CN1969682A

CN1969682A - 竹笋粗多糖在保健食品制备中的应用

Info

Publication number: CN1969682A
Application number: CNA2006101544770A
Authority: CN
Inventors: 杨志坚
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2006-11-02
Filing date: 2006-11-02
Publication date: 2007-05-30

Abstract

本发明涉及竹笋粗多糖在制备具有免疫调节功能的保健食品中的新用途。本发明以竹笋或其干制品笋干为原料，提取其中的粗多糖，将其作为活性成分与食品工艺上可接受的其他原料及辅料开发成相宜的具有免疫调节功能的保健食品制剂，如胶囊剂(软胶囊、硬胶囊)、滴丸剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液等。实验证明竹笋粗多糖在体外促进细胞免疫的功能方面有良好效果，且毒副作用小，有着良好的开发应用前景。

Description

竹笋粗多糖在保健食品制备中的应用

技术领域：

本发明涉及竹笋粗多糖的用途，尤其是在保健食品中的用途。

技术背景：

竹笋多糖是从废弃笋衣、笋头中提取的可溶性多糖。多糖是由10个以上单糖组成的聚合物，作为可溶性的膳食纤维，它具备了膳食纤维的一般生理功能，现代科学业已证明，膳食纤维具有防治高血压、冠心病等以及清除外源有害物质等功能，。许多现代文明病如高血压、高血脂、肥胖等的发病都与膳食纤维的缺乏相关。同时，多糖往往还具有更重要的生理活性，多糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别。细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等有着密切的关系。多糖在医药上还是一种很好的佐剂。此外它还能控制细胞的分裂和分化，调节细胞的生长和衰老等多种多样的生物活性。目前，对多糖的化学研究以及生物功能的研究方兴未艾，不同来源多糖的潜在功能确定尚须进一步研究。

目前发现的功能性多糖的生理功能主要在以下两个方面：

一、抗肿瘤

人们已从不同的生物材料中得到多种具有抗肿瘤活性的多糖，如从香菇中得到的香菇多糖具有强的抗肿瘤活性，其抑制癌症和抗肿瘤效果不是直接作用于移植性癌细胞，而是通过宿主调节而发生作用。

二、增强免疫作用

已证实不同的多糖具有不同的免疫促进作用。香菇多糖是理想的免疫促进剂，它作为T细胞定位的佐剂和辅助T细胞刺激参与机体免疫反应。现已发现，其具有高度特异性免疫增强作用。银耳多糖能促进淋巴细胞的转化，增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，明显促进肝脏蛋白质核酸的合成以及促进骨髓造血功能，提高体液免疫力。黑木耳多糖可有效地提高小鼠巨噬细胞的吞噬指数和百分率。药理实验证明，茶多糖具有增强免疫功能，促进单核巨噬细胞系统吞噬功能的作用。研究表明：茶多糖是一种免疫促进剂，能明显促进巨噬细胞的吞噬能力，使免疫器官脾脏重量增加，其他多糖如大蒜、萝卜等提取的多糖对T淋巴细胞、B淋巴细胞及巨噬细胞分别具有不同的增强作用，可增强机体细胞免疫功能。

虽然多糖的研究文献较多，但竹笋多糖的研究较为罕见，文献检索后，仅见零散功能报道，报道的已有功能为抗肿瘤(动物实验)。

发明内容

本发明的目的在于提供竹笋粗多糖的新用途，即在保健食品功能定位中的用途。

本发明特点是，竹笋粗多糖在保健食品中的应用。

本发明具体竹笋粗多糖在制备具有免疫调节功能的保健食品中的新应用。

本发明以竹笋或其干制品笋干为原料，提取其中的粗多糖，将其作为活性成分与食品工艺上可接受的其他原料及辅料开发成相宜的具有免疫调节功能的保健食品制剂，如胶囊剂(软胶囊、硬胶囊)、滴丸剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液等。

为了更好地理解本发明的实质，下面用竹笋粗多糖的免疫调节功能研究和急性毒性实验的结果来说明其在制备具有免疫调节功能的保健食品中的用途。

一：竹笋粗多糖的免疫调节试验：ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT法)

I：试验原理：一.原理：当T淋巴细胞受ConA致分裂原刺激后发生母细胞转化，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶将MTT(一种淡黄色的唑盐)分解为兰紫色的甲月赞(formazan)结晶而显色，其光密度值能够反映细胞的增殖情况。

