CN104352440A - 一种阳离子脂质体核酸类药物制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸转染阳离子脂质体，包含该阳离子脂质体的核酸类药物制剂，及其制备方法和用途。所述阳离子脂质体包含阳离子脂质，辅脂质和聚乙二醇修饰的中性脂质。所述阳离子脂质体核酸类药物制剂包含阳离子脂质体和核酸类药物制剂。本发明涉及的阳离子脂质体作为一种非病毒类基因载体，细胞毒性低，血液稳定性强，而且基因沉默效率高。对于恒定表达荧光素酶的HepG-2细胞的最高基因沉默效率为90.8％。该阳离子脂质体具有优秀的抗非特异性蛋白吸附性能，长循环能力强，这有利于提高脂质体的稳定性和运转效率，并且有利于有效地提高核酸类药物的药效，可用于医药领域等。
Description
技术领域
本发明属于药物输送领域，具体涉及一种药用载体阳离子脂质体，尤其涉及一种含有阳离子脂质分子CL1的阳离子脂质体，包含该阳离子脂质体的核酸类药物制剂及其制备方法和应用。
背景技术
基因转染是将具有生物功能的核酸(包括DNA，反义寡核苷酸及RNAi)转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。单独的核酸分子在组织或细胞中易被核酶降解，且核酸分子自身带有负电荷，不利于渗透进入带负电荷的细胞膜。
早期的转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。因此，研究人员积极开发了多种基因载体，并且在其选择性、安全性和高效性上不断进行研究和改进。目前，研究和临床应用中常用的载体大致分为病毒载体和非病毒载体两类。病毒载体是一种常使用于分子生物学的工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞进行感染的分子机制，可发生于完整活体或是细胞培养中。病毒载体因其高效而倍受关注，但其负载量低、特异性不强、安全性差等缺点，给临床应用带来很大障碍。非病毒载体主要包括阳离子聚合物和阳离子脂质体，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。阳离子聚合物基因载体相对于病毒载体具有一定优势，然而其基因转染效率低，所用聚合物材料多为非生物可降解材料，尤其是反复给药后这些材料容易积聚于体内，可能会引发毒性反应。
脂质体是指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型囊泡体。阳离子脂质体通常由阳离子脂质和辅脂质在适当的条件下复合而成，其中阳离子脂质通过静电作用与基因复合，而辅脂质则起到防止脂质氧化或将配体连接至脂质体的表面的作用或者可以减少脂质颗粒的聚集。
与阳离子聚合物相比，阳离子脂质体具有低毒、生物相容性好及转染效率高等优点，是一种应用较为广泛的非病毒基因载体。但是阳离子脂质体在临床应用仍然存在困难。阳离子脂质体基因复合物由于表面带有正电荷，易于与血浆中的血清蛋白产生非特异性吸附，形成大尺寸的聚集体，该聚集体易被网状内皮系统清除，导致其血液循环时间短，稳定性差，运转效率低。为此，需要对阳离子脂质体进行表面修饰，制备长循环阳离子脂质体。目前常用的长循环阳离子脂质体修饰试剂为基于聚乙二醇(PEG)的脂质分子，如二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)分子。PEG通过氢键和溶剂中的水分子作用，在被修饰的阳离子脂质体表面形成一层水合层，掩盖阳离子脂质体表面正电荷，从而达到抑制蛋白质吸附并减少吞噬系统识别的作用。因此，我们设计的新型脂质体采用我们已发明的阳离子脂质分子CL1和聚乙二醇(PEG)的中性脂质以及另外一种辅脂质构建，该阳离子脂质体既具有较强运载核酸类药物的作用，又具有在体内长循环的能力，而且细胞毒性低、血清稳定性好，操作简单，基因转染效率高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种药用载体阳离子脂质体，特别是一种操作简单，并具有优异抗非特异性蛋白吸附性能的阳离子脂质体核酸类药物制剂，及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
