CN1933854A

CN1933854A - 含白介素－6拮抗剂作为有效成分的内耳障碍治疗剂

Info

Publication number: CN1933854A
Application number: CN 200580009303
Authority: CN
Inventors: 藤冈正人; 冈野洋尚詹姆斯; 小川郁; 冈野荣之; 神崎晶
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; Keio University
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; Keio University
Priority date: 2004-03-24
Filing date: 2005-03-24
Publication date: 2007-03-21
Also published as: ZA200607524B

Abstract

本发明涉及含有白介素－6拮抗剂，优选含有抗白介素－6受体抗体作为有效成分的内耳障碍治疗和/或预防剂。

Description

含白介素-6拮抗剂作为有效成分的内耳障碍治疗剂

技术领域

本发明涉及内耳障碍治疗和/或预防剂。本发明的治疗和/或预防剂含有白介素-6(IL-6)拮抗剂。

背景技术

耳聋中，因内耳性(耳蜗性)或者迷走性(第8脑神经性)导致的耳聋叫做感觉神经性耳聋。耳聋的原因多种多样，例如可列举梅尼埃病综合症(Meniere’s disease)、药物诱导性内耳障碍(由于抗癌制剂，如氨基糖苷类和顺铂等导致的内耳障碍)、病毒性内耳炎、化脓性内耳炎、侧头骨骨折、听觉神经肿瘤。另外突发性耳聋、老人性耳聋、噪音性耳聋(noise deafness)也包括在感觉神经性耳聋中。噪音性耳聋是链锯、内燃机引擎、重型装置、枪、飞机等发出大的噪音导致内耳障碍而发生的结果，与射击、雪上移动、飞机旅行、摇滚音乐会等相关。

认为感觉神经性耳聋的原因多种多样，已知内耳的急性免疫反应能够引起永久性听力下降(hearing loss)(Satoh H et al.，Laryngoscope.2002 Sep；112(9)：1627-34)。该文献还报道KLH(keyhole limpet hemocyanin)的内耳或者蛛网膜下的注射引发在耳蜗的免疫反应，表达TNF-α和IL-1β，TNF-α导致耳蜗的疾病恶化，以及由于TNF-α抑制剂导致听力部分降低。可是，至今，尚完全没有关于将白介素-6对感觉神经性耳聋有贡献的报道。

非专利文献1 Satoh H et al.，laryngoscope.2002 Sep；112(9)1627-34

发明内容

本发明的目的在于提供用于治疗和/或预防内耳障碍的新型药物。

本发明人等刻苦研究，阐明白介素-6与感觉神经性耳聋的疾病形成有关，白介素-6拮抗剂具有感觉神经性耳聋疾病的治疗效果。

因此，本发明提供作为有效成分含有白介素-6拮抗剂的内耳障碍治疗和/或预防剂。

上述内耳障碍，例如感觉神经性耳聋，该感觉神经性耳聋例如梅尼埃病综合症、药物诱导性内耳障碍、病毒性内耳炎、化脓性内耳炎、侧头骨骨折、听觉神经肿瘤导致的感觉神经性耳聋，或者突发性耳聋、老人性耳聋或噪音性耳聋。

或者，上述内耳障碍，例如前庭障碍，该前庭障碍，例如梅尼埃病综合症、前庭神经炎或者药物性内耳障碍导致的前庭障碍。

上述白介素-6拮抗剂，例如抗白介素-6受体抗体，该抗白介素-6受体抗体例如是抗白介素-6受体的单克隆抗体，优选抗人白介素-6受体的单克隆抗体，或抗小鼠白介素-6受体的单克隆抗体，上述抗人白介素-6受体的单克隆抗体例如：PM-1抗体，上述抗小鼠白介素-6受体的单克隆抗体例如：MR16-1抗体。

上述抗白介素-6受体的抗体优选重组型抗体，该重组型抗体，例如，是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。该人源化抗体例如是人源化PM-1抗体。

本发明可以采取下面的方式。

(1)白介素-6拮抗剂在制造内耳障碍治疗和/或预防剂中的应用。

(2)上述(1)所述的应用，其中，所述内耳障碍是感觉神经性耳聋。

(3)上述(2)所述的应用，其中，所述感觉神经性耳聋是梅尼埃病综合症、药物诱导性内耳障碍、病毒性内耳炎、化脓性内耳炎、侧头骨骨折、听觉神经肿瘤导致的感觉神经性耳聋。

(4)上述(2)所述的应用，其中，所述感觉神经性耳聋是突发性耳聋、老人性耳聋或噪音性耳聋。

(5)上述(1)所述的应用，其中，所述内耳障碍是前庭障碍。

(6)上述(5)所述的应用，其中，所述前庭障碍是梅尼埃病综合症、前庭神经炎或药物诱导性内耳障碍导致的前庭障碍。

(7)上述(1)～(6)任一项所述的应用，其中，所述白介素-6拮抗剂是抗白介素-6受体的抗体。

(8)上述(7)所述的应用，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是抗白介素-6受体的单克隆抗体。

(9)上述(8)所述的应用，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是抗人白介素-6受体的单克隆抗体。

(10)上述(8)所述的应用，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是抗小鼠白介素-6受体的单克隆抗体。

(11)上述(7)～(10)任一项所述的应用，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是重组型抗体。

(12)上述(9)所述的应用，其中，所述抗人白介素-6受体的单克隆抗体是PM-1抗体。

(13)上述(10)所述的应用，其中，所述抗小鼠白介素-6受体的单克隆抗体是MR16-1抗体。

(14)上述(7)～(13)任一项所述的应用，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是抗白介素-6受体的嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

(15)上述(14)所述的应用，其中，所述抗白介素-6受体的人源化抗体是人源化PM-1抗体。

本发明还可以采取下面的方式：

(1)治疗和/或预防内耳障碍的方法，包括给予白介素-6拮抗剂。

(2)上述(1)所述的方法，其中，所述内耳障碍是感觉神经性耳聋。

(3)上述(2)所述的方法，其中，所述感觉神经性耳聋是梅尼埃病综合症、药物诱导性内耳障碍、病毒性内耳炎、化脓性内耳炎、侧头骨骨折、听觉神经肿瘤导致的感觉神经性耳聋。

(4)上述(2)所述的方法，其中，所述感觉神经性耳聋是突发性耳聋、老人性耳聋或噪音性耳聋。

(5)上述(1)所述的方法，其中，所述内耳障碍是前庭障碍。

(6)上述(5)所述的方法，其中，所述前庭障碍是梅尼埃病综合症、前庭神经炎或药物诱导性内耳障碍导致的前庭障碍。

(7)上述(1)～(6)中任一项所述的方法，其中，所述白介素-6拮抗剂是抗白介素-6受体的抗体。

(8)上述(7)所述的方法，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是抗白介素-6受体的单克隆抗体。

(9)上述(8)所述的方法，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是抗人白介素-6受体的单克隆抗体。

(10)上述(8)所述的方法，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是抗小鼠白介素-6受体的单克隆抗体。

(11)上述(7)～(10)中任一项所述的方法，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是重组型抗体。

(12)上述(9)所述的方法，其中，所述抗人白介素-6受体的单克隆抗体是PM-1抗体。

(13)上述(10)所述的方法，其中，所述抗小鼠白介素-6受体的单克隆抗体是MR16-1抗体。

(14)上述(7)～(13)中任一项所述的方法，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是抗白介素-6受体的嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

(15)上述(14)所述的方法，其中，所述抗白介素-6受体的人源化抗体是人源化PM-1抗体。

附图说明

图1是表示实施例1的结果，表示在通过3种频率制得的小鼠的耳聋模型中，给予本发明的白介素-6R人源化抗体(MR16-1)的施用组和给予小鼠免疫球蛋白G的对照组的听力阈值降低度(dB)的图。

图2是表示实施例2中的RT-PCR的电泳结果，该结果表示在进行声音负荷后的SD大鼠的耳蜗的各种细胞因子的经时变化。

图3是表示实施例2中的定量RT-PCR的结果，该结果表示在进行声音负荷后的SD大鼠的耳蜗的TNFα的经时变化。

图4是表示实施例2中的定量RT-PCR的结果，该结果表示在进行声音负荷后的SD大鼠的耳蜗的白介素-6的经时变化。

图5是表示实施例2中的定量RT-PCR的结果的图，该结果表示在进行声音负荷后的SD大鼠的耳蜗的IL-1β的经时变化。

图6是表示实施例2中的通过Vectastein ABC试剂盒使用抗小鼠白介素-6抗体检测进行声音负荷6小时后的SD大鼠的组织的结果的图的替代照片。

图7是表示实施例2中的通过Vectastein ABC试剂盒对声音负荷6小时后的SD大鼠的组织使用抗小鼠白介素-6抗体检测白介素-6的结果的图的替代照片。

图8是C57BL/6J小鼠负荷2小时124dB的放大的声音后，测定在施用本发明的MR16-1(在参考例4制备的抗白介素-6人源化抗体)或者大鼠IgG(对照)后的内耳螺旋器中总STAT3、Erk和Akt以及磷酸化的STAT3、Erk和Akt的表达的结果的电泳图。

