和二十碳烷基(C20)。在优选的实施方案中；R¹和R²是相同的，即它们都是肉豆蔻基(C14)或都是棕榈烷基(C16)或都是硬脂基(C18)等。在优选的实施方案中，所述烷基基团是饱和的。

在上述的式VI中，“PEG”是聚乙二醇，其具有在约550道尔顿到约10,000道尔顿范围内的平均分子量，更优选约750道尔顿到约5,000道尔顿范围内的平均分子量，更优选约1,000道尔顿到约5,000道尔顿范围内的平均分子量，更优选约1,500道尔顿到约3,000道尔顿范围内的平均分子量，并且甚至更优选约2,000道尔顿，或约750道尔顿的平均分子量。所述PEG可以任选地被烷基，烷氧基，酰基或芳基取代。在一个优选的实施方案中，末端羟基基团被甲氧基或甲基基团所取代。

在上述的式VI中，“L”是包含非酯的接头部分或包含酯的接头部分。在一个优选的实施方案中，L是包含非酯的接头部分。适合的包含非酯的接头包括，但不限于，酰氨基接头部分，氨基接头部分，羰基接头部分，氨基甲酸酯接头部分，脲接头部分，醚接头部分，二硫化物接头部分，琥珀酰胺基接头部分及其组合。在一个优选的实施方案中，包含非酯的接头部分是氨基甲酸酯接头部分(即，PEG-C-DAA缀合物)。在另一个优选的实施方案中，包含非酯的接头部分是酰氨基接头部分(即，PEG-A-DAA缀合物)。在一个优选的实施方案中，包含非酯的接头部分是琥珀酰胺基接头部分(即，PEG-S-DAA缀合物)。

使用本领域那些技术人员已知的标准技术和试剂来合成PEG-DAA缀合物。将认识到所述PEG-DAA缀合物将包含各种酰胺，胺，醚，硫代，氨基甲酸酯和脲键。本领域那些技术人员将认识到用于形成这些键的方法和试剂是众所周知的并且是容易获得的。见，例如March，ADVANCEDORGANIC CHEMISTRY(Wiley 1992)，Larock，COMPREHENSIVEORGANIC TRANSFORMATIONS(VCH 1989)；和Furniss，VOGEL′STEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY第5版.(Longman1989)。还将理解，存在的任何官能团在合成所述PEG-DAA缀合物中可能需要在不同位点上的保护和去保护。那些本领域技术人员将认识到这些技术是众所周知的。见，例如Green和Wuts，PROTECTIVE GROUPS INORGANIC SYNTHESIS(Wiley 1991)。

在目前优选的实施方案中，所述PEG-DAA缀合物是二月桂基氧基丙基(C12)-PEG缀合物，二肉豆蔻基氧基丙基(C14)-PEG缀合物，二棕榈酰氧基丙基(C16)-PEG缀合物或二steryl氧基丙基(C18)-PEG缀合物。本领域那些技术人员将容易明白其它的二烷氧基丙基可以用在本发明的PEG-DAA缀合物中。

除了上述，本领域那些技术人员将容易清楚的是，可以用其它亲水性聚合物来取代PEG。可以用来取代PEG的适合的聚合物的实例包括，但不限于，聚乙烯吡咯烷酮，聚甲基噁唑啉，聚乙基噁唑啉，聚羟基丙基甲基丙烯酰胺，聚甲基丙烯酰胺和聚二甲基丙烯酰胺，聚乳酸，聚羟基乙酸，和衍生化纤维素，诸如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。

除了前述成分外，本发明的SNALPs和SPLPs还可以包括阳离子聚(乙二醇)(PEG)脂质，或CPLs，其已经被设计用于插入脂双层中来赋予正电荷(见，Chen et al.，Bioconj.Chem.11：433-437(2000))。用在本发明中的适合的SPLPs和SPLP-CPLs，以及制备和使用SPLPs和SPLP-CPLs的方法公开于例如美国专利号6,852,334，和WO 00/62813中。用在本发明中的阳离子聚合物脂质(CPLs)有如下的结构特色：(1)将CPLs结合到脂双层中的脂质锚，诸如疏水脂质；(2)将脂质锚连接于阳离子头部基团的亲水间隔臂，诸如聚乙二醇；和(3)产生可质子化的阳离子头部基团的聚阳离子部分，诸如天然存在的氨基酸。

适合的CPL包括式VII的化合物：

A-W-Y(VII)

其中A，W和Y如下所述。

参考式VII，“A”是脂质部分诸如两亲性脂质，中性脂质或充当脂质锚的疏水性脂质。适合的脂质实例包括小泡-形成脂质或采用小泡的脂质并包括，但不限于二酰基甘油基、二烷基甘油基、N-N-二烷基氨基、1，2-二酰氧基-3-氨基丙烷和1，2-二烷基-3-氨基丙烷。

“W”是聚合物或低聚物，诸如亲水性聚合物或低聚物。优选地，亲水性聚合物是生物相容的聚合物，其是非免疫原性的或具有低内在免疫原性。或者，如果与合适的佐剂一起使用，所述亲水聚合物可以是弱抗原性的。合适的非免疫原性聚合物包括，但不限于，PEG、聚酰胺、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物及其组合。在一个优选的实施方案中，所述聚合物具有约250至约7000道尔顿的分子量。

“Y”是聚阳离子部分.术语聚阳离子部分指在选定的pH，优选地生理pH上带正电荷、优选地带至少2个正电荷的化合物、衍生物或官能团.合适的聚阳离子部分包括碱性氨基酸和它们的衍生物诸如精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸和组氨酸；精胺；亚精胺；阳离子树状聚体；聚胺；聚胺糖；和氨基多糖.所述聚阳离子部分在结构上可以是线性的诸如线性四赖氨酸(tetralysine)、支链或树状聚体.聚阳离子部分在选定的pH值，具有介于约2-约15个之间的正电荷，优选地具有约2至约12之间的正电荷，并且更优选地具有介于约2至约8个之间的正电荷.选择使用的聚阳离子部分的类型可以通过需要的脂质体应用的类型来进行确定.

在聚阳离子部分上的电荷可以分布在整个脂质体部分周围或，它们可以是在脂质体部分的一个具体区域中电荷密度的不连续集中，例如电荷尖峰(spike)。如果电荷密度分布在脂质体上，电荷密度可以相等地分布或不相等地分布。聚阳离子部分的电荷分布的所有变化包含在本发明中。

脂质“A”和非免疫原性的聚合物“W”可以通过各种方法以及优选地通过共价连接进行连接。本领域那些技术人员已知的方法可以用于“A”和“W”的共价连接。合适的键合物包括，但不限于，酰胺、胺、羧基、碳酸酯、氨基甲酸酯、酯和腙键合物。本领域技术人员将清楚的是“A”和“W”必须具有互补的官能团从而完成所述键合。这样两个官能团的反应将提供理想的键合，所述官能团一个在脂质上并且另一个在聚合物上。例如，当所述脂质是二酰基甘油并且所述末端羟基被用例如NHS和DCC激活从而形成活性酯，接着与包含氨基基团的聚合物诸如与聚酰胺反应时(见，美国专利号6,320,017和6,586,559)，酰胺键将在两个基团之间形成。

在某些情形中，聚阳离子部分可以具有连接的配体诸如靶向配体或络合钙的鳌合部分。优选地，在所述配体连接后，所述阳离子部分维持正电荷。在某些情形中，连接的配体具有正电荷。合适的配体包括，但不限于，具有反应官能团的化合物或装置并包括脂质，两亲性脂质，载体化合物，生物亲和性化合物，生物材料，生物聚合物，生物医用装置，在分析上可检测的化合物，治疗上有活性的化合物，酶，肽，蛋白质，抗体，免疫刺激物，放射性标记，荧光，生物素，药物，半抗原，DNA，RNA，多糖，脂质体，病毒体，胶束，免疫球蛋白，官能团，其它靶向部分或毒素。

D核酸组分

本发明的核酸组分包括使目标基因的表达沉默(例如部分或完全抑制)的干扰RNA。干扰RNA可以以数种形式进行提供。例如，干扰RNA可以作为一种或多种分离的小干扰RNA(siRNA)双链体，更长的双链RNA(dsRNA)或作为转录自DNA质粒中的转录盒的siRNA或dsRNA来提供。所述干扰RNA可以单独或组合以常用的药剂的施用进行施用，所述常用药剂用于治疗与目标基因相关的疾病或病症。目标基因包括，但不限于，与病毒感染和存活相关的基因，与肝和肾疾病和病症相关的基因，与肿瘤发生和细胞转化相关的基因，生血管基因，免疫调节剂基因，诸如与炎性和自身免疫应答相关的那些，配体受体基因，和与神经变性疾病相关的基因。

1.选择siRNA序列

可以使用本领域已知的任何方法来鉴定适合的siRNA序列。典型地，描述在Elbashir，et al.，Nature 411：494-498(2001)和Elbashir，et al.，EMBOJ 20：6877-6888(2001)中的方法与在Reynolds et al.，Nature Biotech.22(3)：326-330(2004)中提及的随机设计规则进行组合。

典型地，在来自目标靶基因的转录物的AUG起始密码子的3′的约50到约100个核苷酸中的序列进行关于二核苷酸序列(例如，AA，CC，GG，或UU)的扫描(见，例如Elbashir，et al.，EMBO J 20：6877-6888(2001)).将紧接所述二核苷酸序列3′的核苷酸鉴定为潜在的siRNA目标序列.典型地，将紧接二核苷酸序列3′的19，21，23，25，27，29，31，33，35或更多的核苷酸鉴定为潜在的siRNA目标位点.在一些实施方案中，所述二核苷酸序列是AA序列，并且将紧接AA二核苷酸的3′的19个核苷酸鉴定为潜在的siRNA目标位点.典型地，siRNA目标位点沿目标基因的长度以不同的位点间隔.为了进一步增加siRNA序列的沉默功效，还可以对潜在的siRNA靶位点进行分析以鉴定不包含与其它编码序列同源的区域的位点.例如，约21个碱基对的适合的siRNA目标位点将不具有与其它编码序列同源的超过16-17个连续碱基对.如果所述siRNA序列将自RNA Pol III启动子表达，选择缺乏超过4个连续A′s或T′s的siRNA靶序列。

一旦已经鉴定了潜在的siRNA目标位点，可以设计互补于siRNA目标位点的siRNA序列。为了提高它们的沉默功效，还可以通过随机设计算法对所述siRNA序列进行分析以鉴定具有下列特征的一个或多个的序列：(1)约25％到约60％G/C的G/C含量；(2)在有义链的位点15-19的至少3个A/Us；(3)没有内部重复序列；(4)在有义链的位点19的A；(5)在有义链的位点3的A；(6)在有义链的位点10的U；(7)在有义链的位点19没有G/C；和(8)在有义链的位点13上没有G。siRNA设计工具可以见于，例如http://boz094.ust.hk/RNAi/siRNA，所述siRNA设计工具结合赋予这些特征的每个适合的值的算法并用于选择siRNA。

在一些实施方案中，一旦已经鉴定了潜在的siRNA序列，对所述序列进行免疫刺激基序(例如，富GU的基序)的存在与否的分析，如在例如同时待审的提交于2004年7月2日的美国临时专利申请号60/585301；提交于2004年7月19日的60/589363，提交于2004年11月12日的60/627326和提交于2005年3月25日的60/665297中所述。一旦被鉴定，可以对免疫刺激siRNA分子进行修饰以增加或减少它们的免疫刺激特性并可以对非免疫刺激分子进行修饰从而使它们具有免疫刺激特性。

产生siRNA

siRNA可以以数种形式进行提供，包括，例如作为一个或多个分离的小干扰RNA(siRNA)双链体，更长的双链RNA(dsRNA)或作为转录自DNA质粒中的转录盒的siRNA或dsRNA。还可以对siRNA进行化学合成。优选地，合成的或转录的siRNA具有约1-4个核苷酸的3′突出端，优选地约2-3个核苷酸的3′突出端，和5′磷酸末端。所述siRNA序列可以具有突出端(例如，如在(Elbashir，et al.，Genes Dev.15：188(2001)；

，et al.，Cell107：309(2001)中描述的3′或5′突出端)或可以无突出端(即，具有平端)。

RNA群可以用于提供长的前体RNAs，或与可用于制备siRNA的选定靶序列具有基本或完全同一性的长前体RNAs。所述RNAs可以按照本领域技术人员众所周知的方法来从细胞或组织中分离，合成，和/或克隆。RNA可以是混和的群(获自细胞或组织，转录自cDNA，扣除的(subtrated)，选择的等)，或可以代表单一靶序列。RNA可以是天然存在的(例如，分离自组织或细胞样品)，在体外合成的(例如，使用T7或SP6聚合酶和PCR产物或克隆的cDNA)；或以化学方法合成。

为了形成长的dsRNA，对于合成RNAs，互补体还可以在体外转录并杂交以形成ds RNA。如果使用天然存在的RNA群，例如通过转录相应于RNA群的cDNAs，或通过使用RNA聚合酶，还提供了RNA互补体(例如，形成dsRNA，其通过大肠杆菌(E.coli)RNAse III或切酶进行消化)。接着，前体RNAs进行杂交从而形成双链RNAs进行消化。dsRNAs可以直接施用于受试者或可以在施用前进行体外消化。

或者，可以将编码一个或多个siRNA模板的一个或多个DNA质粒用于提供siRNA.例如，基于小核RNAU6或人RNase P RNA H1的天然存在的转录单位，可以从质粒中的DNA模板将siRNA转录为自动折叠为具有发夹环的双链体的序列，所述质粒具有RNA聚合酶III转录单位(见，Brummelkamp，et al.，Science 296：550(2002)；Donzé，et al，Nucleic AcidsRes.30：e46(2002)；Paddison，et al.，Genes Dev.16：948(2002)；Yu，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.99：6047(2002)；Lee，et al.，Nat.Biotech.20：500(2002)；Miyagishi，et al.，Nat.Biotech.20：497(2002)；Paul，et al.，Nat.Biotech.20：505(2002)；和Sui，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.99：5515(2002))。典型地，转录单位或盒将包含RNA转录启动子序列，诸如H1-RNA或U6启动子和终止序列，所述启动子可操作地与转录所需siRNA序列的模板连接，所述终止序列包括2-3个尿苷残基和聚胸苷(T5)序列(多腺苷酸化信号)(Brummelkamp，Science，同上)。选定的启动子可以提供组成型或可诱导型转录。组合物和DNA-指导的RNA干扰分子的转录的方法详细描述于美国专利号6,573,099。将转录单位结合到质粒或DNA载体中，干扰RNA转录自所述质粒或DNA载体。适合于体内递送遗传物质用于治疗目的的质粒详细描述于美国专利号5,962,428和5,910,488中。选定的质粒可以提供靶细胞的瞬时或稳定的递送。本领域那些技术人员将清楚的是起初被设计用于表达所需基因序列的质粒可以被进行修饰从而包含用于siRNA的转录的转录单位盒。