在第一方面，本发明提供了一种阳离子脂质体，其包含阳离子脂质CL1，辅脂质和聚乙二醇修饰的中性脂质。
其中，所述的阳离子脂质CL1的结构式如下：
其中：
R1为-(CH2)n-O-、-(CH2)n-COS-、-(CH2)n-CONH-、-(CH2)n-COO-、-(CH2)n-OCOO-、-(CH2)n-、-(CH2)n-S-或不存在，其中n为0～5的整数值；
R2为-(CH2)n-O-、-(CH2)n-COS-、-(CH2)n-CONH-、-(CH2)n-COO-、-(CH2)n-OCOO-、-(CH2)n-、-(CH2)n-S-或不存在，其中n为0～5的整数值；
X为氢、取代或未取代的C10-18烷基、取代或未取代的C10-18烷氧基、取代或未取代的C6-12芳基-C10-18烷基、取代或未取代的杂芳基-C10-18烷基、取代或未取代的C6-12芳氧基-C10-18烷基、取代或未取代的杂芳氧基-C10-18烷基、取代或未取代的C10-18环烷基、取代或未取代的C10-18环烷基-C10-18烷基、取代或未取代的杂环基-C10-18烷基中的任意1种；
R3独立地选自氢、取代或未取代的C1-10烷基、取代或未取代的C1-10烷氧基、取代或未取代的C6-12芳基-C1-8烷基、取代或未取代的杂芳基-C1-8烷基、取代或未取代的C6-12芳氧基-C1-8烷基、取代或未取代的杂芳氧基-C1-8烷基、取代或未取代的C3-10环烷基、取代或未取代的C3-10环烷基-C1-8烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基-C1-8烷基中的任意1种。
本发明所述的阳离子脂质CL1的制备方法包括以下步骤：
化合物(I)的合成：叔胺分子与Y-X反应得到化合物(I)
下面按照上述反应式说明本发明的具体制备方法。
所述制备方法包括：叔胺分子与Y-X反应得到化合物(I)。
本发明中所述叔胺分子为含有羟基，氨基，巯基或卤素接头的亲水基团的分子，优选为含有羟基。
本发明中所述Y-X为含有羧基和/或酰氯接头的化合物，优选为含有羧基。
本发明中所述反应以二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、正己烷、乙醚、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜或甲苯中的任意1种或至少2种的组合为溶剂，优选为甲苯。
本发明中所述反应以磷酸，硼酸，有机磺酸，盐酸盐及硫酸盐，阳离子交换树脂，多种沸石(包括合成分子筛)和各种改性沸石及氧化物催化剂，杂多酸以及固体超强酸等为催化剂，优选为对甲基苯磺酸。
本发明中所述反应温度为80～150℃，进一步优选为100～120℃，特别优选为110℃。
其中，本发明中的阳离子脂质CL1结构简单，具有叔胺头部以及两条疏水尾部。
本发明中的辅脂质可以为本领域中熟知的可用于制备阳离子脂质体的各种辅脂质，例如可以是1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和/或胆固醇(Cholesterol)，优选为胆固醇。
本发明中的聚乙二醇修饰的中性脂质，例如可以是聚乙二醇修饰的脂质分子为聚乙二醇500-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇2000-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇500-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇500-1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺或聚乙二醇2000-1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺中的至少一种，优选为聚乙二醇2000-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或聚乙二醇2000-1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺，更优选为聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。
