CN102048770B - 一种人工培植蛹虫草子实体提取物及其制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从人工培植蛹虫草子实体中提取的治疗慢性肾炎的药物，同时，本发明还提供了该人工培植蛹虫草子实体提取物的制备工艺，本发明将人工培植蛹虫草子实体干燥粉碎后，依次进行总提取物的制备，化学成分部位的制备和正丁醇部位的大孔树脂纯化，得到纯化合物。研究证实本发明人工培植蛹虫草子实体提取物具有增强免疫力功能作用，能作为治疗慢性肾炎的药物用于治疗慢性肾炎。由于本发明采用了合理的优化工艺，实现了提取人工培植蛹虫草子实体正丁醇部位的最优化条件。

Description

一种人工培植蛹虫草子实体提取物及其制备工艺

技术领域

本发明涉及一种从植物原料中提取医用配置品的方法，具体涉及从一种人工培植蛹虫草子实体提取物的提取制备工艺。

背景技术

慢性肾小球肾炎(CGN)是多种原发性肾小球疾病所导致的一组病情迁延、病变缓慢进展，最终发生渐进性慢性肾功能衰竭的一组免疫性炎症性临床综合征。患者多于2～3年或20～30年后出现肾功能衰竭的现象。CGN发病率较高，已成为影响人们健康的主要疾病之一。目前，临床尚缺乏有效的CGN治疗方法和药物，中药在治疗CGN上的应用开创了肾病治疗的新领域。特别是名贵中药冬虫夏草在治疗慢性肾炎上具有显著的疗效，但药用冬虫夏草来源主要靠野生资源，由于其生长周期长，生长环境不断受到破坏，加上人为的采集过量过早，资源锐减，难于满足市场需求。近年来北冬虫夏草(又称蛹虫草)作为冬虫夏草的代替品，其规模生产技术已取得突破。从人工培养的北冬虫夏草产品中进行有效成分的提取纯化逐步成为研究的热点。

北冬虫夏草(Cordyceps militaris)又称蛹虫草，简称北虫草，为子囊菌亚门(Ascomycotina)麦角菌科(Clavicipitaceae)虫草属(Cordyceps)蛹虫草种真菌，是冬虫夏草(Cordyceps sinensis)的同属的近缘品种，也是虫草属的模式种^[9]。有望作为冬虫夏草的替代品之一，北冬虫夏草具有与冬虫夏草相似的主要活性成分和医疗保健功效，大量研究表明，其主要活性成分腺苷，虫草素等的含量高出冬虫夏草数倍^[10-13]。近年来北冬虫夏草的规模生产技术已取得突破，已形成的北冬虫夏草产品主要有发酵菌丝体和米饭子实体，从人工培养的北冬虫夏草产品中进行有效成分的提取纯化逐步成为研究的热点。目前需要大量廉价人工培植蛹虫草子实体提取物以满足应用需求，但目前关于人工培植蛹虫草子实体提取物的提制备工艺的针对性方法鲜有报道。

发明内容

本发明的任务是提供一种从人工培植蛹虫草子实体中提取的治疗慢性肾炎的药物，使其具有治疗慢性肾炎的药物作用。同时，本发明还提供了人工培植蛹虫草子实体提取物的制备工艺。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的用于治疗慢性肾炎的药物，是按以下步骤制备的人工培植蛹虫草子实体提取物：

步骤一、以当年生人工培植蛹虫草子实体为原料，洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得原料粗粉；

步骤二、将原料粗粉用30倍量水超声提取1次，30min，提取液过滤，浓缩至1/3量即为总浸膏；

步骤三、将总浸膏加入乙醇至体系含醇70％，充分搅拌，静置过夜，取上清液，回收溶剂，得水提醇沉物；

步骤四、取醇沉物，以水分散，用与水等体积乙酸乙酯萃取3次，弃去乙酸乙酯萃取液，用与保留的水分散液相等体积水饱和正丁醇对保留的水分散液萃取6次，合并萃取液，减压回收溶剂，真空干燥，得淡黄色粉末状人工培植蛹虫草子实体提取物，即本发明提供的用于治疗慢性肾炎的药物。

本发明提供的人工培植蛹虫草子实体提取物的制备工艺，包括以下步骤：

步骤一、以当年生人工培植蛹虫草子实体为原料，洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得原料粗粉；