具体实施方式

本发明的治疗剂具有抑制耳蜗组织障碍、即内耳性感觉神经性耳聋(sensorineural hearing loss)的听力下降的发展的效果。特别是本发明的治疗剂具有抑制感觉神经性耳聋中的高音区域听力下降的效果。作为与感觉神经性耳聋相同与毛细胞的障碍有关的疾病，可列举前庭障碍。在感觉神经性耳聋中的耳蜗发生障碍，尽管耳蜗和前庭掌管不同的感觉，在结构上，任何一个都以毛细胞、支持细胞与淋巴液相连，通过它们类似的组织及其物理性质承担着生理功能。即，毛细胞感知由于声音导致的摇动、加速度导致的淋巴的运动的不同而产生的不同感觉，成为以同样的结构进行感知的组织。耳蜗和前庭的任何一个与有毛细胞的障碍与功能降低相关联，其对药物的感受性是相似的。所以，本发明的治疗剂可以用于治疗感觉神经性耳聋、前庭障碍等内耳障碍。

白介素-6是被称为B细胞刺激因子2(BSF2)或干扰素β2的细胞因子。白介素-6作为参与B淋巴细胞活化的分化因子被发现(Hirano，T.et al.，Nature(1986)324，73-76)，后来被阐明是影响各种细胞功能的多功能细胞因子(Akira，S.et al.，Adv.inImmunology(1993)54，1-78)。据报道白介素-6诱导T淋巴细胞的成熟(Lotz，M.et al.，J.Exp.Med.(1988)167，1253-1258)。

白介素-6通过细胞上的两种蛋白质传递其生物学活性。一种是结合白介素-6的分子量约80kD的配体结合性蛋白质白介素-6受体(Taga，T.et al.，J.Exp.Med.(1987)166，967-981，Yamasaki，K.et al.，Science(1987)241，825-828)。白介素-6受体除了贯通细胞膜、在细胞膜上表达的膜结合型之外，主要作为由该细胞外区域构成的可溶性白介素-6受体存在。

另一种是非配体结合性的与信号转导有关的分子量约130kD的膜蛋白质gp130。白介素-6与白介素-6受体形成白介素-6/白介素-6受体复合物，然后通过与gp130结合，白介素-6的生物学活性被传递到细胞内(Taga，T.et al.，Cell(1989)58，573-581)。

白介素-6拮抗剂是抑制白介素-6生物学活性传递的物质。到目前为止，已知有针对白介素-6的抗体(抗白介素-6抗体)、针对白介素-6受体的抗体(抗白介素-6受体抗体)、针对gp130的抗体(抗gp130抗体)、白介素-6变体、白介素-6或白介素-6受体的部分肽等。

已有几个与抗白介素-6受体抗体有关的报告(Novick，D.et al.，Hybridoma(1991)10，137-146、Huang，Y.W.et al.，Hybridoma(1993)12，621-630、国际专利申请公开号WO 95-09873、法国专利申请公开号FR 2694767、美国专利号US 521628)。通过将其中之一的小鼠抗体PM-1(Hirata，Y.et al.，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)的互补决定区(CDR；complementarity determiningregion)移植到人抗体得到的人源化PM-1抗体已为人们所知(国际专利申请公开号WO 92-19759)。

上述白介素-6拮抗剂优选抗白介素-6受体的抗体，最好是抗人白介素-6受体的单克隆抗体或抗小鼠白介素-6受体的单克隆抗体。作为上述抗人白介素-6受体的单克隆抗体如PM-1抗体，此外作为抗小鼠白介素-6受体的单克隆抗体如MR16-1抗体。上述抗体最好是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，例如：人源化PM-1抗体。人源化抗体是称做人化抗体(altered antibody)或者再构(reshaped)人抗体的改型抗体。

本发明中使用的白介素-6拮抗剂只要是抑制内耳障碍细胞增殖，可用作内耳障碍治疗和/或预防剂的活性成分，不管其来源、种类和形状都可以使用。

白介素-6拮抗剂是可阻断依赖于白介素-6的信号转导，抑制白介素-6生物学活性的物质。白介素-6拮抗剂最好是对白介素-6、白介素-6受体以及gp130中任一个的结合具有抑制作用的物质。作为白介素-6拮抗剂，例如：抗白介素-6抗体、抗白介素-6受体抗体、抗gp130抗体、白介素-6变体、可溶性白介素-6受体变体或白介素-6或白介素-6受体的部分肽、以及表现出与它们同样活性的低分子物质。

本发明中使用的抗白介素-6抗体可以使用众所周知的手段以多克隆或单克隆抗体形式获得。作为本发明中使用的抗白介素-6抗体，特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。作为来自哺乳动物的单克隆抗体，有由杂交瘤产生的抗体、以及通过基因工程手段由用含有抗体基因的表达载体转化的宿主产生的抗体。该抗体通过与白介素-6结合，抑制白介素-6与白介素-6受体的结合，阻断白介素-6生物学活性向细胞内传递。

作为这样的抗体，如MH166(Matsuda，T.et al.，Eur.J.Immunol.(1988)18，951-956)和SK2抗体(Sato，K.et al.，第21次日本免疫学会总会、学术记录(1991)21，166)等。

可以基本上使用众所周知技术，如下制备产生抗白介素-6抗体的杂交瘤。即、使用白介素-6作为致敏抗原，按照通常的免疫方法进行免疫，使用通常的细胞融合法使得到的免疫细胞与众所周知的亲本细胞融合，通过常规的筛选方法，筛选制备产生单克隆抗体的细胞。

具体来说，可以象如下那样制备抗白介素-6抗体。例如：可以通过使用Eur.J.Biochem(1987)168，543-550、J.Immunol.(1988)140，1534-1541、或Agr.Biol.Chem.(1990)54，2685-2688公开的白介素-6基因/氨基酸序列获得用作获得抗体的致敏抗原的人白介素-6。

将白介素-6的基因序列插入到众所周知的表达载体系统，转化适当的宿主细胞后，用众所周知的方法从该宿主细胞中或培养上清中纯化目的白介素-6蛋白质，可以使用该纯化的白介素-6蛋白质作为致敏抗原。另外，也可以使用白介素-6蛋白质与其它蛋白质的融合蛋白质作为致敏抗原。

可以使用众所周知的手段，以多克隆或单克隆抗体形式获得本发明中使用的抗白介素-6受体的抗体。作为本发明中使用的抗白介素-6受体的抗体特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。作为来自哺乳动物的单克隆抗体，有由杂交瘤产生的抗体、以及由通过基因工程手段用以含有抗体基因的表达载体转化的宿主产生的抗体。该抗体通过与白介素-6受体结合，抑制白介素-6与白介素-6受体的结合，阻断白介素-6的生物学活性向细胞内的传递。

作为这样的抗体，如：MR16-1抗体(Tamura，T.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90，11924-11928)、PM-1抗体(Hirata，Y.et al.，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)、AUK12-20抗体、AUK64-7抗体或AUK146-15抗体(国际专利申请公开号WO 92-19759)等。其中特别优选的抗体是PM-1抗体。

将产生PM-1抗体杂交瘤细胞株作为PM-1，于平成元年(1989年)7月12日，以FERM BP-2998，根据布达佩斯条约保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)。另外，将产生MR16-1抗体杂交瘤细胞株作为Rat-mousehybridoma MR16-1，于平成9年(1997年)3月13日，以FERM BP-5875，根据布达佩斯条约保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)。

可以基本上使用众所周知技术，如下制备产生抗白介素-6受体单克隆抗体的杂交瘤。即、使用白介素-6受体作为致敏抗原，根据通常的免疫方法进行免疫，通过常规的细胞融合方法使得到的免疫细胞与众所周知的亲本细胞融合，使用通常的筛选方法，可通过筛选产生单克隆抗体的细胞制备。

具体来说，可以如下制备抗白介素-6受体的抗体。例如：作为用于获得抗体的致敏抗原使用的人白介素-6受体可通过使用欧州专利申请公开号EP 325474、小鼠白介素-6受体可通过使用日本专利申请公开号特开平3-155795公开的白介素-6受体的基因/氨基酸序列获得。