本发明的阳离子脂质体，其中，阳离子脂质CL1：辅脂质：聚乙二醇修饰的中性脂质(摩尔比)＝N1:N2:N3，其中N1为0.1～100，例如可以是0.1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100，优选为10～90，更优选为40～70，N2为0.1～100，例如可以是0.1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100，优选为10～90，更优选为10～55，N3为0.1～100，例如可以是0.1、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50，60、70、80、90、100，优选为1～50，更优选为5～20。
第二方面，本发明提供了如第一方面所述的阳离子脂质体的制备方法，所述方法例如可以为薄膜分散法，超声分散法，反相蒸发法，冷冻干燥法，冻融法，复乳法或注入法，优选为注入法，薄膜分散法或超声分散法。
作为优选技术方案，本发明的阳离子脂质体的制备方法采用注入法，所述注入法包含以下步骤：
(1)称取阳离子脂质CL1，辅脂质和聚乙二醇修饰的中性脂质，使其在有机溶剂中充分溶解，摇匀，形成油相；
(2)量取处方量的酸性缓冲溶液于圆底烧瓶中，在水浴中，磁力搅拌下用注射器将油相缓慢注入酸性缓冲溶液中，并继续搅拌定量一段时间得到脂质体混悬液；
(3)将得到的脂质体混悬液装入透析袋中，用酸性缓冲溶液作为透析液将脂质体混悬液中的有机溶剂透出，每隔一段时间更换一次透析液；
(4)将透析后的脂质体样品装入离心管并定容为最终体系。
本发明的上述方法中，步骤(1)中的有机溶剂为乙醚，乙醚/甲醇混合物，或乙醇，优选为乙醇。
本发明步骤(2)中所述酸性缓冲溶液的pH为1～7，优选为3～5，更优选为3.5～4.0。
本发明步骤(2)中所述水浴温度为20～70℃，优选为30～60℃，更优选为40℃。
本发明步骤(2)中所述磁力搅拌速度为30～300r/min，优选为30～100r/min，更优选为40r/min。
本发明步骤(2)中所述继续搅拌定量时间为0.5h～5h，优选为1h～3h，更优选为2h。
第三方面，本发明还提供了一种阳离子脂质体核酸类药物制剂，其包含如第一方面所述的阳离子脂质体、核酸类药物制剂工作液和有待转染的核酸。
其中，所述的核酸类药物是RNA、DNA、反义核酸、质粒、干扰核酸、适体、antagomir、miRNA、核酶及siRNA中的一种或两种以上的混合物。优选地，所述核酸类药物制剂工作液为去离子水、超纯水、磷酸盐缓冲液或生理盐水，优选为磷酸盐缓冲液或生理盐水，更优选为生理盐水。
本发明的阳离子脂质体核酸类药物制剂中，阳离子脂质体：工作液＝(0.05～20)g：100mL，优选为(0.1～10)g：100mL，更优选为(0.2～5)g：100mL。
第四方面，本发明还提供了如第三方面所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂的制备方法，包含下述步骤：
(1)将所述阳离子脂质体在所述核酸类药物制剂工作液中平衡；
(2)将核酸类药物加入平衡后的阳离子脂质体与核酸类药物制剂工作液的混合物中进行复合；
其中，所述平衡时间为0.1～10h，优选为0.3～5h，更优选为0.5～2.5h。
所述复合时间为0.1～10h，优选为0.3～5h，更优选为0.5～1.5h。
第五方面，本发明还提供了一种阳离子脂质体制剂，其包含如第一方面所述的阳离子脂质体，和工作液，所述工作液为生理盐水。
第六方面，本发明还提供了如第一方面所述的阳离子脂质体、如第三方面所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂或如第五方面所述的阳离子脂质体制剂在基因转染试剂盒或核酸类药物制备中的用途。