步骤二、将原料粗粉用30倍量水超声提取1次，30min，提取液过滤，浓缩至1/3量即为总浸膏。同时制备70醇热回流提取物；

步骤三、将总浸膏加入乙醇至体系含醇70％，充分搅拌，静置过夜，取上清液，回收溶剂，得水提醇沉物；

步骤四、取醇沉物，以水分散，用与水等体积乙酸乙酯萃取3次，弃去乙酸乙酯萃取液。用与保留的水分散液相等体积水饱和正丁醇对保留的水分散液萃取6次，合并萃取液，减压回收溶剂，真空干燥，得淡黄色粉末状本发明人工培植蛹虫草子实体提取物。

本发明实验资料

一、本发明所用人工培植蛹虫草子实体品种的鉴定

1、人工培植蛹虫草子实体用菌种的鉴定

本发明人工培植蛹虫草子实体所用菌种由广东省东莞市生物技术研究所助理研究员喻孟君先生自辽宁省鞍山市千山风景区采挖，经组织分离、孢子分离等得到生产用菌种，经中国科学院微生物研究所(2006)微检字第020号检测鉴定为蛹虫草[Cordyceps militaris(L.)Link]菌种，标本存于广东省东莞市生物技术研究所组织培养室，标本编号20050818。

人工培植蛹虫草子实体品种的鉴定

人工培植蛹虫草子实体由广东省东莞市生物技术研究所培植，本项目研究用人工培植蛹虫草子实体药材(批号：20060928)，标本存放于华中科技大学同济药学院中药资源室，经华中科技大学同济药学院中药系张长弓副教授鉴定为蛹虫草子实体[Cordyceps militaris L.Link]。

3、人工培植蛹虫草子实体的性状

本项目研究用人工培植蛹虫草子实体成圆柱条状，粗0.3～05cm，长2～6cm，为鲜艳的橙黄色，上部稍膨大，质韧，气微腥，味微苦。

4、人工培植蛹虫草子实体品质检测

本项目研究用人工培植蛹虫草子实体水分按GB/5009.3标准检测其含量≤0.9％；重金属按GB/5009.11、12、17标准检查，其汞(以Hg计)≤0.3mg/kg，铅(以pb计)≤1.5mg/kg，砷(以As计)≤1.5mg/Kg；微生物按GB4789.2、3、4、5、10、11、15标准检查，其菌落总数，≤1000cfu/g，大肠菌群≤40MPN/100g，肠道致病菌及致病性球菌未检出，霉菌≤25cfu/g，酵母≤25cfu/g。均符合国家有关规定要求。

二、本发明人工培植蛹虫草子实体提取物制备工艺的优化

1、仪器与试剂

HITACHI L-2130高效液相色谱仪(HPLC)；HITACHI L-2400紫外检测器；T2000P色谱工作站；UV-750MC紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；SG5200HZ超声波清洗仪(上海冠特超声仪器有限公司)；RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；分析天平用Mettler AE160十万分之一天平；真空干燥箱(DZF-6021型)。

腺苷对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号110879-200202)，供含量测定用；甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水和去离子水；HPD100大孔吸附树脂(河北沧州宝恩化工有限公司)；乙醇、乙酸乙酯、正丁醇等均为分析纯。

2、方法

2.1提取分离条件的确定

2.1.1最佳条件参数的确定

采用超声提取法，以HPLC法测定总提取物中腺苷的百分含量为评价指标，进行4因素3水平(L₉(3⁴))正交设计(见表1～3)优选提取最佳溶剂、最佳温度、最佳时间和最佳料液比，以确定人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎总提取物制备的最佳条件参数。

2.1.2人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位分离条件的确定

应用传统的溶剂分配分离技术，以人工培植蛹虫草子实体总提取物中腺苷转移含量为评价指标，单因素考察萃取溶剂正丁醇在等体积用量时萃取次数对萃取效果的影响，每次均以等倍量正丁醇对蛹虫草子实体总提物进行萃取。从第五次开始，每次萃取液于旋转蒸发仪上蒸干，加甲醇10mL溶解，吸取10μL注入高效液相仪，以腺苷峰的含量作为指标，结果表明第9次萃取液中已不含腺苷峰。而萃取6次就可使萃取率达到95％以上，确定了自人工培植蛹虫草子实体总提取物分离治疗慢性肾炎有效部位的最佳条件。

表1因素水平表

表2直观分析表

表3方差分析表

实验结果分析：经方差分析，溶剂及用量对腺苷提取含量有显著影响，提取温度和提取时间无显著影响；由极差分析可得，对腺苷提取有影响的因素顺序为：B＞D＞A＞C；由直观分析得腺苷最佳提取条件为30倍量水，50℃提取30min。由于提取温度对提取率无显著影响，从节约成本操作简便性方面考虑将提取温度定为室温。

2.2色谱条件与系统适应性试验

2.2.1流动相的选择

以提取物中主要成分各色谱峰的分离度，对称度和主要色谱峰的理论塔板数为评价指标，通过选择不同品牌的C₁₈反向柱，不同的流动相系统及调节各流动相系统中溶剂的比例，最终确定了使用anglient C₁₈反向柱，以15％甲醇为流动相。柱温对色谱峰的出峰时间和分离度有较大影响，故控制柱温在25℃。

2.2.2测定波长的选择

用UV-750MC紫外可见分光光度计在波长200nm-400nm紫外区段进行光谱全扫描，结果人工培植蛹虫草子实体总提取液在260nm处有最大吸收，故选择260nm作为检测波长。

2.2.3色谱条件

色谱柱：angilentTC-C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：甲醇-水(15∶85)流速：1ml/min，检测波长：260nm，进样量：10μL，柱温：25℃。在选定条件下各主要特征峰与相邻组分色谱峰的分离度均大于1.5，按腺苷峰计算，理论塔板数在10000以上，对称度小于1.15。

2.2.4总提取物供试品溶液的制备

称取干燥的人工培植蛹虫草子实体粉末药材适量，精密称定，置具塞的锥形烧瓶中，精密加入适量溶剂，称重。超声提取后，静置，擦干锥形瓶外侧水分，称重，用相应溶剂补足减失重量，加一定量甲醇沉淀多糖，静置，待沉淀完全，过滤，吸取20mL，甲醇定容至50mL，用0.45μm微孔滤膜滤过，作为人工培植蛹虫草子实体总提物供试品溶液。

精密吸取供试品溶液10μl，在上述色谱条件下进样分析，按下式以外标法计算总提取物中腺苷的百分含量。

$\frac{\frac{\mathrm{\μg}}{10\×4\mathrm{\μl}}\×\mathrm{Vml}\×{10}^{-3}}{g}\×100\%$

2.2.5空白试验

吸取甲醇10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。在选定条件下，空白溶剂(甲醇)对测定无干扰。

2.2.6精密度试验

精密吸取同一供试品溶液10μL，连续进样5次，腺苷峰面积的RSD值分别为0.98％，结果表明仪器精密度良好，见表4。

表4精密度试验

2.2.7腺苷标准曲线的制定

吸取对照品溶液2.0mL，4.0mL，6.0mL，8.0mL，10.0mL，于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度。取各对照品溶液10μL进样，按2.2.3项下工作条件进样分析，以峰面积为纵坐标，以进样量为横坐标，得直线回归方程为Y＝718189X-2594.7，R²＝0.9997，线性范围为0.08μg～0.40μg，见图1。

2.2.8重现性试验

取同一批次供试品，按2.2.4项方法平行制备人工培植蛹虫草子实体供试液5份，按2.2.3项下工作条件进样分析。结果测得腺苷含量的RSD值分别为1.95％，结果表明方法重现性良好，见表5。

表5重复性试验

2.2.9加样回收试验

精密称取1.0g已知腺苷含量的人工培植蛹虫草子实体样品5份，定量加入对照品溶液，按2.2.4项下方法制成供试品溶液，按2.2.3项下工作条件测定加样回收率，每份样品平行测定3次，结果取平均值，并计算RSD值，结果见表6。

表6腺苷加样回收试验

2.3人工培植蛹虫草子实体正丁醇部位得率的测定

取同一批次的人工培植蛹虫草子实体样品5份，精密称重，按最佳的提取和萃取条件制备其正丁醇有效部位的浸膏，结果表明正丁醇部位浸膏的平均得率为10.48％，见表7。

表7人工培植蛹虫草子实体正丁醇部位得率的测定

2.4结论

根据本实验实际测定结果，可见最佳提取参数为提取溶剂水，料液比1∶30(药材重量∶溶剂体积)，提取方式为超声提取，室温下提取时间30分钟，提取次数为1次。萃取的最佳条件是将总提物用正丁醇等体积分配6次制备获得人工培植蛹虫草子实体的正丁醇部位，得率为10.48％。

3、人工培植蛹虫草子实体提取物的制备

3.1总提取物的制备

根据正交设计2.2.4优选确定的人工培植蛹虫草子实体总提取物制备的最佳方案，本项目研究，称取粉碎的人工培植蛹虫草子实体粗粉100g，加入3000ml水超声提取1次，30min，滤取提取液，减压浓缩为1000ml(1ml相当于0.1g原生药)，即人工培植用虫草子实体总浸膏；同时制备70％乙醇热回流提取物。

3.2化学成分部位的制备

取人工培植蛹虫草子实体总提取物加入乙醇至体系含醇量达到70％，充分搅拌，静置过夜，滤取上清液，回收溶剂，得水提醇沉物。

取人工培植蛹虫草子实体总提取物，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压回收溶剂，真空干燥，得到干燥浸膏状提取物，即乙酸乙酯部位乙酸乙酯萃取后的水提取浓缩液，继续用等体积的水饱和正丁醇萃取六次，合并萃取液，减压回收溶剂，真空干燥，得到淡黄色粉末状正丁醇部位提取物，即本发明人工培植蛹虫草子实体提取物，可用于治疗慢性肾炎。

三、本发明人工培植蛹虫草子实体提取物药效学研究资料

1、材料与方法

1.1样品来源及处理

样品为淡黄色粉末状本发明人工培植蛹虫草子实体提取物，人群推荐日摄入量为0.1g/60kg BW(即0.00167g/kg BW)。样品配制：准确称取本发明人工培植蛹虫草子实体提取物0.042g、0.084g、0.167g样品粉末，分别用蒸馏水定容至100mL，作低、中、高剂量组小鼠灌胃用。

1.2实验动物及环境

SPF级昆明种雌性小鼠，18～22g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。湖北省实验动物从业人员证书：G20080516。动物饲养室温度为20～25℃，湿度为40～70％。

1.3剂量分组

按人群推荐日摄入量0.00167g/kg BW扩大5、10、20倍设置低、中、高三个剂量组，即0.0084、0.0167、0.0334g/kg BW，共分四个实验组，每实验组包括阴性对照组、低、中、高剂量组，各剂量组实验动物数为10只。实验一组进行迟发型变态反应和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验；实验二组进行淋巴器官/体重比值测定和碳廓清实验；实验三组进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验和NK细胞活性测定；实验四组进行血清溶血素的测定和抗体生成细胞检测。小鼠连续灌胃30天后开始试验。各实验组均按0.20ml/10gBW容量经口灌胃给予。

1.4试验方法

1.4.1ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验[参见：方正而.辨证治疗CGN52例临床观察[J].湖南中医学院学报，1998；18(1)：32-33.]

方法：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制或单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank’s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为3×10⁶个/mL。将每一份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μL ConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置5％CO₂，37℃CO₂孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPM11640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔(100μL/孔)，用酶标仪以570nm波长测定光密度值。

1.4.2二硝基氟苯(DNFB)诱导迟发型变态反应(DTH)[参见：卢月英.慢性肾小球肾炎的中医治疗[J].现代中西医结合杂志，1998；7(7)：1057-1058.]

方法：耳肿胀法。用1％DNFB(以1∶1的丙酮麻油溶液配制)致敏小鼠后，第5天再用DNFB攻击右耳，24h后处死动物剪下左右耳壳用打孔器取下直径8mm的耳片，称重，以左右耳的重量之差来表示DTH的程度。

1.4.3血清溶血素的测定[参见：郭大庆，余江毅，熊宁宁，等.132例原发性肾小球疾病载脂蛋白水平与中医辨证分型关系[J].中国中西医结合杂志，1994；14(7)：409-411]

方法：血凝法。取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2％(v/v)的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4～5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。

凝集反应：用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μL，再加入100μL 0.5％(v/v)SRBC悬液，混匀，放入湿润的平盘内并加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血清凝集程度。根据血清凝聚程度的级别计算出抗体积数。

1.4.4腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验[参见：师晶丽，黄韵竹.肾小球疾病中医辨证分型与血脂关系探讨[J].贵阳医学院学报，1995；20(1)：32]

方法：半体内法。制备20％的鸡红细胞悬液，每只鼠腹腔注射1mL该悬液，30min后处死动物，将其仰位固定于鼠板上，开腹，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1min，然后，吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片载玻片上，37℃温育30min；育毕用生理盐水漂洗，晾干，以1∶1的丙酮甲醇溶液固定，4％Giemsa一磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数：

1.4.5小鼠碳廓清试验[参见：余江毅，熊宁宁，余承惠.慢性肾病瘀血与湿热病理的临床和实验研究[J].辽宁中医杂志，1995；22(2)：91-92.]

方法：按体重从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁(10mL/kg)，待墨汁注入，立即计时注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，并立即将其加到2mL0.1％Na₂CO₃溶液中。各吸0.1mL于96孔酶标板中，用酶标仪在600nm波长处测光密度值(0D)，以Na₂CO₃溶液作阴性对照。

将小鼠处死.取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重。

以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a。受试样品组的吞噬指数显著高于对照组，可判定该项实验结果阳性。

$K=\frac{{\mathrm{LgOD}}_1-{\mathrm{LgOD}}_2}{t_2-t_1}$

1.4.6抗体生成细胞检测[参见：周清发.慢性肾小球疾病尿酶变化与辨证分型的研究[J].中医研究，1995；8(6)：25]

取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min，每只鼠经腹腔注射2％(v/v)SRBC 0.2mL。将SRBC免疫4～5天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛装有Hank’s液的小平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心(1000/min)10min，用Hank’s液洗2遍，最后将细胞悬浮在5mL RPM11640培养液中计数细胞，并将细胞浓度调整为5×10⁶个/mL。

空斑的测定：将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至100mL)加热溶解后，放入45～50℃水浴保温，与等量pH7.2～7.4、2倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加50μL 10％SRBC(v/v，用SA缓冲液配制)，20μL脾细胞悬液(5×10⁶个/mL)，迅速混匀，倾倒于己刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h，然后用SA缓冲液稀释的补体(1∶8)加入玻片架凹槽内，继续温育1.5h后，计数溶血空斑数。

1.4.7NK细胞活性测定[参见：程李涛.熊宁宁教授治疗CGN湿热证经验拾粹[J].中医药学刊，2003；21(3)：348-349.]

方法：乳酸脱氢酶(LDH)测定法。

靶细胞的传代(YAC一1细胞)：

实验前24h将靶细胞进行传代培养。用前以Hank’s液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4X10⁵个/mL。

脾细胞悬液的制备(效应细胞)：

无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’S液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank’S液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL 2倍Hank’S液及8mLHanks液，1000r/min，10min离心，用1mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1％冰醋酸稀释后计数(活细胞数应在95％以上)，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×10⁷个/mL。

NK细胞活性检测：

取靶细胞和效应细胞各100μL(效靶比50∶1)，加入U型96孔培养板中：靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μL；上述各项均设三个平行孔，于37℃、5％CO₂培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，根据室温不同反应3～10min，每孔加入1mol/L的HCL 30μL，在酶标仪490nm处测定光密度值(0D)。

按下式计算NK细胞活性，受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，即可判定该项实验结果阳性。

2、结果

2.1人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位对小鼠体重的影响

人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位对小鼠体重的影响结果见表18、表19、表20、表21，各实验组小鼠试验前后体重与对照组比较，无显著性差异，表明人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位对小鼠体重无明显影响。

表18实验一组试验前后小鼠体重记录(x±S)

表19实验二组试验前后小鼠体重记录(x±S)

表20实验三组试验前后小鼠体重记录(x±S)

表21实验四组试验前后小鼠体重记录(x±S)

2.2人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位对动物淋巴器官的影响

人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位对动物淋巴器官/体重比值的影响见表22。各组小鼠胸腺/体重比值和脾脏/体重比值与阴性对照组比较，均无显著性差异(P＞0.05)。

表22对动物淋巴器官/体重比值的影响对小鼠淋巴器官/体重比值的影响(x±s)

2.3人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位脾淋巴细胞转化实验

人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位脾淋巴细胞转化实验结果见表23。从表23可见，与阴性对照组比较，人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位高剂量组显著性增强ConA诱导的脾淋巴细胞增殖能力(P＜0.05)。

表23对细胞免疫功能的影响(x±S)

2.4人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位对小鼠迟发型变态反应的影响

人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位对小鼠迟发型变态反应的影响结果见表23。从表23可见，与阴性对照组比较，人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位高剂量组显著性增强小鼠对DNFB诱发的DTH反应(p＜0.05)。

2.5人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位对小鼠血清溶血素滴度水平的影响

人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位对小鼠血清溶血素滴度水平的影响见表24。从表24可见，与阴性对照组比较，人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位对小鼠血清溶血素滴度水平的影响高剂量组可显著性升高血清溶血素含量(P＜0.05)。

表24对小鼠体液免疫功能的影响(x±S)

2.6人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验

人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验研究结果见表25。从表25可见，与阴性对照组比较，人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位高剂量组明显提高吞噬率、吞噬指数(P＜0.05)。

表25对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(x±S)

2.7人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位碳廓清实验

人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位碳廓清实验研究结果见表26。从表26可见，与阴性对照组比较，人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位高剂量组可显著性提高小鼠碳廓清吞噬指数(P＜0.05)。

表26对小鼠碳廓清功能的影响(x±S)

2.8人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位抗体生成细胞检测实验

人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位抗体生成细胞检测实验研究结果见表27。从表27见，与阴性对照组比较，人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位高剂量组能明显增强抗体生成细胞能力(P＜0.01)。

表27对抗体生成细胞功能的影响(x±S)

2.9人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位NK细胞活性实验

人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位NK细胞活性实验研究结果见表28。从表28可见，与阴性对照组比较，人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位各剂量组不能增强小鼠NK细胞活性(P＞0.05)。

表28对小鼠NK细胞活性的影响(x±S)

3结论

根据人群推荐日摄入量0.00167g/kg BW扩大5、10、20倍设置低、中、高三个剂量组，即0.0084、0.0167、0.0334g/kg BW，另设阴性对照组。采用SPF级昆明种小鼠，连续灌胃给予30天后开始检测有关指标。实验结果以P＜0.05判断为显著性差异，结果显示：

1)各剂量组与阴性对照组比较，小鼠体重、淋巴器官/体重比值差异均无显著性；

2)高剂量组能明显增强ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力；

3)高剂量组能明显增强二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型变态反应；

4)高剂量组能明显升高小鼠血清溶血素含量；

5)高剂量组能明显增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能；

6)高剂量组能明显增强小鼠碳廓清能力；

7)高剂量组能明显增强抗体生成细胞能力；

8)各剂量组均不能增强小鼠NK细胞活性。

四、本发明人工培植蛹虫草子实体提取物安全性研究资料

为了评价本发明人工培植蛹虫草子实体提取物(即本发明工艺制备的人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位)的安全性，本发明应用现代毒理学技术和方法，对人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位进行了相关安全性研究。

1材料和方法

1.1样品及处理

人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位按本发明制备工艺制备，为淡黄色粉末，人群推荐日摄入量为0.00167g/kg BW。将受试样品粉末用蒸馏水配制成相应浓度的均匀混悬液，供小鼠急性经口毒性试验用，大鼠30天喂养试验将样品掺入饲料中饲喂大鼠。

1.2动物品种及来源

SPF级昆明种小鼠、wistar大鼠及饲料均由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，湖北省实验动物从业人员证书：G20080516。动物体重依各项试验要求而定。实验室温度20～24℃，湿度40～70％。

1.3小鼠急性经口毒性试验[参见：马玉凤，李文泉，王卫霞.195例肾小球疾病中医分型与实验指标相关性的探讨[J].中医杂志，1998；39(8)：483-485.]

1.3.1剂量设置

受试样品小鼠灌胃剂量为1.0g/kg BW，相当于人群推荐同摄入量0.00167g/kg BW的[计算公式：相当于人群推荐量的倍数＝小鼠灌胃剂量(g/kg BW)/人群推荐同摄入量(g/kg BW)]598.8倍。

1.3.2样品配制

灌胃前准确称取受试样品1g，置于碾钵中，加适量的蒸馏水充分碾磨，然后将样品移入50ml的量筒中，再加蒸馏水定容至总容量为40ml。配制好的受试样品的浓度为：0.025g/ml，灌胃前充分摇匀配制好的受试样品。

1.3.3试验方法

最大耐受量法。选用SPF级昆明种小鼠，体重为18～22g，雌雄各10只，灌胃前16h动物禁食不禁水，称重后受试物按间隔4h分两次灌胃给予，灌胃容量为0.2ml/10g BW，累计总剂量为1g/kg BW，末次灌胃后2h小鼠恢复自由进食。灌胃当天连续观察，以后每天观察2次直至第14天，并记录动物中毒症状及死亡数，试验结束未死亡动物称重。

1.4人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位30天喂养试验[参见：张福生，杨颖.CGN湿热证客观指标的变化[J].浙江中医杂志，1995；30(7)：322.]