分离RNA，合成RNA，杂交核酸，制备和筛选cDNA文库以及进行PCR的方法是本领域众所周知的(见，例如.，Gubler&Hoffman，Gene25：263-269(1983)；Sambrook et al.，同上；Ausubel et al.，同上)，PCR方法也是这样(见美国专利4,683,195和4,683,202；PCR Protocols：A Guide toMethods and Applications(Innis et al.，eds，1990))。表达文库也是本领域技术人员众所周知的。公开用在本发明中的一般方法的另外的基本书籍包括Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2nd ed.1989)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et a1.，eds.，1994))。

对适合的质粒进行工程改造从而使其以可表达的形式包含模板序列，所述序列编码目标基因产物的部分长度的序列或完整长度的序列。模板序列还可以用于提供分离的或合成的siRNA和dsRNA。一般而言，理想的是使目标基因产物的转录和翻译下调或沉默。

目标基因

目标基因包括，但不限于，与病毒感染和存活相关的基因，与代谢疾病和病症(例如，肝疾病和病症)相关的基因，与肿瘤发生和细胞转化相关的基因，生血管基因，免疫调节剂基因诸如与炎症和自身免疫应答相关的那些，配体受体基因和与神经变性病症相关的基因。

与病毒感染和存活相关的基因

与病毒感染和存活相关的基因包括通过病毒表达从而结合，进入并在细胞中复制的那些。与慢性病毒疾病相关的病毒序列是特别感兴趣的。特别感兴趣的病毒序列包括肝炎病毒的序列(Hamasaki，et al.，FEBS Lett.543：51(2003)；Yokota，et al，EMBO Rep.4：602(2003)；Schlomai，et al.，Hepatology 37：764(2003)；Wilson，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.100：2783(2003)；Kapadia，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.100：2014(2003)；和FIELDSVIROLOGY(Knipe et al.eds.2001))，人免疫缺陷病毒(HIV)(Banerjea，etal.，Mol Ther.8：62(2003)；Song，et al.，J.Virol.77：7174(2003)；StephensonJAMA 289：1494(2003)；Qin，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.100：183(2003))，疱疹病毒(Jia，et al.，J.Virol.77：3301(2003))，和人乳头状瘤病毒(HPV)(Hall，et al.，J.Virol.77：6066(2003)；Jiang，et al.，Oncogene 21：6041(2002))。可以被沉默的示例性肝炎病毒核酸序列包括，但不限于：涉及转录和翻译的核酸序列(例如，En1，En2，X，P)，编码结构蛋白质的核酸序列(例如，包括C和C相关的蛋白质的核心蛋白；包括S，M，和/或L蛋白质的衣壳和包膜蛋白质，或其片段)(见，例如，FIELDS VIROLOGY，2001，同上)。可以被沉默的示范性丙型肝炎核酸序列包括但不限于：丝氨酸蛋白酶(例如，NS3/NS4)，解旋酶(例如，NS3)，聚合酶(例如，NS5B)和包膜蛋白(例如，E1，E2，和p7)。甲型肝炎核酸序列在例如Genbank登记号NC_001489中提及；乙型肝炎核酸序列在例如Genbank登记号NC_003977中提及；丙型肝炎核酸序列在例如Genbank登记号NC_004102中提及；丁型肝炎核酸序列在例如Genbank登记号NC_001653中提及；戊型肝炎核酸序列在例如Genbank登记号NC_001434中提及；并且G型肝炎核酸序列在例如Genbank登记号NC_001710中提及。

与代谢疾病和病症相关的基因

与代谢疾病和病症(例如，其中肝被靶向的病症和肝疾病以及病症)相关的基因包括，例如，在例如血脂异常(例如，肝X受体(例如，LXRα和LXRβGenback登记号NM_007121))，类法尼醇X受体(FXR)(Genbank登记号NM_005123)，固醇调节元件结合蛋白质(SREBP)，位点-1蛋白酶(S1P)，3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶-A还原酶(HMG辅酶-A还原酶)，载脂蛋白(ApoB)，和载脂蛋白(ApoE))和糖尿病(例如，葡糖-6-磷酸)中表达的基因(见，例如，Forman et al.，Cell 81：687(1995)；Seol et al.，Mol.Endocrinol.9：72(1995)，Zavacki et al.，PNAS USA 94：7909(1997)；Sakai，et al.，Cell85：1037-1046(1996)；Duncan，et al.，J.Biol.Chem.272：12778-12785(1997)；Willy，et al.，Genes Dev.9(9)：1033-45(1995)；Lehmann，et al.，J.Biol.Chem.272(6)：3137-3140(1997)；Janowski，et al.，Nature 383：728-731(1996)；Peet，etal.，Cell 93：693-704(1998))。本领域技术人员将理解与代谢疾病和病症(例如其中肝被靶向的疾病和病症以及肝疾病和病症)相关的基因包括在肝本身中表达的基因以及在其它器官和组织中表达的基因。

与肿瘤发生相关的基因

与肿瘤发生和细胞转化相关的基因序列的实例包括易位序列诸如MLL融合基因，BCR-ABL(Wilda，et al.，Oncogene，21：5716(2002)；Scherr，etal，Blood 101：1566)，TEL-AML1，EWS-FLI1，TLS-FUS，PAX3-FKHR，BCL-2，AML1-ETO和AML1-MTG8(Heidenreich，et al.，Blood101：3157(2003))；过度表达的序列诸如多药物抗性基因(Nieth，et al.，FEBSLett.545：144(2003)；Wu，et al，Cancer Res.63：1515(2003))，细胞周期蛋白(Li，et al.，Cancer Res.63：3593(2003)；Zou，et al.，Genes Dev.16：2923(2002))，β-联蛋白(Verma，et al.，Clin Cancer Res.9：1291(2003))，端粒末端转移酶基因(Kosciolek，et al.，Mol Cancer Ther.2：209(2003))，c-MYC，N-MYC，BCL-2，ERBB 1和ERBB2(Nagy，et al.Exp.Cell Res.285：39(2003))；和突变序列诸如RAS(综述于Tuschl和Borkhardt，Mol.Interventions，2：158(2002))。例如，发现使编码DNA修复酶的序列沉默与化疗剂的施用结合使用(Collis，et al.，Cancer Res.63：1550(2003)).编码与肿瘤迁移相关的蛋白质的基因也是目标靶序列，所述蛋白质，例如是整联蛋白、选择蛋白和金属蛋白水解酶.前述实例并不是排外的.可以将有利于或促进肿瘤发生或细胞转化，肿瘤生长或肿瘤迁移的任何完整或部分基因序列包括进来作为目标基因序列.

生血管/抗生血管基因

生血管基因能够促进新血管的形成。血管内皮生长因子(VEGF)(Reich，et al.，Mol.Vis.9：210(2003))或VEGFr是特别感兴趣的。靶向VEGFr的siRNA序列在例如GB 2396864；美国专利公开号20040142895；和CA2456444中提出。

抗生血管基因能够抑制新血管形成。这些基因特别用于治疗其中血管发生在所述疾病的病理发展中具有作用的那些癌症。抗生血管基因的实例包括，但不限于，内皮抑制素(见，例如美国专利号6,174,861)，制管张素(见，例如美国专利号5,639,725)，和VEGF-R2(见，例如Decaussin et al.(1999)J.Pathol.188(4)：369-737)。

免疫调节剂基因

免疫调节剂基因是调节一个或多个免疫应答的基因。免疫调节剂基因的实例包括细胞因子诸如生长因子(例如，TGF-α，TGF-β，EGF，FGF，IGF，NGF，PDGF，CGF，GM-CSF，SCF，等)，白细胞介素(例如，IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-7，IL-10，IL-12，IL-15，IL-20等)，干扰素(例如，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，等)，TNF(例如，TNF-α)，和Flt-3配体。Fas和Fas配体基因也是目标免疫调节剂靶序列(Song，et al.，Nat.Med.9：347(2003))。在造血和淋巴样细胞中编码次级信号分子的基因也包括在本发明中，例如，Tec家族激酶，诸如Bruton’s酪氨酸激酶(Btk)(Heinonen，et al.，FEBS Lett.527：274(2002))。

细胞受体配体

细胞受体配体包括这样的配体，其能结合细胞表面受体(例如，胰岛素受体、EPO受体、G-蛋白质偶联受体、具有酪氨酸激酶活性的受体、细胞因子受体、生长因子受体等)以调节(例如，抑制，激活等)受体涉及的生理途径(例如，葡萄糖水平调节、血液细胞发展、有丝分裂发生等)。细胞受体配体的实例包括细胞因子、生长因子、白细胞介素、干扰素、促红细胞生成素(EPO)、胰岛素、胰高血糖素、G-蛋白质偶联的受体配体等)。编码三核苷酸重复序列(例如，CAG重复序列)扩张的模板发现用于使在神经变性疾病中的病原序列沉默，所述神经变性疾病由三核苷酸重复序列的扩张所引起，诸如脊髓延髓肌肉萎缩和亨廷顿舞蹈病(Caplen，et al.，Hum.Mol.Genet.11：175(2002))。

肿瘤抑制基因

肿瘤抑制基因是能够抑制细胞，特别是肿瘤细胞的生长的基因。因此，将这些基因递送到肿瘤细胞中在癌症的治疗中是有用的。肿瘤抑制基因包括，但不限于，p53(Lamb et al.，Mol.Cell.Biol.6：1379-1385(1986)，Ewen etal.，Science 255：85-87(1992)，Ewen et al.(1991)Cell 66：1155-1164，和Hu etal.，EMBO J.9：1147-1155(1990))，RB1(Toguchida et al.(1993)Genomics17：535-543)，WT1(Hastie，N.D.，Curr.Opin.Genet.Dev.3：408-413(1993))，NF1(Trofatter et al.，Cell 72：791-800(1993)，Cawthon et al.，Cell 62：193-201(1990))，VHL(Latifet al.，Science 260：1317-1320(1993))，APC(Gorden et al.，Cell 66：589-600(1991))，DAP激酶(见，例如，Diess et al.(1995)Genes Dev.9：15-30)，p16(见，例如，Marx(1994)Science 264(5167)：1846)，ARF(见，例如，Quelle et al.(1995)Cell 83(6)：993-1000)，神经纤维瘤蛋白(见，例如，Huynh et al.(1992)Neurosci.Lett.143(1-2)：233-236)，和PTEN(见，例如，Li et al.(1997)Science 275(5308)：1943-1947)。

制备SNALPs

本发明提供制备血清稳定性核酸脂质颗粒的方法，其中质粒或其它核酸被包封在脂双层中并且被保护免于降解。由本发明的方法制备的颗粒典型地具有约50nm到约150nm的大小，更典型地具有约100nm到约130nm的大小，最典型地具有约110nm到约115nm的大小。所述颗粒可以通过本领域已知的任何方法来形成，所述方法包括，但不限于：连续混合方法，去污剂透析方法，或改进的反相方法，其在混和所述成分的过程中使用有机溶剂来提供单相。

在优选的实施方案中，所述阳离子脂质是式I和式II的脂质或其组合。在其它优选的实施方案中，所述非阳离子脂质是ESM，DOPE，DOPC，DPPE，DMPE，16:0单甲基磷脂酰乙醇胺，16:0二甲基磷脂酰乙醇胺，18:1反式磷脂酰乙醇胺，18:0 18:1磷脂酰乙醇胺(SOPE)，16:0 18:1磷脂酰乙醇胺，DSPE，基于聚乙二醇的聚合物(例如，PEG 2000，PEG 5000，PEG-修饰的二酰基甘油，或PEG-修饰的二烷氧基丙基)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，胆固醇，或其组合。在其它优选的实施方案中，所述有机溶剂是甲醇，氯仿，二氯甲烷，乙醇，二乙醚或其组合。

在特别优选的实施方案中，所述核酸是质粒；所述阳离子脂质是式I或II的脂质或其组合；所述非阳离子脂质是ESM，DOPE，PEG-DAAs，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，胆固醇，或其组合(例如，DSPC和PEG-DAAs)；并且所述有机溶剂是甲醇，氯仿，二氯甲烷，乙醇，二乙醚或其组合。

在特别优选的实施方案中，本发明提供通过持续的混合方法来产生核酸-脂质颗粒，所述持续混和方法，例如这样的过程，所述过程包括在第一储存器中提供包含核酸诸如siRNA或质粒的水溶液，和在第二储存器中提供有机脂质溶液，并将所述水溶液与有机脂质溶液混和从而使所述有机脂质溶液与水溶液混和从而基本上瞬间产生包封核酸(例如，siRNA)的脂质体。用于进行该过程的方法和装置详细描述在美国专利公开号20040142025中。

将脂质和缓冲溶液持续引入混和环境，诸如混和室中的操作导致了用缓冲液对脂质溶液的持续稀释，由此在混和后基本瞬时地产生脂质体。用于本文时，短语“用缓冲液持续稀释脂质溶液”(和变化)通常指用足够完成小泡形成的力量在水合作用过程中充分迅速地稀释所述脂质溶液。通过将包含核酸的水溶液和有机脂质溶液进行混和，在存在缓冲溶液(即，水溶液)时，有机脂质溶液经历持续逐步的稀释从而产生核酸-脂质颗粒。

使用持续混和方法形成的血清稳定性核酸-脂质颗粒典型地具有约50nm到约150nm的大小，更典型地具有约100nm到约130nm的大小，最典型地具有约110nm到115nm的大小。由此形成的颗粒没有聚集并且任选地进行大小排列以获得均一的颗粒大小。

在一些实施方案中，使用去污剂透析来形成所述颗粒。不倾向于被任何具体形成机制所束缚，质粒或其它核酸(例如siRNA)与阳离子脂质的去污剂溶液接触从而形成被包被的核酸复合体。这些被包被的核酸可以聚集并沉淀。然而，去污剂的存在减少了这种聚集并且使被包被的核酸与过量脂质(典型地，非阳离子脂质)反应从而形成颗粒，在所述颗粒中，质粒或其它核酸被包封在脂双层中。因此，本发明提供用于制备血清稳定性核酸-脂质颗粒的方法，其包括：

(a)在去污剂溶液中使核酸与阳离子脂质组合从而形成被包被的核酸-脂质复合体；

(b)使非阳离子脂质与被包被的核酸-脂质复合体接触从而形成包括核酸-脂质复合体和非阳离子脂质的去污剂溶液；和

(c)透析步骤(b)中的去污剂溶液从而提供血清稳定性核酸-脂质颗粒的溶液，其中所述核酸被包封在脂双层中，所述颗粒是血清稳定性的并具有约50-约150nm之间的大小。

通过在去污剂溶液中使核酸与阳离子脂质组合来形成被包被的核酸-脂质复合体的起始溶液。

在这些实施方案中，所述去污剂溶液优选地是具有临界胶束浓度为15-300mM，更优选地为20-50mM的中性去污剂的水溶液。合适的去污剂的实例包括，例如，N，N’-((辛酰基亚氨基)-二-(1，3-亚丙基))-二-(D-葡糖酰胺(gluconamide))(BIGCHAP)；BRIJ 35；脱氧-BIGCHAP；十二烷基聚(乙二醇)醚；吐温20；吐温40；吐温60；吐温80；吐温85；Mega 8；Mega9；

3-08；3-10；Triton X-405；己基-，庚基-，辛基-和壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷；和庚基硫代吡喃葡萄糖苷；其中辛基β-D-吡喃葡萄糖苷和吐温20是最优选的。去污剂在去污剂溶液中的浓度典型地是约100mM-约2M，优选地是约200mM-约1.5M。