第七方面，本发明还提供了如第一方面所述的阳离子脂质体、如第三方面所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂或如第五方面所述的阳离子脂质体制剂在用于治疗由基因异常表达引起的相关疾病的药物制备中的用途，所述疾病包括遗传病，例如血友病、囊性纤维病和家庭型高胆固醇血症；恶性肿瘤，例如血癌、淋巴癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌、结肠癌、食管癌、胃癌、大肠癌、鼻咽癌、脑肿瘤、宫颈癌、前列腺癌和骨癌；心血管疾病；以及感染性疾病，例如艾滋病和类风湿。
本发明的阳离子脂质体基因转染的机制和原理在于：
(1)阳离子脂质体基因转染复合物的形成：阳离子脂质体表面带有正电荷，而基因药物携带负电荷，二者通过静电相互结合形成阳离子脂质体基因转染复合物；(2)阳离子脂质体基因转染复合物表面带有正电荷，通过静电相互作用吸附到带负电荷的细胞表面，利用细胞内吞作用进入细胞，形成内涵体；(3)阳离子脂质体中的阳离子脂质与内涵体中带负电荷的脂质发生静电相互作用，带负电荷的脂质由内涵体的腔外翻转到腔内，与正电荷脂质形成中性离子对，基因脱离阳离子脂质体后进入细胞质；(4)转染入细胞的基因在细胞内发挥相应功能。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明的阳离子脂质体具有细胞毒性低，血液稳定性强，而且基因沉默效率高等优点，其中，对于恒定表达荧光素酶的HepG-2细胞的最高基因沉默效率为90.8％；
(2)本发明的阳离子脂质体具有优秀的抗非特异性蛋白吸附性能，长循环能力强，这有利于提高脂质体的稳定性和运转效率，并利于有效提高核酸类药物的药效，可广泛用于医药领域等。
附图说明
图1是本发明实施例1所制备的化合物(I)CL1脂质分子的1H NMR谱图。
图2为本发明的阳离子脂质体制剂冷冻电镜图。
图3为本发明的阳离子脂质体核酸类药物制剂基因复合能力图。
图4为本发明的阳离子脂质体核酸类药物制剂血清稳定性结果图。
图5为本发明的阳离子脂质体核酸类药物制剂细胞毒性结果图。
图6为本发明的阳离子脂质体核酸类药物制剂细胞基因转染结果图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
实施例1
脂质分子CL1(化合物(I))的合成
称取50.27g(176.7mmol)硬脂酸，18.3g(96.2mmol)对甲基苯磺酸，取约350mL甲苯溶解，在温度为110℃条件回流反应；1h之后，在混合液中加入9.56g(80.2mmol)N-甲基二乙醇胺(NMA)，反应过夜；第二天，停止加热，加入30mLNaCl饱和溶液萃取。采用旋转蒸发仪除去溶剂甲苯，加入适量二氯甲烷，抽滤，得白色固体，继而柱层析提纯，得终产物，其结构表征如图1所示。实施例2阳离子脂质体核酸类药物制剂的制备
1)制备阳离子脂质体：称取摩尔比例为6:3:1的阳离子脂质CL1，胆固醇和DSPE-PEG，使其在乙醇中充分溶解，摇匀，形成油相，至浓度为1mg/mL；量取体积为3倍量乙醇的pH值为3的酸性缓冲溶液于圆底烧瓶中，在30℃水浴中，速率为30r/min的磁力搅拌下用注射器将油相缓慢注入酸性缓冲溶液中，并继续搅拌1h后得到脂质体混悬液；将得到的脂质体混悬液装入透析袋中，用酸性缓冲溶液作为透析液将脂质体混悬液中的乙醇透出，每隔一段时间更换一次透析液；将透析后的脂质体样品装入离心管并定容为最终体系。
2)制备核酸类药物制剂工作液：取0.03mL的生理盐水作为核酸类药物制剂的工作液。
3)制备阳离子脂质体核酸类药物制剂：称取0.2g的阳离子脂质体，溶于100mL核酸类药物制剂工作液，平衡30min。按照质量比为5/1、25/1，50/1，100/1，150/1和200/1分别取相应量的siRNA溶于10μL的生理盐水，与溶有阳离子脂质体的核酸类药物制剂工作液混合，复合30min，制备得本发明所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂。
实施例3阳离子脂质体核酸类药物制剂的制备