白介素-6受体蛋白质有在细胞膜上表达的和从细胞膜脱离的(可溶性白介素-6受体)(Yasukawa，K.et al.，J.Biochem.(1990)108，673-676)两种。可溶性白介素-6受体的抗体由结合在细胞膜上的白介素-6受体的实质上的细胞外区域构成，因缺少细胞膜贯通区域或细胞膜贯通区域与细胞内区域，可溶性白介素-6受体与膜结合型白介素-6受体不同。白介素-6受体蛋白质只要是可作为制备本发明中使用的抗白介素-6受体的抗体的致敏抗原使用，可以使用任一种白介素-6受体。

可以将白介素-6受体的基因序列插入到众所周知的表达载体系统中，转化适当的宿主细胞后，用众所周知的方法从该宿主细胞中或培养上清中纯化目的白介素-6受体蛋白质，将该纯化白介素-6受体蛋白质作为致敏抗原使用。另外，也可以使用表达白介素-6受体的细胞或白介素-6受体蛋白质与其它蛋白质的融合蛋白作为致敏抗原。

含有含编码人白介素-6受体的cDNA的质粒pIBIBSF2R的大肠杆菌(E.coli)于平成元年(1989年)1月9日以HB101-pIBIBSF2R、保藏号FERM BP-2232，根据布达佩斯条约保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)。

本发明中使用的抗gp130抗体可以使用众所周知的手段以多克隆或单克隆抗体形式获得。作为本发明中使用的抗gp130抗体特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。作为来自哺乳动物的单克隆抗体，有由杂交瘤产生的抗体以及由通过基因工程手段用含有抗体基因的表达载体转化的宿主产生的抗体。该抗体通过与gp130结合，抑制白介素-6/白介素-6受体复合物与gp130的结合，阻断白介素-6的生物学活性向细胞内的传递。

作为这样的抗体，如AM64抗体(特开平3-219894公报)、4B11抗体以及2H4抗体(US 5571513)、B-S12抗体和B-P8抗体(特开平8-291199公报)等。

可基本上使用众所周知技术如下制备产生抗gp130单克隆抗体的杂交瘤。即、使用gp130作为致敏抗原，根据通常的免疫方法进行免疫，通过常规的细胞融合法使得到的免疫细胞与众所周知的亲本细胞融合，使用常规的筛选方法，通过筛选单克隆抗体产生细胞进行制备。

具体来说，可以如下制备单克隆抗体。例如：可以通过使用欧州专利申请公开号EP 411946中公开的gp130的基因/氨基酸序列得到用作获得抗体的致敏抗原使用的gp130。

可以将gp130的基因序列插入到众所周知的表达载体系统中，转化至适当的宿主细胞后，使用众所周知方法从该宿主细胞中或培养上清中纯化目的gp130蛋白质，将该纯化的gp130受体蛋白质作为致敏抗原使用。另外，也可以将表达gp130的细胞或gp130蛋白质与其它蛋白质的融合蛋白质作为致敏抗原使用。

作为用致敏抗原免疫的哺乳动物，没有特别限定，最好是考虑到与细胞融合中使用的亲本细胞的适合性之后选择，一般使用啮齿类动物，例如：小鼠、大鼠、仓鼠等。

按照众所周知的方法将致敏抗原免疫动物。例如、作为一般的方法，通过将致敏抗原注射到哺乳动物的腹腔内或皮下。具体来说，将致敏抗原用PBS(Phosphate-Buffered Saline)或生理盐水等稀释到适当量，根据要求可以将悬浊溶液与通常的佐剂，例如：弗氏完全佐剂适量混合，乳化后最好是每4-21日向哺乳动物注射数次。另外，在致敏抗原免疫时，可以使用适当的载体。

象上述那样进行免疫，确认血清中期望的抗体水平上升后，从哺乳动物取出免疫细胞，用于细胞融合。作为用于细胞融合的理想的免疫细胞特别列举脾细胞。

适宜使用已经众所周知的各种细胞株作为可与上述免疫细胞融合的另一方亲本细胞的哺乳动物骨髓瘤细胞，例如：P3X63Ag8.653(Kearney，J.F.et al.J.Immnol.(1979)123，1548-1550)、P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology andImmunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.and Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.etal.，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.et al.，Nature(1978)276，269-270)、FO(de St.Groth，S.F.et al.，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.et al.，Nature(1979)277，131-133)等。

上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合基本上根据众所周知的方法、例如Milstein等人的方法(Kohler.G.and Milstein，C.、MethodsEnzymol.(1981)73，3-46)等进行。

更具体地说，上述细胞融合可以在例如有细胞融合促进剂存在的情况下，在常规的营养培养液中实施。作为融合促进剂，例如，可以使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，另外根据要求，为了进一步提高融合效率，也可以添加使用二甲基亚砜等辅助剂。

免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例，例如、优选相对于骨髓瘤细胞1～10倍的免疫细胞。作为上述细胞融合使用的培养液，例如、可以使用适合上述骨髓瘤细胞株增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、其它的在这种细胞培养中使用的常规培养液，另外也可以并用胎牛血清(FCS)等血清添加液。

细胞融合可以通过将所定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中充分混合，按照30～60％(w/v)的浓度添加预先加热到37℃左右的PEG溶液，例如：平均分子量1000～6000左右的PEG溶液，通过混合形成目的融合细胞(杂交瘤)。然后，逐次添加适当的培养液，通过重复离心除去上清的操作，可以除去影响杂交瘤生育的细胞融合剂等。

该杂交瘤通过在通常的选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的培养液)中进行培养、选择。为了为目的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)的彻底死亡提供充分的时间，通常使在该HAT培养液中的培养持续数日～数周。然后，实施常规的极限稀释法，进行产生目的抗体的杂交瘤的筛选以及克隆。

另外、除了对人以外的动物进行抗原免疫获得上述杂交瘤之外，也可以在体外用期待的抗原蛋白质或抗原表达细胞致敏人淋巴细胞，使致敏B淋巴细胞与人骨髓瘤细胞、例如U266融合，也可以得到与期待的抗原或抗原表达细胞具有结合活性的期望的人抗体(参照特公平1-59878)。另外、将抗原或抗原表达细胞给予具有人抗体基因库(repertoire)的转基因动物，使用上述方法也可以获得期待的人抗体(参照国际专利申请公开号WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。

这样制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在常规的培养液中进行传代培养，另外可以在液氮中长期保存。

为了从该杂交瘤取得单克隆抗体，可以采用下述方法：按照常规方法对该杂交瘤进行培养，得到其培养上清，或下述方法：将杂交瘤给予适合它的哺乳动物，使其增殖，得到其腹水等。前面的方法适于获得高纯度的抗体，而后者的方法适于抗体的大量生产。

例如、可以根据特开平3-139293公开的方法制备产生抗白介素-6受体抗体的杂交瘤。将于平成元年(1989年)7月12日、以FERMBP-2998，根据布达佩斯条约国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)的产生PM-1抗体的杂交瘤注入BALB/c小鼠的腹腔内获得腹水，从该腹水纯化PM-1抗体，或将本杂交瘤在适当的培养基、例如、含有10％胎牛血清、5％BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim制造)的RPMI1640培养基、杂交瘤SFM培养基(GIBCO-BRL制造)、PFHM-II培养基(GIBCO-BRL制造)等进行培养，从该培养上清纯化PM-1抗体。

在本发明中，作为单克隆抗体，可以使用从杂交瘤克隆抗体基因，整合到适当的载体，将该载体导入宿主，使用基因重组技术产生的重组型抗体(例如、参照Borrebaeck C.A.K.and Larrick J.W.THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，Published in the UnitedKingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。

具体来说，从产生目的抗体的细胞、例如杂交瘤分离编码抗体可变(V)区的mRNA。mRNA的分离根据众所周知的方法，例如、胍超离心法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P.et al.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等制备总RNA，使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制)等制备mRNA。另外通过使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制造)可以直接制备mRNA。

使用逆转录酶可以从得到的mRNA合成抗体V区的cDNA。使用AMV逆转录酶第1条链cDNA合成试剂盒等进行cDNA的合成。另外为了进行cDNA的合成和扩增，可以使用5′-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech制造)以及使用PCR的5′-RACE法(Frohman，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.et al.，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)。由得到的PCR产物纯化目的DNA片段，与载体DNA连接。再由此制成重组载体，导入大肠杆菌等，选择菌落，制备期待的重组载体。通过众所周知的方法、例如：脱氧法确认目的DNA的碱基序列。

如果得到编码目的抗体V区的DNA，将它与期待的编码抗体恒定区(C区)的DNA连接，整合到表达载体。或也可以将编码抗体V区的DNA整合到含有抗体C区DNA的表达载体中。