II：试验器材及试剂：

无菌室、超净工作台	N H₄CI	新洁尔灭
无菌室、超净工作台	N H₄CI	新洁尔灭	正压装置	RPMI1640	小牛血清
过滤器(0.22μm、0.45μm)	谷氨酰胺	青霉素、链霉素	正压装置	RPMI1640	小牛血清
过滤器(0.22μm、0.45μm)	谷氨酰胺	青霉素、链霉素	厚玻璃瓶(500ml、250ml、100ml、50ml)青霉素瓶和盖	N_aHCO₃	Hanks液
各种滴管、滴头、吸管、吸头、玻管、移液管	ConA	台盼兰染色液	厚玻璃瓶(500ml、250ml、100ml、50ml)青霉素瓶和盖	N_aHCO₃	Hanks液
各种滴管、滴头、吸管、吸头、玻管、移液管	ConA	台盼兰染色液	200目筛网	N_aCl	竹笋粗多糖(冷冻干燥、真空干燥)
镊子、剪刀、直头和弯头的眼科剪、眼科镊数把	KCl		200目筛网	N_aCl	竹笋粗多糖(冷冻干燥、真空干燥)
镊子、剪刀、直头和弯头的眼科剪、眼科镊数把	KCl		培养皿数个	MTT
微量加样器(1ml、20ul、200ul)	异丙醇		培养皿数个	MTT
微量加样器(1ml、20ul、200ul)	异丙醇		96孔细胞板	乙醇
24孔细胞板	NaCl		96孔细胞板	乙醇
24孔细胞板	NaCl			HCl
以上器材及试剂在实验时都需经过灭菌，视情况分为紫外灭菌、湿热灭菌、过滤灭菌等。				HCl

III：试验步骤：

1.试剂配制：

1.1配制RPMI1640完全培养液：根据RPMI1640的说明配制好RPMI1640培养液，过滤除菌，用前加入10％小牛血清，1％谷氨酰胺(200mmol/L)，青霉素(100U/ml)，链霉素(100ug/L)及5×10^-5mol/L 2-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH7.0-7.2，即完全培养液。

1.2ConA液用双蒸水配制成100ug/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱(-20℃)保存。用前配制成5μl/ml

1.3PBS液：0.02M pH7.2 1L

1.4 0.155M NH₄Cl 0.83g定容到100ml

1.5无菌Hanks液用前以3.5％的无菌NaHCO3调pH7.2-7.4。

1.6 MTT液5mgMTT溶于1mLpH7.2的PBS中，现配使用。

1.7酸性异丙醇溶液96mL异丙醇中加入4ml 1mol/L的HCL，临用前配制。

1.8竹笋粗多糖原液(100mg/ml)制备

竹笋粗多糖粉40g→PBS400ml→冰块中，搅拌混匀30min→超声处理(冰浴)→4℃ 15000rpm 10min离心→取上清，10层纱布过滤→0.45μm滤膜抽滤→无菌0.22μm滤膜抽滤→4℃保存→用前分别配制成33.33mg/ml、11.11mg/ml

2.脾细胞悬液制备：

处死小鼠，75％Alc浸泡，剪开，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hanks液洗，离心10min(1500r/min)，加1mlNH₄Cl3.5min，加Hanks液，离心10min(1500r/min)，再用Hanks液离心10min(1500r/min)洗一次。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为2×10⁶个/Ml。

3.淋巴细胞增殖反应：

将细胞悬液分孔加入24孔培养板中，每孔1Ml。再加入相应试剂。

空白对照PBS50μl	高浓度冷冻干燥竹笋粗多糖粉50μl	高浓度真空干燥竹笋粗多糖粉50μl
空白对照PBS50μl	高浓度冷冻干燥竹笋粗多糖粉50μl	高浓度真空干燥竹笋粗多糖粉50μl	ConA对照50μl	低浓度冷冻干燥竹笋粗多糖粉50μl	高浓度真空干燥竹笋粗多糖粉50μl
ConA协同对照PBS50μl+ConA25μl	高浓度冷冻干燥竹笋粗多糖粉50μl+ConA25μl	高浓度真空干燥竹笋粗多糖粉50μl+ConA25μl	ConA对照50μl	低浓度冷冻干燥竹笋粗多糖粉50μl	高浓度真空干燥竹笋粗多糖粉50μl

置5％CO2，37℃培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50ul/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3孔作为平行样，用酶联免疫检测仪。以570nm波长测定光密度值。

IV：实验结果及判定：

1.实验结果：

2.判定：

从实验结果可以看出：真空干燥竹笋粗多糖粉试液的OD₅₇₀值明显高于其他项的值。从此项实验结果看，真空干燥竹笋粗多糖粉试液具有促进细胞免疫的功能。

二：竹笋粗多糖的急性毒性试验：

1.实验材料与方法

1.1实验动物昆明种小白鼠18～22g，雌雄各半，检疫后备用。

1.2实验方法小鼠按体重均衡分为6个剂量组，每组20只。实验前禁食不禁水12小时，根据预实验结果，分为六个剂量组：11.03g/Kg、13.00g/Kg、14.25g/Kg、16.00g/Kg、18.40g/Kg、20.75g/Kg，相邻剂量比值为0.88，稀释给小鼠灌胃，给样后连续观察4h、24h、48h、72h、7天各观察一次。7天后记录小白鼠毒性反应及死亡数。