1)制备阳离子脂质体：称取摩尔比例为6:3:1的阳离子脂质CL1，胆固醇和DSPE-PEG，使其在乙醚中充分溶解，摇匀，形成油相，至浓度为1mg/mL；量取体积为3倍量乙醚的pH值为3.5的酸性缓冲溶液于圆底烧瓶中，在40℃水浴中，速率为40r/min的磁力搅拌下用注射器将油相缓慢注入酸性缓冲溶液中，并继续搅拌2h后得到脂质体混悬液；将得到的脂质体混悬液装入透析袋中，用酸性缓冲溶液作为透析液将脂质体混悬液中的乙醚透出，每隔一段时间更换一次透析液；将透析后的脂质体样品装入离心管并定容为最终体系。
2)制备核酸类药物制剂工作液：取0.03mL的生理盐水作为核酸类药物制剂的工作液。
3)制备阳离子脂质体核酸类药物制剂：称取5g的阳离子脂质体，溶于100mL核酸类药物制剂工作液，平衡20min。按照质量比为5/1、25/1，50/1，100/1，150/1和200/1分别取相应量的siRNA溶于10μL的生理盐水，与溶有阳离子脂质体的核酸类药物制剂工作液混合，复合30min，制备得本发明所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂。
实施例4阳离子脂质体核酸类药物制剂的制备
1)制备阳离子脂质体：称取摩尔比例为6:3:1的阳离子脂质CL1，胆固醇和DSPE-PEG，使其在乙醚和甲醇的混合物中充分溶解，摇匀，形成油相，至浓度为1mg/mL；量取体积为3倍量乙醚和甲醇的混合物的pH值为4.0的酸性缓冲溶液于圆底烧瓶中，在60℃水浴中，在速率为150r/min的磁力搅拌下用注射器将油相缓慢注入酸性缓冲溶液中，并继续搅拌3h得到脂质体混悬液；将得到的脂质体混悬液装入透析袋中，用酸性缓冲溶液作为透析液将脂质体混悬液中的乙醚和甲醇的混合物透出，每隔一段时间更换一次透析液；将透析后的脂质体样品装入离心管并定容为最终体系。
2)制备核酸类药物制剂工作液：取0.03mL的生理盐水作为核酸类药物制剂的工作液。
3)制备阳离子脂质体核酸类药物制剂：称取10g的阳离子脂质体，溶于100mL核酸类药物制剂工作液，平衡1h。按照质量比为5/1，25/1，50/1，100/1和150/1分别取相应量的siRNA溶于10μL的生理盐水，与溶有阳离子脂质体的核酸类药物制剂工作液混合，复合30min，制备得本发明所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂。
实施例5阳离子脂质体核酸类药物制剂的制备
1)制备阳离子脂质体：称取摩尔比例为6:3:1的阳离子脂质CL1，胆固醇和DSPE-PEG，使其在乙醇中充分溶解，摇匀，形成油相，至浓度为1mg/mL；量取体积为3倍量乙醇的pH值为5酸性缓冲溶液于圆底烧瓶中，在70℃水浴中，在速率为100r/min的磁力搅拌下用注射器将油相缓慢注入酸性缓冲溶液中，并继续搅拌5h得到脂质体混悬液；将得到的脂质体混悬液装入透析袋中，用酸性缓冲溶液作为透析液将脂质体混悬液中的乙醇透出，每隔一段时间更换一次透析液；将透析后的脂质体样品装入离心管并定容为最终体系。
2)制备核酸类药物制剂工作液：取0.03mL的生理盐水作为核酸类药物制剂的工作液。
3)制备阳离子脂质体核酸类药物制剂：称取0.1g的阳离子脂质体，溶于100mL核酸类药物制剂工作液，平衡2h。按照质量比为5/1、25/1，50/1，100/1，150/1和200/1分别取相应量的siRNA溶于10μL的生理盐水，与溶有阳离子脂质体的核酸类药物制剂工作液混合，复合30min，制备得本发明所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂。
实施例6阳离子脂质体核酸类药物制剂的制备
1)制备阳离子脂质体：称取摩尔比例为6:3:1的阳离子脂质CL1，胆固醇和DSPE-PEG，使其在乙醚中充分溶解，摇匀，形成油相，至浓度为1mg/mL；量取体积为3倍量乙醚的pH值为1的酸性缓冲溶液于圆底烧瓶中，在20℃水浴中，在速率为30r/min磁力搅拌下用注射器将油相缓慢注入酸性缓冲溶液中，并继续搅拌得到脂质体混悬液；将得到的脂质体混悬液装入透析袋中，用酸性缓冲溶液作为透析液将脂质体混悬液中的乙醚透出，每隔一段时间更换一次透析液；将透析后的脂质体样品装入离心管并定容为最终体系。
2)制备核酸类药物制剂工作液：取0.03mL的生理盐水作为核酸类药物制剂的工作液。