为了制造本发明中使用的抗体，象下面叙述的那样，将抗体基因整合到可在表达调控区、例如增强子、启动子的调控下表达的表达载体。然后，用该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。

在本发明中，为了使对人的异种抗原性降低等的目的，可以使用人为改变的基因重组型抗体，例如：嵌合(Chimeric)抗体、人源化(Humanized)抗体、人(human)抗体。可以使用已知方法制造这些改变抗体。

嵌合抗体可以通过将如上所述得到的编码抗体V区的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，然后整合到表达载体，导入宿主，使其产生得到(参照欧州专利申请公开号EP 125023、国际专利申请公开号WO92-19759)。使用这个已知的方法，可以得到用于本发明的嵌合抗体。

例如、含有编码嵌合PM-1抗体L链以及H链V区的DNA的质粒分别被命名为pPM-k3和pPM-h1，含有该质粒的大肠杆菌于1991年2月12日分别以NCIMB 40366和NCIMB 40362，根据布达佩斯条约保藏于National Collections of Industrial and Marine BacteriaLimited(Ferguson Building，Craibst one Estate，Bucksburn，Aberdeen AB 21 9YA，United Kindom)。

人源化抗体也称为再构(reshaped)人抗体，是将人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体互补决定区后的产物，其一般的基因重组方法已为人所知(参照欧州专利申请公开号EP125023、国际专利申请公开号WO 92-19759)。

具体来说、由制作成在末端部具有重叠部分的数个寡核苷酸通过PCR法合成按照小鼠抗体的CDR与人抗体的框架区(FR；frameworkregion)连接那样设计的DNA序列。将得到的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，然后整合到表达载体中，将该载体导入宿主，使其产生得到(参照欧州专利申请公开号EP 239400、国际专利申请公开号WO92-19759)。

通过CDR连接的人抗体的FR选择可使互补决定区形成良好抗原结合部位的区域。根据需要，为了使再构人抗体的互补决定区形成合适的抗原结合部位也可以对抗体可变区的构架区的氨基酸进行置换(Sato，K.et al.，Cancer Res.(1993)53，851-856)。

对于嵌合抗体、人源化抗体，可以使用人抗体C区。作为人抗体C区，如Cγ，例如：可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。而为了改善抗体或其产生的稳定性，也可以对人抗体C区进行修饰。

嵌合抗体由来自人以外的哺乳动物的抗体的可变区和来自人抗体的C区构成，人源化抗体由来自人以外的哺乳动物的抗体的互补决定区与来自人抗体的构架区和C区构成，由于在人体内的抗原性低下，所以可作为本发明中使用的抗体。

作为本发明中使用的人源化抗体的理想的具体例子，如人源化PM-1抗体(参照国际专利申请公开号WO 92-19759)。

而作为获得人抗体的方法，除了前面叙述的方法之外，已知还有使用人抗体库，通过淘选，获得人抗体的技术。例如、通过噬菌体展示法使人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)展示在噬菌体表面，也可以选择与抗原结合的噬菌体。如果解析选择的噬菌体的基因，可以确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的DNA序列。如果与抗原结合的scFv的DNA序列被阐明，可以利用该序列制备适当的表达载体，获得人抗体。这些方法已众所周知，可以参考WO 92/01047，WO 92/20791，WO93/06213，WO 93/11236，WO 93/19172，WO 95/01438，WO 95/15388。

象上述那样构建的抗体基因可以通过众所周知的方法使其表达获得。在是哺乳类细胞的情况下，通过使常用的有用的启动子、被表达的抗体基因、其3′侧下游聚A信号肽功能性地结合的DNA或含有该DNA的载体表达。例如：作为启动子/增强子，如人巨细胞病毒即早期启动子/增强子(human cytomegalovirus immediate earlypromoter/enhancer)。

另外作为其它的可用于在本发明的抗体表达中使用的启动子/增强子，可以使用逆病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿病毒40(SV 40)等病毒启动子/增强子或人延伸因子1a(HEF1a)等来自哺乳类细胞的启动子/增强子。

例如、使用SV 40启动子/增强子时，根据Mu11igan等人的方法(Mulligan，R.C.et al.，Nature(1979)277，108-114)，使用HEF1α启动子/增强子时，根据Mizushima等人的方法(Mizushima，S.andNagata，S.Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)容易实施。

使用大肠杆菌时，可以使常用的有用的启动子、用于抗体分泌的信号肽序列、被表达的抗体基因功能性地结合、表达。例如作为启动子，如lacZ启动子、araB启动子。使用lacZ启动子时，可以根据Ward等人的方法(Ward，E.S.et al.，Nature(1989)341，544-546；Ward，E.S.et al.FASEB J.(1992)6，2422-2427)实施，使用araB启动子时，可以根据Better等人的方法(Better，M.et al.Science(1988)240，1041-1043)实施。

作为用于抗体分泌的信号肽序列，使抗体在大肠杆菌的周质产生时，可以使用pelB信号肽序列(Lei，S.P.et al J.Bacteriol.(1987)169，4379-4383)。分离在周质产生的抗体后，对抗体的结构进行适当重折叠(refold)后使用(例如、参照WO96/30394)。

作为复制起点，可以使用来自SV 40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头状瘤病毒(BPV)等的复制起点，另外，为了在宿主细胞系进行基因拷贝数扩增，表达载体可以含有作为选择标志的氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。

为了制造本发明中使用的抗体，可以使用任意的生产系统。用于抗体制造的生产系统有体外和体内的生产系统。作为体外的生产系统，如使用真核细胞的生产系统和使用原核细胞的生产系统。

使用真核细胞时，有使用动物细胞、植物细胞、或真菌细胞的生产系统。作为动物细胞，已知(1)哺乳类细胞、例如：CHO、COS、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Vero等；(2)两栖类细胞、例如：非洲爪蟾卵母细胞、或(3)昆虫细胞、例如、sf9、sf21、Tn5等。作为植物细胞，已知来自烟草(Nicotianat abacum)的细胞，可以对它们进行愈伤组织培养。作为真菌细胞，已知有酵母、例如：酵母(Saccharomyces)属、例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、丝状菌、例如：曲霉属(Aspergillus)、例如：黑曲霉(Aspergillusniger)等。

使用原核细胞时，有使用细菌细胞的生产系统。作为细菌细胞已知有大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌。

通过转化将目的抗体基因导入到这些细胞中，通过将被转化的细胞在体外进行培养，可得到抗体。根据众所周知的方法进行培养。例如、作为培养液，可以使用DMEM、MEM、RPMI 1640、IMDM，也可以并用胎牛血清(FCS)等血清添加液。另外也可通过将导入了抗体基因的细胞转移到动物的腹腔等，在体内生产抗体。

另外，作为体内的生产系统，如使用动物的生产系统和使用植物的生产系统。使用动物时有使用哺乳类动物、昆虫的生产系统等。

作为哺乳类动物，可以使用山羊、猪、羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser，SPECTRUM Biotechnology Applications，1993)。而作为昆虫可以使用蚕。使用植物时，例如可以使用烟草。

将抗体基因导入这些动物或植物中，使抗体在动物或植物的体内产生、回收。例如：将抗体基因插入到编码山羊β酪蛋白那样的在乳汁中固有产生的蛋白质的基因中间后，制备成融合基因。将含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚中，将这个胚导入雌性山羊。可以从接受了胚的山羊产下的转基因山羊或其子孙产生的乳汁获得期待的抗体。为了使从转基因山羊产生的含有期待抗体的乳汁量增加，也可以对转基因山羊使用适当的激素。(Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。

另外，使用蚕时，用插入了目的抗体基因的杆状病毒感染蚕，从该蚕的体液获得期待的抗体(Maeda，S.et al.，Nature(1985)315，592-594)。另外，使用烟草时，将目的抗体基因插入植物表达用载体、例如pMON 530，将该载体导入到根癌土壤杆菌那样的细菌中。使该细菌感染烟草、例如Nicotiana tabacum，可以从本烟草的叶得到期待的抗体(Julian，K.-C.Ma et al.，Eur.J.Immunol.(1994)24，131-138)。

象上述那样通过体外或体内的生产系统生产抗体时，也可以将编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA分别整合到表达载体后，同时转化宿主，也可以将编码H链和L链的DNA整合到一个的表达载体中，转化宿主(参见国际专利申请公开号WO 94-11523)。

本发明中可使用的抗体只要是适合本发明使用的，即使是抗体的片段或其修饰物也可以。例如：作为抗体的片段，如Fab、F(ab′)₂、Fv或用适当的接头连接Fv的H链与L链的单链Fv(scFv)。

