CN1980668A - 通过作用于类固醇依赖性基因激活路径不同步骤中抑制剂的组合而增强抗雄激素活性及用途 - Google Patents

Abstract

本发明包括用于抑制或减少类固醇依赖性基因激活的方法和组合物，包括作用于类固醇受体基因激活路径中不同步骤的至少两种化合物的施加。优选的方法包括施加能诱导类固醇受体降解的第一化合物，然后施加能抑制类固醇受体路径不同步骤中基因激活的第二化合物。当该至少两种化合物结合或一起施加的时候，可以更好地减少或抑制、调节或控制类固醇依赖性基因激活。

Description

通过作用于类固醇依赖性基因激活路径不同步骤中抑制剂的组合而增强抗雄激素活性及用途

相关申请的交叉参考

本发明要求2004年1月28日递交的美国临时专利申请60/539,753发明名称为“通过作用于雄性诱导AR激活路径不同步骤中抑制剂的组合而增强抗雄激素活性及其用途”，在此全文引入作为参考。

技术领域

本发明涉及通常用于类固醇相关医疗情况的治疗方法和组合物。更特别地，本发明包括通过施加至少两种作用于类固醇诱导基因激活路径不同步骤中的化合物从而抑制或减少类固醇依赖性基因的激活。

背景技术

雄激素受体(AR)是类固醇受体超家族。类固醇受体当与同源荷尔蒙配体结合时作为转录因子。类固醇受体通常包括配体结合区(LBD)、铰链区和DNA结合区(DBD)。

雄激素通过进入靶细胞并与特定雄激素受体(AR)结合而发挥作用，导致雄激素调节基因的激活。男性循环雄性荷尔蒙，即睾丸激素，通过5-α还原酶在外周组织中转换成主要的细胞内雄激素，二氢睾酮(DHT)。医药公司研究出抑制睾丸激素转化成DHT或者妨碍在雄激素和AR之间结合的药物。例如，5-α还原酶抑制剂、非那雄胺(Prosca和Propecia)和雄激素-AR结合抑制剂，氟他胺(flutamide)和比卡鲁胺(bicalutamide)(康士德Casodex)，是非类固醇抗雄激素，其用于治疗良性前列腺增生、前列腺癌和其他雄激素紊乱。但是，这些抗雄激素药引起副作用，例如在某些男性接受治疗过程的阳痿。主要由于这些抗雄激素导致了雄激素活性的无差异性抑制。

雄激素诱导的AR激活路径是多步骤方法(例如，Lee和Chang(2003)J.Clin.Endocrinol.Metab.，88：4043-4054，在此全文引入作为参考)，并且没有简单涉及雄激素和AR的结合。AR激活路径可以通过如下步骤总结：

1)AR表达：雄激素靶细胞，在其细胞核中携带AR基因，其通过转录AR基因(DNA)成AR信使RNA(AR mRNA)从而表达AR蛋白质。AR mRNA移动进入细胞质，其中发生AR合成。合成的AR蛋白质与伴侣蛋白质(热休克蛋白质，例如hsp70和hsp90)形成复合物，其使得AR蛋白质稳定并且有助于维持它们与配体(雄激素)的结合力。

2)细胞内雄激素的转运：睾丸激素从循环中进入靶细胞并且通过酶5-α还原酶I和II转化成主要的细胞内激素，二氢睾酮(DHT)。

3)雄激素受体激活、二聚合和定位：细胞质雄激素(DHI)与AR结合，其然后从伴侣蛋白质上分离形成雄激素-AR复合物，该复合物然后转移进入细胞核。在结合与转移的过程中，雄激素-AR复合物被蛋白质激酶磷酸化并进行二聚合。

4)与AR辅调节因子相互作用：二聚合AR蛋白质也可以与其他调节蛋白质作用，也就是，AR辅调节因子或雄激素受体相关的蛋白质(ARA)，其增加或减少调节AR活性。

5)雄激素响应元件结合：在细胞核内，雄激素-AR-ARA复合物作为转录因子，在雄激素调节基因的启动子区域结合雄激素响应元件(ARE)，恢复其他涉及总转录机制中的调节蛋白质，该调节蛋白质导致雄激素响应靶基因的激活(表达或再表达)。

发明内容

本发明涉及用于抑制或减少类固醇依赖性基因激活的新方法和组合物，包括至少两种化合物的施加。该化合物可以施加到生物样品例如真核细胞或生物体例如人体中。该第一化合物能诱导类固醇受体的降解，第二化合物能抑制或减少由类固醇受体引起的基因激活。第二化合物可以作用于类固醇受体基因激活路径中的不同步骤。第二化合物可以抑制类固醇与类固醇受体之间的结合，类固醇受体结合到类固醇响应元件上，类固醇受体结合到类固醇受体相关的蛋白质或协同因子上，类固醇受体的细胞核转移，类固醇受体的转录，或者类固醇受体的翻译。当至少两种上述化合物结合或一起施加时，相对于单一化合物施加，可以更多地减少或抑制类固醇依赖性基因的激活。

在本发明的另一方面，一种组合物包括诱导类固醇受体降解的第一组合物和抑制类固醇受体激活基因的第二化合物。该第一和第二化合物作用于类固醇受体路径中的不同点和步骤。

在本发明的另一方面中，一种药物组合物包括第一化合物或药学上可接受的盐用于诱导类固醇受体的降解，第二化合物或药学上可接受的盐用于抑制类固醇依赖性基因的激活，以及药学上可接受的稀释液、辅剂或载体。该第一化合物和第二化合物作用于类固醇受体路径中不同步骤，并且当结合使用时，提供药学上有效量。当类固醇受体是雄激素受体时，可用的化合物的例子包括但不限于姜黄素衍生物或类似物(例如但不限于ASCJ-9和ASCJ-15)，比卡鲁胺(bicalutaminde)，羟基氟他胺(hydroxyflutamide)，二十二碳六烯酸(DHA)，水飞蓟宾(Silibinin，SB)，栎精(QU)，非那斯提(finesteride)，度他雄胺(dutasteride)，或其功能性衍生物。

在本发明的另一方面，一种预防或治疗人体内类固醇调节的医疗情况的方法包括提供怀疑患有类固醇调节的医疗情况的个体，然后施加药学上有效量的至少一种公开的药物组合物。该药物组合物包括能减少或抑制类固醇依赖性基因激活的至少两种化合物，作用于类固醇受体路径的不同步骤。优选地，当该至少两种化合物结合或一起使用时，相对于单独施加，较大程度地减少或抑制类固醇依赖性基因激活。受益于本发明的医疗情况的例子包括但不限于痤疮、多毛症、雄激素脱发症(雄性秃头)、良性前列腺增生、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、肝癌、乳腺癌和子宫颈癌。

在本发明的另一方面，公开了用于伤口或炎症治疗的方法和组合物，该方法包括向个体施加一种或更多公开的组合物、药物或化妆品进行伤口或炎症的有效治疗。

在本发明的另一方面，提供人体内施加公开的组合物或药物的方法，与类固醇依赖性基因激活相关的抑制或减少。该方法还包括封装入脂质体中并且将封装的组合物或要求施加进入需要的个体。

附图的简要说明

图1显示了来自细胞溶解的人前列腺癌细胞，LNCaP细胞的Western凝胶图像，当施加1μM姜黄素衍生的化合物ASCJ-15时，用考马斯蓝(Coomassie Blue)染色显示雄激素受体(AR)内生水平的显著降低。睾丸激素所产生的荷尔蒙，二氢睾酮，或者载体对照加入到根据实施例1以2nM培养24小时的LNCaP细胞中。雄激素受体(AR)的相对密度也以DHT或者对照载体描述，并且通过正常化雄激素受体(AR)信号与肌动蛋白的信号而得出。

图2显示了来自细胞溶解的人前列腺癌细胞，LNCaP细胞的Western凝胶图像，当在1μM姜黄素衍生的化合物ASCJ-15存在时，用考马斯蓝染色显示雄激素受体的降解。特别地，小格1、4、7和10相应于LNCaP培养的细胞；小格2、5、8和11相应于用1μM ASCJ-15处理的培养的LNCaP细胞，一种姜黄素衍生物；以及小格3、6、9和12相应于用负对照处理的培养的LNCaP细胞，维生素E。安置于上述引用的小格中的时间阶段相应于在环己胺，一种蛋白质合成抑制剂，加入到培养基后的时间。提供β-肌动蛋白作为对照显示所有的蛋白质没有降解。