3)制备阳离子脂质体核酸类药物制剂：称取20g的阳离子脂质体，溶于100mL核酸类药物制剂工作液，平衡15min。按照质量比为5/1、25/1，50/1，100/1，150/1和200/1分别取相应量的siRNA溶于10μL的生理盐水，与溶有阳离子脂质体的核酸类药物制剂工作液混合，复合30min，制备得本发明所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂。
实施例7阳离子脂质体核酸类药物制剂的形态研究
脂质体做冷冻透射电镜观察需要负染色处理样品。样品分散后用带支持膜的铜网滴片后，滤纸轻轻吸干，染色数分钟后，用滤纸吸干染液后，半小时后上机观察。结果如图2所示，本发明所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂具有均匀且分散的形态，粒径较小，在70nm左右。
实施例8阳离子脂质体核酸类药物制剂的基因复合能力的研究
具有强的基因复合能力是核酸类药物制剂成功的关键因素，本实施例8采用琼脂糖凝胶渗透电泳实验考察本发明所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂的基因复合能力。称取1.0g的琼脂糖溶于50mL的1×TBE溶液中，在微波炉中加热使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却，加入5μL的核酸染料Gel Green于冷却的琼脂糖凝胶中，凝胶加入凝胶槽，自然晾干。将不同复合比的阳离子脂质体/siRNA复合物(实施例1所述)与2μL的6×Loading Buffer的混合液加入到琼脂糖凝胶孔内，设置电泳电压为90V进行电泳实验，常温下电泳10min。结果如图3所示，本发明所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂在100/1比例时能够完全复合住siRNA，具有很强的siRNA复合能力。
实施例9阳离子脂质体核酸类药物制剂的血清稳定性的研究
体内循环过程中存在大量带负电荷的血清蛋白，易与正电荷的阳离子脂质体发生吸附，形成大尺寸的聚集体而被单核吞噬系统清除，导致阳离子脂质体基因转染效率降低。本实验考察了本发明所述阳离子脂质体核酸类药物制剂的血清稳定性。将质量比为100/1和150/1的基因制剂(实施例2所述)加入含有10％胎牛血清(FBS)的培养基中，在37℃条件下搅拌，定时取样测定核酸类药物制剂的粒径变化，通过粒径变化来分析核酸类药物制剂的血清稳定性。结果如图4所示，在7天内，本发明的阳离子脂质体核酸类药物制剂的粒径变化小，说明其具有很好的血清稳定性。
实施例10阳离子脂质体核酸类药物制剂的细胞毒性
良好的生物相容性是核酸类药物制剂应用的前提，本实验采用HepG2细胞模型，考察了不同质量比条件下的阳离子脂质体核酸类药物制剂的细胞毒性。将HepG2细胞以1×104的密度接种于96孔板中，培养24h。将不同质量比的含有0.25μg siRNA的制剂(实施例1所述)加入含有10％FBS的培养基中，培养24h。每孔加入10μL的MTT于培养基中，在37℃条件下孵育4h。移除培养基，加入100μL的DMSO，在37℃条件下孵育5min，溶解MTT结晶。采用酶联免疫检测仪在波长为490nm条件下测定吸光度值，以未处理细胞为参照，计算细胞存活率。结果如图5所示，本发明阳离子脂质体核酸类药物制剂在不同质量比下，细胞存活均大于80％，说明该核酸类药物制剂具有很好的生物相容性。
实施例11阳离子脂质体核酸类药物制剂的基因转染效率
为了考察本发明核酸类药物制剂的基因转染效果，本实验以稳定表达荧光素酶的Luc-HepG细胞为模型，考察不同质量比的包覆siRNA的制剂(实施例2所述)的基因转染效率。细胞培养到细胞密度达到65％～75％时，将核酸类药物制剂加入培养基中，在37℃条件下培养24小时，换上新鲜培养基继续培养24h。采用溶解缓冲液处理细胞，用荧光素酶测试试剂盒，在底物发光化学检测仪上测定荧光强度。以未处理细胞为参照，结果如图6所示，本发明阳离子脂质体核酸类药物制剂与裸siRNA相比具有很好的基因沉默效果。