具体来说，将抗体用酶、例如：木瓜蛋白酶、胃蛋白酶进行处理，使之生成抗体片段，或构建编码这些抗体片段的基因，将该基因导入表达载体后，用适当的宿主细胞表达(例如、参照Co，M.S.et al.，J.Immunol.(1994)152，2968-2976、Better，M.& Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Plueckthun，A.&Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663、Rousseaux，J.et al.，Methods in Enzymology(1989)121，663-66、Bird，R.E.et al.，TIBTECH(1991)9，132-137)。

通过将抗体的H链的V区与L链的V区连接可以获得scFv。在这个scFv中，H链的V区与L链的V区通过接头、最好是肽接头连接(Huston，J.S.et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。ScFv中的H链的V区与L链的V区也可以是来自上述作为抗体记载的任一个抗体。作为连接V区的肽接头，例如可以使用由12-19个氨基酸残基构成的任意的单链肽。

可以通过以编码上述抗体的H链或H链的V区的DNA、以及编码L链或L链的V区的DNA作为模板，对编码这些序列中期待的氨基酸序列的DNA部分使用规定其两端的引物对通过PCR法进行扩增，然后再将编码肽接头部分的DNA以及规定其两端能够与各个H链、L链连接的引物对组合后进行扩增获得编码scFv的DNA。

而一旦制备得到编码scFv的DNA，可以通过常规方法获得含有这些DNA的表达载体、以及用该表达载体转化的宿主，另外可以使用该宿主根据常规方法得到scFv。

这些抗体的片段可与上述同样地得到其基因，通过宿主表达产生。本发明中提到的“抗体”也包含这些抗体的片段。

作为抗体的修饰物，也可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。本发明中提到的“抗体”也包含这些抗体修饰物。为了获得这样的抗体修饰物，通过对得到的抗体实施化学修饰可以得到。这些方法在该领域中已经确立。

可以从细胞内外、从宿主分离象上述那样产生、表达的抗体，纯化至均一。可以通过亲和层析进行本发明中使用的抗体的分离、纯化。作为用于亲和层析中的柱子、例如蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱中使用的载体，例如、Hyper D、POROS、Sepharose F.F.等。此外，可以使用通常蛋白质中使用的分离、纯化方法，没有任何限定。

例如：可以适当选择、组合上述亲和层析以外的层析、过滤、排阻过滤、盐析、透析等，可以对本发明中使用的抗体进行分离、纯化。作为层析，例如、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤等。这些层析适用于HPLC(High performance liquid chromatography)。另外，也可以使用反相HPLC(reverse phase HPLC)。

可以通过吸光度测定或ELISA等进行上述得到的抗体的浓度测定。即、利用吸光度测定时，用PBS(-)适当稀释后，测定280nm的吸光度，以1mg/ml作为1.35OD计算。通过ELISA测定时，可如下测定。即、将100μl用0.1M碳酸氢酸缓冲液(pH9.6)稀释至1μg/ml的山羊抗人IgG(TAG制造)加到96孔板(Nunc制造)，于4℃温育过夜，固定抗体。封闭后、添加适当稀释的本发明中使用的抗体或含有抗体的样品、或作为标准品的人IgG(CAPPEL制)100μl，于室温下温育1小时。

洗涤后，加稀释了5000倍的碱性磷酸酶标记的抗人IgG(BIOSOURCE制)100μl，于室温下温育1小时。洗涤后，加底物溶液，温育后，使用MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad制)测定405nm的吸光度，计算目的抗体的浓度。

本发明中使用的白介素-6变体是具有与白介素-6受体的结合活性，而且不传递白介素-6生物学活性的物质。即，白介素-6变体与白介素-6竞争性地结合白介素-6受体，由于不传递白介素-6的生物学活性，所以可阻断依赖于白介素-6的信号转导。

白介素-6变体是通过对白介素-6的氨基酸序列的氨基酸残基进行置换导入突变制备的。作为白介素-6变体的本体的白介素-6不管其来源，如果考虑抗原性等，最好是人白介素-6。

具体来说，使用众所周知的分子模型程序，例如WHATIF(Vriend etal.，J.Mol.Graphics(1990)8，52-56)对白介素-6的氨基酸序列的二级结构进行预测，再通过对被置换的氨基酸残基对整体的影响进行评价。确定合适的置换氨基酸残基后，以含有编码人白介素-6基因的碱基序列的载体作为模板，通过使用通常进行的PCR法导入能够使氨基酸置换的突变，可以得到编码白介素-6变体的基因。根据需要可以将该基因整合到适当的表达载体，通过上述重组型抗体的表达、产生以及纯化方法可以得到白介素-6变体。

作为白介素-6变体的具体例子，如Brakenhoff et al.，J.Biol.Chem.(1994)269，86-93、以及Savino et al.，EMBO J.(1994)13，1357-1367、WO 96-18648、WO 96-17869公开的例子。

本发明中使用的白介素-6部分肽或白介素-6受体部分肽是分别具有与白介素-6受体或白介素-6的结合活性，而且不传递白介素-6生物学活性的物质。即，白介素-6部分肽或白介素-6受体部分肽与白介素-6受体或白介素-6结合，通过捕获它们，特异性地抑制白介素-6与白介素-6受体的结合。其结果由于不传递白介素-6的生物学活性，所以阻断了依赖于白介素-6的信号转导。

白介素-6部分肽或白介素-6受体部分肽是由在白介素-6或白介素-6受体的氨基酸序列中与白介素-6和白介素-6受体结合有关的区域的一部分或全部氨基酸序列构成的肽。这样的肽通常由10～80、优选20～50、更优选20～40个氨基酸残基构成。

白介素-6部分肽或白介素-6受体部分肽可以如下制备。对白介素-6或白介素-6受体的氨基酸序列中与白介素-6和白介素-6受体的结合有关的区进行特别指定，通过常规的已知方法、例如基因工程手段或肽合成法制备其的一部分或全部的氨基酸序列。

为了通过基因工程手段制备白介素-6部分肽或白介素-6受体部分肽，将编码期待的肽的DNA序列整合到表达载体中，根据上述重组型抗体表达、产生以及纯化方法可以得到所述部分肽。

为了通过肽合成法制备白介素-6部分肽或白介素-6受体部分肽，可以使用在肽合成中通常使用的方法、例如固相合成法或液相合成法。

具体来说，可以根据“续医药品的开发”第14卷，“肽合成”，监修矢岛治明，广川书店，1991年，所述的方法进行。作为固相合成法，例如可以使用在不溶于有机溶剂的载体上使对应于要合成的肽的C末端氨基酸结合，通过交替反复进行使用适当保护基对α-氨基以及侧链官能基进行了保护的氨基酸按照从C末端至N末端方向的顺序一个一个进行氨基酸缩合的反应和使结合在树脂上的氨基酸或肽的α-氨基的该保护基脱离的反应，使肽链延伸的方法。固相肽合成法因使用的保护基的种类不同大致分为Boc法与Fmoc法。

象上述那样合成了目的肽后，进行脱保护反应以及将肽链从载体上切下的反应。在切下肽链的切断反应中，如果使用Boc法通常使用氟化氢或三氟甲烷磺酸，而如果使用Fmoc法通常使用TFA。如果用Boc法，例如在氟化氢中于茴香醚存在下对上述保护肽树脂进行处理。然后脱保护基和从载体上切下，回收肽。通过将该肽进行冷冻干燥，得到粗肽。另外，如果用Fmoc法，例如在TFA中与上述同样操作，进行脱保护反应以及将肽链从载体上切下的反应。

得到的粗肽通过运用HPLC可以进行分离、纯化。在进行洗脱时，使用蛋白质纯化中通常使用的水-乙腈系溶剂，在最适条件下进行。对得到的相当于整个层析图的峰级分进行收集，对该级分进行冷冻干燥。对于这样纯化的肽级分，通过质谱分析进行的分子量解析、氨基酸组成分析、或通过氨基酸序列解析等进行鉴定。

白介素-6部分肽以及白介素-6受体部分肽的具体例子，如特开平2-188600、特开平7-324097、特开平8-311098和美国专利公报US5210075公开的例子。

本发明中使用的白介素-6拮抗剂的白介素-6信号转导抑制活性可以通过通常用的方法进行评价。具体来说，通过对白介素-6依赖性人骨髓瘤株(S6B45，KPMM2)、人Lennert T淋巴瘤细胞株KT3、或白介素-6依赖性细胞MH60.BSF2进行培养，添加白介素-6，同时使白介素-6拮抗剂共存，据此测定白介素-6依赖性细胞的³H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入。

另外，通过对作为白介素-6受体表达细胞的U266进行培养，添加¹²⁵I标记的白介素-6，同时加入白介素-6拮抗剂，测定与白介素-6受体表达细胞结合的¹²⁵I标记的白介素-6。在上述分析体系中，除了使白介素-6拮抗剂存在的组外，设置不含有白介素-6拮抗剂的阴性对照组，如果对两者得到的结果进行比较，可以评价白介素-6拮抗剂的白介素-6抑制活性。