图3显示了在人前列腺癌细胞(LNCaP细胞)中，ASCJ-15，一种姜黄素的衍生物，以及二十二碳六烯酸(DHA)对于雄激素诱导基因激活的抑制效果的图表。根据实施例1，使用图中所述抑制剂的浓度进行雄激素受体(AR)反式激活检测。当DHA和ASCJ-15单独可以抑制DHT诱导反式激活时，DHA和ASCJ-15的结合显示了对雄激素受体(AR)活性的最大抑制。

图4显示了ASCJ-15和DHA对于雄激素诱导的人前列腺癌细胞生长的抑制效果图。ASCJ-15和DHA单独相对于载体对照可以更多抑制LNCaP细胞的生长。但是，当结合施加ASCJ-15和DHA时，发现得到LNCaP细胞生长的最大抑制。

图5显示了羟基氟他胺(HF)，一种氟他胺的代谢物，和二十二碳六烯酸(DHA)，单独或者结合对于人前列腺癌细胞中雄激素诱导的基因活性抑制效果的示意图。当HF和DHA可以抑制DHT诱导的雄激素受体(AR)活性时，结合使用HF和DHA时观察到DHT诱导的活性的最大抑制。

图6显示了ASCJ-15和水飞蓟宾(SB)单独和结合对于人前列腺癌细胞(LNCaP细胞)中雄激素诱导基因激活的抑制效果的示意图。ASCJ-15和SB可以显著抑制DHT诱导雄激素受体活性。当一起施加ASCJ-15和SB时，具有抑制DHT诱导基因激活的附加效果。

图7显示了ASCJ-15和SB对于雄激素诱导LNCaP细胞生长的抑制效果。当单独施加ASCJ-15和SB时，观察到DHT诱导细胞生长的显著抑制。当联合施加时，ASCJ-15和SB表现出对于DHT诱导细胞生长抑制的附加效果。

图8显示了ASCJ-15和栎精(QU)单独和结合使用在人前列腺癌细胞中对雄激素诱导基因激活的抑制效果的示意图。当ASCJ-15和QU单独施加时，观察到DHT诱导雄激素受体(AR)的显著抑制。当ASCJ-15和QU联合施加时，观察到协同作用。

图9显示了羟基氟他胺(HF)，一种氟他胺的代谢物，和ASCJ-15单独和联合使用对野生型雄激素诱导基因激活的抑制效果的示意图。ASCJ-15和HF可以显著抑制野生型DHT诱导雄激素受体活性。当ASCJ-15和SB一起施加时，对DHT诱导基因激活的抑制具有附加效果。

具体实施方式

本发明包括用于类固醇依赖性基因激活调节的方法和组合物。本发明中的方法和组合物包括至少两种化合物的使用，每种都能调节、抑制、制止或减少与类固醇受体相关的激活或效果。两种化合物作用于类固醇受体基因激活路径中不同步骤，从而得到类固醇受体的效果或活性的附加调节或抑制。与单一化合物独立使用或单独施加相比，两种化合物的使用可以提供增加的抑制、调节或调整。

I.使用抑制剂的组合来抑制或减少类固醇依赖性基因激活的方法

本发明包括使用抑制剂的组合来调节或减少类固醇受体效果的方法。类固醇受体，例如雄激素受体(AR)、黄体酮受体(PR)、肾上腺皮质激素受体(GR)、甲状腺受体、过氧化酶体增殖物激活受体(PPAR)、类维生素AX受体(RXR)和孤生类固醇受体以及类似的，通过一系列在类固醇和类固醇受体之间结合的发生调节基因转录，并通过类固醇受体和相应的类固醇响应元件(SRE)之间的相互作用导致基因激活。更特别地，类固醇受体基因调节或激活路径可以包括类固醇结合类固醇受体、类固醇受体的二聚合(选择地形成同型二聚体)、类固醇受体移动到细胞核、类固醇受体结合辅助因子(例如ARA)、类固醇受体结合到适合的类固醇响应元件以及选择地转录因子的激活。通过施加作用于类固醇受体路径的至少两种化合物，本发明提供一种对于不同情况的潜在治疗方法。优选地，该至少两种化合物作用于类固醇受体路径上不同步骤，使得当一起施加或协同施加时，该化合物能在两点调节类固醇受体的效果。这提供了类固醇依赖性基因调节的更多控制或抑制，从而提供在疾病或类固醇相关情况治疗中相关的优势。

该方法可以应用于生物样品包括隔离的细胞，例如用于化验的体外生长的真核细胞或者完整的活生物体。适合的生物体包括哺乳动物的研究、农业或经济利益，包括啮齿动物、兔类动物、犬科动物、猫科动物、猪类、牛科动物和非人灵长类。生物体包括任何年龄、性别或身体状况的人。生物的特定利益包括诊断为例如具有或者处于发展危险的疾病状况或医疗情况的人，也就是说，至少部分受到类固醇或类固醇受体活性的影响。例子包括但不限于受到雄激素或雄激素受体(AR)、黄体酮或黄体酮受体(PR)、雌激素或雌激素受体(ER)以及类似的影响的情况。可以使用公开的方法或化合物治疗的疾病或医疗情况包括但不限于癌症例如前列腺癌、肝癌、膀胱癌、子宫颈癌、肺癌和乳腺癌，以及涉及雄激素受体激活路径、神经和神经肌肉紊乱的其他癌症，例如但不限于肯尼迪氏症(Kennedy Disease)，皮肤病例如痤疮，其是由脂肪腺的雄激素诱导AR激活而引起的，毛发病例如多毛症和雄性脱发症或“男性秃头”，其中头发缺少是由于在细胞囊和临近细胞中的雄激素受体而引起的，以及伤口治愈或炎症的治疗。

雄激素受体的两种异构体(全长AR-B和N-终端切除的AR-A)以免疫学可检测形式在许多胚胎和成人人组织中表达(Wilson和McPhaul(1996))。在男性和女性胚胎生殖组织中发现高水平AR，并且在非生殖胚胎组织中有不同的水平。也在成人生殖组织(前列腺、子宫内膜、卵巢、子宫、输卵管、睾丸、精囊、子宫肌和射精管)中发现高水平AR，而在成人胸部、大肠、肺和肾上腺组织中具有较低水平。

AR路径对于男性生殖器官和非生殖器官(包括肌肉、发囊和大脑)的发展和适当功能是特别重要的。也涉及几种疾病或情况的病理学，包括前列腺癌、男性不孕和肯尼迪氏症。

根据影响范围和普及程度，前列腺癌是美国男性中最常见的恶性肿瘤。它是在美国最经常诊断的肿瘤以及引起美国人癌症相关死亡处于第二位的疾病(Boring等，1992)。每年超过180,000名男性患上前列腺癌，大约与女性患上乳腺癌的数目相同。其在1999年引起31,900名美国男性的死亡，仅在肺癌之后处于第二位。每年前列腺癌发生的增长与美国男性人口的老化相关。

前列腺癌细胞生长依赖于雄激素受体(AR)的雄激素诱导激活。大多数前列腺癌在第一次诊断时取决于雄激素，因此使用抗雄激素进行治疗。转移的前列腺癌的一种有效治疗是雄激素阻滞治疗，其应用外科或化学切除，结合使用抗雄激素治疗，从而抑制雄激素的生物作用(Crawford等，1989)。但是，肿瘤响应于类固醇消耗的中间阶段只是18～36个月，并且癌症几乎总是复发并且变成雄激素非响应性。在这种情况下，病人面对更小希望的治疗，例如化疗。在某些情况下，抗雄激素的变更延缓了复发的前列腺肿瘤的进展(Dupont等，1993；Taplin等，1999)，这显示了对于特定抗雄激素治疗复发的前列腺肿瘤可以响应于另外不同的抗雄激素。

