CN102423346A - 一种牡丹皮提取物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种牡丹皮提取物及其制备方法和用途。其制备方法为：牡丹皮药材用有机醇水溶液提取、浓缩、干燥，得到所述的牡丹皮提取物。该牡丹皮提取物能够抑制葡萄糖调节蛋白GRP78，用于抗病毒。体外实验证明：牡丹皮提取物具有显著的抗乙肝病毒分泌作用，同时对正常细胞及肝癌细胞的毒性都较小，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于中药领域，具体地涉及一种中药提取物及其制备方法和用途，特别是涉及一种牡丹皮提取物及其制备方法，该提取物可用于抗病毒。
背景技术
牡丹皮又名丹皮、粉丹皮，为毛茛科芍药属植物牡丹Paeoniasuffruticosa Andr.的干燥根皮。始载于《神农本草经》，现收录于《中国药典》，性微寒，味苦、辛，归心、肝、肾。具有清热解毒，活血化瘀之功效。用于治疗温毒发斑，吐血衄血，夜热早凉，无汗骨蒸，经闭痛经，痈肿疮毒，跌打伤痛等。
牡丹皮的主要化学成分包括丹皮酚及其苷类、芍药苷及其苷类、三萜、甾醇等。近年来国内外学者对该植物的药理活性研究发现其在治疗心脑血管疾病、抗菌、消炎、抗肿瘤、治疗皮肤病等方面有很好的功效，具有增强免疫、降血糖、保肝、镇痛、镇静、抗惊厥等作用，显示该植物具有很大的药用前景。
GRP78是位于内质网(endoplasmic reticulum，ER)的分子量78KDa的分子伴侣，全称为葡萄糖调节蛋白78(78-kDaglucose-regulated protein)，又被称为Bip(免疫球蛋白结合蛋白)。具有钙离子结合能力及保护子功能，对于折叠、成熟、转运蛋白质到细胞外有重要的作用，使蛋白质具有正确的功能和结构。已知在短暂高温、缺氧、低温、高糖、辐射等ER压力下，未折叠或非正常折叠蛋白质蓄积于ER内，会诱导GRP78的表达。通过GRP78过量表达实验或反义抑制实验发现，GRP78与针对ER压力引起的细胞死亡的防御反应有关(Lee AS.Trends Biochem Sci.2001，26：504-10)。
据报道，数种病毒诱导UPR(未折叠蛋白反应，unfolded proteinresponse)伴随GRP78表达上调及细胞死亡，包括：乙肝病毒(Xu Z.JVirol.1997，71(10)：7387-92)、丙肝病毒(Tardif，K.D.et al.J.Virol.76：7453-7459)、疱疹病毒(Mao，H.Virus Research.2001，76(2)：127-135)、登革热病毒(S Wati et al.Journal of Virology.2009，83：12871-12880)、人巨细胞病毒(Nicholas J.Buchkovich.Journalof Virology.2008，82：31-39)、日本脑炎病毒(Su H.L.et al.J.Virol.76：4162-4171)及很大程度依赖内质网正确折叠及装配的病毒(S Wati etal.Journal of Virology.2009，83：12871-12880)。
研究显示，GRP78利用其分子伴侣功能折叠装配病毒蛋白。GRP78与病毒的核心蛋白有结合反应，提示GRP78参与了蛋白质包被核酸的过程(He B.Cell Death Differ 2006，13(3)：393-403)。
GRP78裂解剂SubAB可以使GRP78几乎消失，不影响病毒蛋白的合成，但可以阻断病毒颗粒的形成，提示控制GRP78的表达可达到影响病毒颗粒装配及向外释放的目的(Nicholas J.Buchkovich.Journalof Virology.2008，82：31-39)。
用GRP78抗体处理也可以降低病毒进入细胞的蛋白G结合，并减少感染(Honda et al.J.Virol.2009，83：12622-12625)。
有研究表明，苎麻提取物降低了乙肝病毒引起的GRP78上调，结果病毒蛋白质合成未受影响，但病毒颗粒分泌下降(Huang KL.J ViralHepat.2009，16：367-375.)。
这些都提示了一个新的抗病毒途径：抑制GRP78的表达以提供一个影响病毒装配的目标，该途径可能不易发展耐药性。