就象下面实施例给出的那样，由于确认了抗白介素-6受体的抗体对内耳障碍细胞的增殖抑制效果，表明抗白介素-6受体的抗体等白介素-6拮抗剂可用作内耳障碍的治疗剂。

本发明的治疗对象是哺乳动物。治疗对象哺乳动物优选人。

本发明的内耳障碍治疗和/或预防剂或内耳障碍细胞增殖抑制剂可以通过口服或非口服方式全身或局部施用。例如、可以选择点滴等静脉内注射、肌肉内注射、胸腔内注射、腹腔内注射、皮下注射、栓剂、灌肠、口服性肠溶剂等，可以根据患者的年龄、症状选择适当的给予方法。有效给予量可从每次、每1kg体重、从0.01mg至100mg的范围内选择。或对于每个患者可以选择1～1000mg、优选5～50mg的给予量。

理想的施用量、施用方法，例如是抗白介素-6受体抗体时，以血中有游离抗体存在程度的量为有效施用量，作为具体的例子，每1kg体重1个月(4周)内分1次至数次，例如按照2次/周、1次/周、1次/2周、1次/4周等的施用计划使用点滴等静脉内注射、皮下注射等方法给予0.5mg至40mg、优选1mg至20mg等。给予计划也可以一边观察病情和血液检查值的动向，进行将施用间隔从2次/周或1次/周延长至1次/2周、1次/3周、1次/4周等调整。

本发明的内耳障碍治疗和/或预防剂或内耳障碍细胞增殖抑制剂可根据施用途径同时含有在医药上容许的载体或添加物。作为这样的载体和添加物的例子，如水、医药上容许的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧乙烯聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯树胶、酪蛋白、明胶、琼脂、一缩二甘油、丙(撑)二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清清蛋白(HSA)、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、作为医药添加物容许的表面活性剂等。使用的添加物可根据剂型，从上述化合物中适当或组合选择，但并不限定于这些化合物。

实施例

以下、通过实施例和参考例对本发明进行具体说明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1.

接实验方法

(1)声音负荷前小鼠的听力测定

对于4周龄的C57BL/6J雄性小鼠，在声音负荷前通过听性脑干反应(ABR)进行听力测定。在测定前，通过向腹腔内注射Xyladine和氯胺酮(Ketamine)，实施充分的深度麻醉，在测定中根据需要，用氯胺酮实施追加麻醉。

(听性脑干反应)上述的噪音条件下，为了知道噪音诱发耳聋的程度，对听性脑干反应(ABR)的阈值shift进行实验，使用PowerLabsystem(Model：PowerLob2/20，ADInstruments CastleHillAustralia)的Scope软件的waveform storing和stimuluscontrol进行ABR的测定，使用细胞外放大器Digital Biomap System(Model：BAL-1，Tucker-Davis Technologies FL/USA)记录EEG。声音刺激是通过向小鼠的外耳道中插入耦合型扬声器(Model：ESlspc，BioResearch Center，名古屋/日本)产生的。使之产生0.1ms升/降时间(cosine gate)的破裂音刺激和1ms的平坦片段(flatsegment)，用声音发生器、Attention Real-time Processor和Programable Attenater(Model：RP2.1 and PA5，Tucker-DavisTechnologies FL/USA)指定振幅。使用Sound Level Meter(Model：LA-5111，0no Sokki横滨/日本)测定声音水平。为了记录，将不锈钢制的针状电极设置于左耳和右耳的顶部和空洞侧部。通常，使用50-5000Hz的滤波器装置，以40000Hz的取样速度，记录时间为12.8ms的ABR波形，平均在9Hz频率的来自256刺激的波形。以5-dB SPL的间隔，从最高振幅处开始记录直至波形到视力不可见为止。为了测定阈值，将给予的声音的频率定为4kHz、12kHz和20kHz三种，测定各听力阈值。

(2)耳聋模型的制作

在声音负荷装置(该装置是用RION Audiometyr AA67N的制噪装置作为声音发生器，用SONY SRP-P150，FOSTEXD-1405作为增幅器，进行增幅后，在密闭空间内以直径大约12cm的扩音器进行负荷的装置)内，向在扩音器正下方1cm处静置的高3cm的金属网制笼中装入小鼠。用同样性状的金属网将笼子以放射状分隔，同时将4只小鼠分别装到每个室中。然后，在声音负荷装置内，按照124±1db预先设定声音压力(CASELA公司，通过CEL-231在2小时的负荷过程中，进行多次测定)，在此条件下，进行2小时的高音负荷。使用4kHzSPL的Octaveband noise的声音。此外，在声音装置内放置温度计，测定声音负荷前后的温度。

(3)施用药物

在上述(2)后，将动物分成A群和B群，马上将大鼠IgG按照2mg/只或者MR16-1(在参考例4中制备的抗白介素-6R人源化抗体)按照2mg/只施用于各组。在施用时，作为盲实验，直至(4)的听力测定结束时，实验人员不清楚向个组施用的内容。

(4)听力阈值的测定

与上述(1)的方式相同，从声音负荷和施用药物一周后测定听力。在确认测定后的小鼠达到充分的麻醉深度后，断头，摘出侧头骨，固定后，保存以备用于组织学考察。

(5)结果分析

取各个个体在上述(4)得到的听力与在上述(1)得到的处置前的听力的差，计算出听力阈值降低度(dB)。分别计算出MR16-1施用组与对照组在各频率处的平均听力阈值降低(dB)。

结果

在进行上述(4)的麻醉时，死亡1只，由于不能测定听力，所以扣除。得到听力阈值度的只数在MR16-1组中为4只，在IgG施用组中为为2只。此外，声音负荷器内的温度在负荷前为25℃，负荷后为27℃。结果如下表1和图1所示。

表1

处理频率	IgG施用对照组	MR16-1施用组	阈值变化差
处理频率	IgG施用对照组	MR16-1施用组	阈值变化差	4kHz	22.5	37.5	-15
12kHz	35	27.5	+7.5	4kHz	22.5	37.5	-15
12kHz	35	27.5	+7.5	20kHz	55	28.8	+26.3

讨论

认为声音外伤是声音压力这种物理性外力，在本实验中使用的模型是耳蜗的物理组织损伤模型。在本实验中，以4kHz的频率为中心，负荷放大的声音。在耳蜗处，感受声音的感受器对应于频率进行空间性分布(to notropic)，在对照组中的听力降低高达4kHz，由此出发，直到高音区域逐渐变小，可以说明在4kHz的区域因为负荷放大的声音，所以造成了越靠近该区域，组织的损伤越大。

另一方面，在白介素-6受体抗体施用组中，负荷放大的声音的组织损伤离直接接受部位越远，与对照组相比，越能抑制听力降低。由上所述，认为白介素-6受体抗体具有空间渐进性抑制耳蜗的组织障碍，即，内耳性神经性耳聋的听力降低的效果，或者具有抑制在神经性耳聋的高音区域的听力降低的效果。

实施例2.炎症性细胞因子在声音外伤后的耳蜗的表达

使用3～4周龄的雄性SD大鼠以实施例1相同的方法，制作耳聋模型，紧接着声音负荷，在3小时后、6小时后、12小时后、24小时后、3天后、5天后、7天后、28天后分别从各大鼠中摘出侧头骨。以不漏出耳蜗内的淋巴液体状态保持，只摘出耳蜗，通过RT-PCR法测定各种炎症细胞因子的表达。结果如图2所示。由图2可知，在声音外伤模型的耳蜗处，TNFα、IL-1α、IL-1β、IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)、白介素-6的表达上升。另一方面，没有发现IL-12p40和GM-CSF的表达。

然后，通过定量RT-PCR，测定TNFα、白介素-6、IL-1β、白介素-6表达的经时变化。定量RT-PCR中，使用18SrRNA作为内标(reference gene)，通过ΔΔCt法分析结果。结果如图3～图5所示。从图3～图5可知，在声音外伤后不足24小时的早期阶段，确认有显示表达量的峰的TNFα、IL-1β、白介素-6的表达。

此外，使用声音负荷6小时的组织，在冷冻切片上进行免疫组织染色。动物使用SD大鼠，以与实施例1相同的方法制成耳聋模型，在噪音负荷后6小时后断头。立即摘出侧头骨，使用液氮将用4％的多聚甲醛固定6小时，用0.5mol/1EDTA液脱矿物质而得到的检测样本迅速冷冻，使用低温保藏器(CM3000，Leica公司)，切成7μm厚，得到冷冻切片。在该切片上施行免疫组化染色。在染色中使用Vectastein ABC试剂盒，用DAB显色。作为染色的对照，使用不加第一抗体进行的染色。结果如图6～图7所示，由图6～图7可知，在声音负荷6小时后的耳蜗，显示出在耳蜗外壁和螺旋器(Corti’s organ)的正下方的基底膜表达白介素-6。