将阳离子脂质和核酸典型地进行组合从而产生约1∶1-约20∶1比率，优选地约1∶1-约12∶1比率，以及更优选地约2∶1-约6∶1比率的电荷比率(+/-)。另外，在溶液中的核酸总浓度将典型地是约25μg/mL-约1mg/mL，优选地是约25μg/mL-约200μg/mL，并且更优选地是约50μg/mL-约100μg/mL。在一段时间内，在去污剂溶液中使核酸与阳离子脂质的组合典型地保持在室温，所述时间足够被包被的复合体形成。或者，核酸和阳离子脂质可以在去污剂溶液中组合并被加热到达到约37℃的温度。对于对温度特别敏感的核酸，被包被的复合体可以在更低的温度形成，所述温度典型地低至约4℃。

在一个优选的实施方案中，在形成核酸-脂质颗粒中的核酸与脂质的比率(质量/质量比率)的范围在约0.01-约0.08之间。起始物质的比率也在这个范围内，因为纯化步骤典型地将未被包封的核酸以及空脂质体去除。在另一个优选的实施方案中，所述核酸-脂质颗粒制剂使用每10mg总脂质约400μg核酸，或约0.01至约0.08，更优选地约0.04的核酸与脂质比率，所述比率对应于每50μg核酸，1.25mg的总脂质。

接着，使被包被的核酸-脂质复合体的去污剂溶液与非阳离子脂质接触从而提供核酸-脂质复合体和非阳离子脂质的去污剂溶液。有效用在该步骤中的非阳离子脂质包括，二酰基磷脂酰胆碱，二酰基磷脂酰乙醇胺，神经酰胺，鞘磷脂，脑磷脂，心磷脂和脑苷脂。在优选的实施方案中，所述非阳离子脂质是二酰基磷脂酰胆碱，二酰基磷脂酰乙醇胺，神经酰胺或鞘磷脂。在这些脂质中的酰基基团优选地是衍生自具有C₁₀-C₂₄碳链的脂肪酸的酰基基团.更优选地，所述酰基基团是月桂酰、肉豆蔻酰、棕榈酰、硬脂酰或油酰.在特别优选的实施方案中，所述非阳离子脂质将是1，2-sn-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)，卵磷脂酰胆碱(EPC)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，胆固醇，或其混合物.在最优选的实施方案中，所述核酸-脂质颗粒将是在体内具有提高特性的融合颗粒，所述非阳离子脂质将是DSPC或DOPE.此外，本发明的核酸-脂质颗粒还可包含胆固醇.在其它优选的实施方案中，所述非阳离子脂质还将包含基于聚乙二醇的聚合物诸如PEG 2000，PEG 5000，和与二酰基甘油、神经酰胺、或磷脂缀合的聚乙二醇，如在美国专利号5,820,873和美国专利公开号20030077829中所述。在其它的优选实施方案中，所述非阳离子脂质还将包含基于聚乙二醇的聚合物诸如PEG 2000，PEG 5000，和与二烷氧基丙基缀合的聚乙二醇。

用于本发明方法的非阳离子脂质的量典型地是对于50μg的核酸，约2-约20mg的总脂质。优选地，总脂质的量是每50μg的核酸约5-约10mg。

在形成核酸-脂质复合体和非阳离子脂质的去污剂溶液后，优选地通过透析来去除去污剂。去污剂的去除导致围绕核酸的脂质双层的形成，从而提供血清稳定性的核酸-脂质颗粒，所述颗粒具有约50nm-约150nm的大小，更典型地具有约100nm到约130nm的大小，最典型地具有约110nm到115nm的大小。由此形成的颗粒不聚集并且任选地以大小排列以获得均一颗粒大小。

可以通过任一可获得的方法来对血清稳定性的核酸-脂质颗粒进行大小排列以获得按粒度分级的脂质体。可以进行按粒度分级从而获得理想的大小范围并且相对较窄的颗粒大小分布。

可获得一些技术从而对所述颗粒进行按大小排列到理想的大小。用于脂质体并等同地可应用于本发明颗粒的一个大小排列的方法描述于美国专利号4,737,323。通过水浴或探针超声波处理对颗粒混悬液进行超声波处理来产生逐渐的颗粒大小减少为少于约50nm的大小的颗粒。匀浆法是依赖于剪切力将更大的颗粒断裂为更小的颗粒的另一个方法。在一个典型的匀浆方法中，通过标准的乳状液匀浆器使颗粒再循环直到观察到典型地在约60和80nm之间的选定颗粒大小。在两种方法中，颗粒大小分布可以通过常规激光束颗粒大小辨别，或QELS来进行监测。

通过小孔聚碳酸酯膜或不对称的陶瓷膜来挤压颗粒也是将颗粒大小减少到相对充分定义的大小分布的有效方法。典型地，通过膜来将混悬液循环一次或数次直到获得需要的颗粒大小分布。可以通过连续更小孔的膜来挤压所述颗粒从而获得大小的逐渐减少。

在另一组实施方案中，本发明提供制备血清稳定性核酸-脂质颗粒的方法，所述方法包括：

(a)在有机溶剂中制备包括阳离子脂质和非阳离子脂质的混合物；

(b)使核酸的水溶液与步骤(a)中的所述混合物接触从而提供清晰的单相；和

(c)移去所述有机溶剂来提供核酸-脂质颗粒的混悬液，其中所述核酸被包封在脂双层中，所述颗粒在血清中是稳定的并且具有约50-150nm的大小。

用于该组实施方案中的核酸(或质粒)，阳离子脂质和非阳离子脂质如对于上述去污剂透析方法所描述的。

对于有机溶剂的选择将典型地包括对溶剂极性和所述溶剂可在颗粒形成的后期被去除的容易性的考虑。也可被用作增溶剂的有机溶剂以足以提供核酸和脂质的清晰单相混合物的量存在。合适的溶剂包括，但不限于，氯仿、二氯甲烷、二乙醚、环己烷、环戊烷、苯、甲苯、甲醇或其它脂族醇诸如丙醇、异丙醇、丁醇、叔-丁醇、异丁醇、戊醇和己醇。两种或更多溶剂的组合也可用在本发明中。

通过将核酸的第一溶液，其典型地是水溶液和脂质的第二有机溶液混和在一起来完成核酸与阳离子和非阳离子脂质的有机溶液接触.本领域技术人员将理解可以通过许多方法，例如通过机械方式诸如通过使用涡旋混和器来使该混和发生.

在核酸已经与脂质的有机溶液接触后，去除所述有机溶剂，由此形成血清稳定性核酸-脂质颗粒的水性混悬液。用于去除有机溶剂的方法将典型地包括在减压下蒸发或将惰性气体(例如，氮或氩气)的气流鼓风吹过所述混合物。

由此形成的血清稳定性核酸脂质颗粒将典型地大小在约50nm和约150nm之间，更典型地在约100nm到约130nm之间，最典型地在约110nm到约115nm之间。为了获得进一步的颗粒中大小减少或大小的均一性，可以按照如上所述进行按大小排列。

在其它的实施方案中，所述方法将还包括添加非脂质聚阳离子，其可用于利用本发明的组合物实现向细胞的递送。合适的非脂质聚阳离子的实例包括，但不限于，海地美溴铵(hexadimethrine bromide)(在商标名

下，从Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，Wisconsin，USA购得)或其它heaxadimethrine的盐。其它合适的聚阳离子包括，例如，聚-L-鸟氨酸，聚-L-精氨酸，聚-L-赖氨酸，聚-D-赖氨酸，聚烯丙胺和聚乙烯亚胺的盐。

在某些实施方案中，可以在单相系统(例如，Bligh和Dyer单相或水性和有机溶剂的类似混合物)或两相系统中进行核酸-脂质颗粒的形成，伴以合适的混和。

当在单相系统中进行复合体的形成时，阳离子脂质和核酸每个都溶解在大量的(a volume of)单相混和物中。两种溶液的组合提供单一混合物，复合体形成在所述混合物中。或者，所述复合体可以在两相混合物中形成，在所述两相混合物中，阳离子脂质与核酸(其出现在水相中)结合，并将其“推”到有机相中。

在另一个实施方案中，本发明提供制备核酸-脂质颗粒的方法，所述方法包括：

(a)使核酸与包括非阳离子脂质和去污剂的溶液接触以形成核酸-脂质混合物；

(b)使阳离子脂质与核酸-脂质混合物接触从而中和核酸的负电荷的部分并形成核酸和脂质的中和电荷的混合物；和

(c)将去污剂从电荷被中和的混合物中去除从而提供核酸-脂质颗粒，其中所述核酸被保护免于降解。

在一组实施方案中，非阳离子脂质和去污剂的溶液是水溶液。通过将核酸的第一溶液与脂质和去污剂的第二溶液混和在一起来典型地完成核酸与非阳离子脂质和去污剂的溶液接触。本领域技术人员将理解通过许多方法，例如通过机械方式诸如通过使用涡旋混合器该混和可以发生。优选地，所述核酸溶液还是去污剂溶液。用在本发明方法中的非阳离子脂质的量典型地基于所用的阳离子脂质的量进行确定，并典型地是阳离子脂质的量的约0.2-5倍，优选地是所用的阳离子脂质的量的约0.5-约2倍。

在一些实施方案中，如在例如美国专利申请号09/744,103中所述对核酸进行预压缩。

将由此形成的核酸-脂质混合物与阳离子脂质接触从而中和负电荷部分，所述负电荷部分与存在的核酸(或其它聚阴离子物质)关联.所用的阳离子脂质的量将典型地足以中和所述核酸的至少50％的负电荷.优选地，所述负电荷将至少有70％被中和，更优选地有至少90％被中和.有效用在本发明中的阳离子脂质包括，例如DLinDMA和DLenDMA.这些脂质和相关的类似物已经在提交于2004年6月7日的美国临时专利申请号60/578,075；提交于2004年9月17日的60/610,746；和提交于2005年5月9日的60/679,427中有所描述.

可以通过许多技术的任一个，优选地通过将阳离子脂质的溶液和包含所述核酸-脂质混合物的溶液混合在一起，来完成阳离子脂质与核酸-脂质混合物的接触。在将两种溶液混和(或以任一个其它方式接触)后，与核酸关联的负电荷部分被中和。但是，核酸仍旧保持在未压缩的状态并获得亲水特性。

在阳离子脂质已经与核酸-脂质混合物接触后，将去污剂(或去污剂和有机溶剂的组合)去除，由此形成所述核酸-脂质颗粒。用于去除去污剂的方法将典型地包括透析。当有机溶剂存在时，通过在减压下蒸发或通过将惰性气体(例如，氮气或氩气)的气流鼓风吹过混合物来典型地成功去除它。

由此形成的颗粒将典型地从约50nm到数微米，更典型地从约50nm到约150nm，甚至更典型地从约100nm到约130nm，最典型地从约110nm到约115nm来按大小排列。为了进一步获得在所述颗粒中大小减少或大小的均一性，可以将所述核酸-脂质颗粒进行超声波处理、过滤或进行其它用在脂质体制剂中并且是本领域技术人员所熟知的大小排列技术。

在其它实施方案中，该方法将还包括添加非脂质聚阳离子，其可用于利用本发明的组合物实现细胞的脂质转染。合适的非脂质聚阳离子的实例包括，海地美溴铵(在商标名

下，从Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，Wisconsin，USA购得)或其它heaxadimethrine的盐。其它合适的聚阳离子包括，例如，聚-L-鸟氨酸，聚-L-精氨酸，聚-L-赖氨酸，聚-D-赖氨酸，聚烯丙胺和聚乙烯亚胺的盐。这些盐的添加优选地在颗粒已经形成后进行。

在另一方面，本发明提供制备核酸-脂质颗粒的方法，所述方法包括：

(a)在溶液中使适量(an amount of)的阳离子脂质与核酸接触；所述溶液包括约15-35％的水和约65-85％的有机溶剂并且阳离子脂质的量足以产生从约0.85-约2.0的+/-电荷比率，从而提供疏水核酸-脂质复合体；

(b)在溶液中使疏水性的核酸-脂质复合体与非阳离子脂质接触从而提供核酸-脂质混合物；和

(c)从核酸-脂质混合物中去除有机溶剂从而提供核酸-脂质颗粒，其中核酸被保护免于降解。

有效用在本发明该方面中的所述核酸、非阳离子脂质、阳离子脂质和有机溶剂与对于上面使用去污剂的方法所述的那些相同。在一组实施方案中，步骤(a)的溶液是单相的。在另一组实施方案中，步骤(a)的溶液是两相的。

在优选的实施方案中，所述非阳离子脂质是ESM，DOPE，DOPC，基于聚乙二醇的聚合物(例如，PEG 2000，PEG 5000，PEG-修饰的二酰基甘油，或PEG-修饰的二烷氧基丙基)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，DPPE，DMPE，16:0单甲基磷脂酰乙醇胺，16:0二甲基磷脂酰乙醇胺，18:1反式磷脂酰乙醇胺，18:0 18:1磷脂酰乙醇胺(SOPE)，16:0 18:1磷脂酰乙醇胺，DSPE，胆固醇，或其组合。在其它优选的实施方案中，所述有机溶剂是甲醇，氯仿，二氯甲烷，乙醇，二乙醚或其组合。

在一个实施方案中，所述核酸是自其中转录干扰RNA的质粒；所述阳离子脂质是DLindMA，DLenDMA，DODAC，DDAB，DOTMA，DOSPA，DMRIE，DOGS或其组合；所述非阳离子脂质是ESM，DOPE，DAG-PEGs，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，DPPE，DMPE，16:0单甲基磷脂酰乙醇胺，16:0二甲基磷脂酰乙醇胺，18:1反式磷脂酰乙醇胺，18:0 18:1磷脂酰乙醇胺(SOPE)，16:0 18:1磷脂酰乙醇胺DSPE，胆固醇，或其组合(例如，DSPC和PEG-DAA)；并且所述有机溶剂是甲醇，氯仿，二氯甲烷，乙醇，二乙醚或其组合。

如上，优选地通过机械方式诸如通过使用涡旋混和器将核酸的第一溶液，和脂质的第二溶液混和在一起，来典型地完成所述核酸与阳离子脂质的接触。得到的混合物包含如上所述的复合体。接着，通过添加非阳离子脂质和去除有机溶剂来将这些复合体转化成颗粒。非阳离子脂质的添加通过简单将非阳离子脂质的溶液添加到包含所述复合体的溶液中典型地完成。还可以使用反向添加。可以通过本领域那些技术人员已知的方法来完成有机溶剂的随后的去除并也如上所述。

使用在本发明该方面中的非阳离子脂质的量典型地是用于提供电荷被中和的核酸-脂质复合体的阳离子脂质的量(基于摩尔基础)的约0.2-约15倍。优选地，所述量是所用的阳离子脂质的量的约0.5-约9倍。

在另一方面中，本发明提供核酸-脂质颗粒，其通过如上所述的方法进行制备。在这些实施方案中，所述核酸-脂质颗粒是净电荷中性的或携带总电荷，所述总电荷给所述颗粒提供更大的基因脂转染活性。优选地，颗粒的核酸组分是干扰不需要的蛋白质的产生的核酸。在一个优选的实施方案中，核酸包含干扰RNA，并且非阳离子脂质是卵鞘磷脂并且所述阳离子脂质是DLinDMA或DLenDMA。在优选的实施方案中，所述核酸包含干扰RNA，所述非阳离子脂质是DSPC和胆固醇的混合物，并且所述阳离子脂质是DLinDMA或DLenDMA。在其它优选的实施方案中，所述非阳离子脂质还可包括胆固醇。