目前，尚未发现关于牡丹皮提取物作用于GRP78而影响病毒分泌方面的报道。
发明内容
发明人在利用中国专利ZL01121114.8的草药芯片筛选可与GRP78结合的草药活性成分时，惊讶地发现在牡丹皮提取物中存在有一系列活性成分能专一地与GRP78结合并抑制GRP78的活性。进一步经由体外实验，本发明人惊讶的发现牡丹皮提取物对乙肝病毒的分泌有明显的抑制作用并且显示极低的细胞毒性。
为此，本发明提供一种牡丹皮提取物及其制备方法，以及该牡丹皮提取物用于制备抗病毒药物的用途。
本发明的第一方面涉及本牡丹皮提取物用于制备作为葡萄糖调节蛋白GRP78抑制剂的药物中的用途。进一步地，利用该牡丹皮提取物可以以GRP78作为调控目标，用来抗病毒。因此本发明还涉及牡丹皮提取物用于制备抗病毒药物中的用途。所述的病毒包括：乙肝病毒、疱疹病毒、丙肝病毒、登革热病毒、人巨细胞病毒、日本脑炎病毒以及其他所有依赖内质网进行折叠及装配的病毒。
本发明的第二方面涉及上述牡丹皮提取物的制备方法，包括以下步骤：
1)毛茛科芍药属植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，用有机醇的水溶液提取合适的次数；
2)合并步骤1)中获得的提取液，将其浓缩至合适的体积；
3)将步骤2)获得的浓缩液干燥，得到所述的牡丹皮提取物。
上述牡丹皮提取物的制备方法中，所述的毛茛科芍药属植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮与提取溶剂的重量比为1∶1～10，优选的重量比为1∶6～10，进一步优选的重量比为1∶8～10，特别优选的重量比为1∶10；
所述的有机醇为C1-3有机醇，优选为C1-3一元醇、C1-3二元醇，进一步优选为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙二醇，更优选的是乙醇、丙醇、异丙醇，特别优选乙醇；
所述的提取次数为1～10次，优选提取2～6次，特别优选提取3次；
所述的有机醇水溶液中有机醇的重量百分含量为30％-70％，优选的重量百分比含量为40％-60％，更优选的重量百分比含量为50％；特别优选的有机醇水溶液为含乙醇50％重量百分比的水溶液；
所述的浓缩体积为提取液体积的1/20～1/40，优选浓缩至提取液体积的1/25～1/35，进一步优选浓缩至提取液体积的1/30；
所述的浓缩方式为蒸发浓缩、减压浓缩、膜浓缩，优选的浓缩方式为减压浓缩；
所述的干燥方式为减压干燥、真空冷冻干燥、喷雾干燥，优选的干燥方式为真空冷冻干燥。
本发明的第三方面涉及一种牡丹皮提取物，其特征在于，该提取物由前面所述的制备方法获得。
本发明的一个具体实施例分别应用30％、40％、50％、60％、70％的乙醇水溶液制备牡丹皮提取物，获得的牡丹皮提取物的HPLC谱图如图3所示。
本发明的第四方面涉及一种药物组合物，该组合物含有所述的牡丹皮提取物，和药学可接受的辅料。
所述的牡丹皮提取物可与适当的粉末基底混合以生成干燥粉末，其中该粉末基底选自乳糖、淀粉、淀粉衍生物(诸如多葡萄糖)、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，或牡丹皮提取物可与适当的医药上可接受的液体载体混合，该液体载体例如盐水和葡萄糖溶液。
医药上可接受的辅料，诸如粘合剂、甜味剂、增稠剂、芳香剂、崩解剂、涂覆剂、保存剂、润滑剂及/或时间延迟剂等，可加入至药物组合物中。适宜地，适当的甜味剂包括蔗糖、果糖、葡萄糖、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(aspartame)及糖精；适当的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、黄原胶、皂土、藻朊酸及琼脂；适当的芳香剂包括薄荷油、白珠树(wintergreen)油、樱桃香料、柑橘香料及覆盆子果香料；适当的涂覆剂包括丙烯酸及/或甲基丙烯酸的聚合物或共聚物及/或彼等的酯、蜡、脂肪醇、玉米朊、虫胶及谷蛋白粘胶(glutan)；适当的保存剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、硬脂酸、油酸钠、氯化钠及滑石；且，适当的时间延迟剂包括单硬脂酸甘油酯和二硬脂酸甘油酯。
所述的药物组合物可以制成粉末、小袋(sachet)、颗粒、胶囊、药片、糖浆、溶液、悬浮液、乳化液、软膏、乳霜、洗剂或贴片等剂型。对口服给药，该药物组合物可调制成药片、颗粒、粉末、小袋(sachet)、胶囊、糖浆、溶液、悬浮液或乳化液。对静脉内和非经肠给药，该药物组合物可调制为医学上可接受的糖浆、溶液、悬浮液或乳化液。对经皮肤给药，该药物组合物可调制为软膏、乳霜、洗剂或贴片。
所述的药物组合物可用于制备抗病毒药物。其中所述的病毒包括：乙肝病毒、疱疹病毒、丙肝病毒、登革热病毒、人巨细胞病毒、日本脑炎病毒以及其他所有依赖内质网进行折叠及装配的病毒。
本发明的第五方面涉及一种通过抑制GRP78抗病毒的方法，其包括对需要抗病毒的个体施用所述的牡丹皮提取物，所述病毒包括乙肝病毒、疱疹病毒、丙肝病毒、登革热病毒、人巨细胞病毒、日本脑炎病毒以及其他所有依赖内质网进行蛋白正确折叠及装配的病毒。给药方式可以包括口服、静脉内、非经肠或经皮肤给药。推荐的给药剂量为1mg～100mg/kg，优选20mg～80mg/kg，进一步优选的给药剂量为40mg～60mg/kg。
发明的有益效果
本发明的制备方法制备的牡丹皮提取物能够专一地与GRP78结合，并抑制GRP78的活性，对乙肝病毒的分泌有明显的抑制作用并且显示极低的细胞毒性。
附图说明
图1是实施例1制备本发明牡丹皮提取物的工艺流程图示例；
图2是五种不同浓度乙醇水溶液提取牡丹皮得到产物的收率比较图；
图3是本发明牡丹皮提取物的高效液相层析(HPLC)图谱；
图4是各浓度牡丹皮提取物中能与葡萄糖调节蛋白GRP78结合的活性部分的筛选结果图，由上至下分别为不同浓度乙醇的牡丹皮提取物的筛选结果，其中：A，30％乙醇的牡丹皮提取物；B，40％乙醇的牡丹皮提取物；C，50％乙醇的牡丹皮提取物；D，60％乙醇的牡丹皮提取物；E，70％乙醇的牡丹皮提取物；
图5是本发明的牡丹皮提取物体外对HepG2.2.15细胞毒性分析上所显现的细胞毒性；
图6是本发明的牡丹皮提取物体外对AML12细胞毒性分析上所显现的细胞毒性；
图7是本发明的牡丹皮提取物体外对HepG2.2.15细胞分泌乙肝病毒颗粒所显现的抑制活性，其中检测目标为HBsAg的相对表现量；
图8是本发明的牡丹皮提取物体外对HepG2.2.15细胞分泌乙肝病毒颗粒所显现的抑制活性，其中检测目标为HBeAg的相对表现量。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1.应用50％乙醇-水溶液制备牡丹皮提取物
实施例1的牡丹皮提取物的制备方法如图1的流程图所示。具体而言，将毛茛科芍药属植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮10kg于室温下加入100kg50％乙醇-水溶液中，搅拌浸泡8小时，之后将提取液滤出，滤渣于室温下加入80kg50％乙醇-水溶液中，搅拌浸泡8小时，将提取液滤出，滤渣于室温下加入60kg50％乙醇-水溶液中，搅拌浸泡8小时，将三次提取液合并减压浓缩至1/30体积，浓缩液减压干燥或真空冻干即得牡丹皮提取物。
实施例2.应用不同浓度(30％、40％、50％、60％、70％)的乙醇水溶液制备牡丹皮提取物
参考图1所示流程图，制备牡丹皮提取物。具体地，将5份牡丹皮(各1kg)于室温下加入相应浓度(30％、40％、50％、60％或70％)的乙醇水溶液(10kg)中并经搅拌浸泡8小时。随后经过滤，分离出第一滤液和第一滤渣。将该第一滤渣于室温下加入对应浓度(30％、40％、50％、60％或70％)的乙醇水溶液(8kg)中并经搅拌浸泡8小时。随后经过滤，分离出第二滤液和第二滤渣。将该第二滤渣于室温下加入对应浓度(30％、40％、50％、60％或70％)的乙醇水溶液(6kg)中并经搅拌浸泡8小时。随后经过滤，分离出第三滤液和第三滤渣。分别合并各浓度乙醇浸提的第一滤液、第二滤液及第三滤液并把滤液经减压浓缩至1/30的体积。将所得的浓缩液经真空冷冻干燥以得到提取物。计算收率，每组分别重复做3次，求平均值作图，不同浓度乙醇水溶液的收率如图2所示，以40％、50％、60％乙醇水溶液提取所得干燥产物收率较高。
实施例3.利用草药芯片筛选活性成分
利用中国专利ZL01121114.8中记载的草药中活性成分高通量筛选方法，筛选实施例2中获得的牡丹皮提取物。具体描述如下(筛选结果示于图4)：
①利用HPLC对草药萃取液进行分级
实施例2中的应用五个不同浓度的乙醇水溶液提取的牡丹皮提取物，分别取用所得的冷冻干燥粉末适量并将其溶解于50％乙醇水溶液(1ml)中以得到相当于1g生药/ml的溶液。将得到的溶液以12000rpm(上海安亭TGL-16B)离心20分钟，收集澄清上层液。将该澄清上层液以50％乙醇-水溶液稀释2倍后以0.45μm的针筒式过滤器过滤。该滤液用HPLC进行分级(谱图示于图3)，方法如下：
高效液相色谱：Shimadzu Lc-10A
色谱柱：Kromasil ODS 250×4.6mm 5-Micron
柱温：30℃
检测波长：254nm
流速：0.75ml/min
洗脱时间：96min
最高压力：400bar
进样量：50μl
流动相：水-乙醇
梯度程序：
时间 水相比例 乙醇相比例
0 100 0
90 50 50
96 0 100
以每分钟收集一管的方式收集96个流分，将此96个流分加载于96孔U形底微量滴定板中，将此载有96个流分的微量滴定板以离心减压干燥(Thermo Speed Vac)的方式干燥。
②以微数组方式将样品加载至经涂覆的塑料载片上
如述于ZL01121114.8的说明书中的方法，利用微数组器(台湾率然Biodot A101)将①中所述流分点配置于经涂覆的塑料载片上。首先将该微量滴定板中的牡丹皮干燥成分以20％DMSO/0.1M磷酸缓冲液每孔30μl回溶，利用2针具(直径0.8mm)将样品自该96孔U形底微量滴定板加载至该经涂覆的塑料载片上。同时将浓度为4，10，50，250ng/ml的生物素肼点及1μg/ml经Cy5标记的链霉抗生素蛋白配置于该载片上作对照组。待该塑料载片上的样品点干燥后(2～3小时)，将该塑料载片浸于1M乙醇胺(pH8.0)1小时。
③信号检测
利用生物素化的GRP78(B-GRP78)和经Cy5标记的链霉抗生素蛋白作为探针以进行杂交反应。利用2片盖玻片(22×22mm)分别盖住每一个塑料载片的2个凹槽，随后在第一个凹槽加入20μlTBST(50mMTris-HCl/0.15MNaCl/0.05％tween20，pH7.3)作为空白对照，第二凹槽加入20μl以TBST为溶剂的10μg/ml的B-GRP78，在室温避光反应1小时。反应完毕，利用该TBST缓冲液清洗芯片4次，双蒸水清洗芯片4次，于37℃干燥该塑料载片。之后利用2片盖玻片(22×22mm)分别盖住该塑料载片的2个凹槽，在两个凹槽中分别加入20μl以TBST为溶剂的2.5μg/ml的经Cy5标记的链霉抗生素蛋白，在室温避光反应1小时。反应完毕，利用该TBST缓冲液清洗芯片4次，双蒸水清洗芯片4次，于37℃干燥该塑料载片。干燥完毕后利用激光扫描仪(AXON 4100A)进行扫描。显影上红色荧光点显示该分级液与B-GRP78结合(扫描图见图4)。30％、40％、50％、60％、70％五种浓度的乙醇水溶液提取所得的牡丹皮提取物中均有部分分级液与GRP78有结合，以50％乙醇水溶液提取所得的牡丹皮提取物分级液与GRP78结合荧光强度最高。
实施例4.对肝癌细胞的细胞毒性实验
称取实施例2中制备的50％乙醇水溶液提取的牡丹皮提取物冻干粉0.1g，加50％乙醇回溶至10ml，使终浓度为10mg/ml，以0.22μm孔径无菌滤膜将其过滤除菌，以DMEM完全培养液稀释200倍，使其浓度为50μg/ml，再以DMEM完全培养液分别稀释出浓度为12.5μg/ml、25μg/ml的稀释液。
种植HepG2.2.15细胞(来自Dr.Ho，M.S.，Academia Sinica，Taiwan)5×103个细胞/100μl于96孔盘中(每孔100μl)，培养于DMEM完全培养液中，置于CO2培养箱(37℃、5％CO2，Forma Scientific)中培养24小时。确认细胞贴壁且生长良好后，吸出培养液，并在孔中依次加入上述配制好的浓度分别为12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml的牡丹皮提取物稀释液各100μl，各浓度(12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)均设3复孔，并设对照组：50％乙醇组(含有50％乙醇的DMEM完全培养液，正对照组)、纯培养液组、ADV组(ADV为adefovir，是一种已经体外体内实验验证可以有效对抗乙肝病毒的药物，并获美国FDA批准上市治疗慢性乙肝患者)，H2O2组(负对照组)，连续培养72小时。培养结束前4小时每孔加入100μl以FBS free培养液稀释10倍的MTT(5mg/ml)。72小时培养结束后每孔加入100μlDMSO于37℃、5％CO2培养箱中继续培养20分钟。之后以酶联免疫分析仪(ImageQuant，GE Healthcare)读取各孔OD570nm值，记录结果。以50％乙醇组为标准(50％乙醇组的细胞存活率为100％)，计算其他实验组的细胞存活率，计算公式为：实验组细胞存活率％＝(实验孔OD570nm值/50％乙醇孔OD570nm值)×100％，然后作图。如图5所示，12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml的牡丹皮提取物对肝癌细胞未显示细胞毒性。其中12.5μg/ml、25μg/ml浓度的牡丹皮提取物不但没有伤害细胞，还对细胞的增殖有一定的促进。
实施例5.对正常肝细胞的细胞毒性实验
种植AML12细胞(商购，购自American Type Culture Collection，货号：CRL-2254)5×103个细胞/100μl于96孔盘中(每孔100μl)，培养于DMEM完全培养液中，置于CO2培养箱(37℃、5％CO2，FormaScientific)中培养24小时。确认细胞贴壁且生长良好后，吸出培养液，并在孔中加入实施例4中制备的浓度为50μg/ml的牡丹皮提取物(50％乙醇水溶液提取)稀释液100μl，设3复孔，并设对照组：50％乙醇组(含有50％乙醇的DMEM完全培养液，正对照组)、纯培养液组、ADV组(ADV为adefovir是一种已经体外体内实验验证可以有效对抗乙肝病毒的药物并获美国FDA批准上市治疗慢性乙肝患者)，H2O2组(负对照组)，连续培养72小时。培养结束前4小时每孔加入100μl以FBSfree培养液稀释10倍的MTT(商品名：噻唑蓝，3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)，稀释后MTT的浓度为5mg/ml。72小时培养结束后每孔加入100μlDMSO(二甲基亚砜)于37℃、5％CO2培养箱中继续培养20分钟。之后以酶联免疫分析仪(ImageQuant，GE Healthcare)读取各孔OD570nm值，记录结果。以50％乙醇组为标准(50％乙醇组的细胞存活率为100％)，计算其他实验组的细胞存活率，计算公式为：实验组细胞存活率％＝(实验孔OD570nm值/50％乙醇孔OD570nm值)×100％，然后作图。如图6所示，50μg/ml的50％乙醇水溶液提取的牡丹皮提取物对正常肝细胞未显示细胞毒性。
实施例6.对肝癌细胞乙肝病毒分泌的抑制实验
完整具感染性的HBV病毒颗粒(virion)称为邓氏颗粒(Daneparticles)(Dane，Cameron et al.1970)，其外套膜由大型(large surface，LS)、中型(middle surface，MS)、及小型或称主要(small or majorsurface，SS)表面抗原组成，内则包覆由240个或180个核心蛋白(coreproteins、HBcAg)组成的核心颗粒(core particles or capsids)(Crowther，Kiselev et al.1994；Ganem and Prince 2004)，其中包裹部分双股DNA及聚合酶蛋白(polymerase)。因此能够抑制完整的乙肝病毒分泌，就可以抑制乙肝病毒的的感染性。一般而言，病毒的DNA或者RNA复制后，需要与病毒蛋白质装配好成为完整的病毒颗粒然后释放到细胞外才能感染其他的细胞，而GRP78参与了蛋白质包被核酸的过程(He B.Cell Death Differ 2006，13(3)：393-403)，GRP78是位于内质网上对于折叠、成熟、转运蛋白质到细胞外有重要的作用，使蛋白质具有正确的功能和结构的分子伴侣。也就是说只要依赖内质网进行蛋白折叠及装配的病毒都可以借由抑制GRP78的途径来达到对其抑制作用。因此，发明人发现了一个抑制病毒的新途径，即，通过抑制GRP78来抑制病毒颗粒装配和分泌，以达到抑制病毒的目的。为此我们设计了实施例6中的实验模型来测试牡丹皮提取物抑制GRP78的活性，以及抗病毒的活性。具体实验步骤如下所述。