通过上述实施例可以看出，本发明的阳离子脂质体具有细胞毒性低，血液稳定性强，基因沉默效率高等优点，其中，对于恒定表达荧光素酶的HepG-2细胞的最高基因沉默效率可达到90.8％；具有优秀的抗非特异性蛋白吸附性能，长循环能力强，这有利于提高脂质体的稳定性和运转效率，并利于有效提高核酸类药物的药效，可广泛用于医药领域等。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种阳离子脂质体，其特征在于，所述阳离子脂质体包含阳离子脂质CL1，辅脂质和聚乙二醇修饰的中性脂质；
其中，所述的阳离子脂质CL1的结构式如下：
其中：
R1为-(CH2)n-O-、-(CH2)n-COS-、-(CH2)n-CONH-、-(CH2)n-COO-、-(CH2)n-OCOO-、-(CH2)n-、-(CH2)n-S-或不存在，其中n为0～5的整数值；
R2为-(CH2)n-O-、-(CH2)n-COS-、-(CH2)n-CONH-、-(CH2)n-COO-、-(CH2)n-OCOO-、-(CH2)n-、-(CH2)n-S-或不存在，其中n为0～5的整数值；
X为氢、取代或未取代的C10-18烷基、取代或未取代的C10-18烷氧基、取代或未取代的C6-12芳基-C10-18烷基、取代或未取代的杂芳基-C10-18烷基、取代或未取代的C6-12芳氧基-C10-18烷基、取代或未取代的杂芳氧基-C10-18烷基、取代或未取代的C10-18环烷基、取代或未取代的C10-18环烷基-C10-18烷基、取代或未取代的杂环基-C10-18烷基中的任意1种；
R3独立地选自氢、取代或未取代的C1-10烷基、取代或未取代的C1-10烷氧基、取代或未取代的C6-12芳基-C1-8烷基、取代或未取代的杂芳基-C1-8烷基、取代或未取代的C6-12芳氧基-C1-8烷基、取代或未取代的杂芳氧基-C1-8烷基、取代或未取代的C3-10环烷基、取代或未取代的C3-10环烷基-C1-8烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基-C1-8烷基中的任意1种。
2.如权利要求1所述的阳离子脂质体，其特征在于，
所述辅脂质为1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或胆固醇(Cholesterol)中的至少一种，优选为胆固醇；
优选地，所述聚乙二醇修饰的脂质分子为聚乙二醇500-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇2000-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇500-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇500-1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺或聚乙二醇2000-1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺中的至少一种，优选为聚乙二醇2000-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或聚乙二醇2000-1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺中的至少一种，更优选为聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。
3.如权利要求1或2所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述阳离子脂质CL1：辅脂质：聚乙二醇修饰的中性脂质的摩尔比为N1:N2:N3，其中N1为0.1～100，优选为10～90，更优选为40～70，N2为0.1～100，优选为10～90，更优选为10～55，N3为0.1～100，优选为1～50，更优选为5～20。