肯尼迪氏症-已知为肯尼迪氏疾病，脊髓和延髓性肌萎缩或脊髓延髓性肌萎缩(SBMA)或肯尼迪综合症(参考例如Paul E.Barkhaus(2003)“肯尼迪氏症”可以由http://www.emedicine.com/neuro/topic421.htm获得的在线电子出版物，2004年4月15日公开)-是非常罕见的，与X相关的隐形基因神经肌肉疾病，估计全世界每40,000个体中有1人患病。确信肯尼迪氏症是由雄激素受体突变而引起的，包括在AR基因的N终端区域异常的长聚谷氨酸盐扩张。它是一直生长的，目前无法治疗和治愈。脊髓和延髓神经都受到侵袭，引起全身的肌肉乏力和萎缩，最显著的是在神经末梢和脸部和喉咙。肯尼迪氏症引起说话和吞咽的困难，主要是肌肉抽筋，以及其他症状。成人发作的症状通常出现在30到50岁之间，尽管也有稍早的记录。只有带有这种遗传基因的男性发展为疾病的全显性，然而这种基因杂合的女性通常是无症状的携带者。在某些情况下，杂合肯尼迪氏症基因的女性表现出亚临床显性表达。寿命通常没有受到影响。

带有变异AR的细胞具有扩增的聚谷氨酸盐复制(例如，带有质粒p6RARQ49或p6RARQ77)进行实验性转染，显示与减少的反式激活功能，并且在某些情况下，与错折叠的AR蛋白质的细胞核内包容物相关(Chamberlain等，(1994)NucleicAcidRes.，22：3181-3186，在此引入全文作为参考)。这种异常AR的细胞核内积聚是细胞毒素，引发神经细胞的死亡，符合肯尼迪氏症的体内病理学。

诱导类固醇受体的降解

本发明包括抑制或减少类固醇依赖性基因激活的方法，包括施加一种诱导类固醇或类固醇受体降解的化合物，与抑制或减少类固醇受体基因激活的第二种化合物联合或一起使用，优选作用于类固醇受体基因激活路径的不同点或步骤。当一起结合使用时，这种化合物的结合可以提供协同的、附加的或增加的抑制。该第二种化合物可以抑制类固醇转化成更活跃的形式，干扰或抑制类固醇和类固醇受体之间的结合，干扰或抑制类固醇受体和相应的响应元件之间的结合，干扰类固醇受体和辅助因子或与蛋白质相关的类固醇受体(例如选自ARA家族之一)之间的相互作用，减少或防止类固醇受体的细胞核转移，减少或抑制类固醇受体的转录，或者干扰或抑制类固醇受体的翻译。

当使用本发明方法减少或抑制雄激素依赖性基因激活时，优选至少一个施加的化合物可以诱导雄激素受体的降解。能诱导雄激素受体降解的化合物包括姜黄素衍生物和类似物，例如但不限于ASCJ-9和ASCJ-15。本发明所概括的衍生物和类似物包括姜黄素化合物，其具有改变的、减少的或增加的可以导致类固醇或雄激素受体降解的特性。

ASCJ-9或二甲基姜黄素是5-羟基-1，7-双(3，4-二甲氧基-苯基)-1，4，6-庚三烯-3-酮并且具有以下结构：

ASCJ-15是7-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-4-[3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酰]-5-酮-庚-6-烯酸乙酯，并且具有以下结构：

图1和图2描述了通过姜黄素衍生物ASCJ-15的施加二进行雄激素受体的降解。化合物ASCJ-9和ASCJ-15具有相似的降解能力。其他具有特定用途的姜黄素衍生物和类似的化合物在美国专利6,790,979中描述，在此全文引入作为参考。

通过本发明方法或化合物可以利用或诱导一种或更多类固醇受体降解机制。优选地，化合物的施加导致靶类固醇受体的特定降解，而没有实质性改变其他、非靶类固醇受体的水平或活性。

希望诱导靶类固醇受体的降解在靶组织或细胞类型中得到不同的程度。例如，由于不同的组织或细胞类型对给定的类固醇有不同程度的响应，希望诱导适当的类固醇受体的降解在一个组织或细胞类型中而不是另一个，或者希望根据组织或细胞的类型而降低靶类固醇受体到不同的极限或水平。在某些实施方式中，本方法包括施加化合物以足够的量使得给定组织或细胞类型中的靶类固醇受体降解，因此降低类固醇受体的影响到所希望的水平(例如，其中类固醇受体是雄激素受体，所希望的雄激素受体的水平是实质上对循环雄激素没有响应的一种水平)。

本发明方法可以利用任何一种或更多适合的机制来诱导类固醇受体的降解。这些机制包括但不限于干扰类固醇受体转移到细胞核中或者将类固醇受体保留在细胞的细胞质中，暴露可以诱导蛋白酶活性的类固醇受体中的基序，增加能降解类固醇受体的蛋白酶的活性，抑制类固醇受体的稳定性，减少类固醇受体的溶解性，激活能降解类固醇受体的路径，增加类固醇受体的泛素化(ubiquination)，增加由激酶引起的类固醇受体的磷酸化(例如，在雄激素受体的情况下，通过激活Akt激酶，其在至少某些情况下磷酸化雄激素受体，引导受体的泛素化以及随之蛋白体的降解；参考，例如Heinlein和Chang(2004)和Lin等(2002)EMBO J.，21：4037-4048，在此全文引入作为参考)，诱导凋亡，或者减少类固醇受体和可以稳定类固醇受体的辅助因子例如ARA之间的相互作用。

在某些实施方式中，本发明方法包括通过干扰类固醇受体转移进入细胞核从而诱导类固醇受体的降解。例如，雄激素受体，类似许多其他类固醇受体，从细胞质转移到细胞核，其中它们利用锌指基序调节基因。当阻碍转移或保留雄激素受体在细胞质内，雄激素受体经过蛋白质水解，因此不能影响细胞核DNA或调节的基因。

在其他实施方式中，通过暴露类固醇受体中能在蛋白酶存在下诱导蛋白质水解的位点或基序，本发明方法和组合物诱导类固醇受体的降解。可以通过诱导类固醇受体内区域的构象变化而发生这种暴露，例如将一种化合物结合到类固醇受体或通过磷酸化类固醇受体的区域。相信通过泛蛋白依赖性蛋白体路径，或者替代地通过独立的胱天蛋白酶3-依赖性路径，可以降解雄激素受体(Lee和Chang(2003))。支持泛蛋白依赖性蛋白体路径的证据包括高保守PEST(脯氨酸-，谷氨酸-，丝氨酸-，和苏氨酸-富含)序列的存在，认为对于靶蛋白质在AR铰链区域进行泛素化；以及发现蛋白体抑制导致升高的AR水平(Lin等(2002)EMBO J.，21：4037-4048)。AR是磷蛋白质，并且能被Akt磷酸化。Akt的构成表达增强AR的泛素化并且在雄激素二氢睾酮(DHT)的存在或不存在下显著减少AR水平；通过蛋白体抑制剂MG132来阻碍cAkt的效果(Lin等(2002))。另外，相信Akt磷酸化Mdm2，一个泛蛋白连接酶(E3连接酶)；Mdm2与Akt和AR形成复合体，对于AR作为E3连接酶，并且促进AR泛素化和随后由蛋白体引起的降解。

相信胱天蛋白酶-3-依赖性路径(Lee和Chang(2003))是独立于泛蛋白-蛋白体路径的。肿瘤抑制物、磷酸酶和张力蛋白同族体(PTEN)的表达，干扰AR转移到LNCaP细胞的细胞核内，并且促进AR蛋白质降解。PTEN可以干扰AR DNA结合区域，引导保持AR在细胞质中以及AR降解。