种植HepG2.2.15细胞5×103个细胞/100μl于96孔盘中(每孔100μl)，培养于DMEM完全培养液中，置于CO2培养箱(37℃、5％CO2，FormaScientific)中培养24小时。确认细胞贴壁且生长良好后，吸出培养液，并在孔中依次加入实施例4中制备的浓度为50μg/ml的牡丹皮提取物(50％乙醇水溶液提取)100μl，设3复孔，并设对照组：50％乙醇组(含有50％乙醇的DMEM完全培养液)、纯培养液组、ADV组(ADV为adefovir是一种已经体外体内实验验证可以有效对抗乙肝病毒的药物并获美国FDA批准上市治疗慢性乙肝患者)、不分泌乙肝表面抗原的肝癌细胞组(HepG2)，连续培养72小时后，分别吸出培养液置于1.5ml离心管中，使用HBsAg(乙肝病毒颗粒表面抗原)酶联免疫检测试剂盒SURASE B-96(TMB)、HBeAg(乙肝病毒颗粒e抗原)酶联免疫检测试剂盒EASE BN-96(TMB)检测，以酶联免疫分析仪(ImageQuant，GEHealthcare)分别读取各孔OD450nm值(HBsAg)、OD665nm值(HBeAg)，记录结果并以下面公式计算后，将各组的HBsAg相对表现量及HBeAg相对表现量分别作图(见图7、图8)。
实验组相对空白对照组的表现量％＝(实验孔OD值/50％乙醇孔OD值)×100％
如图7、8所示，50μg/ml的50％乙醇水溶液提取的牡丹皮提取物对乙肝病毒的分泌有明显的抑制作用，分别使得HBsAg，HBeAg的表现量下降51.95％，47.54％(P＜0.001)。
上述实验表明50％乙醇水溶液提取的牡丹皮提取物能够明显抑制肝癌细胞分泌乙肝病毒，具有抗病毒作用，并且对细胞的毒性极低。
实施例7.牡丹皮提取物抗疱疹病毒(HSV-1)活性实验
样品配制：称取实施例2中制备的50％乙醇水溶液提取的牡丹皮提取物冻干粉20mg，以二甲亚砜配制成浓度为20mg/ml的溶液。然后用Vero细胞培养液(GIBCO的DEME培养基)分别稀释为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml。
细胞毒性测试：Vero细胞(由复旦大学药学院提供)在96孔培养板单层培养37℃，5％CO2培养24小时，吸弃上清液，分别加入上述已配制的牡丹皮提取物200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml药液，每个浓度4孔，每孔100μl。经37℃，5％CO2培养箱培养72小时显微镜观察细胞形态，显示100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml牡丹皮药液对Vero细胞毒性为0，200μg/ml牡丹皮药液对Vero细胞毒性为75％。
细胞病变抑制试验：Vero细胞(由复旦大学药学院提供)在96孔培养板单层培养，经37℃，5％CO2培养箱培养24小时，吸弃上清液，细胞经稀释液(不含牛血清的MEM培养液)洗涤，每孔加入洗涤液100μl，吸弃洗涤液，再加入10TCID50病毒液(单纯疱疹病毒HSV标准毒株1型Sm44，由北京中国医学科学院医药生物技术研究所提供，经复旦大学药学院传代保存)，于37℃，5％CO2培养箱中吸附2小时，吸去病毒液，加入上述已配制的牡丹皮提取物200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml药液，每个浓度4孔，每孔100μl。经37℃，5％CO2培养72小时，显微镜观察CPE(病变)，设细胞对照组，病毒对照组，阳性对照组(阿昔洛韦)，同时观察CPE。实验结果如表1所示。
表1：牡丹皮提取物抗疱疹病毒(HSV-1)活性实验结果