4.如权利要求1-3任一项所述的阳离子脂质体的制备方法，其特征在于，采用下述方法制备所述的阳离子脂质体，所述方法为薄膜分散法，超声分散法，反相蒸发法，冷冻干燥法，冻融法，复乳法或注入法中的任意一种，优选为注入法，薄膜分散法或超声分散法中的任意一种。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述注入法包含以下步骤：
(1)称取阳离子脂质CL1，辅脂质和聚乙二醇修饰的中性脂质，使其在有机溶剂中充分溶解，摇匀，形成油相；
(2)量取处方量的酸性缓冲溶液于圆底烧瓶中，在水浴中，磁力搅拌下用注射器将油相缓慢注入酸性缓冲溶液中，并继续搅拌定量得到脂质体混悬液；
(3)将得到的脂质体混悬液装入透析袋中，用酸性缓冲溶液作为透析液将脂质体混悬液中的有机溶剂透出，每隔一段时间更换一次透析液；
(4)将透析后的脂质体样品装入离心管并定容为最终体系。
其中，优选地，所述有机溶剂为乙醚，乙醚/甲醇混合物，或乙醇中的任意一种，优选为乙醇；
优选地，所述酸性缓冲溶液的pH为1～7，优选为3～5，更优选为3.5～4.0；
优选地，所述水浴温度为20～70℃，优选为30～60℃，更优选为40℃；
优选地，所述磁力搅拌速度为30～300r/min，优选为30～100r/min，更优选为40r/min；
优选地，所述继续搅拌定量时间为0.5～5h，优选为1～3h，更优选为2h。
6.一种阳离子脂质体核酸类药物制剂，其特征在于，所述核酸类药物制剂包含如权利要求1-3任一项所述的阳离子脂质体、核酸类药物制剂工作液和有待转染的核酸；
其中，优选地，所述的核酸类药物为RNA、DNA、反义核酸、质粒、干扰核酸、适体、antagomir、miRNA、核酶及siRNA中的至少一种；
优选地，所述核酸类药物制剂工作液为去离子水、超纯水、磷酸盐缓冲液或生理盐水中的任意一种，优选为磷酸盐缓冲液或生理盐水，更优选为生理盐水；
优选地，所述阳离子脂质体：核酸类药物制剂工作液＝(0.05～20)g：100mL，优选为(0.1～10)g：100mL，更优选为(0.2～5)g：100mL。
7.如权利要求6所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包含下述步骤：
(1)将所述阳离子脂质体在所述核酸类药物制剂工作液中平衡；
(2)将所述核酸类药物加入平衡后的阳离子脂质体与核酸类药物制剂工作液的混合物中进行复合；
其中，优选地，所述平衡时间为0.1～10h，优选为0.3～5h，更优选为0.5～2.5h；
优选地，所述复合时间为0.1～10h，优选为0.3～5h，更优选为0.5～1.5h。
8.一种阳离子脂质体制剂，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的阳离子脂质体和工作液，优选地，所述工作液为生理盐水。
9.如权利要求1-3任一项所述的阳离子脂质体、权利要求6所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂或权利要求8所述的阳离子脂质体制剂在基因转染试剂盒或核酸类药物制备中的用途。
10.如权利要求1-3任一项所述的阳离子脂质体、权利要求6所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂或权利要求8所述的阳离子脂质体制剂在用于治疗由基因异常表达引起的相关疾病的药物制备中的用途，所述疾病包括遗传病，例如血友病、囊性纤维病或家庭型高胆固醇血症；恶性肿瘤，例如血癌、淋巴癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌、结肠癌、食管癌、胃癌、大肠癌、鼻咽癌、脑肿瘤、宫颈癌、前列腺癌或骨癌；心血管疾病；或感染性疾病，例如艾滋病或类风湿。
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| PB01 | Publication | ||
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Application publication date: 20150218 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |