CN107441129B

CN107441129B - 金花葵核苷类物质的发现及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN107441129B
Application number: CN201710371670.8A
Authority: CN
Inventors: 石任兵; 孔静; 姜艳艳
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-05-24
Filing date: 2017-05-24
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2037-05-24
Also published as: CN107441129A

Abstract

本发明属于自然活性物质的发现与健康产品、药物研究开发领域，涉及金花葵核苷类物质的发现及其制备方法与应用。由金花葵或同属植物及其化学关联植物，经水或乙醇提取；醇沉除杂；大孔吸附树脂富集；萃取纯化等方法制备，得到不同核苷含量的金花葵系列制备物(包括提取物、醇沉物、富集物和纯化物等)。本发明中金花葵系列制备物均具有多种不同的药理活性、特别是抗肿瘤活性，可单用，或组合复方应用，或作为添加物应用于多种药物与健康功能性物质及其制品等的开发之中。

Description

金花葵核苷类物质的发现及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于自然活性物质的发现与健康产品、药物研究开发领域，具体涉及金花葵核苷类活性物质的发现及其制备方法与应用。

背景技术

金花葵为锦葵科秋葵属植物，含有多种生物活性物质，文献报道金花葵中含有黄酮类成分、多糖、不饱和脂肪酸、维生素E及多种微量元素等。申请人通过研究发现金花葵含有核苷类成分，该类成分是生物细胞维持生命活动的基本组成元素，参与DNA代谢过程，具有很好的药理活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗心肌缺血、抗凝血、抗炎、免疫调节、改善心脑血管循环、防治心律失常等作用，有较高的保健与药用价值。本发明采用溶剂提取法、色谱法富集和溶剂萃取法纯化等方法对核苷类成分进行制备，功效考察结果表明所制备的不同核苷类成分含量的系列制备物具有多种不同的药理活性，特别是抗肿瘤活性，可用于健康产品和药物的研发。

发明内容

本发明的目的在于金花葵核苷类物质的发现，本发明的另一个目的在于提供其制备方法，本发明的第三个目的在于提供其质量控制方法，本发明的第四个目的在于提供金花葵系列制备物(包括提取物、醇沉物、富集物和纯化物等)在单方制品、组方制品、或作为添加物等在药品、保健品、食品等方面的应用。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

金花葵核苷类物质，主要活性成分为核苷类成分，如胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷等成分，可由化学合成、制备，自然资源提取制备而成。

本发明中的金花葵核苷类物质可通过含有类似物质的植物及其代用品，包括其植物各个部位，单独或组合制成。如下组，但不限于：

组1金花葵/菜芙蓉、野芙蓉、黏干、山榆皮等同属植物

本发明金花葵系列制备物的制备方法分为如下步骤：

步骤1：以金花葵或金花葵同属植物原植物作为原料；

步骤2：用水或有机溶剂提取，减压回收溶剂；

步骤3：加醇，沉淀除杂；

步骤4：富集；

步骤5：萃取纯化。

该金花葵系列制备物中核苷指标性成分加和含量为1％～100％(质量百分比)，该金花葵系列制备物中核苷指标性成分加和含量优选为5％～100％(质量百分比)。

上述步骤1中，选取金花葵(菜芙蓉、野芙蓉、黏干、山榆皮)同属植物原植物(包括金花葵的各部位)及其加工品，对于金花葵以及金花葵同属植物原植物的选择部位没有特殊限制，可以整体作为原料，也可以选取植物中的一部分作为原料，如花、茎、根、叶等组合或者单独作为原料，优选为金花葵花。

上述步骤2中，金花葵原料用水或5％～90％乙醇回流提取1～5次，每次提取10～90min，合并提取液，减压回收溶剂至干，制得金花葵提取物。

采取上述步骤2的技术方案的有益效果为：提高有效成分的提取率。

上述步骤3中，将步骤2中所得药液减压回收溶剂至浓度(以生药量计)为0.05～1.5kg/L，加入1～8倍量的95％乙醇，充分搅拌，静置过夜，2000～8000r/min离心5～30min，取上清液，减压回收溶剂至干，制得金花葵醇沉物。

上述步骤4中，将步骤3所得金花葵醇沉物加水分散溶解，使水溶液浓度为0.01～0.80kg/L，水溶液通过大孔吸附树脂，吸附流速为0.2～10BV/h，树脂柱径高比为1∶(2～15)，上样量与树脂体积比为0.01～0.50kg/L，水洗脱0～8BV，洗脱流速为0.2～10BV/h，0％～50％乙醇洗脱1～30BV，洗脱流速为0.2～10BV/h，收集洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得金花葵富集物。

上述步骤5中，将步骤4所得的金花葵富集物加少量水完全溶解，使浓度为0.1～0.5kg/L，加入2％氢氧化钠溶液调pH为8～11，再加入等体积的水饱和正丁醇溶液萃取2～8次，静置，合并正丁醇层，回收溶剂，减压干燥，即得金花葵核苷纯化物。

将以上所得的任何形式的制备物，特别是其纯化物，加入常规辅料，食料，香料，调料等，或作为添加物制备任意常规食品形式，或药剂学可接受的任意常规剂型，包括胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、靶向制剂、缓释剂、口服液等，也可应用于单方制品、复方制品、制备物以及健康功能食品、自然健康产品及其调料与药物药品等开发中。

对于金花葵系列制备物，可通过自然资源提取制备，可以通过化学合成或结构修饰以及生物合成或生物转化等途径获得。

本发明金花葵系列制备物为金花葵原料经水、乙醇或其他有机试剂提取；通过一定倍量的乙醇沉淀除杂；再通过大孔树脂吸附或其他色谱方法，如聚酰胺色谱法等；或溶剂法，如溶剂萃取法等纯化得到；经功效实验表明具有多种药理作用，不同核苷类成分含量的金花葵系列制备物均可与其他单方、制备物或复方等药物配伍组合使用，制成可接受的任意常规制品，在多种药物和产品中广泛应用。

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实验例为抗肿瘤活性，但其只是金花葵系列制备物的活性表征之一，并非限定本发明物质在其他活性的应用；所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实验例本发明物质抗肿瘤活性

(一)实验材料

1.肿瘤细胞

肝癌细胞株A549，来自中国科学院细胞库。

2.药品与试剂

胎牛血清(Gibco)；DMEM培养基(高糖，Gibco)；0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(Gibco)；DMSO(分析纯，北京化工厂)；MTT(Amresco)；PBS(北京天悦东方基因技术有限公司)；双抗(Gibco)；乳酸脱氢酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)；不同核苷类成分含量的金花葵系列制备物(自制)。

3.仪器设备

洁净工作台(北京王堂蓝翼科技有限公司)；L3660D型低速离心机(上海知信实验仪器技术有限公司)；恒温培养箱(Thermo Scientific)；立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；XA105 DualRange分析天平(Mettler Toledo)；KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HHS型电热恒温水浴锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；SK-L180-E型摇床(美国SCILOGEX)；Multiskan GO型全波长酶标仪(ThermoScientific)。

(二)实验方法与结果

1.完全培养基的制备及铺板

DMEM完全培养液：精密量取10mL胎牛血清和1mL双抗加入到89mL的DMEM培养基中，即得100mLDMEM完全培养基。

铺板：将肿瘤细胞培养在DMEM完全培养液中，置37℃、饱和湿度、5％CO₂的培养箱中，隔日换液，待细胞进入对数生长期后，弃去上清液，PBS溶液冲洗2遍，用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，用PBS溶液冲洗2遍。用DMEM完全培养液调整浓度为3.5×10⁴个/mL细胞悬液接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃、饱和湿度、5％二氧化碳恒温培养箱中培养24h；用DMEM完全培养液调整浓度为1×10⁵个/mL细胞悬液接种于12孔板，每孔500μL，置于37℃、饱和湿度、5％二氧化碳恒温培养箱中培养24h。

2.药液的制备

分别精密称取金花葵各系列制备物25mg溶于5mLDMEM完全培养基中完全溶解，配制成5mg/mL的母液。通过母液逐级稀释，得到浓度分别为1500μg/mL、1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL的药液。

精密称取金花葵系列制备物5mg溶于5mLDMEM完全培养基中完全溶解，配制成1mg/mL的母液。通过母液逐级稀释，得到浓度分别为200μg/mL、150μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、5μg/mL的药液。

3.加药

取出在96孔板中培养24h后贴壁的A549肿瘤细胞，吸掉完全培养液，分别设对照组(加DMEM完全培养基)和不同浓度药物组(1500μg/mL、1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL)，每组设3个复孔，均加入200μL，置于37℃、饱和湿度、5％CO₂恒温培养箱中培养48h。

取出在12孔板中培养24h后贴壁的A549肿瘤细胞，吸掉完全培养基，分别设对照组(加DMEM完全培养基)和不同浓度药物组(200μg/mL、150μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、5μg/mL)，每组设2个复孔，均加入500μL，置于37℃、饱和湿度、5％CO₂恒温培养箱中培养24h。

4.测定方法

MTT法：

培养48h后，小心吸掉培养基，96孔板每孔加入0.5mg/mL MTT100μL继续放入恒温培养箱中，4h后吸掉MTT液体，每孔加入150μL DMSO，置于摇床上振摇10min。用酶标仪检测各孔吸光度(OD)值，测定波长λ＝490nm，并计算抑制率。计算公式为：抑制率(％)＝(对照组OD值-药物组OD值)/对照组OD值×100％

LDH法：

培养24h后，将12孔板每孔中的培养基上清液转移至1.5mL EP管中(注意不要损伤底部细胞)，2500rpm、4度离心5分钟，将离心后的上清液移至另外事先准备的1.5mLEP管中，取上清液10μL置于0.5mLEP管，加双蒸水90μL，涡旋混匀，制得稀释10倍的上清液，严格按照“南京建成生物工程研究所乳酸脱氢酶测定试剂盒”说明书在96孔板上操作，分为4组，即空白孔、标准孔、测定孔(药物处理组稀释10倍的上清液)、对照孔，收集的上清液每个做2个复孔。

用酶标仪检测各孔吸光度(OD)值，测定波长λ＝450nm，并计算LDH活性。计算公式为：

LDH活性(U/L)＝(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)*标准品浓度(0.2μmol/L)×N×1000。

注：N为待测样本测定前稀释倍数。

5.实验结果

金花葵系列制备物对肿瘤细胞增殖的抑制作用：

使用SPSS17.0统计软件进行分析，实验结果以均数±标准差表示。采用两样本t检验或单因素方差分析(ANOVA)进行组间比较，结果见表1～4和图1。

表1不同浓度的金花葵提取物对肿瘤细胞增殖的抑制作用

表2不同浓度的金花葵醇沉物对肿瘤细胞增殖的抑制作用

表3不同浓度的金花葵富集物对肿瘤细胞增殖的抑制作用

表4不同浓度的金花葵纯化物对肿瘤细胞增殖的抑制作用

注：数据为均值±标准偏差；*表示与对照组比较，P＜0.01，有极显著性差异；▲表示与对照组比较P＞0.05，没有显著性差异。

金花葵系列制备物对肿瘤细胞的损伤程度：

乳酸脱氢酶(LDH)是一种稳定的糖酵解蛋白质酶，存在于生命有机体所有组织、细胞的胞质中，一旦细胞膜受到外界刺激并受到损伤，LDH即被释放到细胞外，可通过检测药物作用后细胞培养上清液中LDH的活性判断药物对肿瘤细胞的损伤程度。金花葵系列制备物作用于肿瘤细胞的LDH活性结果表5和图2。

表5金花葵系列制备物作用于肿瘤细胞的LDH释放量(U/L)

(三)结论

由表1～4和图1可知：金花葵系列制备物对肿瘤细胞株A549均有一定的抑制作用，且随着系列制备物药液浓度的增大，其抗肿瘤细胞增殖的抑制率越高；在相同的药物浓度下，金花葵核苷纯化物对肿瘤细胞的抑制作用最强，然后依次是富集物、醇沉物、提取物，说明药物中的核苷类成分越高，对肿瘤细胞的抑制作用越强。

由表5和图2可知：金花葵系列制备物的浓度从5μg/mL增加到200μg/mL，肿瘤细胞中乳酸脱氢酶释放量不同程度的增加，说明系列制备物均能损伤肿瘤细胞从而促使其释放出LDH，间接发挥抑制肿瘤细胞的作用；随着药液浓度的增加，提取物作用于肿瘤细胞的LDH释放量增加最快且释放量最大，然后依次为纯化物、富集物、醇沉物。

综合以上实验数据分析可知：MTT法实验说明金花葵系列制备物对肿瘤细胞的生长有一定的抑制作用，特别是纯化物对肿瘤细胞有显著的抑制作用；LDH法实验说明金花葵系列制备物在较低的浓度下对肿瘤细胞有间接杀伤能力，能损伤肿瘤细胞，即在低浓度下对肿瘤细胞有一定的抑制作用。故金花葵系列制备物均具有良好的抗肿瘤活性，这种自然活性物质对抗肿瘤自然健康产品及其药物开发具有重要意义。

附图说明

图1：不同浓度下金花葵系列制备物对肿瘤细胞的抑制作用

图2：金花葵系列制备物作用于肿瘤细胞的LDH活性比较图

下述实施例均能实现上述实验例的效果。

实施例1：胶囊剂

以金花葵花为原料制备胶囊剂。

取干燥金花葵原料，15倍量的水回流提取2次，每次提取40min，减压回收溶剂至干，制得金花葵提取物，加水溶解使溶液浓度为0.5kg/L(以生药量计)，加入4倍量的95％乙醇，充分搅拌，静置过夜，4000r/min离心10min，取上清液，减压回收溶剂至干，制得金花葵醇沉物，以适量水分散，使水溶液浓度为0.1kg/L，水溶液通过弱极性或非极性大孔吸附树脂，上样量与树脂体积比为1∶6kg/L，吸附流速为2.5BV/h，树脂柱径高比为1∶8，水洗1.5BV除杂，洗脱流速为2.5BV/h，10％乙醇洗脱6BV，洗脱流速为3.5BV/h，收集洗脱液，回收溶剂，减压干燥，制得金花葵富集物，加水溶解使浓度为0.2kg/L，加入2％氢氧化钠溶液调pH为10，再加入等体积的水饱和正丁醇溶液萃取5次，静置分层，合并正丁醇层，回收溶剂，减压干燥，得金花葵纯化物，将以上所得各系列制备物加入常规辅料，按照常规工艺制成胶囊剂。

核苷类指标性成分含量测定方法：

对照品溶液的制备

取胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷对照品适量，精密称定，分别置5mL容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀即得各对照品储备液，分别精密吸取各对照品储备液适量置10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即得混合对照品溶液。

供试品溶液的制备

取样品适量，精密称定，置10mL容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀即得供试品溶液。

测定方法

色谱柱：Venusil MP C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相为甲醇-水，梯度洗脱，流速1mL/min；柱温30℃；检测波长为260nm，进样量20μL。

梯度条件：

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，分别测定胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷的峰面积，采用外标一点法计算，金花葵提取物、醇沉物、富集物和纯化物中这5个指标性成分的加和含量应分别不低于1.04％、1.52％、9.61％、31.84％。

实施例2：丸剂

以金花葵花为原料制备丸剂。

取干燥金花葵原料，20倍量的20％乙醇回流提取1次，每次提取60min，减压回收溶剂至干，制得金花葵提取物，加水溶解使溶液浓度为0.5kg/L(以生药量计)，加入3倍量的95％乙醇，充分搅拌，静置过夜，4000r/min离心10min，取上清液，减压回收溶剂至干，制得金花葵醇沉物，以适量水分散，使水溶液浓度为0.1kg/L，水溶液通过弱极性或非极性大孔吸附树脂，上样量与树脂体积比为1∶6kg/L，吸附流速为2.5BV/h，树脂柱径高比为1∶6，水洗2BV除杂，洗脱流速为2.5BV/h，5％乙醇洗脱12BV，洗脱流速为3.5BV/h，收集洗脱液，回收溶剂，减压干燥，所得金花葵富集物，加水溶解使浓度为0.1kg/L，加入2％氢氧化钠溶液调pH为11，再加等量体积的水饱和正丁醇溶液萃取6次，静置分层，合并正丁醇层，回收溶剂，减压干燥，得金花葵纯化物，将以上所得各系列制备物加入常规辅料，按照常规工艺制成丸剂。

核苷类指标性成分含量测定方法：

对照品溶液的制备

供试品溶液的制备

测定方法

色谱柱：Venusil MP C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为甲醇-水，梯度洗脱，流速1mL/min；柱温30℃；检测波长为260nm，进样量20μL。

梯度条件：

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，分别测定胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷的峰面积，采用外标一点法计算，金花葵提取物、醇沉物、富集物和纯化物中这5个指标性成分的加和含量应分别不低于1.28％、1.73％、10.05％、32.09％。

实施例3：片剂

以金花葵花为原料制备片剂。

取干燥金花葵原料，12倍量的水回流提取3次，每次提取30min，减压回收溶剂至干，制得金花葵提取物，加水溶解使溶液浓度为0.5kg/L(以生药量计)，加入4倍量的95％乙醇，充分搅拌，静置过夜，4000r/min离心10min，取上清液，减压回收溶剂至干，制得金花葵醇沉物，以适量水分散，使水溶液浓度为0.1kg/L，水溶液通过弱极性或非极性大孔吸附树脂，上样量与树脂体积比为1∶6kg/L，吸附流速为2.5BV/h，树脂柱径高比为1∶10，水洗2BV除杂，洗脱流速为2.5BV/h，10％乙醇洗脱6BV，洗脱流速为3.5BV/h，收集洗脱液，回收溶剂，减压干燥，制得金花葵富集物，加水溶解使浓度为0.2kg/L，加入2％氢氧化钠溶液调pH为10，再加等量体积的水饱和正丁醇溶液萃取3次，静置分层，合并正丁醇层，回收溶剂，减压干燥，得金花葵纯化物，将以上所得各系列制备物加入常规辅料，按照常规工艺制成片剂。

核苷类指标性成分含量测定方法：

对照品溶液的制备

供试品溶液的制备

测定方法

梯度条件：

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，分别测定胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷的峰面积，采用外标一点法计算，金花葵提取物、醇沉物、富集物和纯化物中这5个指标性成分的加和含量应分别不低于1.02％、1.45％、9.46％、29.19％。

实施例4：口服液

以金花葵花为原料制备口服液。

取干燥金花葵原料，15倍量的20％乙醇回流提取2次，每次提取20min，减压回收溶剂至干，制得金花葵提取物，加水溶解使溶液浓度为0.5kg/L(以生药量计)，加入4倍量的95％乙醇，充分搅拌，静置过夜，4000r/min离心10min，取上清液，减压回收溶剂至干，制得金花葵醇沉物，以适量水分散，使水溶液浓度为0.1kg/L，水溶液通过弱极性或非极性大孔吸附树脂，上样量与树脂体积比为1∶6kg/L，吸附流速为2.5BV/h，树脂柱径高比为1∶10，水洗2BV除杂，洗脱流速为2.5BV/h，8％乙醇洗脱8BV，洗脱流速为3.5BV/h，收集洗脱液，回收溶剂，减压干燥，制得金花葵富集物，加水溶解使浓度为0.2kg/L，加入2％氢氧化钠溶液调pH为10，再加等量体积的水饱和正丁醇溶液萃取3次，静置分层，合并正丁醇层，回收溶剂，减压干燥，得金花葵纯化物，将以上所得各系列制备物加入常规辅料，按照常规工艺制成口服液。

核苷类指标性成分含量测定方法：

对照品溶液的制备

供试品溶液的制备

测定方法

梯度条件：

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，分别测定胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷的峰面积，采用外标一点法计算，金花葵提取物、醇沉物、富集物和纯化物中这5个指标性成分的加和含量应分别不低于1.09％、1.56％、9.74％、31.79％。

以上所述仅为本发明的适用实施例，并不用以限制本发明，但在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应属于在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种具有抗肝癌作用的金花葵核苷类制备物，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：

步骤1：以金花葵花作为原料药；

步骤2：用水或有机溶剂提取，减压回收溶剂；

步骤3：加醇，沉淀除杂；

步骤4：富集；

步骤5：萃取纯化；

该金花葵核苷制备物中总核苷含量按质量百分比计为5-100％，其中胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷的加和含量大于等于29.19％；

上述步骤2中，金花葵药材用水或5％～90％乙醇回流提取1～5次，每次提取10～90min，合并提取液，减压回收溶剂；

上述步骤3中，将步骤2中所得药液减压回收溶剂至以生药量计浓度为0.05～1.5kg/L，加入1～8倍量的95％乙醇，充分搅拌，静置过夜，2000～8000r/min离心5～30min，取上清液，减压回收溶剂至干，制得金花葵提取物；

上述步骤4中，将步骤3所得金花葵提取物加水分散溶解，使水溶液浓度为0.01～0.80kg/L，水溶液通过大孔吸附树脂，吸附流速为0.2～10BV/h，树脂柱径高比为1∶(2～15)，上样量与树脂体积比为0.01～0.50kg/L，水洗脱0～8BV，洗脱流速为0.2～10BV/h，0％～50％乙醇洗脱1～30BV，洗脱流速为0.2～10BV/h，收集洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得金花葵富集物；

上述步骤5中，将步骤4所得的金花葵富集物加少量水完全溶解，使浓度为0.1～0.5kg/L，加入2％氢氧化钠溶液调pH为8～11，再加入等体积的水饱和正丁醇溶液萃取2～8次，静置，合并正丁醇层，回收溶剂，减压干燥，即得金花葵核苷类制备物。