在另一实施方式中，本发明方法包括通过防止或减少类固醇受体的稳定性来诱导类固醇受体的降解。通过抑制两个或更多类固醇受体之间的相互作用，或者通过防止或减少类固醇受体与辅助因子之间的相互作用，来进行防止或减少稳定性。在一个实施例中，相信雄激素受体与其第二拷贝进行二聚合形成同源二聚体，这增加受体的稳定性。通过受体的氨基终端相互作用发生二聚合。防止二聚合，例如，通过施加在或靠近氨基终端区域结合能减少或消除二聚合的化合物，可以诱导雄激素受体的降解，因此抑制雄激素受体激活路径。在另一实施方式中，类固醇受体和辅助因子之间的相互作用可以被打断，因此诱导类固醇受体的降解。例如，热休克蛋白质(HSP)是结合于并稳定雄激素受体的辅助因子(以及作为其他蛋白质的伴侣)。确信HSP结合雄激素受体的氨基终端区域。特别地减少辅助因子的结合和稳定化，例如，通过施加能特定阻碍HSP和氨基终端区域结合的化合物(没有影响HSP结合到其他蛋白质作为伴侣)，可以诱导雄激素受体的降解，从而抑制雄激素受体激活路径。在这些非限制性实施例中，通过在类固醇受体上任何位置或多个位置上相互作用，该化合物可以切断二聚合或者辅助因子的结合。

在另一实施方式中，本发明方法可以包括施加能干扰或抑制类固醇受体与辅助调节剂或辅助因子之间结合的化合物。附加的因子例如雄激素受体相关(ARA)的蛋白质结合到类固醇受体上，例如雄激素受体，可以提供稳定性，并可以确定来自类固醇受体的基因激活的特异性。也就是说，ARA蛋白质的结合有助于受类固醇受体影响的基因的确定。已经确认多个雄激素受体相关(ARA)的蛋白质，预想在未来可以发现另外的ARA蛋白质。ARA蛋白质在靠近雄激素受体(AR)氨基终端或羧基终端区域结合。本发明靶ARA蛋白质的例子包括但不限于ARA24，ARA54，ARA70，ARA267-a，ARA衍生物，ARA类似物以及类似的。

在另一实施方式中，本发明方法通过类固醇领域的失稳诱导类固醇受体的降解。例如，某些研究表明类固醇受体AF-2区域稳定受体的整体结构，使得氨基终端区域干扰辅助调节剂。可以失稳AF-2区域的化合物，例如，通过相互作用或结合于AF-2区域或其自身能干扰AF-2区域的区域，可以减少氨基终端区域的稳定性，减少与辅助调节剂的干扰，并增加雄激素受体的降解速率。

在另一实施方式中，本发明方法包括通过激活降解类固醇受体的路径而诱导类固醇受体的降解。例如，提议胱天蛋白酶-3路径来诱导雄激素受体的降解。在PTEN存在下，例如通过DBD和PTEN磷酸酶区域的相互作用，可以产生胱天蛋白酶-3路径。因此能诱导胱天蛋白酶-3路径的化合物可以诱导雄激素受体的降解。在另一实施例中，Akt激酶，其磷酸化雄激素受体，可以被激活，由蛋白体引导泛素化和随后雄激素受体的降解(Heinlein和Chang 2004)。

干扰类固醇向其活性形式的转化

在另一实施方式中，本发明包括施加抑制能诱导类固醇受体降解的化合物，结合使用能抑制或制止类固醇向其活性或另一形式转化的化合物。例如，睾丸激素由5-α-还原酶转化成二氢睾酮(DHT)。能抑制或制止5-α-还原酶(5AR)活性的化合物的施加可以降低DHT的存在，因此制止或减少类固醇依赖性基因激活。适合的抑制剂的例子包括度他雄胺、非那斯提和类似的。因此，施加能抑制从睾丸激素到DHT转化的化合物结合使用姜黄素衍生物或类似物可以提供有效的抗雄激素效果，并提供对多种雄激素相关紊乱有效的治疗。

干扰类固醇和类固醇受体之间的结合

本发明还包括施加能降解类固醇受体的化合物，结合或一起使用能抑制或减少类固醇依赖性基因激活，通过干扰或抑制类固醇和类固醇受体之间的结合。

这两种化合物可以单一组合物施加，例如药物组合物或化妆品组合物，或者以单独组合物施加。这两种化合物用于治疗相同的医疗状况。

能干扰类固醇和类固醇受体之间结合的化合物可以影响类固醇、类固醇受体或二者。例如，该化合物可以完全或部分附着类固醇与类固醇受体的结合位点，从而防止类固醇和类固醇受体之间的结合。替代地，该化合物可以结合于类固醇与类固醇受体结合位点的外部或部分外部。该化合物附着或结合与类固醇受体可以导致类固醇受体的构象改变，从而降低类固醇和类固醇受体相互结合的能力。能干扰类固醇和类固醇受体之间结合的化合物的例子包括但不限于比卡鲁胺、氟他胺和功能性衍生物或其类似物。

对类固醇和类固醇受体之间结合的干扰是通常使用的一种治疗，用于各种类固醇相关的紊乱或医疗情况。例如，医药公司开发的氟他胺和比卡鲁胺(Casodex)是非类固醇抗雄激素，其用于治疗前列腺癌。但是，肿瘤经常复发，并发生荷尔蒙重构。本发明包括施加一种或更多上述化合物，结合或一起使用能诱导雄激素降解的化合物，例如但不限于姜黄素衍生物或类似物。本发明提供雄激素诱导基因激活的更高控制，提供比氟他胺或比卡鲁胺单独使用更有效的治疗。

干扰结合到类固醇响应元件上的类固醇受体

本发明还包括施加能诱导雄激素受体降解的化合物和能减少、制止或干扰类固醇受体类固醇受体和类固醇响应元件(也指类固醇受体响应元件或相应的响应元件)之间结合的化合物。

类固醇响应元件(SRE)是内生DNA序列，通常位于靶基因的启动子区域，并且是类固醇受体的DNA结合靶。当通常具有锌指基序的类固醇受体结合到相应的响应元件时，类固醇受体开始转录。可以用于本发明一种或更多方法和组合物的类固醇响应元件的非限制性例子包括雄激素响应元件(ARE)，黄体酮响应元件(PRE)，雌激素响应元件(ERE)，糖皮质激素响应元件(GRE)和类似的。

可以干扰或抑制类固醇受体和相应的响应元件之间结合的本发明化合物包括但不限于二十二碳六烯酸(DHA)、DHA的功能性衍生物以及类似的。以前一直研究DHA对于雄激素调节基因激活的影响。Chung等，“二十碳六烯酸和二十碳五烯酸在LNCaP前列腺癌细胞中对于雄激素调节细胞生长和基因表达的影响”，致癌作用22：1201-1206，2001年。本发明阐述了DHA用于制止雄激素受体结合到雄激素响应元件(ARE)，并结合使用能诱导雄激素受体降解的化合物。在实施例1中描述了雄激素受体(AR)反式结合方法，并且在实施例3和图4中进一步公开了结果，当DHA与ASCJ-15，一种姜黄素衍生物，结合使用时，发现抑制体外前列腺癌细胞生长的协同效果。

制止类固醇受体的细胞核转移

本发明还包括能抑制或减少类固醇依赖性基因激活的方法和组合物，使用能诱导类固醇受体降解的化合物，并结合或一起使用能抑制或减少至少部分类固醇受体的细胞核转移。

类固醇受体从细胞质转移到细胞核，其中类固醇受体能结合到类固醇响应元件(SRE)上。因此，能减少或抑制类固醇受体转移的本发明化合物和方法可以用于类固醇依赖性基因激活的减少或抑制。因而，当结合能降解类固醇受体例如姜黄素衍生物或类似物的化合物时，可以获得改善的抑制。

能减少或抑制至少部分类固醇受体细胞核转移的化合物的例子，当位于细胞的细胞质中时，可以作用于类固醇受体复合物。化合物目标在于或诱导类固醇受体中的构象改变，防止类固醇受体的二聚合，干扰辅助因子结合到类固醇受体和类似物上。本发明所概括的化合物的特殊例子包括但不限于水飞蓟宾(SB)或其功能性衍生物。水飞蓟宾一直被用于防止雄激素受体的细胞核转移。Zhu等，“水飞蓟素(Silymarin)通过减少人前列腺癌细胞系LNCaP中雄激素受体的细胞核定位从而抑制雄激素受体的功能”，致癌作用22：1399-1403，2001年。实施例5和图6描述了水飞蓟宾(SB)和ASCJ-15，一种姜黄素衍生物，以附加的方式作用于雄激素诱导基因激活的抑制中。水飞蓟宾(SB)和ASCJ-15也显示为以附加的方式抑制前列腺癌细胞生长，表明SB和ASCJ-15在类固醇相关医疗情况的治疗中具有显著的治疗作用。

减少或抑制类固醇受体的转录和翻译

本发明还包括能抑制或减少类固醇依赖性基因激活的方法和组合物，包括施加能诱导类固醇受体的化合物和施加能减少或抑制类固醇受体mRNA转录的化合物。

已知通常在分子生物学领域，DNA或cDNA转录成mRNA，其翻译或表达为蛋白质。因此，类固醇受体的表达和适当的显示要求类固醇受体基因序列适当转录为相应的mRNA。类固醇基因序列转录的抑制或减少可以降低相应的类固醇受体蛋白质的表达，也使得类固醇依赖性基因激活得到部分抑制。

类固醇受体转录的抑制可以利用分子生物学领域各种抑制技术。栎精(QU)一直显示可以通过LNCaP细胞中的雄激素受体抑制基因激活。Xing等，“栎精抑制LNCaP前列腺癌细胞中雄激素受体的表达和功能”，致癌作用22：409-414，2001年。本发明所涵盖的技术包括但不限于制止或减少转录因子启动子的活性、激活或刺激而制止类固醇受体的转录，干扰聚合酶活性，使用小的干扰RNA(siRNA)，利用反义技术和类似的。能抑制雄激素受体转录的化合物的例子包括但不限于栎精(QU)、维生素E琥珀酸酯(VES)和其功能性衍生物。

另外，本发明方法和组合物包括那些减少或抑制类固醇受体翻译的方法和组合物。公开的化合物和方法可以使用任何已知的抑制类固醇受体翻译的方法，包括但不限于影响涉及类固醇受体表达的调节化合物或者利用反义技术。

II.能抑制惑减少类固醇依赖性基因激活的组合物

本发明还包括能抑制或减少类固醇依赖性激活的组合物，使用至少两种化合物，每种能抑制或减少类固醇依赖性基因的激活。在某些实施方式中，一种化合物能诱导类固醇受体的降解，第二化合物能抑制或减少类固醇依赖性基因的激活，通过作用于类固醇受体路径的不同位点或步骤。通过结合或一起施加至少两种化合物，相对于只有施加单一化合物，可以增强类固醇依赖性基因激活的制止或抑制。第二化合物可以抑制类固醇受体路径中一个或更多步骤，例如但不限于：抑制或减少类固醇和相应的类固醇受体之间的结合，抑制或减少类固醇受体和类固醇响应元件之间的结合，干扰类固醇受体和辅助因子或类固醇受体相关的蛋白质(例如ARA)之间的结合，抑制或减少类固醇受体的细胞核转移，减少或防止类固醇受体的转录，减少或抑制类固醇受体的翻译，以及类似的。

当抑制或减少雄激素依赖性基因激活时，优选地，组合物包括只是一种能诱导雄激素受体降解的化合物，更优选地，该化合物是姜黄素衍生物，例如ASCJ-9、ASCJ-15和类似的。能抑制睾丸激素向二氢睾酮转化的化合物的非限制性例子包括5-α还原酶抑制剂，例如度他雄胺、非那斯提和功能性衍生物和类似物，以及类似的。能抑制雄激素和雄激素受体之间结合的化合物的非限制性例子包括但不限于比卡鲁胺、羟基氟他胺和功能性衍生物和类似物，以及类似的。能抑制雄激素受体和雄激素响应元件(ARE)之间结合的化合物的非限制性例子包括二十二碳六烯酸(DHA)和功能性衍生物和类似物，以及类似的。能抑制雄激素受体细胞核转移的化合物的非限制性例子包括水飞蓟宾(SB)和功能性衍生物和类似物，以及类似的。能抑制雄激素受体转录的化合物的非限制性例子包括维生素E琥珀酸酯(VES)、栎精和功能性衍生物和类似物，以及类似的。

本发明组合物包括能治疗至少部分与类固醇依赖性基因激活相关医疗情况的药物组合物或化妆品组合物。特定的类固醇受体包括但不限于雄激素受体(AR)、黄体酮受体(PR)、雌激素受体(ER)肾上腺皮质激素受体(GR)、过氧化酶体增殖物激活受体(PPAR)、类维生素AX受体(RXR)和孤生类固醇荷尔蒙受体。医疗情况包括但不限于，癌症例如但不限于前列腺癌、肝癌、膀胱癌、子宫颈癌、肺癌和乳腺癌，神经和神经肌肉紊乱例如肯尼迪氏症，皮肤病例如痤疮，毛发病雄性脱发症或“男性秃头”，其中头发缺少是由于在细胞囊和临近细胞中的雄激素受体的雄激素活性而引起的，多毛症，以及伤口康复和炎症。

本发明组合物包括两种或更多在适合载体中的活性化合物或有效的类似物、变异或其衍生物。任何适合的活性化合物如果能抑制或减少类固醇依赖性基因激活就是有用的。当进行雄激素相关医疗情况时，优选地至少一种化合物在生理可接受水平上可以有效诱导雄激素受体的降解，例如在不引起实质性副作用或毒性的水平上。活性化合物可以选择地包括一种或更多提供附加优点的元件，例如改善的稳定性、溶解性或释放性能。这种元件包括缩氨酸、多肽、蛋白质、碳水化合物、核酸、亲脂部分、亲水部分、微粒、基体，或其组合。例如，活性化合物可以共价或非共价连接到亲水部分(例如磷酸酯或硫酸酯基，或碳水化合物，或螯合分子)以改进在水性缓冲液或流体中的溶解性。在另一实施例中，活性化合物可以共价或非共价连接到缩氨酸或保护活性化合物免于过早降解的其他部分，或者连接到抗体或特定用于需要的组织或细胞类型的其他特定黏合剂，以改进活性化合物释放到特定的组织或细胞类型。在另一实施例中，活性化合物可以装入或嵌入到脂质体、微粒、基体、凝胶、聚合物或类似物中，以改进稳定性或增强释放性。

本发明组合物中缩使用的合适的载体包括稀释剂、赋形剂或载体材料，根据施加所需要的形式选择并符合惯常的药物或化妆品惯例。适合载体的例子包括但不限于水、生理盐水、磷酸酯缓冲盐水、生理兼容缓冲液、生理兼容盐缓冲的盐水、油包水乳液、水包油乳液、醇、二甲基亚砜、右旋糖、甘露醇、乳糖、丙三醇、丙二醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、清蛋白、谷氨酸钠、半胱氨酸盐酸，以及类似的，和其混合物。适合的载体也包括适合药物上可接受的抗氧化剂或还原剂、防腐剂、悬浮剂、增溶剂、稳定剂、螯合剂、配位剂、粘性调节剂、崩裂剂、粘合剂、调味剂、气味剂、遮光剂、润饰剂、pH缓冲液，及其混合物，这些都符合传统药物惯例(“Remington：药剂科学与实践”，第20版，Gennaro(ed.)和Gennaro，Lippincott，Williams&Wilkins，2000年)。

对于在隔离细胞中使用，例如在培养液中生长并用于生物鉴定的细胞中，可以配制和提供本发明组合物，这都是很方便的。在非限制性实施例中，可以配制组合物为可溶解固体、溶液、悬浮液、脂质体预备物，以及类似的，并通过人工或自动传递给细胞(例如吸液管、施加器、泵、自动施加器，以及类似的)。

对于在活的整个生物体中使用，例如在人体中，可以配制并提供任何适合施加所需形式并符合传统药物实践的本发明组合物(“Remington：药剂科学与实践”，第20版，Gennaro(ed.)和Gennaro，Lippincott，Williams&Wilkins，2000年)。适合配方的例子包括药片、胶囊、糖浆、酏剂、油膏、乳膏、乳液、喷雾、气溶胶、吸入剂、固体、粉末、颗粒、凝胶体、栓剂、浓缩物、乳剂、脂质体、微球体、可溶基体、消毒液、悬浮液或施加剂，以及类似的。施加剂可以制备成通常的形式，液体溶液或者悬浮液，适合用于液体或液体悬浮液的浓缩物或固体形式，或者乳液。

对于在活的整体生物体中使用，例如人体中，并且取决于处理的特定情况时，可以配制本发明药物组合物并系统化或局部施加。

配制和施加的技术可以在“Remington：药剂科学与实践”(第20版，Gennaro(ed.)和Gennaro，Lippincott，Williams&Wilkins，2000年)中找到。施加的合适途径包括口服、肠内、肠道外、经粘膜、经皮肤、肌肉、皮下、经皮肤、直肠、脊髓内、胸内、静脉内、心室内、心房内、织脉内、动脉内、或腹膜内施加。本发明药物组合物可以通过医疗设备施加入物体，例如但不限于可植入设备、可生物降解移植物、贴皮和泵。当使用这种设备时，可以配制组合物包括可溶或不可溶基体或介质(例如，在医疗设备上或在其内的涂层、隔膜、薄膜、注入的基体、聚合物、海绵体、凝胶、或多孔层)，使得活性化合物经过特定一段时间释放。

III.防止或治疗类固醇调节医疗情况的方法

本发明还包括治疗或防止类固醇调节情况的方法。可以使用公开方法治疗的情况的例子包括但不限于，癌症例如前列腺癌、肝癌、膀胱癌、子宫颈癌、肺癌和乳腺癌，以及涉及雄激素受体激活路径的其他癌症，神经和神经肌肉紊乱例如但不限于肯尼迪氏症，皮肤病例如痤疮，其是由雄激素诱导脂肪腺的AR激活而引起的，毛发病例如雄性脱发症或“男性秃头”，其中头发缺失是由于雄激素作用于在毛囊和临近细胞中的雄激素受体而引起的，多毛症，以及伤口愈合或炎症治疗。

防止或治疗类固醇调节医疗情况的方法包括提供怀疑患有或处于发展类固醇调节医疗情况危险中的个体，例如人，并施加入治疗有效量的药物，包括至少两种化合物，选择地以适合的载体，每种都能抑制或制止类固醇依赖性基因激活。该药物是在任何上述提供的方法或组合物中公开的。优选地，至少两个该至少两种化合物作用于类固醇受体基因激活路径的不同步骤或位点。当类固醇调节医疗情况是雄激素调节医疗情况时，优选只是一种化合物可以诱导雄激素受体的降解，更优选该化合物是姜黄素衍生物或类似物，例如但不限于ASCJ-9或ASCJ-15。

本发明还包括治疗伤口或炎症的方法，包括提供具有伤口位点或炎症区域的个体，总体向该位点或区域施加一种组合物。该组合物包括至少两种化合物，每种都能抑制类固醇依赖性基因激活。该化合物应该作用于如上所述类固醇受体基因激活路径的不同位点。

本发明还包括抑制或减少人体内类固醇依赖性基因激活的方法，包括提供至少上述组合物中的一种，组合物封装入脂质体中，并向人体施加封装的组合物。

实施例

实施例1：使用雄激素受体反式激活鉴定，MTT细胞增殖鉴定和蛋白质免疫印迹分析进行检测类固醇诱导基因激活的变化

所提供的实施例提供一种化合物组合施加效果的典型研究，化合物中的至少两种能影响类固醇基因激活路径中不同步骤。提供的实施例包括雄激素受体(AR)反式激活鉴定，以研究化合物的不同组合对野生型或在前列腺癌中发现的突变雄激素受体的活性的影响，以及MTT细胞增殖鉴定以检测化合物组合的能力用于制止前列腺肿瘤细胞的生长。鉴定优选使用人前列腺癌细胞，LNCaP细胞，其被本领域技术人员用来表达临床相关突变雄激素受体(AR)，该雄激素受体响应于雄激素。在提供的实施例中，二氢睾酮(DHT)，也就是睾丸激素的内生荷尔蒙代谢物，施加到LNCaP细胞中，在雄激素受体反式激活鉴定中诱导雄激素受体(AR)的活性，并在MTT细胞增殖鉴定中刺激癌细胞生长。当结合使用时，公开的鉴定为不同类固醇依赖性医疗情况提供不同的潜在治疗方法的指导。

雄激素受体(AR)反式激活鉴定

选择雄激素受体(AR)反式激活鉴定作为主要工具用来评价ASCJ化合物的效果，该化合物是姜黄素衍生物，并结合使用二十二碳六烯酸(DHA)、水飞蓟宾(SB)、栎精(QU)和羟基氟他胺(HF)。雄激素受体(AR)反式激活鉴定通过荧光素酶报告基因的检测，检测用于基因表达的雄激素受体(AR)路径终点。检测抗雄激素活性的方法是已知的。Ohtsu等，“新型二芳基庚酮类的合成以及抗雄激素活性”，BioorgMed Chem 11：5083-90，2003年，以及“姜黄素类似物作为新型雄激素受体与潜在的作为抗前列腺癌试剂的比较”，J Med Chem 45，5037-5042，2002年。荧光素酶报告系统是一直已知的。SherfB.A.等(1996)双荧光素酶报告显示：一个高级的共同报告技术结合了萤火虫(firefly)海肾(Renilla)检测方法。Promega Notes 57，2。来自该检测的数据应该反映所检测化合物在阻止、制止或抑制AR激活路径中合作的重要性。

雄激素受体(AR)反式激活检测包括细胞群或细胞系，例如LNCaP细胞，使用包括雄激素响应元件的质粒进行转染，在启动子中或附近进行整合，以及位于启动子下游的荧光素酶报告系统。在测试化合物存在下，荧光素酶质量的鉴定或检测的变化相应于测试化合物对于基因表达的调节、制止或抑制。

更特别地，人前列腺癌细胞，LNCaP(ATCC，Manassas，VA)，保持在RPMI-1640介质中，并补充10％热灭活的胚牛血清(FBS)，L-谷氨酸盐(300mg/L)，和青霉素-链霉素(100单位/mL青霉素G钠，100μg/mL链霉素硫酸盐)。为了进行鉴定，细胞放于24孔组织培养板中，浓度为每孔1×10⁵细胞，在带有5％CO₂的孵育箱中37℃下培养。两天后，使用SuperFect转染试剂(Qiagen)和DNA混合物在SV40启动子(5ng/孔)的控制下对细胞进行转染，DNA混合物由MMTV-荧光素酶质粒和pRL Renilla质粒组成，MMTV-荧光素酶质粒包括在启动子区的雄激素响应元件(ARE)(0.5μg/孔)。转染后，细胞加入活性炭/葡聚糖处理的含有介质的FBS，根据试验设计，使用选择带有二氢睾酮(DHT)的两种试验化合物的一个或一种组合进行处理。处理后20小时，细胞溶解，并使用双荧光素酶报告检测系统(Promega)分析在溶解产物中荧光素酶活性。

MTT细胞增殖鉴定

在本发明中使用MTT细胞增殖鉴定用来检测化合物的不同细合对于调节、制止或抑制癌细胞生长的效力。所使用的细胞是临床相关的LNCaP细胞。细胞生长是由于二氢睾酮的加入而刺激的。因此，MTT细胞增殖鉴定可以为化合物组合用于抑制或制止前列腺肿瘤细胞生长而提供指导。

MTT检测，其取决于通过线粒体脱氢酶(所有活细胞都具有)将无色基质转化为还原的四唑，被用来检测LNCaP细胞的生长(Su等，1999)。简单地，将1×10³LNCaP细胞/孔置放在96孔微试验III组织培养板上(Falcon，NJ)。两天后，介质改变为含有10％活性炭/葡聚糖的RPMI，去除FBS。带有0.1nM DHT或没有，以指定浓度加入一个或更多试验化合物，持续5天。1/10体积的MTT溶液(PBS中5mg/ml)加入到细胞中，在37℃下2小时。对板进行离心(10分钟，1000rpm)，然后小心去除每孔中的上清液。向每孔中加入100μl裂解缓冲液(50％二甲基甲酰胺，5％十二烷基硫酸钠，0.35M乙酸和50nM HCL)，在每孔中裂解四唑。相对于酶活性数量检测每孔中活细胞数目(使用Bio-RAD BenchMark微孔阅读器在595nm波长处读出吸光率)。来自MTT鉴定的数据也可以通过实际细胞计数和生态学进行验证。