在本文讨论进行多种制备SNALP-CPLs(包含CPL的SNALPs)的通用方法。两种通用技术包括“插入后”技术，即将CPL插入，例如预形成的SNALP中，和“标准”技术，其中在例如，SNALP形成步骤中，CPL被包括在脂质混合物中。所述插入后技术导致这样的SNALPs，所述SNALPs主要在SNALP双层膜的外面中具有CPLs，而标准技术提供这样的SNALPs，其在内面和外面都具有CPLs。所述方法尤其有用于由磷脂制成的小泡(其可以包含胆固醇)，并且还有用于包含PEG-脂质(诸如PEG-DAAs和PEG-DAGs)的小泡。制备SNALP-CPL的方法在例如美国专利号5,705,385，6,586,410，5,981,5016,534,484；6,852,334；美国专利公开号20020072121以及WO00/62813中进行教导。

核酸-脂质颗粒制剂的施用

一旦形成，本发明的血清稳定性核酸-脂质颗粒用于将核酸引入细胞中。因此，本发明还提供将核酸(例如，质粒或和siRNA)引入细胞的方法。所述方法通过首先如上所述形成颗粒，接着使颗粒与细胞接触一段时间来在体外或在体内进行，所述时间足以使核酸向细胞的递送发生。

本发明的核酸-脂质颗粒可以被吸附于几乎任何与它们混和或接触的细胞类型。一旦被吸附，所述颗粒可以被所述细胞的部分所胞吞，与细胞膜交换脂质，或与细胞融合。颗粒的核酸部分的转移或结合可以通过这些途径的任何一种发生。具体而言，当发生融合时，颗粒的膜被整合到细胞膜中并且所述颗粒的内容物与细胞内流体组合。

本发明的核酸-脂质颗粒可以单独或在具有生理可接受的载体(诸如生理盐水或磷酸盐缓冲液)的混合物中进行施用，所述生理可接受的载体按照施用路径和标准的药用实践来选择.一般地，生理盐水将被应用作为药用载体.其它合适的载体包括，例如水，缓冲的水，0.4％的盐水，0.3％的甘氨酸等，包括增加稳定性的糖蛋白，诸如白蛋白，脂蛋白，球蛋白等.

药用载体通常是在颗粒形成后被添加的。因此，在颗粒形成后，所述颗粒可以被稀释到药用载体诸如生理盐水中。

在药用制剂中颗粒的浓度可以在广泛范围内变化，即从少于约0.05重量％，通常在或至少约2-5重量％到多至10-30重量％，并将按照选定的特定施用方式主要通过流体体积、粘度等进行选择。例如，可以将浓度增加以降低与治疗相关的流体负荷。这可以在患有与动脉粥样硬化相关的充血性心力衰竭或严重高血压病的患者中是特别理想的。或者，由刺激性脂质组成的颗粒可以被稀释到低浓度从而在施用位点减少炎症。

本发明的药物组合物可以通过常规，众所周知的灭菌技术进行灭菌。可以对水溶液进行包装以进行使用或在无菌条件下进行过滤并冷冻干燥，在施用前将所述冷冻干燥的制剂与无菌水溶液组合。所述组合物可以如合适的生理条件所要求包含药用辅助物质，所述辅助物质诸如pH调节剂和缓冲剂，张力调节剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾和氯化钙。另外，所述颗粒混悬液可以包括脂质-保护性试剂，其在储存时，保护脂质免于自由基和脂质-过氧化损伤。亲脂性自由基猝灭剂，诸如α生育酚和水溶性铁特异性螯合剂，诸如铁草铵是合适的。

核酸-脂质颗粒可以被结合到广泛的局部剂型中，所述局部剂型包括，但不限于，凝胶，油，乳剂，局部乳膏，糊，软膏，洗剂等。

E.体内施用

已经使用核酸-脂质颗粒诸如在WO 96/40964，美国专利号5,705,385，5,976,567，5,981,501，和6,410,328中公开的那些成功实现了进行体内基因治疗的全身性递送，即将治疗性核酸通过身体系统诸如循环递送到远端靶细胞中。后者提供充分包封的核酸-脂质颗粒，其保护所述核酸在血清中免于核酸酶的降解，是非免疫原性的，小尺寸并且适合于重复给药。

对于体内施用，施用可以以本领域已知的任何方式，例如通过注射、口服施用、吸入、透皮应用或直肠施用来进行。施用可以通过单一或分剂量来完成。所述药物组合物优选地通过肠胃外，即关节内地、静脉内地、腹膜内地、皮下地或肌内地进行施用。更优选地，所述药物组合物通过大丸剂注射以静脉内或腹膜内进行施用(见，例如，Stadler，et al.，美国专利号5,286,634)。细胞内的核酸递送已经在Straubringer，et al.，MethodsEnzymol，Academic Press，New York.101：512(1983)；Mannino，etal.，Biotechniques 6：682(1988)；Nicolau，et al.，Crit.Rev.Ther.Drug CarrierSyst.6：239(1989)，和Behr，Acc.Chem.Res.26：274(1993)中进行了讨论。将施用基于脂质的治疗剂的其它方法描述在例如Rahman et al.，美国专利号3,993,754；Sears，美国专利号4,145,410；Papahadjopoulos et al.，美国专利号4,235,871；Schneider，美国专利号4,224,179；Lenk et al.，美国专利号4,522,803；和Fountain et al.，美国专利号4,588,578中。可以通过直接在疾病位点注射或通过在远离疾病位点的位点注射来施用所述脂质核酸颗粒(见，例如Culver，HUMAN GENE THERAPY，MaryAnn Liebert，Inc.，Publishers，New York.pp.70-71(1994))。

本发明的组合物，单独的或组合以其它适合的组分，可以被制成气溶胶制剂(即，它们可以被“喷雾”)以通过吸入来施用(见，Brigham，et al.，Am.J.Sci.298(4)：278(1989))。气溶胶制剂可以被置于加压的可接受的推进剂诸如二氯二氟甲烷，丙烷，氮等中。

适合于肠胃外施用，诸如，例如通过关节内(在关节中)，静脉内，肌内，真皮内，腹膜内，和皮下路径施用的制剂，包括可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与意欲的受者的血液等渗的溶质的水性和非水性，等渗的无菌注射溶液，和可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性的无菌混悬液。在本发明的实践中，组合物可以通过，例如静脉内输注，口服，局部，腹膜内，膀胱内或鞘内进行施用。

适合于口服施用的制剂可以由下列各项组成：(a)液体溶液，诸如悬浮在稀释剂，诸如水、盐水或PEG 400中的有效量的包装的核酸；b)每种包含预定量的活性成分，如液体、固体、颗粒或明胶的胶囊，香囊或片剂；(c)在适合的液体中的混悬液；和(d)适合的乳剂。片剂形式可以包含乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其它的赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂、加香剂、染料、崩解剂和药用载体中的一种或多种。锭剂形式可以在香料中包含活性成分，例如蔗糖，以及在惰性基质中包含活性成分的软锭剂，诸如明胶和甘油或蔗糖，和除了活性成分之外，包含本领域已知的载体的阿拉伯胶乳剂，凝胶等。

一般而言，当静脉内施用时，所述核酸-脂质制剂与适合的药用载体一起配制。可以将许多药用载体用在本发明的组合物和方法中。用在本发明中的适合的制剂见于，例如REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES，Mack Publishing Company，Philadelphia，PA，第17版(1985)中。可以使用多种水性载体，例如水、缓冲的水、0.4％的盐水、0.3％的甘氨酸等并且可以包括用于增加稳定性的糖蛋白，诸如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。一般而言，普通的缓冲盐水(135-150mMNaCl)可以用作药用载体，但是其它的适合的载体也可以使用。这些组合物可以通过常规脂质体灭菌技术诸如过滤来进行灭菌。所述组合物可以根据适合的生理条件包含药用辅助物质，诸如pH调节和缓冲剂，张力调节剂，湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。这些组合物可以使用参考上述的技术进行灭菌，或备选地，它们可以在无菌条件下来产生。所述得到的水溶液可以被包装进行使用或在无菌条件下进行过滤和冻干，所述冻干的制剂在施用前与无菌水溶液组合在一起。

当制备本发明的核酸-脂质颗粒的药用制剂时，优选的是使用大量已经经过纯化的颗粒从而减少或消除空的颗粒或具有与外表面相关的核酸的颗粒。

本发明的方法可以在不同的宿主中进行。优选的宿主包括哺乳动物种类，诸如禽类(例如，鸭)，灵长类动物(例如，人和黑猩猩以及其它的非人灵长类动物)，犬，猫，马，牛，绵羊、山羊、啮齿类动物(例如大鼠和小鼠)，兔类动物和猪。

施用的颗粒的量将根据核酸与脂质的比率；使用的特定的核酸，待诊断的疾病状态；年龄，重量和患者的情形以及临床医师的判断而确定；但是将通常在每kg体重约0.01和约50mg之间；优选地在每kg体重约0.1和约5mg之间或每次注射约10⁸-10¹⁰颗粒。

F.用于递送干扰RNA的细胞

将本发明的组合物和方法用于体内和体外治疗各种细胞类型。适合的细胞包括，例如，造血前体(干)细胞，成纤维母细胞，角质形成细胞，肝细胞，内皮细胞，骨和平滑肌细胞，成骨细胞，神经元，休眠的淋巴细胞，终末分化的细胞，缓慢或非循环的灵长类动物细胞，实质细胞，淋巴细胞，上皮细胞，骨细胞等。

体内递送包封干扰RNA的核酸脂质颗粒特别适合于靶向任何细胞类型的肿瘤细胞。体内研究显示SNALP′s在肿瘤位点聚集并且主要转染肿瘤细胞。见，Fenske，et al.，Methods Enzymol，Academic Press，New York 346：36(2002)。除了人细胞群外，所述方法和组合物可以用于广泛种类的脊椎动物的细胞，所述脊椎动物包括哺乳动物，尤其是在兽医学上重要的那些，例如犬、猫、马、牛、绵羊、山羊、啮齿类动物、兔类动物、猪等。

至于可能需要细胞的组织培养物的程度，这是本领域众所周知的。Freshney(1994)(Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique，thirdedition Wiley-Liss，New York)，Kuchler et al.(1977)Biochemical Methods inCell Culture and Virology，Kuchler，R.J.，Dowden，Hutchinson and Ross，Inc.，其中引用的参考文献提供对于细胞培养物的一般指导。培养的细胞系统将通常以细胞的单层形式存在，尽管也使用细胞混悬液。

G.SNALPs的检测

在一些实施方案中，可在施用所述颗粒后8，12，24，48，60，72，或96小时的受试者中检测核酸-脂质颗粒。颗粒的存在可以在来自受试者的细胞、组织或其它生物样品中检测到。所述颗粒可以通过，例如颗粒的直接检测，干扰RNA序列的检测，目标靶序列的检测(即，通过检测目标序列的表达或减少的表达)或其组合来进行检测。

1.颗粒的检测

在本文，使用本领域已知的任何方法来检测核酸-脂质颗粒。例如，可以使用本领域众所周知的方法，将标记直接偶联或间接偶联于SNALP或其它基于脂质的载体系统的成分。可以使用广泛种类的标记，其中标记的选择根据所需的敏感性，与SNALP成分缀合的容易性，稳定性要求，和可获得的工具和处理的方案来进行。合适的标记包括，但不限于，光谱标记，诸如荧光染料(例如，荧光素和衍生物，诸如异硫氰酸荧光素(FITC)和Oregon Green^TM；若丹明和衍生物，诸如德克萨斯红，四若丹明异硫氰酸酯(tetrarhodimine isothiocynate)(TRITC)，等，洋地黄毒苷，生物素，藻红蛋白，AMCA，CyDyes^TM等；放射性标记，诸如³H，¹²⁵I，³⁵S，¹⁴C，³²P，³³P，等；酶诸如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等；光谱比色标记诸如胶态金或有色玻璃或塑料珠，诸如聚苯乙烯，聚丙烯，胶乳等。可以使用本领域已知的任何方式来检测所述标记。

2.核酸的检测

通过本领域那些技术人员众所周知的许多方式的任何一种来对本文的核酸进行检测和定量。通过本领域众所周知的方法诸如DNA印迹分析，RNA印迹分析，凝胶电泳，PCR，放射性标记，闪烁计数和亲和性层析法来进行核酸的检测。还可以应用另外的分析生化方法诸如分光光度测定法，X光线照相术，电泳，毛细管电泳，高效液相层析(HPLC)，薄层层析法(TLC)，hyperdiffusion层析法。

核酸杂交形式的选择不是关键性的.多种核酸杂交形式是本领域技术人员已知的.例如，常见形式包括夹层式(sandwich)测定和竞争性或置换分析法.杂交技术通常描述在“Nucleic Acid Hybridization，A PracticalApproach，”Ed.Hames，B.D.和Higgins，S.J.，IRL Press，1985中。

通过应用核酸扩增系统可以提高杂交测定的敏感性，所述核酸扩增系统使被检测的靶核酸成倍增加。已知适合于扩增用作分子探针的序列或产生核酸片段以进行随后的亚克隆的体外扩增技术。通过这些体外扩增方法，包括聚合酶链式反应(PCR)，连接酶链反应(LCR)，Qβ-复制酶扩增和其它的RNA聚合酶介导技术(例如，NASBA^TM)足以指导技术人员的技术实例见于Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，2000，和Ausubel et al.，SHORT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY，eds.，Current Protocols，a joint venture betweenGreene Publishing Associates，Inc.和John Wiley&Sons，Inc.，(2002)，以及Mullis et al.(1987)，美国专利号4,683,202；PCR Protocols A Guide toMethods and Applications(Innis et al.eds)Academic Press Inc.San Diego，CA(1990)(Innis)；Arnheim&Levinson(October 1，1990)，C&EN 36；TheJournal Of NIH Research，3：81(1991)；(Kwoh et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：1173(1989)；Guatelli et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：1874(1990)；Lomell et al.，J.Clin.Chem.，35：1826(1989)；Landegren et al.，Science，241：1077(1988)；Van Brunt，Biotechnology，8：291(1990)；Wu和Wallace，Gene，4：560(1989)；Barringer et al.，Gene，89：117(1990)，和Sooknanan和Malek，Biotechnology，13：563(1995)。克隆体外扩增核酸的改善的方法描述于Wallace et al.，美国专利号5,426,039。本领域描述的其它方法基于核酸序列的扩增(NASBA^TM，Cangene，Mississauga，Ontario)和Q β复制酶系统。这些系统可以用于直接鉴定突变体，其中设计PCR或LCR引物以仅当选择的序列存在时进行延伸或连接。备选地，通常可以使用，例如非特异性的PCR引物来扩增选择的序列，然后可以用指示突变的特异性序列来探测所述扩增的靶区域。

如Needham VanDevanter et al.，Nucleic Acids Res.，12：6159(1984)所述，典型地按照Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Letts.，22(20)：18591862(1981)所述的固相亚磷酰胺三酯方法，例如使用自动合成仪来化学合成寡核苷酸，所述寡核苷酸用作例如在体外扩增方法的探针，用作基因探针，或作为抑制剂成分。如果必要，如Pearson和Regnier，J.Chrom.，255：137149(1983)所述，通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或通过阴离子交换HPLC来典型地进行寡核苷酸的纯化。使用Maxam和Gilbert(1980)在Grossman和Moldave(eds.)Academic Press，New York，Methods in Enzymology，65：499中的化学降解方法可以证实合成性寡核苷酸的序列。

确定转录水平的替代方式是原位杂交。原位杂交分析是众所周知的并且通常描述于Angerer et al.，Methods Enzymol.，152：649(1987)中。在原位杂交分析中，将细胞固定于固体支持物，典型地载玻片上。如果要探测DNA，用热或碱使细胞变性。接着，在适合的温度，使细胞与杂交溶液接触以容许被标记的特异性探针的退火。用放射性同位素或荧光报道分子来优选地对探针进行标记。

H.转染效率

使用ERP测定，可以对本文所述的核酸-脂质颗粒的转染效率进行优化.例如，基于它们对内体膜的结合/吸收或与其的融合/不稳定化的相对影响，可以将ERP测定用于区分SNALPs的各种阳离子脂质，非阳离子脂质和双层稳定组分的作用.该测定可从数量上确定SNALP的每个组分怎样实现转染效率，由此优化SNALPs.如上解释，内体释放参数，或备选地，ERP被定义为：

受体基因表达/细胞

SNALP吸收/细胞

将容易对于本领域那些技术人员而言是显而易见的是可以使用任何报道基因(例如，萤光素酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白等)。此外，可以用任何可检测的标记来标记脂质成分(或，备选地，SNALP或基于脂质的制剂的任何组分)，提供对到细胞中的吸收的抑制或干扰。使用本发明的ERP测定，本领域技术人员可以评价各种脂质成分(例如，式I或II的阳离子脂质，非阳离子脂质，PEG-脂质衍生物，PEG-DAA缀合物，ATTA-脂质衍生物，钙，CPLs，胆固醇，等)对细胞吸收和转染效率的影响，由此优化SPLP或其它基于脂质的载体系统。通过比较各种SPLPs的每种或其它基于脂质的制剂的ERPs，可以容易地确定优化的系统，例如，在细胞中具有最大的吸收，以及最大的转染效率的SPLP或其它基于脂质的制剂。

进行本发明的ERP测定的合适的标记包括，但不限于，光谱标记，诸如荧光染料(例如，荧光素和衍生物，诸如异硫氰酸荧光素(FITC)和OregonGreen^υ；若丹明和衍生物，诸如德克萨斯红，四若丹明异硫氰酸酯(tetrarhodimine isothiocynate)(TRITC)，等，洋地黄毒苷，生物素，藻红蛋白，AMCA，CyDyes^υ等；放射性标记，诸如³H，¹²⁵I，³⁵S，¹⁴C，³²P，³³P，等；酶诸如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等；光谱比色标记诸如胶态金或有色玻璃或塑料珠，诸如聚苯乙烯，聚丙烯，胶乳等。使用本领域众所周知的方法，可以将标记直接或间接与SNALP的组分进行偶联。如上指出，可以使用广泛种类的标记，其中取决于所需的敏感性，与SNALP的组分缀合的容易性，稳定性需求和可获得的使用仪器和处理方案来选择标记。

本发明将通过具体实施例的方式更详细地进行描述。下列实施例是出于举例说明的目的进行提供，并且不意欲以任何方式限制本发明。那些本领域技术人员将容易地认识到可以被改变或修改从而产生基本上相同的结果的多种非关键参数。

实施例

提供的下列实施例用于举例说明，而不是限制所要求的发明。

实施例1：材料和方法

材料：DPPS，1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-胆碱磷酸(DSPC)和胆固醇购自Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)。TNS获自Sigma-Aldrich Canada(Oakville，ON)。RiboGreen获自Molecular Probes(Eugene，OR)。甲磺酸烷基酯购自Nu-Chek Prep，Inc.(Elysian，MN，USA)。siRNA(抗萤光素酶和错配的对照)购自Dharmacon(Lafayette，CO，USA)。所述抗萤光素酶有义序列是5′-G.A.U.U.A.U.G.U.C.C.G.G.U.U.A.U.G.U.A.U.U-3′。所述抗萤光素酶反义序列是5′-U.A.C.A.U.A.A.C.C.G.G.A.C.A.U.A.A.U.C.U.U-3′。所有其它的化学品购自Sigma-Aldrich(Oakville，ON，Canada)。

DSDMA和DODMA的合成：使用各个烷基溴化物，用衍生自DOTMA前体的方法来合成DSDMA和DODMA(Felgner et al，PNASUSA，84，7413-7417(1987)).将3-(二甲基氨基)-1，2-丙二醇(714mg，6mmol)和95％氢化钠(NaH，1.26g，50mmol)在苯(30mL)中，在氩气下搅拌30分钟.将适合的(油基或硬脂基)烷基溴化物(5.0g，15mmol)加入，并在氩气下回流所述反应物达18小时.接着，在冰浴上冷却所述反应混合物，同时通过缓慢加入乙醇进行猝灭.在用另外的150mL苯进行稀释后，用蒸馏水(2x 150mL)和盐水(150mL)来洗涤所述混合物，如果必要，使用乙醇(～20mL)来协助相分离。通过硫酸镁来干燥所述有机相并将其进行蒸发。在硅胶(Kiesel Gel 60)柱上来纯化所述粗制产物，并用包含0-5％的甲醇的氯仿来进行洗脱。通过薄层色谱法(TLC)(硅胶，氯仿/甲醇9∶1v/v，用钼酸盐进行观察)来分析柱级分，并将包含纯化产物(R_f＝0.5)的级分合并，进行浓缩。通过在活性炭(1g)的乙醇(75mL)的混悬液中于60℃搅拌30分钟来对所述产物进行脱色。将所述炭通过Celite过滤来去除，并将乙醇溶液浓缩来典型地产生2.4g(65％)的纯的产物。

¹H-NMR(DSDMA)：δ_H 3.65-3.32(m，7H，OCH，3x OCH₂)，2.45-2.31(m，2H，NCH₂)，2.27(s，6H，2x NCH₃)，1.61-1.45(m，4H，OCH₂ CH ₂ )，1.40-1.17(m，60H，H_硬脂基)，0.86(t，6H，CH₂CH ₃ ).¹H-NMR(DODMA)：δ_H 5.4-5.27(m，4H，2x CH＝CH)，3.65-3.35(m，7H，OCH，3x OCH₂)，2.47-2.33(m，2H，NCH₂)，2.28(s，6H，2x NCH₃)，2.06-1.94(m，8H，4xCH ₂ CH＝CH)，1.61-1.50(m，4H，OCH₂CH ₂ )，1.38-1.20(m，48H，H_油基)，0.88(t，6H，CH₂CH ₃ ).

1，2-二亚油基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)和1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)的合成将3-(二甲基氨基)-1，2-丙二醇(714mg，6mmol)和95％氢化钠(NaH，1.26g，50mmol)在苯(30mL)中，在氩气下搅拌30分钟。将甲磺酸亚油酯(5.0g，15mmol)加入，并在氮气下回流所述反应物达3小时。接着，在冰浴上冷却所述反应混合物，同时通过缓慢加入乙醇进行猝灭。在用另外的150mL苯进行稀释后，用蒸馏水(2x 150mL)和盐水(150mL)来洗涤所述混合物。通过硫酸镁来干燥所述有机相并将其进行蒸发以得到粗制产物。

在硅胶(Kiesel Gel 60)柱上来纯化所述粗制产物，并用在氯仿中的0-5％的甲醇来进行洗脱。通过薄层色谱法(TLC)(硅胶，氯仿/甲醇9∶1v/v，用钼酸盐浸渍(dip)进行观察)来分析柱级分，并将包含纯化产物(R_f＝0.5)的级分合并，进行浓缩。

用第二柱来实现DLinDMA的脱色和进一步的纯化，这次用20-50％的在己烷中的乙酸乙酯来洗脱。通过TLC(硅胶，乙酸乙酯/己烷1∶1v/v，用钼酸盐来观察)来分析柱的级分，并将包含纯化产物的级分(R_f＝0.4)进行合并和浓缩。本文所述的方法典型地产生2.2g(60％)的纯化产物。

对于DLenDMA的合成，用甲磺酸亚麻酯来取代甲磺酸亚油酯，并如上所述来进行下面的合成，脱色和纯化反应。

PEG₂₀₀₀-C-DMA的合成：如下合成PEG-C-DMA。简而言之，通过首先用肉豆蔻酰溴来烷化3-烯丙氧基丙烷-1，2-二醇的羟基基团来制备C₁₄脂质锚。随后，通过钯催化来去除烯丙基基团，得到C₁₄羟基脂质。通过甲酰化作用和氨基化作用来将羟基基团转化为伯胺，以产生1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺，所述脂质锚。通过用过量的氯甲酸三氯甲酯来处理单甲氧基聚(乙二醇)(平均分子量2000)来形成氯甲酸酯以实现与PEG的缀合。添加C₁₄胺脂质锚并过夜搅拌来产生PEG₂₀₀₀-C-DMA，其在本文被称为PEG-C-DMA。

SNALP制备：通过乙醇稀释方法，使用自发小泡形成来制备脂质组成为DSPC∶Chol∶PEG-C-DMA∶阳离子脂质(20∶48∶2∶30摩尔百分比)的SNALP[Jeffs et al.，Pharm.Res.In Press(2005)]。使用交叉流超滤药筒(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)来针对100mL的PB S(20倍洗涤体积)对所述样品进行渗滤，并将其通过Acrodisc 0.2μm Posidyne滤器(Pall Corp.，Ann Arbor，MI)进行过滤除菌。使用RiboGreen测定和siRNA标准曲线来确定最终样品的siRNA浓度。使用Malvern InstrumentsZetasizer 3000HSA(Malvern，UK)来确定颗粒大小和多分散性。使用RiboGreen测定法，在存在和不存在Triton X-100的情况下比较荧光来确定核酸包封。使用具有λ_ex＝500nm，λ_em＝525nm的Varian Eclipse分光荧光计(Varian Inc)来测量RiboGreen荧光。

TNS测定法：将20μM的SNALP脂质和6μM的TNS在荧光比色杯中混合于pH在4.5-9.5变化的2mL的20mM磷酸钠，25mM柠檬酸盐，20mM的乙酸铵和150mM的NaCl中。使用设置为λ_ex＝322nm，λ_em＝431nm的Varian Eclipse分光荧光计(Varian Inc)，在每个pH上来测量荧光。接着，在不同的pH，将每种系统的荧光标准化为在pH 4.5处的值。pK_a值是其中50％存在的分子带电的点。通过假设最少的荧光代表0电荷，而最多的荧光代表100％的电荷，可以通过测量在最少和最多电荷的值之间恰好一半的点的pH来估计pKa。

³¹P核磁共振光谱学：制备以1∶1的摩尔比率包含DPPS和阳离子脂质的多层小泡(MLV)。通过干燥来自氯仿溶液的脂质，将其转移到10mm的NMR管中，并在1.5mL的10mM柠檬酸钠，pH 4中水合来完成此。获得对应于1000扫描的自由感应衰减(FIDs)，其具有脉冲间间隔为1s的3.0μs，60o脉冲，谱宽为25000Hz。将门控双水平质子去偶合用于确保用最少的样品加热进行的足够的去偶合。在傅里叶变换之前，将对应于50Hz的谱线加宽的指数倍增应用于FIDs。使用Bruker B-VT1000可变温度装置来调节样品温度(+/-1℃)。化学位移参考作为外标准的85％的磷酸。

体外转染：将细胞培养在包含10％胎牛血清(FBS)(CanSera)和0.25mg/mL G418(Invitrogen)的MEM(Invitrogen)中。将Neuro2A-G细胞(Neuro2A细胞被稳定地转染以表达萤光素酶[R.E.Kingston.in CurrentProtocols in Molecular Biology，Vol.2，pp.9.1.4-9.1.9，John Wiley&Sons，Inc.(1997)])以4x10⁴细胞/孔的浓度接种于24孔板中，并将其培养过夜。以0.0625-1.0μg/mL的核酸的剂量用SNALP来处理细胞(AntiLuc活性或错配对照)并将其在37℃和5％CO₂温育48小时。接着，用PBS来洗涤细胞并用包含0.1％Triton X-100的200μL的250mM磷酸钠来进行裂解。使用萤光素酶试剂(Promega)和标准的萤光素酶蛋白质(Roche)来测定每个孔的萤光素酶活性。使用Berthold MicroLumatPlus LB96V板发光计来测量每个的发光。接着，使用Micro BCA测定试剂盒(Pierce)来对于蛋白质的量将得到的萤光素酶活性进行标准化。接着，对于每个系统确定相对于对照的萤光素酶下降。

细胞吸收：制备SNALP，其结合不可交换的氚标记的脂质胆甾烯基十六烷醚(3H-CHE)(11.1μCi/mol总脂质)[Bally et al.，in LiposomeTechnology，Vol.III，pp.27-41，CRC Press(1993)]。将Neuro2A细胞(ATCC，VA，USA)以1.6x105细胞/孔接种在12孔板的基本培养基中。次日，去除培养基并用包含放射性标记的0.5μg/mL核酸的SNALP的培养基进行取代。24小时后，去除培养基和未结合的SNALP，将贴壁细胞用PBS轻柔洗涤4次，接着用600μL的裂解缓冲液(具有0.1％Triton X-100的250mM磷酸盐)进行裂解。将得到的细胞裂解物(500μL)加入包含5mL Picofluor 40(Perkin Elmer)的玻璃闪烁瓶中，并使用Beckman LS6500闪烁计数器(Beckman Instruments)来测定³H-CHE.使用Micro BCA测定法(Pierce)来测定细胞裂解物的蛋白质含量。将吸收表示为应用到细胞的活性的总量/mg细胞蛋白质的百分比。

包含Cy3-标记的siRNA的SNALP的吸收：如前所述来配制SNALP，但是使用用荧光团Cy3(Cy3-siRNA是Sirna Therapeutics Inc，Boulder，CO的赠品)标记的siRNA。如所述来确定包封，siRNA浓度和颗粒大小。

对于吸收研究，将8x10⁴Neuro2A-G细胞过夜培养在4孔室载玻片(BD Falcon，Mississauga，ON)的包含0.25mg/mL G418的MEM中。将包含Cy3-siRNA的DSDMA，DODMA，DLinDMA，和DLenDMA SNALP，以及裸Cy3-siRNA和未标记的DSDMA SNALP以0.5μg/mL的siRNA置于细胞上。在用转染的培养基温育4小时后，用PBS洗涤细胞，接着用包含G418的MEM进行洗涤，并最终用PBS再一次洗涤。接着，将所述细胞于室温，固定在4％的低聚甲醛的PBS溶液中达10分钟。用PBS洗涤所述细胞，并用在PBS中的300nM DAPI(Molecular Probes，Eugene，OR)来染色5分钟。用PBS洗涤所述细胞，应用封固剂ProLong Gold Antifade试剂(Molecular Probes，Eugene，OR)并加上盖玻片。使用荧光能力有所改进的Olympus BX60显微镜来观察细胞。使用若丹明立方形装置(MicrogenOptics，Redding，CA)来观察在细胞中的Cy3荧光，并使用DAPI立方形装置(Carsen Group，Markham，ON)来观察DAPI荧光。使用Olympus DP70照相系统来捕获数据图片。当检查Cy3荧光时，以1/4秒的曝光时间拍摄细胞的图片，当检查DAPI荧光时，以1/80秒的曝光时间来拍摄细胞的图片。