1.4.1剂量及分组

选体重60～80g共80只wistar大鼠，雌难各半，随机分成一个阴性对照组和三个剂量组(即0.042、0.083、0.167g/kg BW，受试样品低、中、高剂量组分别相当于人群推荐日摄入量0.00167g/kg BW的25、50、100倍)。每组雌雄各10只大鼠，饲养方法为单笼喂养。

1.4.2样品配制

受试样品采用掺入饲料的方法给予。按表29所示，准确称取各剂量组的受试样品和基础饲料，拌匀，制成颗粒状饲料，消毒后备用。大鼠日摄入量按其体重的10％计，每个剂量组饲料配制16kg。阴性对照组给予同批正常饲料。

表29大鼠30天喂养试验剂量设计表

1.4.3观察指标：包括

①一般临床症状：一般表现，行为，中毒症状和死亡情况。

②体重、进食量和食物利用率。

③血液学检查：试验结束时测定血红蛋白(HB)，红细胞计数(RBC)，白细胞(WBC)计数及分类、血小板(PLT)计数、淋巴细胞(LY％)、中间细胞(MO％)、中性粒细胞(GR％)，均用光电MEK-6318K型自动血球计数仪测定。

④血液生化检查：试验结束时测定血清谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)，血清尿素氮(BUN)，总胆固醇(TCH)，甘油三酯(TG)，肌酐(Cr)，血糖(GLu)，血清白蛋白(Alb)、总蛋白(TP)等指标。检测仪器为：日立7020型全自动生化分析仪。检测试剂为：上海丰汇医学科技有限公司生产的试剂盒。

⑤脏器重量和脏/体比值(为禁食后的体重，即剖杀重)。

1.5实验数据统计

实验数据用Microsoftt Excel软件建立数据库，计量资料采用t检验，计数资料采用非参数统计法(Nonparmetric statistic)，并按动物性别分别统计。

2结果

2.1小鼠急性经口毒性试验结果见表30。

表30对昆明种小鼠急性毒性试验结果

结论：在两周观察期内动物未见明显中毒症状，亦无动物死亡，MTD大于1g/kg BW，按急性毒性分级标准评价，该受试样品属无毒级。

2.230天喂养试验

2.2.1动物一般表现：试验过程中动物无死亡，毛发正常，无异常行为表现。

2.2.2对大鼠体重、进食量、食物利用率的影响：对大鼠体重、进食量、食物利用率影响的结果见表31～33。从表31～33可见，受试样品各剂量组大鼠每周体重、进食量、食物利用率与阴性对照组比较差异均无显著性(P＞0.05)。

表31对大鼠体重的影响(均数±标准差)

表32大鼠进食量的影响(均数±标准差)

表33对大鼠食物利用率的影响(均数±标准差)

2.2.3对大鼠增重及总食物利用率的影响

对大鼠增重及总食物利用率的影响结果见表34。从表34可见，受试样品各剂量组鼠总食物利用率和增重与阴性对照经比较，均无显著性差异(P＞0.05)。

表34对大鼠增重及总食物利用率率的影响(均数±标准差)

2.2.4血液学检查结果

2.2.4.1对大鼠血常规的影响

人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位对大鼠血常规的影响结果见表35。从表35可见，受试样品各剂量组与阴性对照组数值比较，均无显著性差异(P＞0.05)，且均在正常值范围内。

表35对大鼠血常规检查结果的影响(均数±标准差)

2.2.4.2对大鼠白细胞分类的影响

人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位对大鼠白细胞分类的影响结果见表36。从表36可见，受试样品各剂量组与阴性对照组数值比较，均无显著性差异(P＞0.05)，且均在正常值范围内。

表36对大鼠白细胞分类的影响(均数±标准差)

2.2.5对大鼠血液生化检查的影响

人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位对大鼠血液生化检查的影响结果见表37。从表37可见，受试样品各剂量组大鼠血清ALT、AST、BUN、TCH、TG、Cr、GLu、Alb、TP测定结果与阴性对照组数值比较，均无显著性差异(P＞0.05)，且均在正常值范围内。

表37对大鼠血液生化的影响(均数±标准差)

续表37对大鼠血液生化的影响(均数±标准差)

2.2.6对大鼠脏器重量及脏/体比值的影响

人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位对大鼠脏器重量及脏/体比值的影响结果见表38。从表38可见，受试样品各剂量组脏器重量和脏/体比值与阴性对照组比较，均无显著性差异(P＞0.05)。且均在正常值范围内。

表38对大鼠脏器重量及脏/体比值的影响(均数±标准差)

续表38对大鼠脏器重量及脏/体比值的影响(均数±标准差)