2.试验结果：

剂量(g/Kg)	动物数(只)	死亡动物数(只)(♂∶♀)	死亡率(％)
剂量(g/Kg)	动物数(只)	死亡动物数(只)(♂∶♀)	死亡率(％)	11.03	20	0(0∶0)	0
13.00	20	0(0∶0)	0(但有中毒症状)	11.03	20	0(0∶0)	0
13.00	20	0(0∶0)	0(但有中毒症状)	14.25	20	10(2∶3)	50
16.00	20	12(3∶3)	60	14.25	20	10(2∶3)	50
16.00	20	12(3∶3)	60	18.40	20	16(3∶5)	80
20.75	20	20(5∶5)	100	18.40	20	16(3∶5)	80

连续七天观察后，未再死亡。死亡动物尸解肉眼观察未见明显病变。由此实验得出，此样品LD50＝14.25g/Kg(90％可信限)。按急性毒性分级标准判定，该样品属实际无毒类。

综上所述，竹笋粗多糖在体外促进细胞免疫的功能方面有良好效果，且毒副作用小，有着良好的开发应用前景。

本发明的竹笋粗多糖所用的原料为竹笋及其干制品的老根部或笋衣，而非有较高商品价值的笋干嫩尖，这将一定程度上提高了竹笋的有效利用率。本发明所述的方法工艺简单，符合中国药典的要求，无须特殊设备。本发明中的竹笋粗多糖采用通常的水提、膜浓缩或低压薄膜浓缩、酒精沉淀提取法等适合于工业化生产的方法进行制备。得到的竹笋粗多糖为淡灰黄色粉末。

上述的竹笋粗多糖提取法其步骤为：按重量份计算，称取干制竹笋0.1～20份，加水0.5～200份，加热回流提取3～5小时，温度控制在60～105℃(加热前期温度可设置得高些，后期只要保持温度即可)，将提取液真空浓缩(真空度-0.4--0.01Mpa，温度55-70℃)，浓缩到浓度为25-55度(以折光计)，冷却。在搅拌下，将浓缩液缓缓加入3-15倍体积的乙醇中或将3-15倍体积的乙醇缓缓加入搅拌(搅拌转速为30-400转/分)的浓缩液中，沉淀0.2-10小时，将沉淀物进行真空干燥或冷冻干燥，得到竹笋粗多糖。

竹笋粗多糖具有较明显的免疫调节功能，并且无味无臭，可以很方便地与其他食品原料配伍，或单独作为主料开发产品，使得竹笋地有效成分得以充分利用，从而填补了我国竹笋利用的一项空白，具有实用价值。

具体实施方式

下述实例用以进一步说明本发明，但并不由此限制本发明范围。

实施例1：

按重量份计算，称取干制竹笋500克，放入回流提取罐中，加入2500毫升水，开启加热器加热，并在回流冷凝器中接通冷凝水，当料液沸腾后，关小加热器，使料液微沸，提取4小时，冷却后得到深棕色提取液；将提取液放入真空薄膜蒸发器，控制真空度在-0.08，温度为65℃，将料液蒸发到40度(以折光计)，得到约200毫升浓缩液；将1000毫升95％的食用乙醇放入2000毫升烧杯，插入搅拌器，开启搅拌，调整转速在100转/分，将浓缩液以20毫升/分钟的速度加入到95％的食用乙醇中，加完料后继续搅拌30分钟以上，使多糖充分沉淀；停搅拌，沉淀4小时，吸出上层清液，将沉淀用滤纸滤出，将沉淀用50毫升无水乙醇洗涤两次，真空干燥(温度55℃，真空度-0.08Mpa)，得到5克左右的灰白色竹笋粗多糖粉末。

实施例2：

按重量份计算，称取干制竹笋50公斤，放入多功能提取罐中，加入300公斤净化水，开启夹套蒸汽阀加热，并在回流冷凝器中接通冷凝水，当料液沸腾后，关小蒸汽阀，使料保持在70℃以上，提取6小时，将渣再用200公斤净化水同样提取一次，合并提取液，冷却后得到深棕色提取液；将提取液放入真空浓缩罐，控制真空度在-0.08，温度为70℃，将料液蒸发到38度(以折光计)，得到约60升浓缩液；将400升95％的食用乙醇放入500升回收罐中，开启搅拌，调整转速在50转/分，将浓缩液以1升/分钟的速度加入到95％的食用乙醇中，加完料后继续搅拌60分钟，使多糖充分沉淀；停搅拌，沉淀4小时，吸出上层清液，将下层料液打入三足离心机，以工业滤布为过滤介质，将沉淀滤出，收集沉淀，将沉淀用10升无水乙醇洗涤两次，离心后将沉淀真空干燥(温度45℃，真空度—0.09Mpa)，得到650克左右的灰白色竹笋粗多糖粉末。

Claims

1、竹笋粗多糖在制备具有免疫调节功能的保健食品中的应用。