实施例2：包封si RNA的SNALP制剂

本实施例证实将siRNA包封在SNALP中，所述SNALP用短或长链PEG-DAG来配制和通过将有机脂质和水性缓冲溶液持续混和在一起来产生。所用的PEG-DAG脂质是PEG-二肉豆蔻基甘油(C₁₄)(PEG-DMG)和PEG-二硬脂基甘油(C₁₈)(PEG-DSG)。通过该方法被包封在DSPC∶胆固醇∶DODMA∶PEG-DMG/PEG-DSG SNALP中的抗-β-半乳糖苷酶(β-gal)siRNA导致≥90％的包封(Ribogreen测定)和～120nm颗粒大小(Malvern分级机)。所述制剂具有如下特性：

4ml prep：在DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-DMG脂质体中的抗-B-gal siRNA

起始混和＝94％包封

稀释后混和＝98％包封

温育后混和＝97％包封

过夜透析后＝96％包封

颗粒大小＝109.7nm

多分散性＝0.14

8ml prep：在DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-DMG脂质体中的抗-B-gal siRNA

稀释后&温育的混和＝89％

过夜透析后＝91％

颗粒大小＝127.5nm

多分散性＝0.11

8ml prep：在DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-DSG脂质体中的抗-B-gal siRNA

稀释后&温育的混和＝90％

过夜透析后＝90％

无菌过滤后＝90％

颗粒大小＝111.6nm

多分散性＝0.24

实施例3：通过体外递送包封siRNA的SNALP制剂进行细胞中细胞内表达 的下调

该实施例证明在CT26.CL25细胞中的β-Gal表达的下调，将包封抗-β-Gal siRNA的DSPC∶胆固醇∶DODMA∶PEG-DMG脂质体体外递送到所述CT26.CL25细胞中。将结果描述于图4中。

与未接触的对照细胞相比，0.2μg的Oligofectamine-包封的抗-β-GalsiRNA的体外递送将β-Gal活性减少了约60％。与未接触的对照细胞相比，将1.5μg的抗-β-Gal siRNA包封在DSPC∶胆固醇∶DODMA∶PEG-DMG脂质体中减少了β-Gal的活性约30％。

实施例4：血清稳定性的测定

按照上述指出的技术配制的脂质/治疗性核酸颗粒可以通过各种方法来进行血清稳定性的测定。

例如，在典型的DNase 1消化中，将被包封在目标颗粒中的1μgDNA在100μl总体积的5mM HEPES，150mM NaCl，10.0mM MgCl₂pH7.4中进行温育。用100或10U的DNase I(Gibco-BRL)来处理被Dnase处理的样品。可以将1.0％的Triton X-100加入对照实验中以确保脂质制剂不直接使所述酶失活。将样品在37℃温育30分钟，然后通过加入500μL的DNAZOL，随后加入1.0mL的乙醇来分离DNA。将样品在台式离心机中以15,000rpm离心30分钟。倾去上清液并用80％的乙醇洗涤得到的DNA沉淀两次并进行干燥。将该DNA重悬于30μL的TE缓冲液中。将20μL的该样品上载到1.0％的琼脂糖凝胶中并在TAE缓冲液中进行电泳。

在典型的血清测定中，将游离的，被包封的，或被包封的+0.5％TritonX100形式的50μgDNA等分到1.5mL Eppendorf管中。向所述管中加入45μl的正常鼠或人血清，dH2O(使终体积为50μL)。用石蜡膜密封所述管并在37℃进行温育。将没有用核酸酶(标准)消化的游离的，被包封的，或被包封的+0.5％Triton X100的样品在Eppendorf管中在液氮中冷冻并贮存于-20℃。在各个时间点取出等分试样，将其加入包含蛋白酶K(133μg/mL)的GDP缓冲液中，立即在液氮中冷冻以停止反应。一旦收集了所有的时间点，在水浴中以55℃温育所述样品从而激活蛋白酶K来使任何残余的核酸外切酶变性。将被蛋白酶K消化的样品施加到聚丙烯酰胺凝胶中以评价核酸外切酶降解的水平。

上述揭示的颗粒通过甚至在存在100U DNase 1时，显示这些处理的结果是少于5％和优选地不可检测的量的DNA降解(部分或总的)，来证明血清稳定性。其有利地与被彻底降解的游离DNA，和质粒/脂质复合体(诸如DOTMA或DODAC∶DOPE复合体)比较，在所述质粒/脂质复合体中DNA在这些处理后被基本降解(即，大于20％，通常80％)

实施例5.SNALPs的特征

该实施例描述在具有肿瘤的小鼠中，由静脉内施用SNALP包封的质粒导致的疾病位点靶向和基因表达。

质粒DNA包封在小的(直径～70nm)核酸-脂质颗粒(即，SNALP)中，所述核酸-脂质颗粒的每个颗粒包含一个质粒，所述颗粒被包封在脂双层中，通过双层稳定成分，诸如聚(乙二醇)(PEG)包衣的存在来稳定所述脂双层.SNALP显示在静脉内施用后的延长的循环生存期并促进完整的质粒递送到远端肿瘤位点，导致在疾病位点的报告基因表达.

具有长循环时间的SNALP累积到对应于每克肿瘤总注射剂量的百分之五到百分之十的水平或大于每个细胞1000个拷贝的质粒DNA的水平，引起这样的基因表达的水平，所述基因表达的水平比在任何其它组织中观察到的那些大于超过两个数量级。有趣的是，尽管肝积累20-30％的总注射剂量，在肝中观察到非常低的基因表达水平。认为这是由于PEG化的SNALP的肝细胞吸收受到限制所引起的。见，图8-10。

通过阳离子PEG脂质(CPL)的结合，进一步提高包含双层稳定成分的核酸-脂质颗粒的体内递送和转染潜力，所述阳离子PEG脂质(CPL)由DSPE锚，PEG₃₄₀₀间隔臂链和阳离子头部基团组成。当以2-4mol％的浓度将CPL结合到SNALP中时，得到的CPL-SNALP与天然SNALP具有相似的大小和稳定性。CPL的结合导致了在体外和体内测量的细胞内递送的急剧增加和转染活性的伴随增加。具体地，与天然SNALP相比，CPL-SNALP产生10⁵倍更多的体外基因表达。当CPL-SNALP被静脉内施用时，与天然SNALP相比，它们产生了肝基因表达的基本增加(250倍)。CPL-SNALP功效的增加特异于肝。在肺、肾、脾或心脏中测量的基因表达的水平保持不变，解释了在肝中测量的基因表达水平与其它器官相比多于两个数量级的差异。

这些结果举例说明了调节包含PEG-脂质的系统的递送特性，同时保持获得全身性基因递送所需要的稳定性和小的均一大小的可能。特别地，它们说明了疾病位点靶向和组织特异性基因表达可以通过改变非病毒基因递送系统的脂质组成来重新被进行规划。

实施例6.包含PEG-DAG缀合物的SNALPs

该实施例说明了一系列PEG-二酰基甘油脂质(PEG-DAG)SNALPs的制备。在该实施例中，被包封的核酸是质粒。

结合10mol百分比的PEG-二月桂基甘油(C₁₂)，PEG-二肉豆蔻基甘油(C₁₄)，PEG-二棕榈酰甘油(C₁₆)或PEG-二硬脂基甘油(C₁₈)制备PEG-DAGSNALP，并评价其体外传染活性，药物代谢动力学和在具有肿瘤的小鼠中由全身施用导致的基因表达的生物分布。与包含PEG-神经酰胺的那些相比，包含PEG-DAG脂质的SNALP显示在酰基链长度和体外转染活性之间的相似的关系。与结合更长酰基链锚(二硬脂基(C₁₈))的那些相比，更短的酰基链锚(二肉豆蔻基(C₁₄)和二棕榈酰(C₁₆))导致了较不稳定的SNALP颗粒在体外具有更高的转染活性。包含PEG-DAG的SNALP的药物代谢动力学的评价证实了在PEG脂质组成的稳定性和SNALP的循环生存期之间的相关性。包含PEG-二肉豆蔻基甘油(C₁₄)，PEG-二棕榈酰甘油(C₁₆)和PEG-二硬脂基甘油(C₁₈)的SNALP显示了循环半寿期分别为0.75，7和15小时。延长的循环生存期又与肿瘤递送的增加和伴随的基因表达相关。

在静脉内施用后，包含PEG-二硬脂基甘油(C₁₈)的SNALP绕过所谓的“第一通过”器官，包括肺，并在远端肿瘤组织中激发基因表达。与在任何其它组织中观察到的相比，在肿瘤中观察到的报道基因表达的水平表现出了高于其100-1000倍的差异。这可完全与包含PEG-神经酰胺C₂₀的SNALP的行为相比。在SNALP中PEG-DAG的结合证实了小尺寸，低表面电荷和延长的循环生存期是被动疾病位点靶向的必要条件，其导致了在非病毒转染系统的全身施用后在肿瘤中的质粒DNA和基因表达的累积。见，图5-10。

材料与方法

材料

DOPE和DSPC获自Northern Lipids(Vancouver，BC)。DODAC和PEG-二酰基甘油由Inex Pharmaceuticals(Burnaby，BC)生产。其它的材料，HEPES，OGP和³H-胆甾烯基十六烷基醚，获自许多不同的商业来源。

通过在Hepes缓冲盐溶液(150mM NaCl和10mM HEPES)中进行去污剂透析48小时来制备DOPE∶DODAC∶PEG-二酰基甘油(82.5∶7.5∶10)大单层泡。在乙醇中制备脂质贮存液，接着进行干燥以产生脂质薄膜，所述脂质薄膜在最终200mM OGP中重构。用³H-胆甾烯基十六烷基醚以1uCi/1mg脂质对LUVs进行标记。通过nicomp分析来确定颗粒大小。通过用Picofluor20进行闪烁计数来确定放射性。

通过改变盐浓度使DNA包封的百分比最大化的去污剂透析来配制包含PEG-二酰基甘油的SNALP。选择最佳的盐浓度来进行48小时的去污剂透析。通过一步蔗糖离心来将空小泡去除。将3.5％的蔗糖用于从包含质粒的PEG-二酰基甘油制剂中去除空颗粒，除了包含PEG-二肉豆蔻基甘油的SNALP使用5.0％的蔗糖。空小泡迁移到试管的顶部，其被分成小部分并被去除。

体外转染

将5x 10⁴细胞/ml接种到24-孔板上(1ml)。将细胞培养24小时。加入500μl的转染培养基(2.5μg/孔)并接着温育一定的时间。在时间点后，将转染培养基吸出，接着在37℃于5.0％CO₂中与完全培养基再接触24小时。去除完全培养基。用PBS将细胞洗涤2次并贮存于-70℃直到实验当天。用150μl的包含蛋白酶抑制剂的1x CCLR来裂解细胞。将平板摇动5分钟。在96孔发光平板上重复测定20μl的每个样品的萤光素酶活性。药物代谢动力学，生物分布和体内基因表达

药物代谢动力学和生物分布都通过使数据标准化来量化存在的放射性进行确定。通过心脏穿刺术(cardiac puncture)来获得约500μl的血液。通过离心(4℃，3000rpm，10分钟)来分离红血细胞和血浆并将100μl的血浆用于确定放射性计数。在具体时间点收集器官并在裂解基质管(FastPrep，2x 15秒，4.5强度)中进行匀浆化来测定混合物的部分。

通过萤光素酶测定来确定基因表达。收集器官，进行匀浆化并在整个实验中将其保持在冰上。将裂解物进行离心(10,000rpm，5分钟)并在96孔发光平板上重复测定20μl的上清液的萤光素酶活性。结果描述于图7-10中。

体外基因沉默

按照上述方法，用SPLP和SNALPs来转染细胞，所述SPLP包含PEG-脂质缀合物并包含编码在CMV启动子控制下萤光素酶的质粒，所述SNALPs包含抗-萤光素酶siRNA。通过萤光素酶测定来确定基因表达。将结果描述于图17中。

实施例7：被包封在SPLP中的核酸的表达，所述SPLP包括PEG-二烷氧基丙基缀合物

该实施例描述这样的实验，所述实验比较被包封在SPLP中的核酸的表达，所述SPLP包括PEG-二烷氧基丙基缀合物。所有的SPLP制剂包括编码在CMV启动子控制下萤光素酶的质粒(pLO55)。

所述脂质(DSPC∶CHOL∶DODMA∶PEG-脂质)在SPLP中以下列摩尔比(20∶55∶15∶10)存在。下列的制剂被制备

A：无菌过滤的PBS，5mL.

B：具有PEG-DSG的pL055-SPLP，2mL，在0.50mg/mL.

C：具有PEG-A-DSA的pL055-SPLP，2mL，在0.50mg/mL.

D：具有PEG-A-DPA的pL055-SPLP，2mL，在0.50mg/mL.

E：具有PEG-A-DMA的pL055-SPLP，2mL，在0.50mg/mL。

组	#小鼠	接种日期	处理	注射日期	收集日期
						A	4	第0天	PBS	第12天	第14天
B	5	第0天	SPLP PEG-DSG	第12天	第14天
						C	5	第0天	SPLPPEG-A-DSA	第12天	第14天
D	5	第0天	SPLPPEG-A-DPA	第12天	第14天
						E	5	第0天	SPLPPEG-A-DMA	第12天	第14天

在第0天，将1.5x10⁶Neuro2A细胞施用给每只小鼠。当肿瘤是合适大小(200-400mm³)时，小鼠被随机安排并通过静脉内(IV)注射用1剂量的SPLP制剂或PBS进行处理。剂量的量基于在给药日当天进行的体重测量。在SPLP施用后48小时，将小鼠处死，并收集它们的血液，收集下列组织：肿瘤，肝(切成两半)，肺，脾&心脏，进行称重，立即冷冻并贮存于-80℃直到进一步分析。

通过测定被表达的萤光素酶报道蛋白的酶促活性来确定在收集的组织中的基因表达。将结果显示于图11和12中。

所述结果说明包含PEG-二烷氧基丙基(即，PEG-DAA)的SPLP可以方便地用于转染远端肿瘤达到与包含PEG-二酰基甘油的SPLP相同的程度。而且，用包含PEG-二烷氧基丙基的SPLP所见的转染水平与用包含PEG-二酰基甘油(例如，PEG-DSG)的SPLP所见的那些相似。还显示与PEG-二酰基甘油系统相似，在非肿瘤组织中发生非常低的转染。而且，与其它SPLP制剂相比，包括PEG-二烷氧基丙基的SPLP显示减少的毒性。

实施例8：包含PEG-二烷氧基丙基缀合物的SNALPs

该实施例描述这样的实验，所述实验分析一系列PEG-二烷氧基丙基脂质SNALPs(即，包含被包封的siRNA的SPLP)的生物分布(局部和全身的)和药物代谢动力学。

局部生物分布

通过荧光显微镜，确定由对具有Neuro-2a肿瘤的小鼠全身性施用包含抗-β半乳糖苷酶siRNA的SNALP所导致的SPLP的局部分布。

A：PBS

B：抗-βgal siRNA-若丹明-PE标记-DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-A-DMASNALP(1∶20∶54∶15∶10)

组	小鼠	细胞	处理	时间点	测定
						A	2	Neuro2A	PBS	24hr	荧光可照相显微镜
B	5	Neuro2A	抗-Bgal siRNA-若丹明-PE标记的-DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-A-DMA	24hr	荧光可照相显微镜

在第0天，将1.5x10⁶Neuro2A细胞施用给每只小鼠。当肿瘤是合适的大小时(200-400mm³，典型地在第9-12天)，将小鼠随机安排，并通过总体积为230μl的静脉内(IV)注射用1剂量的包含100μg siRNA的SNALP制剂或PBS进行处理。剂量的量基于在给药日进行的体重测量。在SPLP施用后24小时，将小鼠处死，并收集它们的血液，收集如下的组织：肿瘤，肝(切成两半)，肺，脾&心脏，称重，立即将其进行冷冻并贮存于-80℃直到进一步的分析。

通过荧光显微镜来确定SNALP的局部分布.SNALP的积累见于例如，肝中，说明包括PEG-二烷氧基丙基的SNALP能够外渗，即脱离循环并回到靶组织或器官.