3小结

对两种性别的SPF级昆明种小鼠急性经口毒性试验，累计两次灌胃剂量达20g/kg BW(相当于人群推荐同摄入量0.00167g/kg BW的598.8倍)，在14天的观察期内实验动物未见明显中毒症状和死亡，依据急性毒性分级评价标准规定，该受试样品属无毒级。

30天喂养试验结果表明：将受试样品按0.42、0.83、1.67g/kgBW剂量(分别相当于人群推荐同摄入量1.0g/60kgBW，即0.00167g/kg Bw的25、50、100倍)对SPF级Wistar大鼠连续给予30天，实验动物未见明显的中毒症状和死亡。受试样品各剂量组大鼠体重、进食量、食物利用率、血液学、血液生化、脏器重量、脏/体比值等指标与阴性对照组比较，均无显著性差异，结果为：未发现该受试样品有明显的毒性作用。

以上研究证实本发明人工培植蛹虫草子实体提取物具有增强免疫力功能作用，能作为治疗慢性肾炎的药物用于治疗慢性肾炎。由于本发明采用了合理的优化工艺，提高了原材料的利用率和工作效率。本发明人工培植蛹虫草子实体提取物安全无毒。

附图说明

图1为腺苷标准曲线图。

具体实施方式

实施例1

取当年人工培植蛹虫草子实体为原料，洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得原料粗粉80.00g。原料粗粉用2400ml水超声提取1次，30min，提取液过滤，浓缩至1/3量即为总浸膏。将总浸膏加入乙醇至体系含醇70％，充分搅拌，静置过夜，取上清液，回收溶剂，得水提醇沉物。取醇沉物，用等体积乙酸乙酯萃取3次弃去，乙酸乙酯萃取后的水提取浓缩液继续用等体积水饱和正丁醇萃取6次，合并萃取液，减压回收溶剂，真空干燥，得干燥浸膏状提取物5.32克。

实施例2

取当年人工培植蛹虫草子实体为原料，洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得原料粗粉74.60g。原料粗粉用2238ml水超声提取1次，30min，提取液过滤，浓缩至1/3量即为总浸膏。将总浸膏加入乙醇至体系含醇70％，充分搅拌，静置过夜，取上清液，回收溶剂，得水提醇沉物。醇沉物用等体积乙酸乙酯萃取3次弃去，。乙酸乙酯萃取后的水提取浓缩液继续用等体积水饱和正丁醇萃取6次，合并萃取液，减压回收溶剂，真空干燥，得干燥浸膏状提取物4.98克。

Claims (3)

1. 一种增强免疫力的药物，其特征在于，它是按以下步骤制备的人工培植蛹虫草子实体提取物：

　　步骤一、以当年生人工培植蛹虫草子实体为原料，洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得原料粗粉；

步骤二、将原料粗粉用30倍量水超声提取1次，30min，提取液过滤，浓缩至1/3量即为总浸膏；

步骤三、将总浸膏加入乙醇至体系含醇70%，充分搅拌，静置过夜，取上清液，回收溶剂，得水提醇沉物；

步骤四、取醇沉物，以水分散，用与水等体积乙酸乙酯萃取3次，弃去乙酸乙酯萃取液，用与保留的水分散液相等体积水饱和正丁醇对保留的水分散液萃取6次，合并萃取液，减压回收溶剂，真空干燥，得淡黄色粉末状人工培植蛹虫草子实体提取物。

2. 一种人工培植蛹虫草子实体提取物的制备工艺，其特征在于包括以下步骤：

步骤一、以当年生人工培植蛹虫草子实体为原料，洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得原料粗粉；

步骤二、将原料粗粉用30倍量水超声提取1次，30min，提取液过滤，浓缩至1/3量即为总浸膏；

步骤三、将总浸膏加入乙醇至体系含醇70%，充分搅拌，静置过夜，取上清液，回收溶剂，得水提醇沉物；

步骤四、取醇沉物，以水分散，用与水等体积乙酸乙酯萃取3次，弃去乙酸乙酯萃取液，用与保留的水分散液相等体积水饱和正丁醇对保留的水分散液萃取6次，合并萃取液，减压回收溶剂，真空干燥，得淡黄色粉末状本发明人工培植蛹虫草子实体提取物。

3.依据权利要求２所述人工培植蛹虫草子实体提取物的制备工艺制备的人工培植蛹虫草子实体提取物在制备增强免疫力的药物中的应用。

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