实施例3.白介素-6拮抗剂的全身施用所致的药效的确认

与实施例1一样，向C57BL/6J雄性小鼠负荷2小时124dB的过大音，紧接着，将MR16-1按照2mg/只、将大鼠IgG按照2mg/只向腹腔内施用。施用抗体后，在8小时后摘出侧头骨，摘出两侧的内耳，解剖出螺旋器，分成第一螺旋(尖部)、第二螺旋(基底)，分别从左右回收，合并。通过Western印迹方法，测定总STAT3、Erk、Akt和磷酸化的STAT3、Erk、Akt的表达。结果如图8所示。由图8可知，对照组中很清楚的确认磷酸化的STAT3、磷酸化Erk、磷酸化Akt的信号在MR16-1使用组受到抑制。根据该结果，可确认全身施用的MR16-1在耳蜗内发挥药效。

根据该结果和实施例2的结果，认为通过实施例1所示的MR16-1的腹腔内施用所致的抑制听力降低的作用机制是：在由于声音外伤后早期时的耳蜗内的表达的白介素-6信号受到MR16-1的抑制的效果。

参考例1.人可溶性白介素-6受体的制备

使用根据Yamasaki等人的方法(Yamasaki，K.et al.，Science(1988)241，825-828)得到的含有编码白介素-6受体的cDNA的质粒pBSF2R.236，通过PCR法制备成可溶性白介素-6受体。将质粒pBSF2R.236用限制性内切酶Sph I消化，得到白介素-6受体cDNA，将该cDNA插入到mp18(Amersham制造)中。为了向白介素-6受体cDNA导入终止密码子，使用设计的合成寡核苷酸引物，通过体外诱变系统(Amersham制造)用PCR法向白介素-6受体cDNA导入突变。通过该操作，终止密码子被导入到氨基酸345的位置，得到编码可溶性白介素-6受体的cDNA。

为了在CHO细胞表达可溶性白介素-6受体cDNA，使它与质粒pSV(Pharmacia制造)连接，得到质粒pSVL344。向含有dhfr的cDNA的质粒pECEdhfr插入用Hind III-Sal I切断的可溶性白介素-6受体cDNA，得到CHO细胞表达质粒pECEdhfr 344。

用磷酸钙沉淀法(Chen，C.et al.，Mol.Cell.Biol.(1987)7，2745-2751)以10μg的质粒pECEdhfr344转染dhfr-CHO细胞株DXB-11(Urlaub，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，4216-4220)。将转染的CHO细胞在含有1mM谷胺酰胺、10％透析FCS、100U/ml的青霉素以及100μg/ml的链霉素的不含核苷酸的αMEM选择培养液中培养3周。

用极限稀释法对选择的CHO细胞进行筛选，得到单一的CHO细胞克隆。将该CHO细胞克隆在20nM～200nM浓度的氨甲蝶呤中进行扩增，得到可产生人可溶性白介素-6受体的CHO细胞株。将CHO细胞株5E27在含有5％FBS的Iscove改进的Dulbecco培养液(IMDM、Gibco制造)中进行培养。回收培养上清，培养上清中的可溶性白介素-6受体浓度通过ELISA进行测定。该结果确认培养上清中存在可溶性白介素-6受体。

参考例2.抗人白介素-6抗体的制备

将10μg的重组型白介素-6(Hirano，T.et al.，Immunol.Lett.(1988)17，41)与弗氏完全佐剂一起免疫BALB/c小鼠，每隔一周继续免疫直至血清中能够检测出抗白介素-6抗体为止。从局部淋巴节摘出免疫细胞，使用聚乙二醇1500，与骨髓瘤细胞株P3U1融合。根据Oi等人的使用HAT培养液的方法(Selective Methodsin CellularImmunology，W.H.Freeman and Co.，San Francisco，351，1980)选择杂交瘤，建立产生抗人白介素-6抗体的杂交瘤。

产生抗人白介素-6抗体的杂交瘤可以象下述那样进行白介素-6结合分析。即、将以柔软的聚乙烯制的96孔微量板(DynatechLaboratories，Inc.制，Alexandria，VA)在0.1M的碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中用100μl的山羊抗小鼠Ig(10μl/ml，Cooper Biomedical，Inc制Malvern，PA)于4℃下包被过夜。然后将板用含有100μl1％牛血清清蛋白(BSA)的PBS于室温下处理2小时。

然后用PBS将板洗涤后，将100μl的杂交瘤培养上清加到各孔，于4℃下温育过夜。洗涤板，按照2000cpm/0.5ng/well那样向各孔添加¹²⁵I标记的重组型白介素-6，洗涤后，用γ计数器(Beckman Gamma9000，Beckman Instruments，Fullerton，CA)测定各孔的放射活性。通过白介素-6结合分析，216个杂交瘤克隆中有32个杂交瘤克隆为阳性。在这些克隆中最终得到稳定的MH166.BSF2。该杂交瘤产生的抗白介素-6抗体MH166具有IgG1K亚型。

然后使用白介素-6依赖性的小鼠杂交瘤克隆MH60.BSF2，研究MH166抗体与杂交瘤增殖有关的中和活性。将MH60.BSF2细胞按照1×10⁴/200μl/孔进行分注，然后加含有MH166抗体的样品，培养48小时，加0.5μCi/孔的³H胸腺嘧啶脱氧核苷(New England Nuclear，Boston，MA)后，再继续培养6小时。将细胞置于玻璃过滤纸上，用自动收集器(Labo Mash Science Co.，Tokyo，Japan)处理。使用兔抗白介素-6抗体作为对照。

该结果表明MH166抗体容量依赖性地抑制由白介素-6诱导的MH60.BSF2细胞的³H胸腺嘧啶脱氧核苷掺入。由此表明MH166抗体可中和白介素-6的活性。

参考例3.抗人白介素-6受体抗体的制备

根据附带的配方使通过Hirata等人的方法(Hirata，Y.et al.J.Immunol.(1989)143，2900-2906)制备成的抗白介素-6受体抗体MT18与用CNBr活化的琼脂糖4B(Pharmacia Fine Chemicals制，Piscataway，NJ)结合，纯化白介素-6受体(Yamasaki，K.et al.，Science(1988)241，825-828)。将人骨髓瘤细胞株U266用含有1％毛地黄皂苷(Wako Chemicals制)，10mM三乙醇胺(pH7.8)以及0.15MNaCl的1mM对氨基苯基甲烷磺酰氟盐酸盐(Wako Chemicals制)(毛地黄皂苷缓冲液)溶解，与结合在琼脂糖4B颗粒的MT18抗体进行混合。然后，将颗粒用毛地黄皂苷缓冲液洗6次，作为用于进行免疫的部分纯化的白介素-6受体。

用从3×10⁹个U266细胞得到的上述部分纯化白介素-6受体每隔10日免疫一次BALB/c小鼠，免疫4次，然后通过常规方法制成杂交瘤。通过下述方法研究来自成长阳性孔的杂交瘤培养上清与白介素-6受体的结合活性。将5×10⁷个U266细胞用³⁵S-蛋氨酸(2.5mCi)进行标记，用上述毛地黄皂苷缓冲液进行溶解。将溶解的U266细胞与0.04ml容量的结合在琼脂糖4B颗粒的MT18抗体混合，然后，用毛地黄皂苷缓冲液洗6次，用0.25ml的毛地黄皂苷缓冲液(pH3.4)将³⁵S-蛋氨酸标记白介素-6受体洗脱出，用0.025ml的1MTris(pH7.4)进行中和。

将0.05ml的杂交瘤培养上清与0.01ml的Protein G琼脂糖(Phramacia制)混合。洗涤后，将琼脂糖与上述制备的0.005ml的³⁵S标记的白介素-6受体溶液一起温育。通过SDS-PAGE对免疫沉淀物质进行分析，研究与白介素-6受体反应的杂交瘤培养上清。该结果建立了反应阳性杂交瘤克隆PM-1(FERM BP-2998)。由杂交瘤PM-1产生的抗体具有IgG1κ亚型。

使用人骨髓瘤细胞株U266研究杂交瘤PM-1产生的抗体对白介素-6与人白介素-6受体结合的抑制活性。从大肠杆菌制备人重组型白介素-6(Hirano，T.et al.，Immunol.Lett.(1988)17，41-45)、通过Bolton-Hunter试剂(New England Nuclear，Boston，MA)进行¹²⁵I标记(Taga，T.et al.，J.Exp.Med.(1987)166，967-981)。