也在增殖鉴定中使用正常的和非前列腺肿瘤细胞。由Clonetics(MD)获得人内皮细胞，保持在EGM中，并补充人上皮细胞生长因子、肾上腺皮质素、庆大霉素、两性霉素B和2％FBS。为了建立该鉴定，在96孔组织培养板上以5×10³/孔浓度接种细胞。24小时后，细胞中加入相同的介质，补充2％活性炭/葡聚糖，去除FBS。以不同浓度(0.1-10μg/ml)向细胞中加入TCHM提取物，持续5天。然后加入MTT溶液，如上述检测细胞增殖活性。接着，使用实际细胞计数和细胞形态学验证来自MTT鉴定的数据。

蛋白质免疫印迹分析

使用蛋白质免疫印迹方法(Western blotting method)来检测雄激素受体(AR)的表达。早已经公开蛋白质印迹方法(Su等，1999)。简单地，在2×SDS负载缓冲液或者RIPA裂解缓冲液中加上10μg/ml苯甲脒、10μg/ml胰岛素抑制剂和1nM苯甲基璜酰氟收集细胞。来自细胞裂解物的总蛋白质(40μg/样品)在SDS-PAGE凝胶中分离。分离后，蛋白质标准化程序后从凝胶转移到硝化纤维膜。该膜用10％脱脂牛奶在磷酸盐缓冲的盐水中孵育，补充0.1％Tween-2020(PBST)，过夜。向膜中加入特定用于人雄激素受体(AR)的主抗体，在4℃下过夜或者在室温下2小时。使用PBST缓冲液清洗三次，每次10分钟，然后加入辣根过氧化酶共轭的次抗体，在室温下1小时。用PBST在此清洗后，使用增强的化学发光基质(ECL，Amersham)可以呈现膜中雄激素受体(AR)蛋白质信号。为了保证样品中相同的负载量，按照厂商的建议进行剥离膜后，使用特定抗体再孵育为β-肌动蛋白(Sigma)。

实施例2：通过施加姜黄素衍生物诱导雄激素受体的降解

当LNCaP细胞再姜黄素衍生物(定义为ASCJ化合物)存在下培养时，LNCaP细胞裂解物的蛋白质免疫分析被用来描述减少的雄激素受体(AR)。当ASCJ化合物单独在LNCaP细胞中培养时，当ASCJ与雄激素DHT共同培养时，以及当ASCJ与环己酰亚胺(一种蛋白质合成抑制剂)共同培养时，发现雄激素受体的减少。

特别地，LNCaP细胞在10％CD/RPMI中培养，并使用ASCJ-15(1μM)，也就是一种姜黄素衍生物，或者在DHT(2nM)存在或不存在下，使用控制载体进行处理24小时。通过实施例1中所述的蛋白质免疫印迹分析每孔样品的雄激素受体(AR)蛋白质表达。该实验进行四次以确保数据的可重复性。一个实验中得到的典型数据如图1所示。通过与β-肌动蛋白相比，正常化雄激素受体(AR)信号，得到雄激素受体的相对密度，也在图1中显示。

为了显示雄激素受体(AR)的减少是由于雄激素受体(AR)的降解而不是由于转录或翻译，LNCaP细胞暴露于环己酰亚胺，一种蛋白质合成抑制剂。参考图2，LNCaP细胞在带有载体控制(小格1，4，7，10)的10％CD/RPMI中培养，，并使用ASCJ-15(1μM，lanes 2，5，8和11)或者维生素E琥珀酸盐(VES)(10μM，小格3，6，9和12)处理，持续20小时。然后，环己酰亚胺，也就是一种蛋白质抑制剂，加入到所有培养的细胞中(15μg/ml，在所有小格中)保持指定时间(2，3和4小时)。使用如实施例1所述的蛋白质印迹分析来分析来自每孔样品的雄激素受体(AR)表达。该数据相对于雄激素受体(AR)密度与0小时样品进行比较。单一试验的代表数据如图2所示。

实施例3：通过单独施加能降解类固醇受体的化合物或结合施加能阻碍类固醇受体和相应的类固醇响应元件(SRE)之间结合的化合物

能降解雄激素受体(AR)的化合物可以单独施加以及结合能阻碍或干扰雄激素受体和雄激素响应元件(ARE)之间结合的化合物。图2中所示的姜黄素衍生物ASCJ是作为一种能诱导雄激素受体(AR)降解的化合物。单独提供化合物ASCJ-15以及结合二十二碳六烯酸(DHA)，一种能阻碍或干扰雄激素受体(AR)和雄激素响应元件(ARE)之间结合的ω-3脂肪酸。关于DHA对雄激素调节基因激活影响的研究一直在进行。Chung等，二十二碳六烯酸和酸对LNCaP前列腺癌细胞中雄激素调节细胞生长和基因表达的影响，致癌作用(Carcinogenesis)22：1201-1206，2001年。在本实施例中，在如实施例1中所示的雄激素受体反式激活鉴定和MTT细胞增殖鉴定中，都检测作用于雄激素受体(AR)路径不同点的化合物结合。

如实施例1所述，在雄激素受体(AR)反式激活鉴定中，使用LNCaP细胞，施加0，0.5和1.0μM的ASCJ-15。包括0.5μM这种非理想剂量是为了确保对雄激素受体(AR)活性在ASCJ-15和DHA之间任何调节的检测，不论活性增加或降低。施加在先最小有效剂量150μM的DHA。

更特别地，在转染的LNCaP细胞中使用如上实施例1中所述雄激素受体(AR)反式激活检测。细胞在ASCJ-15或DHA存在或不存在的情况下，在1nM的DHT中生长24小时。图3描述了试验的结果。DHT诱导增加了MMTV-荧光素酶表达在基础水平10倍以上。向细胞施加150μM的DHA或1μM的ASCJ-15，分别阻止了30％或45％的DHT诱导报告基因表达。伴随增加150μM的DHA和1μM的ASCJ-15，降低了84％诱导的MMTV荧光素酶；获得了相对于单独加入每种化合物更显著的效果。使用非最理想剂量(0.5μM)ASCJ-15，与150μM的DHA一起处理，下调诱导的报告基因表达达到55％，该抑制显著高于DHA单独处理所产生的抑制(30％)。这些数据表明结合DHA和ASCJ-15可以对AR活性的抑制产生协同效果。

ASCJ-15和DHA也可以单独检测并结合控制人前列腺细胞生长功效。如实施例1所述在MTT鉴定中使用LNCaP细胞。该结果如图4所示。DHT显著刺激了150％LNCaP细胞生长。向DHT处理细胞中加入150μM的DHA削弱了30％细胞生长。使用1μM的ASCJ-15处理细胞，降低22％细胞生长。当ASCJ-15和DHA结合施加时，DHT刺激的生长抑制64％，其接近等于或大于ASCJ-15和DHA各自产生效果的总和。这些结构与来自雄激素受体(AR)反式结合鉴定的数据相一致，也就是说，结合ASCJ化合物和DHA在抑制前列腺癌细胞生长上有协同效果。

实施例4：通过施加能减少类固醇和相应的类固醇受体之间结合的化合物，结合使用能减少类固醇受体和类固醇响应元件之间结合的化合物，从而抑制类固醇诱导基因激活

能减少雄激素和雄激素受体(AR)之间结合的化合物单独施加并结合能阻碍或干扰类固醇受体和类固醇响应元件(ARE)之间结合的化合物。羟基氟他胺(HF)，一种氟他胺的衍生物，确信可以阻碍雄激素和雄激素受体之间的结合。二十二碳六烯酸(DHA)，一种ω-3脂肪酸，确信可以阻碍或干扰雄激素受体(AR)和雄激素响应元件(ARE)之间结合。这两种化合物单独施加以及结合LNCaP细胞，如实施例1所述，使用雄激素受体(AR)反式激活鉴定。