药物代谢动力学和全身生物分布

该实施例举例说明在皮下接种了Neuro2A肿瘤的小鼠中SPLPs和SNALPs的药物代谢动力学和生物分布，所述SPLPs包含编码在CMV启动子控制下萤光素酶的质粒(LO55)，所述SNALPs包含抗-萤光素酶siRNA。

组	小鼠	细胞	处理	时间点(h)
					A	6	Neuro2A	[3-H]CHE-L055-DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-A-DMA	0.25，1，4，8，24
B	6	Neuro2A	[3-H]CHE-抗-lucsiRNA-DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-A-DMA	0.25，1，4，8，24
					C	6	Neuro2A	[3-H]CHE-L055-DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-C-DMA	0.25，1，4，8，24
D	6	Neuro2A	[3-H]CHE-L055-pSPLP(PEI)	0.25，1，4，8，24
					E	6	Neuro2A	[3-H]CHE-L055-DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-DSG	0.25，1，4，8，24

所有的样品以0.5mg/ml核酸进行提供。制备如下的SPLP和SNALP制剂：

A.[³H]CHE-L055-DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-A-DMA(20∶55∶15∶10)

B.[³H]CHE-抗-luc siRNA-DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-A-DMA(20∶55∶15∶10)

C.[³H]CHE-L055-DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-C-DMA(20∶55∶15∶10)

D.[³H]CHE-L055-pSPLP(PEI)(即.，预浓缩的SPLP)

E.[³H]CHE-L055-DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-DSG(20∶55∶15∶10)

组	#小鼠	接种日期	处理	注射日期	收集日期
						A	6	第0天	[3-H]CHE-L055-DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-A-DMA	第12天	7月31

组	#小鼠	接种日期	处理	注射日期	收集日期
						B	6	第0天	[3-H]CHE-抗-lucsiRNA-DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-A-DMA	第12天	7月31
C	6	第0天	[3-H]CHE-L055-DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-C-DMA	第13天	第14天
						D	6	第0天	[3-H]CHE-L055-pSPLP(PEI)	第13天	第14天
E	6	第0天	[3-H]CHE-L055-DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-DSG	第14天	第15天

在第0天，以在50μL总体积的磷酸盐缓冲溶液中的1.5x 10⁶细胞的剂量，用Neuro 2A细胞对30只雄性A/J小鼠(Jackson Laboratories)进行皮下接种。在肿瘤达到合适大小后(典型地在第9天或其后)，将200μl(100μg核酸)的上述的SPLP或SNALP制剂进行静脉内施用。在施用SPLP或SNALP 0.25，1，2，4，和8小时后，将小鼠进行称重并通过尾端切口来收集血液(典型地25μL)。在SPLP或SNALP施用后24小时，将小鼠处死，收集血液并测定[³H]CHE的清除率。收集器官(例如，肝、肺、脾、肾、心脏)和肿瘤并进行[³H]CHE积累的评价。结果显示于图13-16。

对于所有的制剂，包含PEG-DSG的SPLP在循环中保持的时间最长，其中在6小时后，50％的被注射剂量仍旧保持。有趣的是，似乎在最初的15分钟内，是pSPLP的起始快速清除，这在任何其它制剂中都没有观察到。1小时后，pSPLP的清除模式与SPLP的非常相似。这种对于pSPLP样品的起始快速清除可以说明实际上有两种类型的颗粒存在，一种非常迅速地清除，一种的行为表现与SPLP非常相似。

与包含C18PEG-DSG的SPLP相比，用C14PEG-A-DMA配制的包含抗-Luc siRNA的小泡(SNALP)显示从血液中更加快速的清除。但是，与用相同的PEG脂质配制的SPLP相比，这种SNALP制剂显示明显更慢的血清清除。这种结果可能的原因可能是包含siRNA的颗粒可以比包含质粒的SPLP更容易地逃避细胞免疫系统。

包含PEG-C-DMA的SPLP证实了基本与在包含PEG-A-DMA的SPLP中观察到相同的从血液中的快速清除。对于这两种制剂而言，血浆半寿期是约2小时，比包含C18PEG-脂质的SPLP更低。

包含PEG-DSG的SPLP具有每克组织10.9％的注射剂量的最高的肿瘤积累。包含C14PEG-脂质，PEG-A-DMA和PEG-C-DMA的这两种SPLP制剂具有在每克组织6.1％和5.9％注射剂量的低得多的肿瘤积累。与具有相同的PEG-脂质的SPLP样品的7.3％相比，SiRNA SNALP具有稍稍更高的肿瘤积累，其还与这种SNALP的血浆半寿期具有相对良好的相关性。所述pSPLP制剂具有在7.5％的肿瘤积累，其比可比较的PEG-DSG SPLP更低。

在心脏和肺中包含PEG-DSG的SPLP和pSPLP的积累比其它的SPLP和SNALP更高，其与具有C18PEG-脂质的颗粒的增加的循环半寿期具有一致性.毫不令人惊奇地，对于所有被测试的样品而言，在血浆半寿期和肝中的积累之间存在反比关系，而对于脾中的样品累积则没有明显的趋势.对于所有的被测试制剂，在肾中的积累是非常低的，其中积累介于每克组织1.2和2.4％被注射的剂量之间.

实施例9：用SNALPS使基因表达沉默

该实施例举例说明在共施用SPLPs和SNALPs后，在具有Neuro 2A肿瘤的小鼠中的基因表达的沉默，所述SPLPs包含编码在CMV启动子控制下萤光素酶的质粒，所述SNALPs包含抗-萤光素酶siRNA。

在第0天，以在50μL磷酸盐缓冲溶液总体积中1.5x 10⁶细胞的剂量，用Neuro 2A细胞对36只雄性A/J小鼠(Jackson Laboratories)进行皮下接种。一旦肿瘤达到合适大小后(典型地在第9天或其后)，将200-240μl的PBS如上述实施例6描述所制备的SPLP，SNALP制剂(总共100μg核酸)进行静脉内施用。在施用PBS，SPLP或SPLP和SNALP的混合物24，48或72小时后，将小鼠处死，收集器官(例如，肝、肺、脾、肾、心脏)和肿瘤并进行萤光素酶活性的评价。将结果显示于图18-22中。

所述结果说明在单一iv给药后48小时，pL055SPLP和抗-luc siRNASNALP(都包含PEG-A-DMA)的共施用最大地减少萤光素酶基因表达达40％。

实施例10：在稳定转染的CT26-CL25细胞中的β-Gal活性的下调

制备包含针对β-半乳糖苷酶的报道基因的siRNA双链体的SNALP，并将其以1.0μg/mL siRNA的浓度应用到表达β-半乳糖苷酶的稳定的细胞系：CT26CL25中，所述CT26CL25以2x10⁴细胞/孔接种。使细胞暴露于SNALP达24小时并在96小时后测量β-半乳糖苷酶活性。在培养物的90％的细胞中观察到沉默，其与在体内40％的细胞中的靶蛋白的沉默相关。

实施例11：在单一静脉内施用后若丹明标记的SNALP的肝分布

制备SNALP，并将其通过尾静脉，静脉内施用于A/J小鼠，所述SNALP包含针对所用的β-半乳糖苷酶报道基因的siRNA双链体。在24小时收集组织，快速冷冻并进行切片以观察SNALP散布。用若丹明对细胞进行染色，并且用染细胞核的DAPI进行对比染色。SNALP的体内生物分布偏好肝，其中多到50％的被施用的SNALP材料被递送到肝中。发现被递送到肝中的SNALP以扩散模式，在整个肝中分布。

实施例12：在递送包封在包含阳离子脂质的SPLP中的siRNA后的基因表 达的沉默

该实施例描述了在用SNALP体外转染Neuro2A细胞后，比较核酸的表达的实验，所述SNALP包括：(1)DODAC，DODMA，或DLinDMA；(2)PEG-C-DMA；和(3)针对包封在SNALP中的萤光素酶的siRNA双链体(即，这样的siRNA，其包含下列序列：GAUUAUGUCCGGUUAUGUAUU并靶向互补于：GATTATGTCCGGTTATGTATT的DNA序列)。用编码在CMV启动子控制下萤光素酶的质粒(pLO55)来稳定转染Neuro2A细胞。接着，用SNALP转染稳定转染的细胞，所述SNALP包含15，20，25，30，35，或40％的DODAC，DODMA，或DLinDMA；2％PEG-C-DMA，和针对包封在SNALP中的萤光素酶的siRNA双链体。在用SNALP转染后48小时测量萤光素酶蛋白质的表达。与包含DODAC或DODMA的SNALP比较，包含30％DLinDMA的SNALP在减少Neuro2A细胞的萤光素酶表达中更加有效。这些结果显示在图23中。

DLinDMA，具有最低表观相变温度的最具融合性的脂质，当结合在SNALP中时，产生最大的击倒，其中萤光素酶表达仅是未处理对照的21％。随后是DLenDMA制剂(32％)和DODMA(54％)。如所观察到的在击倒效率和阳离子脂质的H_II相形成能力之间的紧密的相关性提示两种参数是关联的。

实施例13：包含不饱和的阳离子脂质的SNALP显示增加的基因沉默活性

评估了包含四种阳离子脂质(即，DSDMA，DODMA，DLinDMA，和DLenDMA)的每种的SNALP在稳定转染的Neuro2A细胞中影响基因沉默的能力.用包含抗-萤光素酶的siRNA的SNALP来处理被稳定转染以表达萤光素酶的Neuro2A细胞达48小时.通过比较在这些细胞中残余的萤光素酶活性和在用包含错配的siRNA的对照SNALP处理的细胞中残余的萤光素酶活性来评估基因沉默的效率.

包含饱和的脂质DSDMA的制剂证实没有活性。如在脂质烷基链中的不饱和增加时，RNA干扰的能力也增加，其中DLinDMA颗粒在基因表达中产生80％的击倒。³¹P-NMR确定DLinDMA在所述系列中具有最低的相变温度并因此，是最具融合性的脂质。包含DLenDMA，最不饱和的脂质的颗粒，与包含DLinDMA的那些相比，有效性稍低。通过t检验发现所有的结果具有显著性(在0.5μg/mL的siRNA浓度上P＜0.05，在1.0μg/mL的siRNA浓度上，P＜0.01)。误差条表示标准偏差，n＝3。将结果显示在图24中。

实施例14：各种SPLP制剂对器官的体内转染

该实施例描述了这样的实验，所述实验证实可以使用包含15％DLinDMA的SPLP来体内转染器官。将包封质粒的SPLP施用于具有Neuro2A肿瘤的雄性A/J小鼠，所述质粒编码在CMV启动子的控制下萤光素酶。所述SPLP具有下列制剂：

	样品描述
		A	SPLP-PEG<sub>2000</sub>-C-DMA(CHOL∶DSPC∶DODMA∶PEG<sub>2000</sub>-C-DMA 55∶20∶15∶10mol％)
B	SPLP-PEG<sub>2000</sub>DlinDMA(CHOL∶DSPC∶DlinDMA∶PEG<sub>2000</sub>-C-DMA 55∶20∶15∶10mol％)
		C	SPLP-PEG<sub>750</sub>-C-DMA/DODMA(CHOL∶DSPC∶DODMA∶PEG<sub>750</sub>-C-DMA 55∶20∶15∶10mol％)
D	SPLP-PEG<sub>750</sub>-C-DMA/DLinDMA(CHOL∶DSPC∶DlinDMA∶PEG<sub>750</sub>-C-DMA 55∶20∶15∶10mol％)0.41mg/ml
		E	SPLP-High PEG<sub>750</sub>-C-DMA(CHOL∶DSPC∶DODMA∶PEG<sub>750</sub>-C-DMA 50∶20∶15∶15mol％)
F	SPLP-High PEG<sub>750</sub>-C-DMA(CHOL∶DSPC∶DlinDMA∶PEG<sub>750</sub>-C-DMA 50∶20∶15∶15mol％)
		G	SPLP-DODAC(CHOL∶DSPC∶DODMA∶PEG<sub>2000</sub>-C-DMA∶DODAC 45∶20∶15∶10∶10mol％)0.35mg/ml

在SPLP静脉内施用后48小时，在肝、肺、脾、心脏和肿瘤中评估萤光素酶基因表达。将所述结果显示于图25中。

实施例15：用另外的SPLP制剂体内转染肿瘤

该实施例描述了这样的实验，其显示了用SPLP对器官进行体内转染，所述SPLP包含DLinDMA或DODMA和不同百分比(15％，10％，5％，或2.5％)的PEG-C-DMA。将包封编码萤光素酶的质粒的SPLP施用于具有Neuro2A肿瘤的雄性A/J小鼠中。所述SPLP具有下列制剂：

	Mol％(DSPC∶Chol∶PEG-C-DMA∶DXDMA
		A	20∶50∶15∶15(DODMA)
B	20∶55∶10∶15(DODMA)
		C	20∶60∶5∶15(DODMA)
D	20∶62.5∶2.5∶15(DODMA)
		E	20∶55∶10∶15(DLinDMA)
F	20∶60∶5∶15(DLinDMA)
		G	20∶62.5∶2.5∶15(DLinDMA)

在静脉内施用SPLP后48小时，在肿瘤中评估萤光素酶基因表达。将结果显示于图26中。

实施例16：包含PEG-C-DMA的脂质小泡的血液清除率

该实施例描述了这样的实验，进行所述实验来评估包含不同百分比的PEG-C-DMA的脂质小泡的血液清除率。将单一静脉内剂量的³H-CHE-标记的SPLP，SNALP，或空载小泡施用于雄性A/J小鼠。SPLP包含阳离子脂质DODMA，SNALP包含阳离子脂质DLinDMA。所述脂质小泡具有下列制剂：