将4×10⁵个U266细胞与70％(v/v)的杂交瘤PM-1的培养上清以及14000cpm的¹²⁵I标记的白介素-6一起培养1小时。将70μl的样品铺在400μl的微融合聚乙烯管的300μl的FCS上面，离心后，测定细胞上的放射活性。

该结果表明杂交瘤PM-1产生的抗体抑制白介素-6与白介素-6受体的结合。

参考例4.抗小鼠白介素-6受体抗体的制备

利用Saito，T.et al.，J.Immunol.(1991)147，168-173所述的方法制备抗小鼠白介素-6受体的单克隆抗体。

将产生小鼠可溶性白介素-6受体的CHO细胞在含有10％FCS的IMDM培养液中培养，使用在Affigel 10凝胶(Biorad制造)上固定了来自该培养上清的抗小鼠白介素-6受体抗体RS12的亲和柱(参照上述Saito，T.et al)纯化小鼠可溶性白介素-6受体。

将得到的小鼠可溶性白介素-6受体50μg与弗氏完全佐剂混合，注射到Wistar大鼠的腹部。2周后用弗氏不完全佐剂进行追加免疫。第45天时，获取大鼠脾脏细胞，将2×10⁸个细胞与1×10⁷个小鼠骨髓瘤细胞P3U1使用50％的PEG1500(Boehringer Mannheim制)通过常规方法进行细胞融合后，通过HAT培养基筛选杂交瘤。

将杂交瘤培养上清加到包被了兔抗大鼠IgG抗体(Cappel制造)的板后，使之与小鼠可溶性白介素-6受体反应。然后，通过使用兔抗小鼠白介素-6受体抗体和碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG的ELISA法筛选产生小鼠可溶性抗白介素-6受体抗体的杂交瘤。确认产生抗体的杂交瘤克隆进行2次亚筛选，得到单一的杂交瘤克隆。将该克隆命名为MR16-1。

通过使用MH60.BSF2细胞(Matsuda，T.et al.，J.Immunol.(1988)18，951-956)的³H胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入研究该杂交瘤产生的抗体在小鼠白介素-6的信息转导中的中和活性。按照1×10⁴个/200μl/孔那样在96孔板中制备MH60.BSF2细胞。向该板加10pg/ml的小鼠白介素-6和MR16-1抗体或RS12抗体12.3～1000ng/ml，于37℃、5％CO₂下培养44小时后，加1μCi/孔的³H胸腺嘧啶脱氧核苷。于4小时后测定³H胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入。该结果表明MR16-1抗体抑制MH60.BSF2细胞的³H胸腺嘧啶脱氧核苷掺入。

因此表明杂交瘤MR16-1(FERM BP-5875)产生的抗体抑制白介素-6与白介素-6受体的结合。

Claims

1.含有白介素-6拮抗剂作为有效成分的内耳障碍治疗和/或预防剂。

2.权利要求1所述的治疗和/或预防剂，其中，所述内耳障碍是感觉神经性耳聋。

3.权利要求2所述的治疗和/或预防剂，其中，所述感觉神经性耳聋是梅尼埃病综合症、药物诱导性内耳障碍、病毒性内耳炎、化脓性内耳炎、侧头骨骨折、听觉神经肿瘤导致的感觉神经性耳聋。

4.权利要求2所述的治疗和/或预防剂，其中，所述感觉神经性耳聋是突发性耳聋、老人性耳聋或噪音性耳聋。

5.权利要求1所述的治疗和/或预防剂，其中，所述内耳障碍是前庭障碍。

6.权利要求5所述的治疗和/或预防剂，其中，所述前庭障碍是梅尼埃病综合症、前庭神经炎或药物诱导性内耳障碍导致的前庭障碍。

7.权利要求1～6任一项所述的治疗和/或预防剂，其中，所述白介素-6拮抗剂是抗白介素-6受体的抗体。

8.权利要求7所述的治疗和/或预防剂，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是抗白介素-6受体的单克隆抗体。

9.权利要求8所述的治疗和/或预防剂，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是抗人白介素-6受体的单克隆抗体。

10.权利要求8所述的治疗和/或预防剂，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是抗小鼠白介素-6受体的单克隆抗体。

11.权利要求7～10任一项所述的治疗和/或预防剂，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是重组型抗体。

12.权利要求9所述的治疗和/或预防剂，其中，所述抗人白介素-6受体的单克隆抗体是PM-1抗体。

13.权利要求10所述的治疗和/或预防剂，其中，所述抗小鼠白介素-6受体的单克隆抗体是MR16-1抗体。

14.权利要求7～13任一项所述的治疗和/或预防剂，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是抗白介素-6受体的嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

15.权利要求14所述的治疗和/或预防剂，其中，所述抗白介素-6受体的人源化抗体是人源化PM-1抗体。

16.白介素-6拮抗剂在制造内耳障碍治疗和/或预防剂中的应用。

17.权利要求16所述的应用，其中，所述内耳障碍是感觉神经性耳聋。

18.权利要求17所述的应用，其中，所述感觉神经性耳聋是梅尼埃病综合症、药物诱导性内耳障碍、病毒性内耳炎、化脓性内耳炎、侧头骨骨折、听觉神经肿瘤导致的感觉神经性耳聋。

19.权利要求17所述的应用，其中，所述感觉神经性耳聋是突发性耳聋、老人性耳聋或噪音性耳聋。

20.权利要求16所述的应用，其中，所述内耳障碍是前庭障碍。

21.权利要求20所述的应用，其中，所述前庭障碍是梅尼埃病综合症、前庭神经炎或药物诱导性内耳障碍导致的前庭障碍。

22.权利要求16～21任一项所述的应用，其中，所述白介素-6拮抗剂是抗白介素-6受体的抗体。

23.权利要求22所述的应用，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是抗白介素-6受体的单克隆抗体。

24.权利要求23所述的应用，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是抗人白介素-6受体的单克隆抗体。

25.权利要求23所述的应用，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是抗小鼠白介素-6受体的单克隆抗体。

26.权利要求22～25任一项所述的应用，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是重组型抗体。

27.权利要求24所述的应用，其中，所述抗人白介素-6受体的单克隆抗体是PM-1抗体。

28.权利要求25所述的应用，其中，所述抗小鼠白介素-6受体的单克隆抗体是MR16-1抗体。

29.权利要求22～28任一项所述的应用，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是抗白介素-6受体的嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

30.权利要求29所述的应用，其中，所述抗白介素-6受体的人源化抗体是人源化PM-1抗体。

31.治疗和/或预防内耳障碍的方法，包括向对象给予白介素-6拮抗剂。

32.权利要求31所述的治疗和/或预防方法，其中，所述内耳障碍是感觉神经性耳聋。

33.权利要求32所述的治疗和/或预防方法，其中，所述感觉神经性耳聋是梅尼埃病综合症、药物诱导性内耳障碍、病毒性内耳炎、化脓性内耳炎、侧头骨骨折、听觉神经肿瘤导致的感觉神经性耳聋。

34.权利要求32所述的治疗和/或预防方法，其中，所述感觉神经性耳聋是突发性耳聋、老人性耳聋或噪音性耳聋。

35.权利要求31所述的治疗和/或预防方法，其中，所述内耳障碍是前庭障碍。

36.权利要求35所述的治疗和/或预防方法，其中，所述前庭障碍是梅尼埃病综合症、前庭神经炎或药物诱导性内耳障碍导致的前庭障碍。

37.权利要求31～36任一项所述的治疗和/或预防方法，其中，所述白介素-6拮抗剂是抗白介素-6受体的抗体。

38.权利要求37所述的治疗和/或预防方法，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是抗白介素-6受体的单克隆抗体。

39.权利要求38所述的治疗和/或预防方法，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是抗人白介素-6受体的单克隆抗体。

40.权利要求38所述的治疗和/或预防方法，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是抗小鼠白介素-6受体的单克隆抗体。

41.权利要求37～40任一项所述的治疗和/或预防方法，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是重组型抗体。

42.权利要求39所述的治疗和/或预防方法，其中，所述抗人白介素-6受体的单克隆抗体是PM-1抗体。

43.权利要求40所述的治疗和/或预防方法，其中，所述抗小鼠白介素-6受体的单克隆抗体是MR16-1抗体。

44.权利要求37～43任一项所述的治疗和/或预防方法，其中，所述抗白介素-6受体的抗体是抗白介素-6受体的嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

45.权利要求44所述的治疗和/或预防方法，其中，所述抗白介素-6受体的人源化抗体是人源化PM-1抗体。