如实施例3，在雄激素受体(AR)反式激活鉴定中使用DHA最小有效剂量150μM。HF为0.5或1.0μM。DHT为1×10⁹M。图5中显示该结果。DHA和HF都能单独以及结合抑制DHT诱导雄激素活性。当DHA和HF结合使用时，得到DHT诱导活性的更多抑制，从而观察到协同的抗雄激素效果。

实施例5：通过施加能诱导类固醇受体降解的化合物，结合使用能阻碍类固醇受体细胞核转移的化合物，从而抑制类固醇诱导基因激活

能诱导雄激素受体(AR)降解的化合物单独施加，以及结合能阻碍或干扰雄激素受体细胞核转移的化合物。在实施例2中描述的ASCJ-15能降解雄激素受体。水飞蓟宾(SB)的纯化形式，一种在广泛消费的水飞蓟提取物中的聚酚类黄酮富含物，确信可以干扰雄激素受体的细胞核转移。每种单独施加以及结合使用实施例1所述的雄激素受体反式激活鉴定和MTT细胞增殖鉴定。

如实施例1所述，在雄激素受体反式激活鉴定中，施加浓度为0，0.5或1.0μM的ASCJ-15。Zhu等已经描述使用很小如50μM的浓度能抑制反转录活性。在本发明中，SB具有0或20μM的浓度。Zhu等，“水飞蓟素通过减少人前列腺癌细胞系LNCaP中受体的细胞核定位而抑制雄激素受体的功能”，致癌作用(Carcinogenesis)22：1399-1403，2001年。参考图6，ASCJ-15和SB，单独和结合使用，能在LNCaP细胞中抑制DHT诱导雄激素受体(AR)活性。当结合施加时，ASCJ-15和SB以附加方式抑制70％DHT诱导雄激素受体活性。当结合20μM SB和1μMASCJ-15的抑制效果单独施加时，也可以计算出DHT诱导活性的70％抑制。

也可以单独和结合检测ASCJ-15和SB在控制人前列腺肿瘤细胞生长中的功效。如实施例1所述，在MTT鉴定中使用LNCaP细胞。该结果在图7中显示。ASCJ-15和SB能单独和结合抑制肿瘤细胞的增殖。当结合施加时，ASCJ-15和SB附加地抑制肿瘤细胞的增殖。

实施例6：通过施加能诱导类固醇受体降解的化合物，结合使用能抑制类固醇受体mRNA转录的化合物，从而抑制类固醇诱导基因激活

单独施加能诱导雄激素受体(AR)降解的化合物，以及结合使用能抑制雄激素受体转录的化合物。如实施例2所述的ASCJ-15能降解雄激素受体。栎精(QU)的纯化形式，一种在苹果、洋葱和绿茶中发现的类黄酮，确信可以抑制雄激素受体mRNA的转录。Xing等，“栎精抑制雄激素受体在LNCaP前列腺癌细胞中的表达及功能”，致癌作用(Carcinogenesis)22：409-414，2001年。每种单独或结合施加，使用如实施例1所述的雄激素受体反式激活鉴定。

在实施例1所述的雄激素受体(AR)反式激活鉴定中，施加浓度为0，0.125，0.25，0.5或1.0μM的ASCJ-15。施加0，5或7μM的栎精(QU)。参考图8，ASCJ-15和栎精都能抑制DHT诱导雄激素受体(AR)活性。当结合施加时，两种检测化合物协同抑制DHT诱导活性。

实施例7：通过施加能诱导类固醇受体降解的化合物，结合使用类固醇和类固醇受体结合的化合物，从而抑制类固醇诱导基因激活

单独施加能诱导雄激素受体(AR)降解的化合物，并结合能抑制雄激素和相应的雄激素受体(AR)之间结合的化合物。如实施例2所述的ASCJ-15能降解雄激素受体(AR)。羟基氟他胺(HF)，一种氟他胺的代谢物，确信可以阻碍雄激素和雄激素受体之间的结合。在如实施例1所述的雄激素受体反式激活鉴定中，单独检测HF或结合ASCJ-15。使用LNCaP肿瘤细胞，检测每种化合物抑制野生型雄激素受体和变异雄激素受体活性的能力。HF和ASCJ-15单独和结合抑制野生型雄激素受体活性。当结合施加时，如图9所示，抑制是附加的。

所有标题是为了读者的方便，而不应该用于限制标题下面的内容，除非有特别说明。所有参考或引用的文献在此全文引入作为参考。

Claims (23)

1.一种抑制或减少类固醇依赖性基因激活的方法，其包括：

a)提供包括类固醇受体的生物样品；

b)向所述生物样品施加第一化合物，其中所述第一化合物能诱导所述类固醇受体的降解；以及

c)向所述生物样品施加第二化合物，其中所述第二化合物能抑制所述类固醇受体激活基因；

其中所述第一化合物和所述第二化合物作用于所述类固醇受体基因激活路径中不同步骤；进一步，其中相对于单独施加所述第一化合物或者所述第二化合物，更多地减少或抑制类固醇依赖性基因激活。

2.根据权利要求1的方法，其中所述类固醇受体是雄激素受体。

3.根据权利要求1的方法，其中所述第一化合物包括姜黄素衍生物或类似物。

4.根据权利要求2的方法，其中所述姜黄素衍生物选自ASCJ-9、ASCJ-15及其功能性衍生物。

5.根据权利要求1的方法，其中所述第二化合物能部分抑制类固醇结合于所述类固醇受体。

6.根据权利要求5的方法，其中所述第二化合物选自比卡鲁胺、羟基氟他胺及其功能性衍生物。

7.根据权利要求1的方法，其中所述第二化合物能部分抑制类固醇受体结合于类固醇响应元件。

8.根据权利要求7的方法，其中所述第二化合物是二十二碳六烯酸(DHA)或其功能性衍生物。

9.根据权利要求7的方法，其中所述类固醇响应元件是雄激素响应元件(ARE)。

10.根据权利要求1的方法，其中所述第二化合物能部分抑制所述类固醇受体的细胞核转移。

11.根据权利要求10的方法，其中所述第二化合物是水飞蓟宾(SB)或其功能性衍生物。

12.根据权利要求1的方法，其中所述第二化合物能部分抑制所述类固醇受体的转录。

13.根据权利要求12的方法，其中所述第二化合物是栎精(QU)或其功能性衍生物。

14.根据权利要求1的方法，其中所述第一化合物和所述第二化合物一起施加。

15.一种组合物，包括：

诱导类固醇受体降解的第一化合物；和

抑制所述类固醇受体基因激活的第二化合物，其中所述第二化合物不能显著诱导所述类固醇受体的降解。

16.一种药物组合物，包括：

a)诱导类固醇受体降解的第一化合物或其药物上可接受的盐；

b)抑制所述类固醇受体基因激活的第二化合物或其药物上可接受的盐；

c)药物上可接受的稀释剂、辅剂或载体；并且

其中当结合使用所述第一化合物和所述第二化合物时，提供治疗有效量。

17.根据权利要求16的药物组合物，其中所述第一化合物是姜黄素衍生物或类似物。

18.根据权利要求16的药物组合物，其中所述第二化合物或其药物上可接受的盐选自比卡鲁胺、羟基氟他胺、二十二碳六烯酸(DHA)、水飞蓟宾(SB)、维生素E琥珀酸盐(VES)、栎精、非那斯提、度他雄胺或其功能性衍生物。

19.根据权利要求16的药物组合物，其中所述第一化合物和所述第二化合物封装在脂质体中。

20.一种在人体中防止或治疗类固醇调节医疗情况的方法，包括：

a)提供怀疑患有类固醇调节医疗情况的个体；以及

b)向个体施加药物有效量的权利要求16的药物组合物。

21.根据权利要求20的方法，其中所述类固醇调节医疗情况选自痤疮、多毛症、雄性脱发症(男性秃头)、前列腺癌、良性前列腺增生、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、子宫颈癌和肺癌。

22.一种治疗伤口或炎症的方法，包括：

a)提供具有伤口或炎症的个体；以及

b)向伤口或炎症处施加权利要求16的药物组合物。

23.一种在人体内抑制或减少类固醇依赖性基因激活的方法，包括：

a)提供权利要求16的药物组合物；以及

b)将所述药物组合物封装于脂质体中；

c)向人体施加封装的药物组合物。

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