组	处理	Mol％(DSPC∶Chol∶PEG-C-DMA∶阳离子脂质)
			A	空的小泡	20∶48∶2∶30
B	SNALP(DlinDMA，PEG-C-DMA)	20∶48∶2∶30
			C	SNALP(DlinDMA，PEG-C-DMA)	20∶55∶5∶20
D	SPLP(15mol％PEG-C-DMA)	20∶50∶15∶15
			E	SPLP(10mol％PEG-C-DMA)	20∶55∶10∶15
F	SPLP(5mol％PEG-C-DMA)	20∶60∶5∶15

在³H-CHE-标记的SPLP，SNALP，或空的小泡施用后1，2，4和24小时后，确定在小鼠的血浆中残余的脂质小泡的注射剂量的百分比。将所述结果显示于图27中。

实施例17：包含PEG-C-DMA的脂质小泡的生物分布

该实施例描述了这样的实验，进行所述实验来评估包含不同百分比的PEG-C-DMA的脂质小泡的生物分布。将单一静脉内剂量的³H-CHE-标记的SPLP，SNALP，或空的小泡施用于具有Neuro 2A肿瘤的雄性A/J小鼠。SPLP包含阳离子脂质DODMA，SNALP包含阳离子脂质DLinDMA。所述脂质小泡具有下列制剂：

组	处理	Mol％(DSPC∶Chol∶PEG-C-DMA∶阳离子脂质)
			A	空的小泡	20∶48∶2∶30
B	SNALP(DlinDMA，PEG-C-DMA)	20∶48∶2∶30
			C	SNALP(DlinDMA，PEG-C-DMA)	20∶55∶5∶20
D	SPLP(15mol％PEG-C-DMA)	20∶50∶15∶15
			E	SPLP(10mol％PEG-C-DMA)	20∶55∶10∶15
F	SPLP(5mol％PEG-C-DMA)	20∶60∶5∶15

在³H-CHE-标记的小泡施用后48小时，在小鼠的肝、脾、肺和肿瘤中评估脂质小泡的注射剂量的百分比。将所述结果显示于图28中。

实施例18：在远端肿瘤中使基因表达沉默

该实施例描述了这样的实验，所示实验显示在施用SNALP后，在远端肿瘤中的基因沉默，所述SNALP包含DLinDMA并包封抗-萤光素酶siRNA序列。

用质粒稳定转染Neuro 2A细胞来产生Neuro 2A-G细胞，所述质粒编码在CMV启动子的控制下萤光素酶(pLO55)。用Neuro2A-G细胞来接种雄性A/J小鼠。将包封抗-萤光素酶siRNA序列(即，siRNA包含下列序列：GAUUAUGUCCGGUUAUGUAUU并靶向互补于GATTATGTCCGGTTATGTATT的DNA序列)的SNALP静脉内施用于具有Neuro2A-G肿瘤的A/J小鼠。所述SNALP制剂如下：

组		Mol％(DSPC∶Chol∶PEG-C-DMA∶DLinDMA)
				PBS
A	抗萤光素酶SNALP	20∶48∶2∶30
			B	对照(反向序列)SNALP	20∶48∶2∶30

组		Mol％(DSPC∶Chol∶PEG-C-DMA∶DLinDMA)
			C	抗萤光素酶SNALP	20∶55∶5∶20
D	对照(反向序列)SNALP	20∶55∶5∶20
			E	抗萤光素酶SNALP	20∶55∶10∶15
F	对照(反向序列)SNALP	20∶55∶10∶15

在施用SNALP后48小时来测量萤光素酶基因表达，所述SNALP包含DLinDMA并包封抗-萤光素酶siRNA序列。将结果显示在图29中。

实施例19：在Neuro2A-G肿瘤细胞中的体外基因表达的沉默

该实施例描述了这样的实验，所述实验显示在接触如上面实施例3中所述的SNALP后，在哺乳动物细胞中的基因沉默，所述SNALP包括DLinDMA并且包封抗萤光素酶siRNA序列。用如上面的实施例3中所述的编码萤光素酶的质粒稳定转染Neuro 2A细胞以产生Neuro 2A-G细胞。所述Neuro 2A-G细胞与SNALP制剂接触达24或48小时。所述SNALP制剂包含PEG-C-DLA(C₁₂)或PEG-C-DMA(C₁₄)并且如下：

组	处理	Mol％(DSPC∶Chol∶PEG-C-DAA∶DLinDMA)
			A	SNALP(PEG-C-DLA)	20∶48∶2∶30
B	SNALP(PEG-C-DLA)	20∶45∶5∶30
			C	SNALP(PEG-C-DLA)	20∶40∶10∶30
D	SNALP(PEG-C-DMA)	20∶48∶2∶30

在用包封抗-萤光素酶的siRNA序列的SNALP接触Neuro 2A-G细胞后24或48小时，测量萤光素酶基因表达。将结果显示于图30中。

实施例20：在Neuro2A-G肿瘤细胞中的体外基因表达的沉默

该实施例描述了这样的实验，所述实验显示在接触如上面实施例3中所述的SNALP后，在哺乳动物细胞中的基因沉默，所述SNALP包括DLinDMA并且包封抗萤光素酶siRNA序列。用如上面的实施例3中所述的编码萤光素酶的质粒稳定转染Neuro 2A细胞以产生Neuro 2A-G细胞。在存在和不存在氯喹的情况下，Neuro 2A-G细胞接触SNALP制剂达48小时。所述SNALP制剂包含不同比例的PEG-C-DMA(C₁₄)和DODMA或DLinDMA.所述制剂如下：

组	处理	Mol％(DSPC∶Chol∶PEG-C-DAA∶DLinDMA)
			A	PBS	-
B	裸siRNA	-
			C	SNALP(PEG-C-DMA)	20∶40∶10∶30
D	SNALP(PEG-C-DMA)	20∶46∶4∶30
			E	SNALP(PEG-C-DMA)	20∶48∶2∶30
F	SNALP(PEG-C-DMA)	20∶49∶1∶30

在用包封抗-萤光素酶的siRNA序列的SNALP接触Neuro 2A-G细胞后48小时，测量萤光素酶基因表达。将结果显示于图31中。

要理解的是上述描述意欲举例说明而不是限制性的。在阅读上述描述后，许多实施方案将对于本领域那些技术人员而言是显而易见的。因此，本发明的范围应该不是参考上述描述来确定，而是应该参考后附的权利要求连同被授予这些权利要求的等价物的充分范围来确定。出于所有的目的，将所有的文章和参考文献，包括专利申请，专利和PCT出版物的内容和Genbank登记号并入本文作为参考。

Claims (44)

1.一种核酸-脂质颗粒，所述核酸-脂质颗粒包括：

(a)干扰RNA；

(b)式I的阳离子脂质，其具有下列结构：

其中R¹和R²独立地选自由H和C₁-C₃烷基组成的组；并且

R³和R⁴独立地选自由具有10-20个碳原子的烷基基团组成的组，其中R³和R⁴至少其中之一包括至少两个不饱和位点；

(c)非阳离子脂质；和

(d)抑制颗粒聚集的缀合的脂质。

2.权利要求1的核酸-脂质颗粒，其中所述阳离子脂质选自由下列各项组成的组：1，2-二亚油基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷，1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷，和它们的混合物。

3.权利要求1的核酸-脂质颗粒，其中在所述核酸-脂质颗粒中的所述干扰RNA在水溶液中对核酸酶的降解具有抗性。

4.权利要求1的核酸-脂质颗粒，其中所述颗粒具有少于150nm的中径。

5.权利要求1的核酸-脂质颗粒，其中所述干扰RNA是小的干扰RNA。

6.权利要求1的核酸-脂质颗粒，其中所述干扰RNA是15-60bp长度的双链RNA。

7.权利要求1的核酸-脂质颗粒，其中所述干扰RNA转录自质粒。

8.权利要求1的核酸-脂质颗粒，其中所述干扰RNA是双链RNA。

9.按照权利要求1的核酸-脂质颗粒，其中所述非阳离子脂质是选自由下列各项组成的组的成员：二油酰-磷脂酰乙醇胺，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱，卵磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱，胆固醇，及其混合物。

10.按照权利要求1的核酸-脂质颗粒，其中抑制颗粒聚集的缀合的脂质是选自由下列各项组成的组的成员：聚乙二醇-脂质缀合物，聚酰胺-脂质缀合物，及其混合物。

11.按照权利要求1的核酸-脂质颗粒，其中抑制颗粒聚集的缀合的脂质包含聚乙二醇-脂质，并且所述聚乙二醇-脂质是选自由下列各项组成的组的成员：聚乙二醇-二酰基甘油，聚乙二醇-二烷氧基丙基，聚乙二醇-磷脂，聚乙二醇-神经酰胺及其混合物。

12.按照权利要求11的核酸-脂质颗粒，其中抑制颗粒聚集的缀合的脂质包含聚乙二醇-二烷氧基丙基缀合物。

13.按照权利要求12的核酸-脂质颗粒，其中所述聚乙二醇-二烷氧基丙基缀合物是选自由下列各项组成的组的成员：聚乙二醇-二月桂基氧基丙基，聚乙二醇-二肉豆蔻基氧基丙基，聚乙二醇-二棕榈基氧基丙基，聚乙二醇-二硬脂基氧基丙基，和它们的混合物。

14.按照权利要求1的核酸-脂质颗粒，其中抑制颗粒聚集的缀合的脂质具有式：A-W-Y(式VII)

其中A是脂质部分；

W是亲水性聚合物；和

Y是聚阳离子部分。

15.权利要求14的核酸-脂质颗粒组合物，其中W是选自由下列各项组成的组的聚合物：聚乙二醇、聚酰胺、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物及其组合，所述聚合物具有250到7000道尔顿的分子量。

16.权利要求14的核酸-脂质颗粒组合物，其中Y在生理的pH具有至少4个正电荷。

17.权利要求14的核酸-脂质颗粒组合物，其中Y是选自由下列各项组成的组的成员：赖氨酸，精氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，及其组合。

18.核酸-脂质颗粒在制备用于通过将细胞与所述核酸-脂质颗粒接触而将干扰RNA引入所述细胞的药物中的应用，其中所述核酸-脂质颗粒包括：

(a)所述干扰RNA；

(b)式I的阳离子脂质，其具有下列结构：

其中：

R¹和R²独立地选自由H和C₁-C₃烷基组成的组；并且

R³和R⁴独立地选自由具有10-20个碳原子的烷基基团组成的组，其中R³和R⁴至少其中之一包括至少两个不饱和位点；

(c)非阳离子脂质；和

(d)抑制颗粒聚集的缀合的脂质。

19.权利要求18的应用，其中在所述核酸-脂质颗粒中的所述干扰RNA在水溶液中对核酸酶的降解具有抗性。

20.权利要求18的应用，其中所述颗粒具有少于150nm的中径。

21.权利要求18的应用，其中所述干扰RNA是小的干扰RNA。

22.权利要求18的应用，其中所述干扰RNA转录自质粒。

23.权利要求18的应用，其中所述非阳离子脂质是选自由下列各项组成的组的成员：二油酰-磷脂酰乙醇胺，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱，卵磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱，棕榈酰油酰磷脂酰甘油，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺，二棕榈酰磷酸乙醇胺，二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺，16-O-单甲基PE，16-O-二甲基PE，18-1-反式PE，棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺，1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺，胆固醇及其混合物。

24.权利要求18的应用，其中抑制颗粒聚集的缀合的脂质是选自由下列各项组成的组的成员：聚乙二醇-脂质缀合物，聚酰胺-脂质缀合物，及其混合物。

25.权利要求18的应用，其中抑制颗粒聚集的缀合的脂质是聚乙二醇-脂质。

26.权利要求25的应用，其中所述聚乙二醇-脂质是选自由下列各项组成的组的成员：聚乙二醇-二酰基甘油、聚乙二醇-二烷氧基丙基、聚乙二醇-磷脂，聚乙二醇-神经酰胺及其混合物。

27.权利要求26的应用，其中抑制颗粒聚集的缀合的脂质是聚乙二醇-二烷氧基丙基缀合物。

28.权利要求27的应用，其中所述聚乙二醇-二烷氧基丙基缀合物是聚乙二醇-二肉豆蔻基氧基丙基。

29.权利要求18的应用，其中所述细胞来自哺乳动物。

30.权利要求29的应用，其中所述哺乳动物是人。

31.核酸-脂质颗粒在制备用于体内递送干扰RNA到哺乳动物受试者的药物中的应用，其中所述核酸-脂质颗粒包括：

(a)所述干扰RNA；

(b)式I的阳离子脂质，其具有下列结构：

其中R¹和R²独立地选自由H和C₁-C₃烷基组成的组；并且

R³和R⁴独立地选自由具有10-20个碳原子的烷基基团组成的组，其中R³和R⁴至少其中之一包括至少两个不饱和位点；

(c)非阳离子脂质；和

(d)抑制颗粒聚集的缀合的脂质。

32.权利要求31的应用，其中所述哺乳动物是人。

33.权利要求32的应用，其中所述人具有与基因的表达相关的疾病或病症，并且其中所述基因的表达通过所述干扰RNA来减少。

34.权利要求33的应用，其中所述疾病或病症与所述基因的过量表达相关。

35.权利要求31的应用，其中所述药物适于静脉内施用。

36.核酸-脂质颗粒，所述核酸-脂质颗粒包括

(a)干扰RNA；

(b)式I的阳离子脂质，其具有下述结构：

其中：

其中R¹和R²独立地选自由H和C₁-C₃烷基组成的组；并且

R³和R⁴独立地选自由具有10-20个碳原子的烷基基团组成的组，其中R³和R⁴至少其中之一选自由十二碳二烯基，十四碳二烯基，十六碳二烯基，亚油基，二十碳二烯基，十二碳三烯基，十四碳三烯基，十六碳三烯基，亚麻基和二十碳三烯基组成的组；

(c)非阳离子脂质；和

(d)聚乙二醇-脂质缀合物。

37.权利要求36的核酸-脂质颗粒，其中R³和R⁴至少其中之一选自由亚油基和亚麻基组成的组。

38.权利要求36的核酸-脂质颗粒，其中R¹和R²都是甲基。

39.权利要求38的核酸-脂质颗粒，其中R³和R⁴都是亚油基。

40.权利要求38的核酸-脂质颗粒，其中R³和R⁴都是亚麻基。

41.权利要求36的核酸-脂质颗粒，其中所述非阳离子脂质是选自由下列各项组成的组的成员：二油酰-磷脂酰乙醇胺，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱，卵磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱，胆固醇，及其混合物。

42.权利要求36的核酸-脂质颗粒，其中所述聚乙二醇-脂质缀合物是选自由下列各项组成的组的成员：聚乙二醇-二酰基甘油，聚乙二醇-二烷氧基丙基，聚乙二醇-磷脂，聚乙二醇-神经酰胺及其混合物。

43.权利要求42的核酸-脂质颗粒，其中所述聚乙二醇-脂质缀合物是聚乙二醇-二烷氧基丙基缀合物。

44.权利要求43的核酸-脂质颗粒，其中所述聚乙二醇-二烷氧基丙基缀合物是选自由下列各项组成的组的成员：聚乙二醇-二月桂基氧基丙基，聚乙二醇-二肉豆蔻基氧基丙基，聚乙二醇-二棕榈基氧基丙基，聚乙二醇-二硬脂基氧基丙基，和它们的混合物。

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