由表1中的数据可以看出，其中50μg/ml牡丹皮提取物药液对细胞病变抑制可达到25％，200μg/ml牡丹皮提取物药液对细胞病变抑制可达到50％，表明50％乙醇水溶液提取的牡丹皮提取物具有明显的抗疱疹病毒作用。
本发明通过实施例3的筛选实验实验，证明了本发明制备的牡丹皮提取物的组分与GRP78有结合反应，实施例4-7的细胞实验进一步证明了本发明制备的牡丹皮提取物能够使病毒颗粒分泌减少，这是GRP78的功能受到抑制的表现，因此本发明的牡丹皮提取物能够抑制GRP78活性，从而具有抗病毒活性。
实施例8.牡丹皮提取物胶囊制备
称取实施例1中用50％乙醇-水溶液制备的牡丹皮提取物250克粉碎，与250克淀粉混匀，过6号筛，装入0号胶囊，制成1000粒。
Claims (9)
1.牡丹皮提取物用于制备作为葡萄糖调节蛋白GRP78抑制剂的药物的用途，或用于制备抗病毒药物的用途。
2.权利要求1中所述的牡丹皮提取物的制备方法，包括以下步骤：
1)毛茛科芍药属植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，用有机醇的水溶液提取合适的次数；
2)合并步骤1)中获得的提取液，将其浓缩至合适的体积；
3)将步骤2)获得的浓缩液干燥，得到所述的牡丹皮提取物。
3.权利要求2中所述的制备方法，其中所述的毛茛科芍药属植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮与提取溶剂的重量比为1∶1～10，优选的重量比为1∶6～10，进一步优选的重量比为1∶8～10，特别优选的重量比为1∶10；
所述的有机醇为C1-3有机醇，优选为C1-3一元醇、C1-3二元醇，进一步优选为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙二醇，更优选的是乙醇、丙醇、异丙醇，特别优选乙醇；
所述的提取次数为1～10次，优选提取2～6次，特别优选提取3次；
所述的有机醇水溶液中有机醇的重量百分含量为30％-70％，优选的重量百分比含量为40％-60％，更优选的重量百分比含量为50％；特别优选的有机醇水溶液为含乙醇50％重量百分比的水溶液；
所述的浓缩体积为提取液体积的1/20～1/40，优选浓缩至提取液体积的1/25～1/35，进一步优选浓缩至提取液体积的1/30；
所述的浓缩方式为蒸发浓缩、减压浓缩、膜浓缩，优选的浓缩方式为减压浓缩；
所述的干燥方式为减压干燥、真空冷冻干燥、喷雾干燥，优选的干燥方式为真空冷冻干燥。
4.一种牡丹皮提取物，其特征在于，该提取物由权利要求2或3的制备方法获得。
5.一种药物组合物，含有权利要求4所述的牡丹皮提取物，和药学可接受的辅料，优选地医药上可接受的辅料包括粘合剂、甜味剂、增稠剂、芳香剂、崩解剂、涂覆剂、保存剂、润滑剂及/或时间延迟剂，优选的甜味剂包括蔗糖、果糖、葡萄糖、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(aspartame)及糖精；优选的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、黄原胶、皂土、藻朊酸及琼脂；优选的芳香剂包括薄荷油、白珠树(wintergreen)油、樱桃香料、柑橘香料及覆盆子果香料；优选的涂覆剂包括丙烯酸及/或甲基丙烯酸的聚合物或共聚物及/或彼等的酯、蜡、脂肪醇、玉米朊、虫胶及谷蛋白粘胶(glutan)；优选的保存剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、硬脂酸、油酸钠、氯化钠及滑石；优选的时间延迟剂包括单硬脂酸甘油酯和二硬脂酸甘油酯。
6.权利要求5的药物组合物，所述的药物组合物的剂型粉末、小袋、颗粒、胶囊、药片、糖浆、溶液、悬浮液、乳化液、软膏、乳霜、洗剂或贴片。
7.权利要求5的药物组合物用于制备抗病毒药物的用途。
8.一种抗病毒的方法，其包括对需要抗病毒的个体施用权利要求4的牡丹皮提取物。
9.权利要求1、7的用途或权利要求8的方法，其中所述的病毒包括：乙肝病毒、疱疹病毒、丙肝病毒、登革热病毒、人巨细胞病毒、日本脑炎病毒以及其他所有依赖内质网进行折叠及装配的病毒。
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